Генетический мониторинг таргетной терапии хронического миелоидного лейкоза

Молекулярно-генетический мониторинг терапии хронического миелолейкоза.

Молекулярно-генетическое исследование методом ПЦР в режиме реального времени было выполнено от 1 до 5 раз у 287 пациентов с ХМЛ из 298 включенных в исследование.

Наибольший интерес представляет оценка минимальной остаточной болезни методом количественной ПЦР в реальном времени в группе пациентов с ПЦГО (n=138). Среди пациентов с полным цитогенетическим ответом медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 0 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL. Диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в этой группе пациентов составил от 0 до 9753 копий гена BCR-ABL х10⁶/копий ABL.

Среди этой группы больных ХМЛ, достигших ПЦГО, в 75 (54,3%) случаях выявлен полный молекулярный ответ (0 копий гена BCR-ABL х10⁶/копий ABL). У 63 (45,7%) больных ХМЛ с ПЦГО был обнаружен остаточный опухолевый клон клеток. В группе пациентов с признаками минимальной остаточной болезни медиана уровня экспрессии гена BCR-ABL, минимальное и максимальное значение экспрессии та же, что и в общей группе пациентов с ПЦГО.

В группе пациентов с частичным цитогенетическим ответом (ЧЦГО, n=44), у которых Ph-хромосома выявлялась в 1%-35% клеток костного мозга, медиана экспрессии гена BCR-ABL была уже выше и составила 8266 копий гена BCR-ABLх10⁶/копий ABL, максимальное значение - 67299 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL, минимальное - 1006 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL.

У пациентов с малым (n=17) и минимальным (n=35) цитогенетическими ответами (36-65% и 66-95% Ph-позитивных клеток в костном мозге соотвественно) медиана экспрессии гена BCR-ABL практически не отличалась (36833 и 39215 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL). Диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL у пациентов с малым цитогенетическим ответом колебался от 9208 до 297222, у больных ХМЛ с минимальным цитогенетическим ответом -от 2224 до 537923 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL.

У пациентов c ХМЛ (n=53) без цитогенетического ответа на терапию иматинибом (Ph-хромосома обнаружена в >95% клеток костного мозга) медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 74457 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL, максимальное значение - 797101 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL, а минимальное - 2943 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL (табл. 5).

Таблица 5. Уровень экспрессии гена BCR-ABL в группах больных ХМЛ с различными вариантами цитогенетического ответа на терапию иматинибом

С целью стандартизации и сопоставимости результатов исследования экспрессии гена BCR-ABL, полученных методом количественной ПЦР в реальном времени, экспрессия гена BCR-ABL оценивалась также как отношение экспрессии гена BCR-ABL к экспрессии контрольного гена (в нашем случае это ген ABL), умноженной на 100%. Обнаружение гена BCR-ABL на уровне 1% и более свидетельствует о выраженной экспрессии, оценить которую еще возможно с помощью стандартного цитогенетического исследования. Уровень экспрессии гена BCR-ABL 0,1-1% свидетельствует об умеренном уровне экспрессии, который уже невозможно оценить с помощью стандартного цитогенетического исследования. Определение экспрессии гена BCR-ABL на уровне 0,1% и менее говорит о наличии у пациента большого молекулярного ответа.

В группе пациентов с ПЦГО медиана экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови составила 0%, максимальное значение экспрессии гена - 0,97%, а минимальное значение составило 0%. В группе пациентов, достигших ЧЦГО, медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 6,7%, максимальное значение экспрессии - 6,7%, а минимальное - 0,1%. У больных с малым и минимальными цитогенетическими ответами медиана экспрессии гена BCR-ABL составила 3,5% и 3,9%, максимальное значение - 29% и 53%, а минимальное значение - 0,9% и 0,2%, соответственно (табл. 5).

Таким образом, у всех пациентов с ПЦГО (n=138), когда Ph-хромосома не обнаруживается стандартным цитогенетическим методом, экспрессия гена BCR-ABL не превышала 1%. Поэтому использование в рутинной практике результатов количественной ПЦР для мониторинга терапии ХМЛ у пациентов с ПЦГО бесспорно. Однако, в случаях ЧЦГО уровень экспрессии гена BCR-ABL колебался от 0,1% до 6,7%, что затрудняет использование результатов молекулярно-генетического исследования для оценки ответа на проводимую терапию у пациентов с ЧЦГО. У пациентов с малым и минимальным цитогентическими ответами уровень экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови практически не различался. Важно, что в некоторых случаях минимального цитогенетического ответа, когда Ph-хромосома обнаруживается в костном мозге в 66-95% клеток, уровень экспрессии гена BCR-ABL был на уровне от 0,2% до 53%. В случаях отсутствия цитогенетического ответа отмечена максимальная экспрессия, но колебания ее значений очень высоки ( 0,3 - 79%).

Исследование динамики изменений экспрессии гена BCR-ABL в процессе терапии ХМЛ позволяет оценить редукцию клона лейкозных клеток. В связи с тем, что оценить изначальную экспрессию гена BCR-ABL у каждого больного не представлялось возможным, в исследовании использован методический подход, основанный на определении медианы базового уровня (БУ) экспрессии у 30 впревые выявленных больных ХМЛ до начала терапии иматинибом. Дальнейшая оценка динамики изменений экспрессии гена BCR-ABL, а следовательно и редукции количества опухолевых клеток, у каждого пациента ХМЛ, получавшего терапию иматинибом, основывалась на сравнении с БУ. При этом результаты исследований выражали в виде десятичного логарифма снижения экспрессии (?log) по отношению к базовому уровню. Снижение экспрессии на 1 log по отношению к базовому уровню означало снижение уровня экспрессии BCR-ABL транскрипта в 10 раз, на 2 log - в 100 раз, на 3 log - в 1000 раз, на 4 log - в 10000 раз.

Экспрессия гена BCR-ABL была определена у 30 больных с впервые диагностированным хроническим миелоидным лейкозом до начала терапии. Диапазон значений экспрессии у этих больных составил от 9118 до 501189 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL. Медиана экспрессии гена BCR-ABL у этих больных с впервые выявленным ХМЛ составила 94211 копий BCR-ABLх10⁶/копий ABL или 4,97 log. Это значение было принято за величину базового уровня (БУ).

Медиана снижения уровня экспрессии гена BCR-ABL (?log) относительно БУ экспрессии в случае полного цитогенетического ответа составила 4,97 log. Максимальное снижение составило, естественно, 4,97 log, а минимальное - 0,1 log. В случаях достижения БЦГО медиана снижения экспрессии была на уровне 1,03 log. При этом диапазон значений колебался в пределах 0,14-1,97 log. Медианы снижения экспрессии при малом и минимальном цитогенетическом ответах составили 0,49 и 0,38 соответственно, максимальный ?log: 1,34 и 1,62 соответственно, минимальный ?log: -0,5 и -0,76 соответственно. В случаях выявления Ph-хромосомы в 95-100 % клеток костного мозга (отсутствие цитогенетического ответа на проводимую терапию) медиана снижения относительно БУ составила всего лишь 0,1 log, минимальное значение - -0,93, максимальное - 2,24.

Несомненно, изменение уровня экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня, отражающее динамику редукции опухолевого клона, имеет клиническое значение. При сопоставлении процента Ph-положительных клеток в костном мозге и уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови обнаружен широкий диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в различных группах.

В связи с этим был проведен корреляционный анализ достигнутого пациентами цитогенетического ответа и результатов молекулярно-генетического исследования, выраженного в количестве копий гена BCR-ABLх10⁶/копий ABL, в процентах относительно уровня экспрессии контрольного гена ABL (%) и в виде десятичного логарифма снижения экспрессии (?log) по отношению к базовому уровню.

Проведенный анализ показал, что все показатели коррелируют между собой. Естественно, что абсолютно коррелируют между собой результаты исследования методом ПЦР в режиме реального времени, выраженные в количестве копий гена BCR-ABLх10⁶ по отношению к количеству копий гена ABL и в процентном отношении к гену ABL (r=1,000). Преимущества последнего способа выражения обусловлены возможностью четкого определения большого молекулярного ответа, при котором экспрессия гена BCR-ABL определяется на уровне 0,1% и меньше. Связь же этих показателей с результатами ПЦР, выраженными как десятичный логарифм снижения экспрессии (?log) по отношению к базовому уровню умеренной силы (r=-0,474 и r=-0,475).

В нашем исследовании установлена умеренная корреляционная связь между результатами цитогенетического исследования (% Ph-положительных клеток в костном мозге) и уровнем экспрессии гена BCR-ABL в клетках крови, что позволяет использовать молекулярно-генетический метод для мониторинга эффективности терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Корреляционная связь между цитогенетическим ответом и уровнем экспрессии гена BCR-ABL, выраженным в процентах и количестве копий гена BCR-ABLх10⁶ по отношению к гену ABL, умеренной силы и r составляет 0,5000. Максимальная сила корреляционной связи установлена между результатом цитогенетического анализа и количественных ПЦР исследований, когда результаты последних оценивались в виде десятичного логарифма снижения экспрессии (?log) по отношению к БУ (r=-0,687). Корреляционная связь отрицательная, поскольку чем больше экспрессия гена BCR-ABL в клетках крови (а следовательно, больше Ph-позитивных опухолевых клеток), тем меньше ?log снижения экспрессии гена BCR-ABL относительно БУ.

Сравнение анализируемых групп с различными вариантами цитогенетического ответа в зависимости от определенной медианы уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови, выраженное в копиях BCR-ABLх10⁶ /ABL, процентном отношении к контрольному гену ABL и ?log снижения экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня, статистически достоверны только при сравнении группы пациентов с ПЦГО и группы больных ХМЛ, не ответивших на терапию иматинибом (р>0,05).

Таким образом, полученные результаты исследования экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови свидетельствуют о целесообразности использования метода количественной ПЦР для диагностики и мониторинга эффективности терапии ингибиторами тирозинкиназ пациентов с ХМЛ. Наиболее информативна оценка минимальной остаточной болезни (количества BCR-ABL позитивных клеток крови) в виде десятичного логарифма снижения экспрессии гена BCR-ABL (?log) по отношению к базовому уровню его экспрессии. Наиболее целесообразно проводить молекулярно-генетические исследования после достижения ПЦГО, когда стандартное цитогенетическое исследование оказывается неинформативным и только молекулярно-генетическое исследование позволяет оценить степень редукции опухолевого клона. Достижение большого молекулярного ответа, определяемого как экспрессия гена BCR-ABL на уровне менее 0,1% или редукция экспрессии более чем на 3 log, является наиболее важным критерием молекулярного ответа на терапию ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ.

В связи с тем, что наиболее информативны и клинически значимы данные о снижении экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня, структура молекулярного ответа в анализируемых цитогенетических группах исследована в соответствии с уровнем ?log снижения экспрессии гена BCR-ABL. При анализе структуры молекулярного ответа (рис.6) было установлено, что в группе пациентов с полным ЦГО (n=138) у 84 (60,9%) больных выявлено снижение экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log по сравнению с базовым уровнем, в 15 (10,9%) случаях - на 2-2,99 log, в 36(26,10%) случаях - на 1-1,99 log. У 3 (2,1%) больных ХМЛ с полным ЦГО снижение экспрессии гена BCR-ABL оказалось на уровне менее чем 1 log. Таким образом, большой молекулярный ответ (БМО) выявлен более чем у половины больных ХМЛ с полным ЦГО, получавших терапию иматинибом. У большинства больных с полным ЦГО (71,8%) было отмечено снижение экспрессии BCR-ABL более чем на 2 log по сравнению с базовым уровнем.

Рис. 6. Структура молекулярного ответа у пациентов с полным цитогенетическим ответом (ПЦГО), частичным цитогенетическим ответом (ЧЦГО), малым цитогенетическим ответом (МЦГО), минимальным цитогенетическим ответом (МинЦГО) и отсутствием цитогенетического ответа (95-100% Ph-позитивных клеток))

В группе обследованных с помощью метода количественной ПЦР пациентов с ХМЛ (n=44) с частичным ЦГО редукция экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log не отмечена. В 3 (6,8%) случаях отмечено снижение экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови на 2-2,99 log по сравнению с БУ, в 19 (43,2%) случаях - на 1-1,99 log, в 22 случаях (50,0%) случаев - менее чем на 1 log.

В группе больных ХМЛ с малым и минимальным цитогенетическим ответом, а также в группе не ответивших на терапию иматинибом (Ph-хромосома обнаруживалась более чем в 95% клеток костного мозга) в большинстве случаев выявлено снижение экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови менее чем на 1 log по сравнению с базовым уровнем. Только у 4 пациентов, не ответивших на терапию иматинибом, отмечена заметная редукция экспрессии гена BCR-ABL на 1-1,99 log.

Несмотря на значительный диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL клетках периферической крови, были отмечены достоверные различия в значениях снижения экспрессии гена BCR-ABL между группами пациентов с отсутствием ответа на терапию иматинибом, малым, минимальным и частичным цитогенетическими ответами с одной стороны и группой с полным цитогенетическим ответом (p=0,0357) с другой стороны. Между группами с ЧЦГО, МЦГО, МинЦГО и отсутствием цитогенетического ответа статистически достоверных различий уровня снижения экспрессии гена BCR-ABL не обнаружено.

В нашем исследовании у 70 пациентов с хроническим миелоидным лейкозом было проведено динамическое наблюдение за минимальной остаточной болезнью методом количественной ПЦР в реальном времени. Повторное молекулярно-генетическое исследование экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови проводилось в среднем через 6 месяцев (минимальный интервал повторного исследования 3 месяца, максимальный 12 месяцев). У 38 пациентов наблюдалось снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови: медиана снижения экспрессии гена относительно предыдущего результата составила 2,2 log, максимальное снижение составило - 5,8 log, а минимальное - 0,2 log.

В группе пациентов, у которых наблюдалось снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL в 42% случаев редукция экспрессии гена составила более чем 3 lоg относительно предыдущего результата, в 19% случаев - на 2-2,99 lоg, в 13% случаев - на 1-1,99 lоg, в 26% случаев - менее чем на 1 lоg. Таким образом, у большинства пациентов с положительной динамикой ответа при терапии иматинибом (61%) было отмечено снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL более чем на 2 lоg относительно предыдущего результата.

У 10 пациентов наблюдалось повышение уровня экспрессии гена BCR-ABL: медиана повышения экспрессии гена BCR-ABL относительно предыдущего результата составила - -1,38 lоg, максимальное повышение - -3,1 lоg, а минимальное - -0,42 lоg. В этой группе пациентов повышение экспрессии гена BCR-ABL более чем на 3 log относительно предыдущего результата наблюдалось в 18% случаев, в 9% случаев - на 2-2,99 log, в 45% случаев - на 1-1,99 log, в 18% случаев - менее чем на 1 log. Таким образом, у большинства пациентов (82%) с отрицательной динамикой ответа на терапию иматинибом было отмечено повышение уровня экспрессии гена BCR-ABL более чем на 1 log относительно предыдущего результата.

Достижение большого молекулярного ответа (БМО) у пациентов с полным ЦГО, характеризующегося уровнем экспрессии гена BCR-ABL менее 0,1% или редукцией экспрессии на 3 log или более относительно БУ, является важнейшим критерием эффективности терапии ХМЛ. В соответствии с рекомендациями Европейского общества по лечению лейкозов (ELN) БМО должен быть достигнут при терапии иматинибом после 18 месяцев лечения. В нашем исследовании БМО достигли 84 (53,2%) пациента с ХМЛ из 158, достигших ПЦГО. Медиана времени достижения БМО составила 18 месяцев, а диапазон времени достижения БМО колебался от 6 до 72 месяцев.

В нашем исследовании было проверено влияние на вероятность достижения БМО различных факторов, в частности тех, которые оказывают влияние на достижение цитогенетического ответа: дополнительных хромосомных аномалий (ДХА) в Ph-позитивных клетках костного мозга, мутаций гена BCR-ABL и перерывов в терапии иматинибом.

Анализ вероятности достижения БЦГО на терапию иматинибом показал, что у пациентов, не имеющих клонов Ph-позитивных клеток с ДХА на фоне терапии иматинибом, она составляет 50% при 5-летнем периоде наблюдения, тогда как у пациентов с ДХА вероятность достижения БМО 0% (р=0,00404) (рис.7).

Рис. 7. Вероятность достижения большого молекулярного ответа (БМО) у больных хроническим миелолейкозом (n=84) в зависимости от наличия клонов Ph-позитивных клеткок с ДХА.

Достижение большого молекулярного ответа возможно только у пациентов, достигших полного цитогенетического ответа. При этом Ph-хромосома не выявляется в клетках костного мозга. Однако, на фоне терапии иматинибом у некоторых больных появляются клоны Ph-негативных клеток с хромосомными аберрациями. В нашем исследовании у 10 пациентов с полным ЦГО обнаружены клоны Ph-негативных клеток с хромосомными аномалиями: у 4 пациентов +8, у 2 пациентов - -7, у 2 пациентов +22, у 1 пациента del(2)(q32), у 1 пациента i(17)(q10). Анализ вероятности достижения БМО при терапии иматинибом показал, что появление клонов Ph-негативных клеток с ДХА на фоне терапии иматинибом не влияет на вероятность достижения БМО (р=0,74921) (рис.8).

Рис. 8 . Вероятность достижения большого молекулярного ответа (БМО) у больных ХМЛ, достигших ПЦГО (n=84), в зависимости от наличия Ph-негативных клонов клеток с хромосомными аномалиями (ДХА).

Перерывы в терапии иматинибом очевидно могут замедлить достижение БЦГО, ПЦГО и БМО. В результате проведенного исследования было обнаружено статистически достоверное снижение вероятности достижения БМО (рис.9) у пациентов с перерывами в терапии иматинибом более 30 дней за весь период лечения (р=0,04572).

Рис.9. Вероятность достижения большого молекулярного ответа (БМО) у больных ХМЛ в зависимости от перерывов терапии иматинибом.

Таким образом, эффективность молекулярно-генетического мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ бесспорна. Наиболее оправдано применение молекулярного мониторинга у пациентов с полным ЦГО, когда Ph-хромосома не обнаруживается стандартным цитогенетическим методом. В достаточно репрезентативной когорте пациентов с ХМЛ, достигших полного ЦГО, экспрессия гена BCR-ABL не превышала 1%, а снижение экспрессии относительно базового уровня не менее чем на 1 log было выявлено у 98% пациентов с полным ЦГО. Значительные колебания экспрессии гена BCR-ABL у пациентов с частичным ЦГО при лечении иматинибом не позволяют сделать однозначный вывод о необходимости молекулярных исследований у пациентов, еще сохраняющих Ph-позитивный клон клеток в костном мозге, доступный цитогенетическому анализу. У пациентов с малым и минимальным цитогенетическими ответами уровень экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови практически не различался, так же как и мало он отличался от уровня экспрессии гена BCR-ABL у рефрактерных к иматинибу пациентов, не ответивших на терапию ХМЛ.

При сопоставлении процента Ph-положительных клеток в костном мозге и уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови обнаружен широкий диапазон значений экспрессии гена BCR-ABL в различных группах. Полученные результаты свидетельствуют о наибольшей информативности оценки минимальной остаточной болезни (количества BCR-ABL позитивных клеток крови) по снижению десятичного логарифма экспрессии гена BCR-ABL (?log) относительно базового уровня его экспрессии. Несомненно, изменение уровня экспрессии гена BCR-ABL относительно БУ, отражающее динамику редукции опухолевого клона клеток, имеет наибольшее клиническое значение.

По нашему мнению, наиболее целесообразно проводить молекулярно-генетические исследования после достижения полного ЦГО, когда стандартное цитогенетическое исследование оказывается неинформативным и только молекулярно-генетическое исследование позволяет оценить степень редукции опухолевого клона. Исследование динамики экспрессии гена BCR-ABL на фоне продолжающейся терапии иматинибом показало высокую чувствительность и лабильность этого показателя, что предполагает необходимость проведения молекулярно-генетического мониторинга после достижения полного ЦГО не менее 1 раза в 3 месяца.

Достижение большого молекулярного ответа, определяемого как экспрессия гена BCR-ABL менее 0,1% или снижение экспрессии более чем на 3 log, является наиболее важным критерием молекулярного ответа на терапию ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Вероятность достижения большого МО достоверно снижается при наличии ДХА в Ph-позитивных клетках, мутаций гена BCR-ABL, а также перерывов в терапии иматинибом и не зависит от появления ДХА в Ph-негативных клетках костного мозга.

Мутационный мониторинг терапии хронического миелолейкоза

В настоящая время роль мутаций гена BCR-ABL в развитии вторичной резистентности определена. Данные о роли мутаций гена BCR-ABL в формировании первичной резистентности единичны. Для проведения мутационного анализа в исследование включены 64 пациента с ХМЛ, рефрактерных к терапии иматинибом. В качестве критериев рефрактерности в нашем исследовании рассматривались отсутствие цитогенетического ответа после шести месяцев терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки, частичного цитогенетического ответа - после 12 месяцев терапии, полного цитогенетического ответа - после 18 месяцев терапии. Вторую группу составили пациенты с ХМЛ (n=30), достигшие цитогенетического ответа на терапию иматинибом (400 мг/ сутки) в течение 6 - 18 месяцев лечения в соответствии с критериями ELN.

В результате проведенного исследования в группе рефрактерных к иматинибу пациентов (n=64) были обнаружены миссенс-мутации у 16 (25,0%) пациентов (таблица 6). Среди этих пациентов 1 мутация выявлена у 10 (62,5%) пациентов и компаунд мутации (2 или 3) выявлены у 6 (37,5%) больных ХМЛ. Всего выявлено 23 мутации.

Таблица 6. Мутации гена BCR-ABL, выявленные у рефрактерных к иматинибу пациентов с ХМЛ

Анализ локализации выявленных мутаций показал, что 15 (65,3%) из 23 выявленных мутаций локализованы в участке гена BCR-ABL, кодирующем P-петлю (рис.12). Мутации P-петли критичны, поскольку именно в ней расположен ATФ-связывающий карман, являющийся мишенью для иматиниба. Основным последствием мутаций, затрагивающих P-петлю, являются нарушение связывания иматиниба с белком BCR-ABL тирозинкиназой. Выявленные мутации P-петли по литературным данным приводят к значительному снижению чувствительности BCR-ABL позитивных клеток к иматинибу в тестах in vitro.

Рис.10. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих P-петлю (Р), IB-домен (IB), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы.

Среди рефрактерных к иматинибу пациентов с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL было 9 мужчин и 7 женщин. Медиана возраста у рефрактерных пациентов с обнаруженными мутациями составила 43 года (от 32 лет до 54 лет). У 6 (37,5%) рефрактерных к иматинибу пациентов с мутациями гена BCR-ABL на момент начала терапии иматинибом диагностирована хроническая фаза, у 10 (62,5%) - фаза акселерации. Медиана продолжительности периода от момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом в группе рефрактерных пациентов с обнаруженными мутациями составила 19 месяцев (от 1 до 108 месяцев), что сопоставимо с медианой продолжительности всех обследованных паицентов (24 месяца). Все пациенты с обнаруженными мутациями с момента постановки диагноза до начала терапии иматинибом получали лечение препаратами гидроксикарбомида и медиана длительности этой терапии составила 18,5 месяцев (минимум - 1 месяц, максимум - 108 месяцев). Из них 1 пациент получал одновременно с гидроксикарбомида терапию бусульфаном. Еще один пациент после 5 месяцев терапии гедреа безуспешно получал терапию интерфероном-б в течение 7 месяцев. Медиана суточной дозы иматиниба за время наблюдения в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL составила 483,5 мг/сутки. В случаях обнаружения мутаций медиана длительности заболевания с момента установления диагноза до момента проведения мутационного анализа составила 22 месяца в группе пациентов с обнаруженными мутациями гена BCR-ABL. Медиана длительности терапии иматинибом на момент проведения мутационного анализа в группе пациентов с мутациями киназного домена гена BCR-ABL составила 21 месяц (минимум - 6, максимум - 48 месяцев).

При сравнении двух групп пациентов с мутациями гена BCR-ABL и без мутаций с помощью двустороннего критерия Фишера по полу, возрасту, продолжительности периода от момента диагностики до начала терапии иматинибом, предшествующей иматинибу цитостатической терапии, средней суточной дозе иматиниба, длительности заболевания статистически значимых различий не обнаружено. Однако, мутации достоверно чаще обнаруживались у пациентов, начавших терапию иматинибом в фазе акселерации.

Проведенное исследование влияние мутаций гена BCR-ABL на вероятность достижения БЦГО, ПЦГО и БМО показало, что достижение цитогенетического и молекулярного ответов зависит от наличия мутаций в гене BCR-ABL: вероятность достижения БЦГО, ПЦГО и БМО статистически достоверно ниже у пациентов с мутациями гена BCR-ABL (БЦГО - p= 0,00028, ПЦГО - p=0,00699 и БМО - р=0,04572)(рис.11).

Рис.11. Вероятность достижения полного цитогенетического ответа (ПЦГО) у больных ХМЛ в зависимости от появления мутаций в гене BCR-ABL.

Таким образом, в нашем исследовании мутации гена BCR-ABL обнаружены у 16 (25,0%) из 64 пациентов, рефрактерных к иматинибу. Большая часть мутаций (65,3%) локализованы в области, кодирующей P-петлю киназного домена BCR-ABL тирозикиназы, являющейся локусом связывания с иматинибом. В нашем исследовании не обнаружено статистически достоверных различий между группами рефрактерных пациентов с мутациями и без мутаций гена BCR-ABL по возрасту, полу, продолжительности периода от установления диагноза до начала терапии иматинибом, предшествующей иматинибу цитостатической терапии, средней суточной дозе иматиниба и длительности терапии иматинибом. По нашим данным, исследованные факторы не влияют на появление мутаций гена BCR-ABL у рефрактерных к иматинибу пациентов.

Различные мутации гена BCR-ABL сообщают BCR-ABL позитивным клеткам разный уровень резистентности к иматинибу в тестах in vitro. Тем не менее, анализ вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом показал, что при групповом анализе всех пациентов c выявленными мутациями у них значительно ниже вероятность достижения большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО, чем у пациентов без мутаций.

Фармакокинетический мониторинг терапии ХМЛ

В связи с тем, что терапевтический уровень концентрации иматиниба может оказывать влияние на достижение цитогенетического и молекулярного ответа, было предпринято исследование концентрации иматиниба у 188 пациентов с ХМЛ из 298. Концентрация препарата в плазме крови измерялась у всех пациентов, давших информированное согласие на проведение этого исследования. Из исследования были исключены 9 (4,8%) пациентов с ХМЛ, у которых выявлено нарушение режима приема препарата. У этих больных ХМЛ концентрация иматиниба в плазме составила 0-197 нг/мл, что в соответствии с данными I фазы клинических испытаний свидетельствует о нарушении режима приема препарата по меньшей мере в течение нескольких дней. В исследовании определялась остаточная концентрация иматиниба в плазме через 24±3 часа после последнего приема (С_trough ), то есть перед очередным приемом иматиниба. В связи с этим из исследования исключены пациенты, принявшие иматиниб менее чем за 21 час и более чем за 27 часов до забора образцов крови. В результате анализировались фармакокинетические данные, полученные для 76 пациентов с ХМЛ.

Результаты измерения концентрации иматиниба в плазме крови были разбиты на квартили. Вероятность достижения БЦГО и ПЦГО оценивалась в зависимости от отношения пациента к 1 квартилю (25% пациентов с минимальной концентрацией иматиниба) или 4 квартилю(25% пациентов с максимальной концентрацией иматиниба). Анализ вероятности достижения БЦГО и ПЦГО не выявил статистически достоверных различий между уровнем достижения БЦГО и ПЦГО у пациентов с низкой (1 квартиль) и высокой (4 квартиль) концентрацией иматиниба в плазме (р=0,43719 и p=0,71240).

В исследование влияния концентрации иматиниба в плазме на достижение БМО были включены 49 пациентов. Все пациенты находились в хронической фазе заболевания и получали терапию иматинибом в дозе 400 мг/сутки в течение 18-36 месяцев.

Среди 49 пациентов, получавших терапию иматинибом в дозе 400 мг/сутки в течение 18-36 месяцев и включенных в наше исследование, 18 больных ХМЛ (36,7%) достигли большого молекулярного ответа (Д lg BCR-ABL > 3) и 31 пациент с ХМЛ (63,3%) не достиг большого молекулярного ответа (Д lg BCR-ABL < 3).

В группе пациентов с ХМЛ (n=18), достигших большого молекулярного ответа, средний возраст составил 54 года, соотношение мужчин и женщин 8/10, средняя длительность терапии иматинибом - 29 месяцев. Среднее значение С_min иматиниба в плазме крови в этой группе пациентов составило 1729,2 ± 215,0 нг/мл, медиана - 1558,5 нг/мл, минимальное значение - 447,0 нг/мл, максимальное значение - 3394,0 нг/мл. Отмечена значительная вариабельность данного показателя, поскольку стандартное отклонение (s) в этой группе пациентов составило 916,2.

В группе пациентов с ХМЛ (n=31), не достигших большого молекулярно ответа, средний возраст составил 51 год, соотношение мужчин и женщин - 16/15, средняя длительность терапии иматинибом - 24 месяца. Среднее значение С_min в плазме крови в этой группе пациентов составило 962,1 ± 77,2 нг/мл, медиана - 922,0 нг/мл, минимальное значение - 263,0 нг/мл, максимальное значение - 2472,0 нг/мл. В этой группе пациентов также выявлена значительная вариабельность С_min - стандартное отклонение (s) составило 430,1.

Проведенный статистический анализ с использованием критерия Манна-Уитни (U - тест) показал, что между группами пациентов с ХМЛ, достигших большого молекулярного ответа и не достигших его, средние значения С_min иматиниба в плазме различаются статистически достоверно (р=0,0007). Использование критерия Спирмена показало, что уровень экспрессии гена BCR-ABL, а следовательно и объем опухолевого клона клеток, коррелирует с уровнем С_min иматиниба (выявлена отрицательная корреляционная связь r=-0,4) c достоверностью р=0,006.

Распределение этих же групп пациентов по квартилям в зависимости от С_trough иматиниба показало, что 75% больных ХМЛ с молекулярной ремиссией имели концентрацию иматиниба выше 992 нг/мл (рис.12).

Рис.12. Дисперсия медианы значения С_trough иматиниба у больных ХМЛ с большим молекулярным ответом (БМО) и без большого молекулярного ответа (нет БМО). По оси ординат - С_trough иматиниба в нг/мл. Горизонтальные линии внутри прямоугольников соответствуют медиане С_trough иматиниба в каждой группе. Верхняя и нижняя границы прямоугольников соответствуют третьему и первому квартилям С_trough иматиниба, а горизонтальные линии на концах пунктирных линий - минимальное и максимальное значения С_trough иматиниба в каждой группе.

В нашей работе впервые было выполнено исследование концентрации иматиниба в межклеточной жидкости костного мозга, полученного в результате стернальной пункции у пациентов с ХМЛ. Измерение концентрации иматиниба в костном мозге с одновременным определением концентрации препарата в плазме крови выполнено у 144 пациентов с ХМЛ. Концентрация препарата в костном мозге была выше в среднем в 1, 4 раза, чем в плазме. Медиана отношения концентрации иматиниба в костном мозге к концентрации иматиниба в плазме составила 1,4 (минимум - 0,5, максимум - 3,6). Корреляционный анализ выявил связь умеренной силы (r=0,6464, p=0,0000) между концентрацией препарата в плазме и костном мозге (рис.13)

Рис. 13. Корреляционная связь концентрации иматиниба в плазме и межклеточной жидкости костного мозга.

Так же, как и в случае с анализом влияния концентрации иматиниба в плазме, нами не обнаружено статистически достоверной разницы вероятности достижения БЦГО и ПЦГО в зависимости от концентрации иматиниба в костном мозге (р=0,67321 и р=0,76678 соответственно).

Таким образом, достижение терапевтической концентрации иматиниба в плазме крови является вариабельным показателем. Однако у пациентов с ХМЛ, достигших большого молекулярного ответа, концентрация иматиниба в плазме значительно выше, чем у больных ХМЛ, не достигших большого молекулярного ответа на терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. Для пациентов с ХМЛ с низким уровнем иматиниба в плазме крови, получавших иматиниб в дозе 400 мг/сутки и не достигших в рекомендованные ELN сроки большого молекулярного ответа, может быть рекомендовано повышение суточной дозы иматиниба до 600-800 мг.

Концентрация иматиниба в плазме коррелирует с концентрацией препарата в межклеточной жидкости костного мозга. Концентрация иматиниба в костном мозге незначительно зависит от “разбавленности” костного мозга периферической кровью и может быть в дальнейшем использована для анализа эффективности терапии иматинибом.

Алгоритм мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ.

Анализ впечатляющих результатов терапии иматинибом с одной стороны, как и понимание механизмов резистентности к иматинибу и путей ее преодоления с другой стороны, являются основой для разработки принципов эффективного применения ингибиторов тирозинкиназ второго поколения и других таргетных препаратов в гематологии и онкологии. В связи с этим, актуальна разработка четких методических подходов к мониторингу терапии ХМЛ и, как следствие, изменения тактики терапии ХМЛ.

В нашем исследовании выявлена высокая эффективность стандартного цитогенетического исследования, молекулярно-цитогенетического и молекулярного исследований для генетической диагностики ХМЛ. Однако, алгоритм мониторинга терапии ХМЛ ингибиторами тирозикиназ (рис.14) до достижения полного ЦГО непременно должен включать СЦИ. Использование молекулярно-генетического мониторинга до достижения полного цитогенетического ответа сомнительно, поскольку динамика снижения экспрессии гена BCR-ABL не всегда отражает в полной мере редукцию клона опухолевых клеток. Напротив, после достижения полного ЦГО молекулярно-генетический метод является единственно возможным и довольно чувствительным подходом для оценки минимальной остаточной болезни.

Рис.14. Алгоритм генетического мониторинга терапии ХМЛ

При отсутствии ответа на проводимую терапию или утрате достигнутого ответа необходимо проведение цитогенетического мониторинга с целью поиска клонов Ph-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями. Появление таких клонов является неблагоприятным фактором, достоверно снижающим вероятность достижения цитогенетического и молекулярного ответов на проводимую терапию.

Проведение фармакокинетического мониторинга необходимо прежде всего для исследования соблюдения пациентом режима приема препарата. Низкая концентрация иматиниба или его отсутствие в плазме и костном мозге свидетельствуют о перерывах в терапии, значительно снижающих вероятность достижения ответа на лечение. Кроме того, концентрация иматиниба в плазме более 1000 нг/мл необходима для достижения большого молекулярного ответа.

Также в случаях резистентности к ингибиторам тирозинкиназ показано исследование мутационного статуса в гене BCR-ABL, поскольку мутации в нем приводят как к первичной, так и вторичной резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ.

Выявленные изменения являются основанием для изменения тактики терапии пациентов с ХМЛ: повышение дозы препарата первой линии - иматиниба, переход на терапию ингибиторами тирозинкиназ второй линии, перевод пациента на программу трансплантации костного мозга.

В нашем исследовании проанализировано несколько генетических факторов, обусловливающих эффективность терапии иматинибом. На основании известных на момент обследования клинико-генетических параметров нами была предпринята попытка прогнозирования важнейшего критерия эффективности терапии иматинибом и другими ингибиторами тирозинкиназ - цитогенетического ответа методом множественной линейной регрессии. Из массива данных были выделены сведения о пациентах, результаты лечения которых были прослежены не менее 24 месяцев. Эта когорта больных была разделена на 2 группы: обучающую и контрольную. Имеющийся массив данных позволил провести корреляционный и регрессионный анализы, на основе которых сделана попытка прогнозирования цитогенетического ответа через заданный (с интервалом 6 месяцев) промежуток времени. Анализ выявленных корреляций позволил выделить показатели, связанные хотя бы умеренной силы связью.

Таким образом, линейное регрессионное уравнение, позволяющее прогнозировать вариант цитогенетического ответа через 24 месяца терапии иматинибом имеет вид:

Y = - 0,52 +0,198 x A + 0,640 x B + 0,855 x C - 0,176 x D

Где Y - прогнозируемый вариант через 24 месяца терапии иматинибом (0- ПЦГО, 1- БЦГО, 2-МЦГО, 3-МинЦГО, 4 - нет ЦГО)

А - цитогенетический ответ после 6 месяцев терапии (0- ПЦГО, 1- БЦГО, 2-МЦГО, 3-МинЦГО, 4 - нет ЦГО)

В - цитогенетический ответ после 12 месяцев терапии (0- ПЦГО, 1- БЦГО, 2-МЦГО, 3-МинЦГО, 4 - нет ЦГО)

С - наличие дополнительных хромосомных аномалий (1- нет ДХА, 2 - есть ДХА)

D - наличие мутаций гена BCR-ABL(1-нет мутаций, 2-есть мутации)

Проверка регрессионного уравнения показала 80% вероятность совпадения результатов. Графическое представление соответствия прогнозируемых и фактических данных в обучающей группе приведено ниже

Очевидно, что линейная модель не является идеальной, однако она дает возможность выделить группу пациентов, требующих мониторирования и, возможно, изменения тактики терапии. Регрессионное уравнение в виде удобного для использования интерфейса размещено в сети Интернет на сайте http://www.ortho-dove.com/cytgen/.

Выводы

1. Цитогенетические и FISH исследования показали высокую эффективность терапии иматинибом в изученной когорте пациентов с ХМЛ: при медиане терапии 24 месяца 66,1% пациентов, получавших терапию иматинибом 6 и более месяцев, достигли большого ЦГО, 59,7% больных ХМЛ, находившихся на терапии иматинибом 12 и более месяцев, достигли полного ЦГО.

2. Эффективность стандартного цитогенетического исследования кариотипа костного мозга на этапе цитогенетической диагностики ХМЛ составила 91,9%. Дополнительные хромосомные аномалии, выявляемые в Ph-позитивных клетках костного мозга при диагностическом цитогенетическом исследовании, не влияют на вероятность достижения большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО.

3. Дополнительные хромосомные аномалии, обнаруживаемые в Ph-позитивных клетках костного мозга на фоне терапии иматинибом, обладают статистически достоверным неблагоприятным прогностическим влиянием на достижение большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО. Дополнительные хромосомные аномалии, обнаруживаемые в Ph-негативных клетках, не обладают аналогичным прогностическим значением

4. Наиболее частой дополнительной хромосомной аномалией в Ph-позитивных клетках является дополнительная Ph-хромосома. В случае отсутствия дополнительной Ph-хромосомы при стандартном цитогенетическом исследовании у пациентов с резистентностью к иматинибу необходимо проведение FISH исследований с ДНК зондом к слитному гену BCR-ABL для выявления малопроцентных клонов опухолевых клеток с дупликацией Ph-хромосомы.

5. Результаты молекулярно-генетических исследований методом ПЦР в режиме реального времени, выполняемых в процессе мониторинга терапии ХМЛ, достоверно коррелируют с результатами стандартных цитогенетических исследований. Проведение молекулярно-генетического мониторинга уровня экспрессии гена BCR-ABL наиболее оправдано у пациентов с полным ЦГО, когда Ph-хромосома не обнаруживается стандартным цитогенетическим методом.

6. Наибольшей информативностью обладает оценка минимальной остаточной болезни, определяемая как снижение десятичного логарифма экспрессии гена BCR-ABL относительно базового уровня экспрессии, рассчитанного для 30 впервые диагностированных пациентов с ХМЛ. Наличие данных об уровне экспрессии гена BCR-ABL до начала терапии иматинибом не является необходимым для оценки редукции опухолевого клона.

7. Мутации гена BCR-ABL, обусловливающие резистентность к проводимой терапии иматинибом, обнаружены в 25,0% случаев рефрактерности к проводимой терапии. Появление мутаций в гене BCR-ABL обладает неблагоприятным прогностическим влиянием на достижение большого ЦГО, полного ЦГО и большого МО.

8. Концентрация иматиниба в межклеточной жидкости костного мозга коррелирует с концентрацией препарата в плазме крови - соотношение этих двух показателей в среднем 1,5:1.

9. Уровень концентрации иматиниба прямо коррелирует с вероятностью достижения большого МО и не коррелирует с вероятностью достижения большого и полного ЦГО.

Практические рекомендации

1. Для оптимизации терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ предложен алгоритм мониторинга эффективности терапии в зависимости от выявляемых цитогенетических, молекулярно-генетических и фармакокинетических факторов.

2. Проведение молекулярно-генетического мониторинга терапии ХМЛ методом ПЦР в реальном времени целесообразно после достижения полного цитогенетического ответа.

3. Исследование рефрактерности к терапии ингибиторами тирозинкиназ должно включать молекулярно-цитогенетический анализ для выявления низкоуровневых клонов клеток с амплификацией гена BCR-ABL

4. Выявление клонов Ph-позитивных клеток с дополнительными хромосомными аномалиями и мутациями гена BCR-ABL является фактором неблагоприятным прогноза цитогенетического и молекулярного ответов на лечение и предполагает изменения тактики терапии ХМЛ.

5. Фармакокинетический мониторинг необходимо проводить у резистентных к иматинибу больных ХМЛ для оценки соблюдения пациентом режима приема препарата и коррекции дозы иматиниба при отсутствии большого молекулярного ответа.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Kutsev, S.I. Our experience with FISH and conventional cytogenetics in oncohematology/ S.I. Kutsev, Y.A.Boumber, L.I. Petrenko, N.M. Moussonova// Cytogenetics and Cell Genetics. - 1999. - V.85, № 1-2. - P. 77.

2. Бурнашева, Е.В.Особенности нарушения функции тромбоцитов у больных с хроническими лейкозами / Е.В.Бурнашева, С.И. Куцев, Н.П.Плескачева, В.С.Отливщикова, Ю.В. Шатохин // Материалы I cъезда терапевтов Юга России. - Ростов-на-Дону, 2000. - С. 49-50.

3. Шатохин, Ю.В. Цитохимическая характеристика клеток грануляторного ряда костного мозга у пациентов, страдающих миелопролиферативными заболеваниями / Ю.В.Шатохин, С.И. Куцев, В.С. Отливщикова // III Научная сессия Ростовского государственного медицинского университета. - Ростов-на-Дону, 2000. - С. 265-266.

4. Куцев, С.И. Мультиплексная флуоресцентная in situ гибридизация хромосом (mFISH) в анализе хромосомных аберраций при онкогематологических заболеваниях /С.И.Куцев, В.Н.Чернышов, Н.М.Мусонова, Ю.В. Шатохин, Л.И. Петренко // Детская онкология. - 2001, №1. - C.112-113.

5. Koutsev, S.I. Fluorescence in situ hybridization (FISH) in the diagnosis and follow up of chronic myeloid leukaemia / S.I. Koutsev, Y.V. Shatokhin, N.M.Moussonova // The Hematology Journal. - 2001. - V.1, Suppl.1. - P. 230.

6. Куцев, С.И. Флуоресцентная in situ гибридизация хромосом (FISH) в диагностике и определении эффективности терапии альфа-интерфероном хронического миелолейкоза / С.И.Куцев, Ю.В.Шатохин // Материалы симпозиума “Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний”. - Москва, 2001. - С.15-16.

7. Бурнашева, Е.В. Роль гливека в лечении хронического миелолейкоза, влияние на функциональные показатели мегакариоцитов костного мозга и тромбоцитов периферической крови / Е.В. Бурнашева, Ю.В. Шатохин, Г.Ю. Нагорная, С.И. Куцев, В.С. Отливщикова, Н.П. Плескачева // Труды IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета. - Ростов-на-Дону, 2004. - C. 243-245.

8. Шатохин, Ю.В. Современные медицинские технологии в диагностике, прогнозировании и оптимизации терапии опухолевых заболеваний кроветворной системы / Ю.В.Шатохин, С.И. Куцев, Л.П. Высоковская, Е.В. Полевиченко, Л.П. Сизякина // Труды IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета. - Ростов-на-Дону, 2004. - C. 19-20.

9. Шатохин, Ю.В. Хронический миелолейкоз / Ю.В.Шатохин, С.И. Куцев, Е.В. Бурнашева, В.С. Отливщикова, О.Н. Шатохина // Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты: Cб. научных трудов под ред. Чернышова В.Н., Куцева С.И., Вып.2. - Ростов-на-Дону, 2004. - С. 175-180.

10. Kutsev, S.I. Quantitative Fluorescent in Situ Hybridization of Chromosomes / S.I. Kutsev, S.V. Mordanov // Medizinische Genetik. - 2004. - V.16, №1. - P. 106.

11. Ворсанова, С.Г. Онкоцитогенетика / С.Г. Ворсанова, Ю.Б. Юров, В.Н. Чернышов, И.Ю. Юров, С.И. Куцев //Глава из учебного пособия Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Чернышов В.Н. “Медицинская цитогенетика” - М., Медпрактика-М, 2006. - С. 148-159.

12. Куцев, С.И. Количественная флуоресцентная гибридизация хромосом / С.И. Куцев, С.В.Морданов // Мат. Конференции “Научно-технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)”. - Ростов-на-Дону, 2006. - С. 85-86.

13. Kutsev, S.I. Cytogenetic and FISH analysis for diagnosis and evaluation of minimal residual disease (MRD) in CML patients / S.I.Kutsev, S.V.Mordanov, A.A. Zeltzer, Y.V. Shatokhin, E.V.Burnasheva // “Developing Research for a Common Feature”, Abstracts of 4th Scientific Symposium. - Rostov-on-Don, 2006. - P. 51-52.

14. Куцев, С.И. Предварительные результаты терапии гливеком хронического миелолейкоза на юге России / С.И. Куцев, А.Н. Зельцер, М.В.Вельченко, Ю.В.Шатохин, Е.В. Бурнашева // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии в педиатрии. - 2006. - Т.5, №4. - С. 12.

15. Куцев, С.И. Анализ мутаций BCR-ABL киназного домена у иматиниб резистентных пациентов с хроническим миелоидным лейкозом / С.И. Куцев, М.В.Вельченко, А.Н. Зельцер, С.В. Морданов, Ю.В. Шатохин, Е.В. Бурнашева // Кардиология СНГ. - 2007. - Т.5, №2. - С. 269-270.

16. Куцев, С.И. Результаты цитогенетической диагностики хронического миелолейкоза в ЮФО в 2005-2007 гг. / С.И.Куцев / Материалы II научно-практической конференции ЮФО “Хронический миелоидный лейкоз: диагностика, лечение и мониторинг”. - Ростов-на-Дону, 2007. - С.3-6.

17. Kutsev, S. Mutation profile of BCR-ABL kinase domain in imatinib primary and secondary resistant chronic myeloid leukemia cases / S. Kutsev, M.Velchenko, S. Mordanov // European Journal of Human Genetics. - 2008. - V. 16, Suppl.2. - P. 212.