Генетический мониторинг таргетной терапии хронического миелоидного лейкоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

На правах рукописи

Автореферат

на соискание ученой степенидоктора медицинских наук

Генетический мониторинг таргетной терапии хронического миелоидного лейкоза

03.00.15 - генетика

14.00.29 - гематология и переливание крови

Куцев Сергей Иванович

Москва - 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Домрачева Елена Васильевна

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Бочков Николай Павлович

доктор медицинских наук Румянцев Сергей Александрович

доктор медицинских наук, профессор Хорошко Нина Дмитриевна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Росздрава»

Защита состоится 2009 г. на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) - клональное миелопролиферативное заболевание, составляющее около 20% вновь диагностированных случаев лейкозов у взрослых. Ежегодная заболеваемость ХМЛ - не более 1-2 случаев на 100 000 взрослого населения. ХМЛ развивается в результате появления в стволовой кроветворной клетке реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11.2). Образующуюся при этом дериватную хромосому der(22)t(9;22) с укороченным длинным плечом называют филадельфийской (Ph-хромосома). В результате реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11.2) происходит слияние гена ABL, расположенного на длинном плече хромосомы 9, с геном BCR, расположенным на длинном плече хромосомы 22, с образованием слитного гена BCR-ABL. Белок BCR-ABL является тирозинкиназой с повышенной активностью и играет ключевую роль в патогенезе ХМЛ. Механизмы, контролирующие в норме активность ABL тирозинкиназы, не способны регулировать активность химерной BCR-ABL тирозинкиназы, что приводит к увеличению пролиферативной активности клеток и ингибированию апоптоза, уменьшает зависимость клеток от цитокинов и снижает клеточную адгезию. При установлении диагноза ХМЛ 90-100% клеток костного мозга характеризуются наличием Ph-хромосомы, выявляемой цитогенетическим или FISH методами.

Исследования молекулярного патогенеза ХМЛ подготовили почву для развития таргетной (целенаправленной) терапии этого заболевания, заключающейся в применении специфических ингибиторов BCR-ABL тирозинкиназы. Создание первого из них - иматиниба (STI571) стало революционным прорывом в области целенаправленной противоопухолевой терапии. Впервые вместо уничтожения всех миелоидных клеток с помощью неспецифического цитостатического воздействия стала применяться терапия, которая действует избирательно, блокируя повышенную пролиферативную активность и стимулируя апоптоз только опухолевых клеток.

Иматиниб селективно ингибирует BCR-ABL тирозинкиназу, встраиваясь в АТФ-связывающий карман киназного домена белка BCR-ABL. Благодаря этому АТФ не может встроиться в АТФ-связывающий карман, BCR-ABL тирозинкиназа остается в неактивном состоянии и тем самым блокируется сигнальный путь пролиферации опухолевых клеток. Клинические испытания иматиниба показали необыкновенно высокую эффективность этого препарата в терапии ХМЛ (Туркина А.Г., Хорошко Н.Д., Дружкова Г.А. и соавт., 2003; Зарицкий А.Ю., Ломаиа Е.Г., Виноградова О.Ю. и соавт., 2007). Так, к пяти годам терапии иматинибом полный гематологический ответ (нормализация клинико-лабораторных показателей) на лечение был достигнут у 98% больных ХМЛ; большой цитогенетический ответ (количество Ph-позитивных миелокариоцитов при цитогенетическом исследовании менее 35%) - у 92% больных; полный цитогенетический ответ (Ph-позитивные клетки в костном мозге не обнаруживаются) - у 87% пациентов; 5-летняя выживаемость без прогрессии заболевания составила 93% (Druker B.J. с соавт., 2006).

Несмотря на столь впечатляющие результаты, существует проблема первичной резистентности (рефрактерности) и вторичной (приобретенной) резистентности. Например, по данным международного исследования IRIS к концу 7 года наблюдения 17% пациентов утратили полный цитогенетический ответ (O'Brien S.G. с соавт., 2008).

Успех терапии ингибиторами тирозинкиназ во многом зависит от внедрения эффективной системы мониторинга результатов лечения, позволяющей своевременно изменять тактику терапии ХМЛ в каждом конкретном случае. В связи с относительной новизной клинического применения ингибиторов тирозинкиназ многие аспекты мониторинга терапии этими препаратами далеки от своего окончательного разрешения. Поэтому развитие системы мониторинга эффективности терапии ХМЛ препаратами ингибиторов тирозинкиназ с помощью генетических технологий для последующей оптимизации терапевтической тактики ведения пациентов с ХМЛ представляется весьма актуальным. К настоящему времени противоречивы данные о прогностическом значении дополнительных хромосомных аномалий, выявляемых при диагностическом цитогенетическом исследовании и в процессе цитогенетического мониторинга эффективности терапии, не вполне определено место молекулярно-генетического мониторинга, не ясна роль мутаций гена BCR-ABL в развитии рефрактерности к проводимой терапии, не оценена роль фармакокинетического мониторинга в терапии ХМЛ.

Цель исследования - оценить значимость цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований в оценке прогноза и мониторинге эффективности терапии ХМЛ.

Задачи исследования:

1. Оценить эффективность терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ цитогенетическим и молекулярно-генетическим методами исследования.

2. Сопоставить информативность цитогенетического, молекулярно-цитогенетического и молекулярно-генетического методов в диагностике и мониторинге терапии ХМЛ.

3. Определить частоту выявления и дать цитогенетическую характеристику клонов лейкозных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями, а также оценить их роль в прогнозе эффективности терапии ХМЛ.

4. Оценить эффективность молекулярно-генетического мониторинга в терапии ХМЛ.

5. Исследовать частоту и спектр мутаций гена BCR-ABL и определить значение клонов лейкозных клеток с мутациями гена BCR-ABL в развитии резистентности к терапии иматинибом.

6. Определить роль цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований для прогноза эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Новизна результатов исследования

В настоящем исследовании впервые:

- проведена комплексная оценка результатов цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических исследований на этапе диагностики и в процессе мониторинга эффективности терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ.

- показана необходимость проведения молекулярно-цитогенетических исследований у резистентных к терапии иматинибом пациентов с целью поиска дополнительных хромосомных аберраций в небольших клонах опухолевых клеток.

- выявлена частота и спектр мутаций химерного гена BCR-ABL, а также оценена их роль в развитии рефрактерности к иматинибу в когорте первично резистентных больных ХМЛ.

- установлено влияние перерывов в терапии иматинибом на развитие первичной и вторичной резистентности к иматинибу.

- выявлено значение измерения концентрации иматиниба в плазме крови для оптимизации терапии ХМЛ.

Практическая значимость.

Разработан алгоритм диагностики и мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ в зависимости от выявляемых цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических факторов, позволяющий оптимизировать тактику терапии заболевания. Создана математическая модель прогнозирования цитогенетического ответа на основании анализа корреляционных взаимосвязей различных показателей генетического мониторинга терапии ХМЛ. Разработаны рекомендации по использованию молекулярно-цитогенетического метода для выявления амплификации гена BCR-ABL в случаях резистентности к проводимой терапии. Предложено использование молекулярно-генетического мониторинга методом ПЦР в реальном времени терапии ХМЛ только после достижения полного цитогенетического ответа. Определена роль клонов опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аберрациями и мутациями гена BCR-ABL в развитии первичной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ. Показана роль фармакокинетических исследований в мониторинге терапии ХМЛ иматинибом.

Основные положения, выносимые на защиту:

- мониторинг терапии ХМЛ должен включать в себя комплекс цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических исследований факторов резистентности при лечении ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ.

- результаты стандартного цитогенетического исследования коррелируют с результатами молекулярно-генетических исследований, однако наиболее целесообразно использовать молекулярно-генетический метод для мониторинга эффективности терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ после достижения полного цитогенетического ответа.

- к факторам, потенцирующим развитие первичной резистентности к ингибиторам тирозинкиназ, относятся: появление на фоне терапии иматинибом клонов опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аберрациями в Ph-положительных клетках, амплификация гена BCR-ABL и мутации гена BCR-ABL.

Апробация работы

Основные результаты работы, составившие содержание диссертации, доложены и обсуждены на 2^nd European Cytogenetics Conference (Vienna, 1999); I Съездe терапевтов Юга России (Ростов-на-Дону, 2000); II и VI Всероссийском симпозиуме “Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний” (Москва, 2001; 2009); I и IV Всероссийском конгрессе “Cовременные технологии в педиатрии и детской хирургии” (Москва, 2002; 2005); IV международном научном симпозиуме “Developing Research for a Common Feature” (Ростов-на-Дону, 2006); Второй научной конференции “Актуальные проблемы генетики”, посвященной 115-летию Н.И.Вавилова (Москва, 2003); II и IV научно-практической конференции Южного Федерального округа с международным участием “Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты” (Ростов-на-Дону, 2004, Кисловодск, 2006); IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2004); Общероссийской открытой конференция “Вопросы организации диагностики и лечения больных, страдающих хроническим миелоидным лейкозом” (Москва, 2005); I, II и III Научно-практической конференции ЮФО “Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг” (Сочи, 2006; Ростов-на-Дону, 2007; Кисловодск, 2008); Научно-практической конференции “Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)” (Ростов-на-Дону, 2006); Всероссийской школе-семинаре “Актуальные проблемы цитогенетики” (Москва, 2007); XXXV и XXXVI Всероссийских гематологических декадниках “Новое в гематологии и клинической трансфузиологии” (Москва, 2008, 2009); Республиканской конференции “Актуальные вопросы гематологии” (Махачкала, 2008); XX International Congress of Genetics (Berlin, 2008); European Human Genetics Conference (Barcelona, 2008); II Сибирской конференции по гематологии “Баркагановские чтения” (Барнаул, 2009). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара МГНЦ РАМН 9 сентября 2009 года.

Внедрение в практику здравоохранения

Полученные данные используются при чтении лекций и проведения семинаров на курсе медицинской генетики ФПК и ППС, кафедре гематологии и трансфузиологии ФПК и ППС и кафедре внутренних болезней №2 ГОУ ВПО “Ростовский государственный медицинский университет Росздрава”, кафедре внутренних болезней ГОУ ВПО “Астраханская государственная медицинская академия Росздрава”. Результаты работы внедрены в работу лаборатории медицинской генетики и отделения гематологии клиники ГОУ ВПО РостГМУ Росздрава. Полученные результаты исследования легли в основу изданных 2 методических рекомендаций для врачей гематологов.

Личное участие диссертанта

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора, как на этапе постановки цели и задач, разработки методических подходов и их выполнения, так и при сборе первичных данных, проведении исследований, обработке, анализе и обобщении полученных результатов для написания и оформления рукописи.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 34 научные работы, из них 8 - в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук. Издано 2 методических рекомендаций для врачей.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа изложена на 220 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав с описанием методики и результатов исследования, заключения, выводов, библиографии (24 источника на русском и 181 на иностранном языках). Работа содержит 42 рисунка и 18 таблиц.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Проведено обследование 298 пациентов с клинически манифестированным хроническим миелолейкозом в хронической фазе или фазе акселерации. У всех 298 пациентов диагноз ХМЛ был подтвержден цитогенетическим методом (обнаружение транслокации t(9;22)(q34;q11.2) в клетках костного мозга) и/или молекулярно-цитогенетическим методом (обнаружение слитного гена BCR-ABL в клетках костного мозга). Все включенные в исследование пациенты с ХМЛ получали 6 или более месяцев терапию препаратом класса ингибиторов тирозинкиназ - иматинибом в дозе 400, 600 или 800 мг/сутки согласно рекомендациям Европейского общества по лечению лейкозов ELN (Baccarani M. c соавт., 2006). Обязательным условием включения больных ХМЛ в исследование являлось наличие информированного согласия пациентов на анонимное использование результатов выполненных анализов в научном исследовании.

У пациентов, включенных в исследование (n=298), медиана возраста на момент постановки диагноза составила 46,6 лет (минимальный возраст - 12,9 лет, максимальный - 77,4 года). Отношение мужчины/женщины - 137/161. В исследование включены пациенты, впервые начавшие получать терапию иматинибом как в хронической фазе (n=215; 72,1%), так и в фазе акселерации (n=83; 27,9%). Медиана длительности периода от момента постановки клинического диагноза до цитогенетического подтверждения диагноза ХМЛ составила 6 месяцев (минимальная длительность - 0,5 месяцев, максимальная - 60).

В обследованной группе больных ХМЛ до начала терапии иматинибом не получали какую-либо специфическую терапию 18 (6,0%) пациентов, 280 (94,0%) пациентов получали цитостатическую терапию гидроксикарбомидом, бусульфаном или интерфероном-б в сочетании с малыми дозами цитозара. Большая часть пациентов с ХМЛ получали терапию только гидроксикарбомидом (n=225, 75,5%). Медиана длительности терапии гидроксикарбомидом составила 7 месяцев, минимальная длительность - 1 месяц и максимальная - 108 месяцев. У 16 (5,4%) пациентов с ХМЛ помимо терапии гидроксикарбомидом были периоды терапии бусульфаном. Медиана длительности терапии бусульфаном у этих больных составила 37,5 месяцев, минимальная длительность - 1 месяц, максимальная - 108 месяцев. У 33 (11,1) пациентов с ХМЛ помимо терапии гидроксикарбомидом имела место терапия интерфероном-б с медианой длительности 13,5 месяцев (минимальное значение - 3 месяца, максимальное - 76). В 6 (2%) случаях пациенты получали терапию интерфероном-б в сочетании с малыми дозами цитозара. Медиана длительности терапии - 54 месяца (минимальное значение - 7 месяцев, максимальное - 108). Распределение пациентов по видам и длительности предшествующей иматинибу терапии представлено в таблице 1. мелоидный лейкоз цитогенетический

Таблица 1. Распределение пациентов по видам и длительности предшествующей терапии

Стандартные цитогенетические исследования клеток костного мозга.

С целью цитогенетической диагностики и мониторинга эффективности терапии пациентов с ХМЛ исследовали стернальный пунктат костного мозга. Общее количество диагностических и мониторинговых исследований для 298 пациентов составило 1190 анализов. Образцы костного мозга в объеме 1 мл помещали в пробирки с гепарином лития. Культивирование клеток костного мозга проводили в среде, содержащей 7 мл RPMI 1640 («Sigma») и 2 мл телячьей эмбриональной сыворотки («Sigma»). Колцемид (концентрация подбиралась эмпирически) добавляли за 2 часа до остановки культивирования. Культивирование осуществлялось в термостате в течение 2 и 24 часов при температуре 37⁰С. После гипотонизации и фиксации культуры клеток полученную клеточная суспензию раскапывали на подготовленные предметные стекла. Цитогенетические препараты окрашивали GТG дифференциальным методом. Кариотипирование проводили с помощью микроскопа Аксиоплан-2-мот («Сarl Zeiss») и программного обеспечения ikaros («Metasystems»). В каждом случае ХМЛ проанализировано не менее 20 метафазных пластинок клеток костного мозга. Результаты цитогенетических исследований приведены в работе в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой (Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J., 2009).

Молекулярно-цитогенетические исследования клеток костного мозга

Флуоресцентную in situ гибридизацию хромосом (FISH) с ДНК зондом к слитному гену BCR- ABL проводили в случаях отсутствия метафазных пластинок при стандартном цитогенетическом исследовании, а также в случае резистентности к терапии иматинибом. Всего выполнено 172 FISH анализа. В работе использован двухцветный ДНК зонд 22q11.2 LSI BCR SpectruGreen / 9q34 LSI ABL SpectrumOrange dual fusion DNA probe (Vysis, Abbott). FISH анализ проводили согласно протоколу производителя на цитогенетических препаратах содержащих как метафазные хромосомы, так и интерфазные ядра.

Препараты исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа «Axioplan-2-mot» с фильтром DAPI/Orange/Green (Vysis, Abbott). В каждом случае ХМЛ проанализировано не менее 200 интерфазных ядер клеток костного мозга. Результаты FISH исследований приведены в работе в соответствии с Международной цитогенетической номенклатурой (Shaffer L.G., Slovak M.L., Campbell L.J., 2009).

Молекулярно-генетические исследования методом ПЦР в реальном времени.

С целью количественной оценки экспрессии химерного гена BCR-ABL типа р210 на этапе постановки диагноза и в процессе мониторинга терапии ХМЛ проводили исследования методом ПЦР в режиме реального времени. Всего выполнено 1015 исследований. Забор периферической крови осуществляли в объеме не менее 5 мл в вакуумные пробирки («Vacuette») c этилендиаминтетрауксусной кислотой. Выделение РНК проводили не позже 24 часов с момента забора материала гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольным методом по Chomczynski P., Sacchi N. (1987). Для реакции обратной транскрипции использовали от 1 до 3 мкг выделенной тотальной РНК, случайные гексамерные праймеры и M-MLV обратную транскриптазу. ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили в термоциклере Rotor-Gene 6000 версии 1.7 («Corbett Life Science», Австралия). Для выделения РНК, постановки реакции обратной транскрипции и проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени использовали наборы реагентов ОНКОСКРИН 1-1-Q (ООО «ГеноТехнология»), разработанные с учетом рекомендаций протокола стандартизации «Европейской программы против рака» (Gabert J. с соавт., 2003; Мисюрин А.В. с соавт.,2007).

Определение интенсивности экспрессии химерного онкогена BCR-ABL типа р210 и контрольного гена ABL проводили согласно протоколу производителя. Для построения калибровочной кривой использовали трехкратные повторы десятикратных разведений положительных контрольных образцов, концентрации которых составляли 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ копий в 5 мкл раствора.

Относительную экспрессию химерного гена BCR-ABL определяли как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженное на 10⁶, как отношение среднего числа копий гена BCR-ABL к среднему числу копий гена ABL, умноженной на 100%, а также в виде десятичного логарифма снижения (?log) относительной экспрессии гена BCR-ABL по отношению к базовому уровню, рассчитанному как медиана экспрессии гена BCR-ABL у 30 больных с впервые выявленным хроническим миелоидным лейкозом до начала терапии иматинибом.

Определение нуклеотидной последовательности кДНК гена BCR-ABL.

С целью поиска мутаций гена BCR-ABL было проведено определение нуклеотидной последовательности методом секвенирования кДНК гена BCR-ABL. Анализ мутаций гена BCR-ABL был выполнен у 64 больных, входящих в группу резистентных к иматинибу пациентов. Амплификацию интересующего фрагмента гена BCR-ABL, кодирующего Р-петлю, С-домен, IB-домен, А-петлю, производили в два этапа в соответствии с рекомендациями Branford S. и Hughes T. (2006). На первом этапе амплифицировали участок гена BCR-ABL с помощью праймеров BCR F - 5'- tga cca act cgt gtg tga aac tc -3' и ABL R - 5'- tcc act tcg tct gag ata ctg gat t -3'. На втором этапе из полученного фрагмента BCR-ABL амлифицировали участок только киназного домена гена ABL с помощью праймеров к гену ABL: ABL F - 5'- cgc aac aag ccc act gtc t -3' и ABL R - 5'- tcc act tcg tct gag ata ctg gat t -3'. Реакцию амплификации проводили при следующих условиях: 95⁰С - 10 мин; 45 циклов: 95⁰С - 15 сек, 60⁰С - 20 сек, 72⁰С - 120 сек; 72⁰С - 5 мин.

Реакцию секвенирования полученного фрагмента гена ABL проводили с помощью набора GenomeLab^TMMethods Development Kit Dye Terminator Cycle Sequencing (“Beckman Coulter”, США) согласно протоколу производителя. Определение нуклеотидной последовательности проводили с помощью автоматического анализатора CEQ8000 (“Beckman Coulter”,США).

Измерение концентрации иматиниба в плазме крови и межклеточной жидкости костного мозга

С целью изучения влияния некоторых фармакокинетических параметров на достижение цитогенетического и молекулярного ответов при терапии иматинибом проводили определение концентрации иматиниба в плазме крови и межклеточной жидкости костного мозга методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с детекцией методом тандемной масс-спектрометрии. В работе определяли C_trough иматиниба - остаточную концентрацию препарата через 24 часа после последнего приема. Для измерения концентрации иматиниба использовали не более 200 мкл сыворотки крови и 100 мкл межклеточной жидкости костного мозга. Внутренний стандарт d8-STI 571 использовали в концентрации 1300 нг/мл. Для построения калибровочных графиков для каждой анализруемой партии использовали растворы иматиниба в плазме крови с концентрацией 10, 25, 100, 200, 500, 1000, 3000 и 5000 нг/мл. Для валидации метода готовились растворы иматиниба в плазме крови с концентрацией 500, 1000, 3000 нг/мл.

После депротеинизации образцы подвергались высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью хроматографа Agilent 1200 (Agilent Technologies) с колонкой XTerra RP18 100х2.1 мм (Waters). Мобильная фаза: ацетонитрил/водный буфер формиата аммония (70/30 об.%). Содержание аммония формиата 4 ммоль/л, рН = 3,2. Объем вводимой пробы для исследования - 5 мкл с последующей электроспрейной ионизацией.

Масс-спектометрия осуществлялась с помощью детектора Agilent 6140 Triple Quad LC/MS (Agilent Technologies) в режиме MRM 494,2 > 394,2 для иматиниба и 502,5 > 394,1 для внутреннего стандарта при следующих условиях: температура осушающего газа - 300єС, скорость потока газа - 6 л/мин, небулайзер - 18 psi, напряжение на капилляре - 3200 V, напряжение на фрагментаторе - 125 V, энергия соударения для иматиниба 30 V и 32 V для внутреннего стандарта, время удерживания (сканирования) - 500 миллисекунд для иматиниба и 200 миллисекунд для внутреннего стандарта.

Статистическая обработка данных. Процедура статистической обработки полученных данных проводилась на персональном компьютере типа IBM PC/AT с использованием пакета прикладных программ Statistica 6,0 и электронных таблиц Exсel 2003. Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой (2002) по обработке численных результатов экспериментов в медицине.

Исследования проводились в период с 1999 по 2009 год в лаборатории медицинской генетики клиники Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию”.

Результаты собственных исследований

Цитогенетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза

В нашем исследовании выявлена высокая эффективность стандартного цитогенетического исследования (СЦИ) кариотипа костного мозга на этапе цитогенетической диагностики ХМЛ: при выполнении диагностического СЦИ Ph-хромосома была обнаружена у 274 (91,9%) пациентов. У 24 больных ХМЛ (8,1%) в случаях неудовлетворительного качества метафазных пластинок или в случаях отсутствия митотически делящихся клеток в костном мозге диагноз ХМЛ был подтвержден методом FISH с двухцветным ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL. Поскольку предшествующая терапия может оказывать влияние на пролиферативную активность клеток костного мозга, было проанализировано возможное влияние предшествующей иматинибу терапии на отсутствие митотически делящихся миелокариоцитов в 24 выявленных случаях ХМЛ. Среди 24 больных ХМЛ этой группы пациентов 20 (83,3%) получали предшествующую иматинибу терапию гидроксикарбомидом, 1 (4,2%) - интерфероном-б, 3 (12,5%) - не получали предшествующей терапии вообще. Таким образом, наиболее часто пациенты получали предшествующую терапию гидроксикарбомидом. В нашем исследовании не обнаружено статистически значимой корреляционной связи между фактом предшествующей иматинибу терапии и отсутствием митотически делящихся миелокариоцитов при СЦИ (r=0,131). Также не было выявлено корреляционной связи между длительностью периода от установления клинического диагноза до проведения цитогенетического исследования с одной стороны и эффективностью цитогенетического исследования с другой стороны (r=0,0321). Таким образом, в нашем исследовании не обнаружено статистически значимой связи между фактом предшествующей иматинибу терапии, а также длительностью заболевания и эффективностью цитогенетического исследования.

При цитогенетическом и FISH исследованиях количество Ph- или BCR-ABL-позитивных клеток в костном мозге варьировало от 0 до 100%, поскольку в результате предшествующей иматинибу терапии интерфероном-б некоторые пациенты достигали частичного, большого и даже полного цитогенетического ответа. У 33 (11,1%) пациентов, получавших терапию интерфероном-б, количество Ph-положительных клеток варьировало от 0 до 100% при цитогенетическом исследовании, а BCR-ABL-позитивных клеток - от 3% до 90% при FISH исследовании. У пациентов, получавших другие виды терапии или не получавших ее вообще (n=265 , 88,9%), количество Ph-положительных клеток варьировало от 85% до 100% при цитогенетическом исследовании, а BCR-ABL-позитивных клеток - от 76% до 100% при FISH исследовании.

Цитогенетические исследования на этапе диагностики позволили выявить клоны опухолевых клеток с вариантными транслокациями t(V;9;22), формирующимися при участии трех хромосом, в 2 (0,7%) случаях и дополнительные хромосомные аберрации (ДХА) в Ph-позитивных клетках у 8 (2,7%) пациентов до начала терапии иматинибом (таблица 2).

Таблица 2. Кариотипы костного мозга у впервые выявленных больных ХМЛ с вариантными транслокациями t(V,9,22) и дополнительными хромосомными аномалиями в Ph-позитивных клетках до начала терапии иматинибом.

Предшествующая иматинибу терапия гидроксикарбомидом, бусульфаном и интерфероном-б, а также длительность периода от клинической диагностики до цитогенетического подтверждения ХМЛ по нашим данным не влияют на формирование вариантных форм транслокаций t(V;9;22) и ДХА в Ph-позитивных клетках.

Появление клонов опухолевых клеток с вариантными формами транслокации t(V;9;22) и дополнительными хромосомными аномалиями в Ph-позитивных клетках, выявляемых на этапе диагностического цитогенетического исследования, по некоторым данным литературы могут являться причиной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ. Проведенное нами исследование показало, что в группе пациентов с такими хромосомными аномалиями, выявленными до начала терапии иматинибом, вероятность достижения большого ЦГО на терапию иматинибом практически не отличается от таковой в группе пациентов без цитогенетических особенностей на этапе диагностики (p=0,71179). Также не обнаружено влияния вариантных транслокаций и ДХА в Ph-позитивных клетках, выявленных до начала терапии иматинибом, на достижение полного ЦГО на терапию иматинибом (p=0,25646).

Таким образом, достижение большого и полного ЦГО не зависит от наличия клонов клеток с вариантными транслокациями и дополнительными хромосомными аномалиями в Ph-позитивных клетках костного мозга, выявленных до начала терапии иматинибом. Наиболее вероятно, что до начала терапии иматинибом повышенная активность BCR-ABL тирозинкиназы приводит к генетической нестабильности, в результате которой возможно образование клонов с дополнительными хромосомными аномалиями. Однако, под действием иматиниба Ph-позитивные клетки с дополнительными хромосомными аномалиями элиминируются так же, как и клоны клеток, имеющие только Ph-хромосому.

Исследование стандартным цитогенетическим и молекулярно-цитогенетическим методами клеток костного мозга в процессе терапии иматинибом позволяют в полной мере оценить редукцию опухолевого клона клеток, преимущественно - в течение первых 12 месяцев терапии. В нашем исследовании при медиане длительности терапии иматинибом 24 месяца (минимальное значение - 6 месяцев, максимальное - 84) среди 298 обследованных пациентов с ХМЛ, получавших терапию иматинибом 6 или более месяцев, у 197 (66,1%) больных был достигнут большой ЦГО, когда при цитогенетическом исследовании костного мозга Ph-положительные клетки составляют менее 35% миелокариоцитов (рис.1). Из них в срок после 6 месяцев терапии иматинибом большой ЦГО был достигнут у 135 (45,3 %) пациентов. У остальных 62 (20,8%) больных БЦГО был достигнут в сроки 12 - 72 месяца. Однако, у 101 больного ХМЛ (33,9%) большой ЦГО не был достигнут на терапии иматинибом вообще.

Полный ЦГО на терапию иматинибом, когда Ph-положительные клетки в костном мозге не обнаруживаются цитогенетическим методом, был достигнут у 157 (59,7%) больных ХМЛ из 263 пациентов, получавших терапию иматинибом 12 или более месяцев (рис.1). Из них в срок после 12 месяцев терапии иматнибом полный ЦГО был достигнут у 119 больных (45,2%). У остальных 38 больных (14,5 %) полный ЦГО был достигнут в сроки 18 - 72 месяца и у 106 (40,3 %) пациентов полный ЦГО на терапию иматинибом не был достигнут вообще.

Рис. 1. Структура цитогенетического ответа на терапию иматинибом у пациентов с ХМЛ, находившихся на терапии 6 и более месяцев (А), 12 и более месяцев (Б).

Редукция клона Ph-позитивных опухолевых клеток в ответ на терапию иматинибом является, несомненно, мультифакториальным процессом, зависящим от многих факторов. Особенный интерес вызывает рефрактерность к иматинибу пациентов, которая обусловлена, вероятно, разными механизмами развития первичной резистентности, в частности - генетическими. Изучение этих механизмов имеет огромное клиническое значение, поскольку может привести к выявлению прогностических факторов, позволяющих предвидеть благоприятный исход или прогрессию заболевания. Более того, выяснение причин рефрактерности может помочь оптимизировать терапию ХМЛ - повысить дозу иматиниба, перейти на терапию ингибиторами тирозинкиназ (ИТК) второго поколения, принять решение о трансплантации костного мозга.

Однако, отсутствие цитогенетического ответа может быть ассоциировано с различными факторами. В нашем исследовании проведен поиск возможных корреляционных связей некоторых демографических показателей (возраст, пол пациентов), продолжительности периода от установления диагноза до начала терапии иматинибом, режима терапии ХМЛ (предшествующей иматинибу цитостатической терапии, перерывов в терапии иматинибом) с достижением цитогенетического ответа на терапию иматинибом.

Хронический миелолейкоз развивается преимущественно у людей среднего возраста. В нашем исследовании медиана возраста также составила 46,6 лет. Тем не менее, отмечены возрастные колебания на момент установления диагноза ХМЛ от минимального 12,9 лет до максимального 77,4 года, которые возможно влияют на достижения большого и полного ЦГО при терапии иматинибом. Однако, проведенный корреляционный анализ не выявил связи между возрастом пациентов и достижением БЦГО (r=0.027, p=0.74) и ПЦГО (r=-0.056 p=0.49).

В группе обследованных пациентов отмечены заметные гендерные различия - среди впервые выявленных пациентов с ХМЛ было 137 мужчин и 161 женщина. Однако, проведенный корреляционный анализ также не обнаружил связи между достижением БЦГО и ПЦГО с одной стороны и полом пациента с другой стороны (для БЦГО - р.=0,66223 и для ПЦГО -p=0,63613).

По некоторым данным литературы, редукция опухолевых клеток, выявляемая цитогенетическим методом, зависит от длительности периода до начала терапии иматинибом. В связи с этим нами проведен корреляционный анализ зависимости времени достижения БЦГО и ПЦГО от длительности периода между постановкой клинического диагноза ХМЛ и началом терапии иматинибом. Из обследованной когорты пациентов с ХМЛ (n=298) только 2 (0,7%) пациента получили терапию ингибитором тирозинкиназ - иматинибом в течение 1 месяца после установления диагноза. У 296 (99,3 %) больных медиана длительности периода до начала терапии иматинибом составила 8 месяцев, минимальная длительность - 1 месяц и максимальная - 120 месяцев. Однако, корреляционный анализ не обнаружил зависимости достижения БЦГО (r=0,1376, p= 0,0931) и ПЦГО (r=0,0507, p=0,5376) от длительности периода до начала терапии иматинибом.

Поскольку пациенты получали различную предшествующую иматинибу терапию, также была исследована возможная корреляционная связь между временем достижения БЦГО, ПЦГО на фоне терапии иматинибом и предшествующей терапией гидроксикарбомидом, бусульфаном и интерферона-б. В результате статистического анализа связи достижения БЦГО и предшествующей терапией гидроксикарбомидом выявлена слабая корреляционная связь (r=0,2149, p=0,0083). Однако, между достижением ПЦГО и предшествующей терапией гидроксикарбомидом корреляционной связи не выявлено (r=0,0918, p=0,2637). Данный факт легко объясняется тем обстоятельством, что достижение БЦГО является наименее “жестким” показателем эффективности терапии иматинибом с позиций статистического анализа. Также не обнаружено корреляционной связи между временем достижения БЦГО, ПЦГО и предшествующей иматинибу терапией бусульфаном (r=0,0992, p=0,2269 для БЦГО; r=0,1182, p=0,1496 для ПЦГО) и интерфероном-б (r=-0,1057, p=0,1981 для БЦГО; r=-0,1147, p=0,1621 для ПЦГО).

В нашем исследовании было изучено влияние на вероятность достижения БЦГО и ПЦГО перерывов в терапии иматинибом, вызванных токсичностью препарата и необоснованным нарушением режима приема препарата. При медиане длительности терапии иматинибом в изученной когорте пациентов с ХМЛ 24 месяца у 95 (31,9%) пациентов выявлены от 1 до 6 эпизодов перерывов в терапии иматинибом. Медиана длительности перерывов в терапии составила 60 дней (минимальное значение - 5 дней, максимальное - 427 дней). С целью проверки гипотезы о влиянии перерывов были изучены различия вероятности достижения БЦГО и ПЦГО у пациентов с перерывами более 30 дней (половина медианы) и без перерывов. В результате проведенного исследования было обнаружено статистически достоверное снижение вероятности достижения БЦГО и ПЦГО у пациентов с перерывами в терапии иматинибом (БЦГО - p = 0,00246 и ПЦГО - p = 0,00013) (рис. 2). Особенно заметно влияние перерывов в течение первого года терапии. Так, у пациентов с перерывами в терапии более 30 дней вероятность достижения БЦГО и ПЦГО после 6 и 12 месяцев терапии в 2 раза меньше, чем у пациентов без перерывов.

Таким образом, проведенный корреляционный анализ не выявил статистически достоверной связи между возрастом, полом пациентов, длительностью периода от момента постановки клинического диагноза до начала терапии иматинибом, предшествующей терапии препаратами гидроксикарбомида, бусульфана и интерферона, длительностью терапии иматинибом с одной стороны и достижением цитогенетического ответа с другой стороны. Однако, была обнаружена статистически достоверная зависимость достижения цитогенетического ответа от непрерывности терапии иматинибом. Перерывы терапии иматинибом более 30 дней при медиане длительности терапии 24 месяца приводят к снижению в 2 раза вероятности редукции опухолевого клона до полного цитогенетического ответа.

Рис. 2. Вероятность достижения полного ЦГО у больных ХМЛ в зависимости от перерывов терапии иматинибом.

Исследование стандартным цитогенетическим методом клеток костного мозга в процессе терапии иматинибом позволяет оценить не только редукцию опухолевого клона клеток, но и выявить признаки клональной цитогенетической эволюции - дополнительные хромосомные аномалии (ДХА) в Ph-позитивных клетках. Появление ДХА в Ph-позитивных клетках на фоне терапии иматинибом означает появление новых клонов опухолевых клеток с дополнительными, помимо t(9;22)(q34;q11.2), хромосомными аберрациями.

В результате проведенного исследования клоны опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аномалиями в Ph-позитивных клетках костного мозга были обнаружены у 33 пациентов с ХМЛ (11%) из 298 больных, включенных в исследование. Медиана возраста в группе больных ХМЛ с ДХА составила 48,8 лет (минимальный возраст - 18,9 лет, максимальный - 72,1 года). Отношение мужчины/женщины - 12/6. К началу терапии иматинибом 18 пациентов (54,5%) были в хронической фазе ХМЛ, 15 пациентов (45,5%) - в фазе акселерации. Медиана длительности терапии иматинибом составила 18 месяцев (минимальное значение - 6 месяцев, максимальное - 60). В группе пациентов c ХМЛ без ДХА (n=265, 89,0%) медиана возраста составила 46,3 года (минимальный возраст - 12,9 лет, максимальный - 77,4 года). Отношение мужчины/женщины - 119/146. К началу терапии иматинибом в хронической фазе были 197 пациентов (74,3%) и в фазе акселерации 67 пациентов (25,7%). Медиана длительности терапии иматинибом составила 24 месяца (минимальное значение - 6 месяцев, максимальное - 84).

У 15 пациентов ДХА были обнаружены при стандартном цитогенетическом исследовании (таблица 3). Наиболее частой хромосомной аберрацией, выявляемой в Ph-положительных клетках костного мозга, явилась дополнительная Ph-хромосома +der(22)(9;22). Еще у 18 больных ДХА - дупликация Ph-хромосомы определялась только методом интерфазной флуоресцентной гибридизации хромосом in situ (FISH) в виде амплификации (удвоения) гена BCR-ABL (таблица 4). Таким образом, дупликация Ph-хромосомы цитогенетическим или FISH методом была выявлена в 27 случаях (81,8%) из 33. Количество клеток с дополнительной Ph-хромосомой при цитогенетическом исследовании варьировало от 10% до 50%. Количество клеток с амплификацией гена BCR-ABL среди BCR-ABL-позитивных клеток при FISH исследовании варьировало от 3 % до 72%.

Таблица 3. Кариотипы костного мозга больных ХМЛ с дополнительными хромосомными аномалиями в Ph-позитивных клетках.

Таблица 4. Результаты FISH исследований костного мозга больных ХМЛ с дупликацией гена BCR-ABL.

Среди 33 больных ХМЛ, у которых контрольные мониторинговые СЦИ или FISH анализ выявили в костном мозге клоны Ph-позитивных опухолевых клеток с дополнительными хромосомными аномалиями и амплификацией гена BCR-ABL, появившимися на фоне терапии иматинибом, большой ЦГО был достигнут только у 11 пациентов (33,3%) и не достигнут у 22 пациентов (66,7%). В соответствии с критериями Европейского общества по лечению лейкозов (ELN) к 6 месяцу терапии БЦГО был достигнут у 21% пациентов с ДХА, а к 12-му месяцу - только у 28% (рис.2), что более чем в 2 раза меньше по сравнению с группой пациентов без ДХА. Среди 265 пациентов с ХМЛ, в Ph-позитивных клетках костного мозга которых ДХА не определялись, большой цитогенетический ответ (БЦГО - Ph-положительных клеток в костном мозге менее 35%) на терапии иматинибом был достигнут у 186 больных (70,2%) и не достигнут у 79 пациентов (29,8%). В этой группе больных ХМЛ к 6 месяцу терапии иматинибом БЦГО был достигнут у 48% пациентов, а к 12 месяцу - у 60% больных. Анализ вероятности достижения БЦГО на терапию иматинибом показал, что у пациентов, не имеющих ДХА, она составляет 83%, тогда как у пациентов с ДХА - всего лишь 40% (р=0,00001) (рис.3).

Рис. 3. Вероятность достижения большого цитогенетического ответа (БЦГО) у больных ХМЛ в зависимости от наличия клонов Ph-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями (ДХА)(n=33).

Также было выявлено, что среди 33 пациентов с ДХА полный ЦГО был достигнут только 6 больных (18,2%) и не достигнут у 27 (81,2%) пациентов. К 12 месяцу терапии ПЦГО наблюдался всего лишь у 13% пациентов, а к 18 месяцу у 18% больных. Для сравнения, полный цитогенетический ответ на терапию иматинибом был достигнут у больных ХМЛ без ДХА в Ph-позитивных клетках костного мозга в 151 случае (57,0%) и не достигнут в у 114 больных (43,0%). К 12 месяцу терапии ПЦГО был достигнут в 45% случаев, а к 18 месяцу - 52% больных ХМЛ в этой группе. Вероятность достижения ПЦГО у пациентов без ДХА составила 70% , а у пациентов с ДХА - 27% (рис.4). Выявленные различия статистически высоко значимы (p=0,00002).

Рис.4. Вероятность достижения ПЦГО у больных ХМЛ в зависимости от наличия клонов Ph-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями (ДХА)(n=33).

Вероятность пятилетней общей выживаемости по Каплану-Майеру среди пациентов, у которых не обнаружены ДХА в Ph-позитивных клетках костного мозга, составила 97%. У пациентов с ДХА расчетная пятилетняя общая выживаемость выявлена на уровне 74% (рис. 5). Различия расчетной выживаемости в этих двух группах пациентов статистически достоверны и высоко значимы (p=0,00002).

Рис.5. Вероятность 5-летней общей выживаемости по Каплану-Майеру у 298 пациентов с ХМЛ в зависимости от появления ДХА в Ph-позитивных клетках костного мозга на фоне терапии иматинибом. Сплошная линия - пациенты без ДХА (n=265), пунктирная линия - пациенты с ДХА (n=33).

Таким образом, в результате проведенного исследования Ph-позитивные клоны клеток с ДХА в костном мозге были обнаружены у 33 пациентов с ХМЛ (11%) из 298 больных, включенных в исследование. Наиболее частой ДХА явилась дополнительная Ph-хромосома +der(22)(9;22), выявленная как стандартным цитогенетическим методом исследования, так и методом FISH в виде амплификации гена BCR-ABL. Анализ вероятности достижения БЦГО на терапию иматинибом показал, что у пациентов c ДХА вероятность достижения БЦГО в 2,1 раза меньше, чем у пациентов без ДХА, а вероятность достижения ПЦГО - в 2,6 раза меньше, чем у пациентов без ДХА. Более того, вероятность 5-летней общей выживаемости по Каплану-Майеру у пациентов c ДХА, появившимися на фоне терапии иматинибом, достоверно ниже, чем у пациентов без ДХА. Наиболее вероятно, что Ph-позитивные клетки с ДХА, обнаруженные на фоне терапии иматинибом, появляются в результате повышенной активности BCR-ABL тирозинкиназы. Эти клетки могли существовать до начала терапии иматинибом в виде низкоуровневых клонов, не выявлявшихся цитогенетическим методом. При терапии иматинибом низкоуровневые клоны с ДХА, обладающие резистентностью к иматинибу, могут получать преимущества в выживании и количество Ph-клеток с ДХА увеличивается. Также клоны Ph-позитивных опухолевых клеток с ДХА могут появляться и de novo в процессе терапии иматинибом в связи с недостаточным подавлением активности BCR-ABL тирозинкиназы.