Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Внеклеточная ДНК - фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля

03.02.07 - Генетика

Конькова Марина Сергеевна

Москва - 2011

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, Вейко Наталья Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Конорова Ирина Львовна

доктор медицинских наук, Писарев Владимир Митрофанович

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП "ГосНИИгенетика")

Защита состоится ______________ 2011г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1.

Автореферат разослан ________________ 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессорЗинченко Р.А.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Ещё два десятилетия назад эффекты радиации изучались у клеток, непосредственно подвергшихся действию частиц высоких энергий, и сводились к последствиям нерепарированных или неправильно репарированных повреждений ядерной ДНК после взаимодействия её с продуктами радиолиза воды. Эффекты в клетках, которые непосредственно не подверглись облучению, как правило, не рассматривались. Однако в последние годы ушедшего столетия начали появляться сообщения о способности клеток, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения в малых дозах, передавать сигнал необлучённым клеткам (клеткам-свидетелям), в результате и в тех, и в других индуцируются одинаковые эффекты (Nagasawa H., Little J. B., 1992). Эффект воздействия облучённых клеток популяции на необлучённые клетки получил название "bystander effect" или "эффект свидетеля" (ЭС) (Lehnert B. E., Goodvin E. H., 1997; Seymour C. B., Mothersill C., 1997).

Эффект свидетеля наблюдается преимущественно в интервале малых доз от 1 до 50 сГр (Morgan W. F., Sowa M. B., 2007). Для рентгеновского излучения ЭС тестируется уже при дозе 5 мГр, при этом уровень повреждений ДНК клетки-мишени включает всего пять однонитевых разрывов, 10-15 повреждённых оснований и один двунитевой разрыв ДНК в 20% клеток. Показано, что ЭС может передаваться от облучённых клеток потомству и проявляется в ряду нескольких последующих поколений клеток (Lyng F. M. et al., 2002, Mothersill C. et al., 2002).

Механизмы передачи клеткам-свидетелям информации о повреждающем воздействии активно изучаются, однако природа всех факторов сигнального пути до конца не известна. Основное внимание исследователей было сосредоточено на факторах белковой природы (Mothersill C., Seymour C. B., 2001; Nikjoo H., Khvostunov I. K., 2003), прежде всего, на различных цитокинах (Natarajan P. K. et al., 2007). Предполагалось также участие в передаче сигнала в ЭС активных форм кислорода и азота (Azzam E.I. et al., 2002; Matsumoto H. et al., 2007; 2010; Morgan W. F., 2010). В 2007 году сотрудниками лаборатории Молекулярной биологии МГНЦ РАМН было впервые высказано предположение о возможной роли внеклеточной ДНК в реализации эффекта свидетеля (Ермаков А.В. и соавт., 2007).

Цель исследования. Цель проведенного исследования - проверка гипотезы: внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых клеток (вкДНК^R) переносит информацию о радиационном воздействии от облучённых клеток - необлучённым, т.е. выступает в роли фактора сигнализации при реализации эффекта свидетеля.

Задачи исследования.

1. Выделить из среды культивирования облучённых лимфоцитов человека вкДНК^R

и охарактеризовать её свойства;

2. Определить возможный источник вкДНК^R;

3. Сравнить эффекты, индуцируемые в лимфоцитах человека ионизирующей

радиацией в малых дозах и депротеинизированной вкДНК^R;

4. Обозначить сигнальные пути, связанные с рецепторами, опознающими вкДНК^R;

5. Исследовать возможность моделирования свойств вкДНК^R с целью направленного изменения индуцируемых ею эффектов.

Научная новизна. Впервые показано, что вкДНК^R выполняет функцию сигнального фактора в реализации эффекта свидетеля, индуцируемого ионизирующим излучением в малых дозах. Определены два условия, которые должны выполняться в клетках для поддержания данной функции вкДНК^R: (1) синтез активных форм кислорода и азота и (2) апоптоз повреждённых радиацией клеток. Установлено, что вкДНК^R стимулирует в лимфоцитах вторичный окислительный стресс. Впервые показано, что рецепторы "врождённого" иммунитета семейства TLR (TLR9) принимают непосредственное участие в ответе лимфоцитов на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах и в реализации эффекта свидетеля. Впервые показана принципиальная возможность моделирования клеточного ответа на действие радиации путем направленного изменения свойств внеклеточной ДНК.

Научно-практическая значимость работы. Данные о влиянии свойств вкДНК на клеточный ответ, индуцированный излучением, могут быть использованы при разработке индивидуальных схем радиотерапии. Моделируя содержание GC-богатых последовательностей (GC - ДНК) во вкДНК можно блокировать развитие адаптивного ответа и снизить летальную для клеток опухоли дозу радиации. С другой стороны, анализ индивидуальных свойств вкДНК и их направленное изменение может способствовать повышению радиорезистентности клеток (в перспективе, организма).

Положения, выносимые на защиту.

1. Внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых лимфоцитов человека - фактор сигнализации при развитии эффекта свидетеля в клеточной популяции.

2. Для проявления сигнальной функции вкДНК, в облучённых лимфоцитах должны соблюдаться два условия: синтез активных форм кислорода/азота и апоптоз облучённых клеток.

3. В реализации сигнальной функции вкДНК в облучённых лимфоцитах принимают участие рецепторы TLR9.

4. Ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения в малых дозах можно изменить путем варьирования содержания во вкДНК GC - богатых последовательностей ДНК.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на V и VI международных конференциях "Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum" (Москва, 2007; Гонконг, 2009); на II Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007); на Российской научной конференции "Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии" (Санкт-Петербург, 2008); на 37 международной конференции "37th Annual Meeting of the European Radiation Research Society" (Прага, 2009); на международной конференции "Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды" (Сыктывкар, 2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); на XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010); на VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010); на 4 международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 2010); на IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2011).

Диссертационная работа прошла апробацию на семинаре Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического центра РАМН, протокол № 3 от 16.03.2010.

Личный вклад автора. Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, определены задачи исследования и планирование экспериментов. Основная часть исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 печатная работа. Из них 8 статей опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 246 источников, из них 30 отечественных и 216 зарубежных авторов. Работа изложена на 151 листах машинописи. Текст содержит 39 рисунков и 13 таблиц.

Материалы и методы

В исследовании принимали участие 23 здоровых добровольца в возрасте от 19 до 55 лет. Лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования в системе фиколл-верографин, облучали на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Облучённые и необлучённые лимфоциты инкубировали в течение 3 ч при 37⁰С (среда содержала 10% эмбриональной телячьей сыворотки). ВкДНК выделяли из среды культивирования стандартным методом экстракции органическими растворителями. Концентрацию фрагментов ДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре "LS 55" ("PerkinElmer", Англия) c использованием красителей Hoechst 33528 или PicoGreen. Для анализа действия вкДНК на интактные клетки в среду культивирования последних добавляли выделенные фрагменты вкДНК в различной концентрации и инкубировали в течение 3 ч при 37⁰С.

Активность каспазы-3 (А_касп.3) в белковых экстрактах клеток определяли с использованием флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC (_возб400нм, _флу490нм). Активность нормировали на количество клеток. Для этого определяли количество ДНК в образце, из которого получали белковый экстракт. А_касп.3=?I_AFC/1мин. ·1мкгДНК, где ?I - увеличение интенсивности флуоресценции субстрата (в стандартизованных единицах). Нуклеазную активность (НА) в белковых экстрактах определяли с использованием модельного субстрата - комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом, содержащим на 5ґ-конце флуоресцентную группу (FAM), а на 3ґ-конце тушитель флуоресценции. Для калибровки использовали стандартный раствор ДНКазы-1. НА=?I_FAM /1мин. ·1мкгДНК. Активность TNF-б в супертатантах определяли по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток мышиной фибросаркомы L-929 (Fish H., Gifford J. E., 1989), анализ выполнен к. б. н Е.А. Калашниковой. Концентрацию нитрита в среде определяли колориметрическим стандартным методом Грисса с использованием набора Griess Reagent Kit ("Invitrogen").

В работе использовали ингибиторы: (1) активности каспазы-3 (2 мкМ Biotin-DEVD-FMK ("Sigma)); (2) активных форм кислорода (АФК) (100 мкМ б-токоферол ацетат ("Галено Фарм", Санкт-Петербург)); (3) рецепторов TLR9 (3 мкг/мл олигодезоксирибонуклеотид 2088 (TCC TGG CGG GGA AGT, "Синтол", Москва) или 2 мкг/мл хлорокин ("Boots Company PLC", Англия)).

Нерадиоактивная гибридизация in situ (FISH). Лимфоциты обрабатывали гипотоническим раствором (0.075М KCl), фиксировали смесью метанол/ледяная уксусная кислота (3:

1). Использовали биотинированный зонд на прицентромерный локус 1-й хромосомы (1q12). Гибридизацию осуществляли в термостате "ThermoBrite" ("StatSpin", США). Биотин выявляли конньюгатом авидин-ФИТЦ. Использовали микроскоп Axioplan ("Opton", Германия) и цифровую камеру "RETIGA 2000R" ("IMAGING", Канада). Определение параметров клеток проводили с помощью компьютерной программы анализа изображений ("ИнтерЭВМ", Москва). Для построения распределения параметров использовали данные для 300-500 клеток.

Селективная окраска азотнокислым серебром фиксированных ядер лимфоцитов проводилась к. б. н. Н.А. Еголиной (лаборатория общей цитогенетики МГНЦ РАМН). Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь в 150 - 200 интерфазных ядрах.

Содержание повторяющихся последовательностей генома (рибосомный и теломерный повторы человека и сателлит III) в ДНК определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации c биотинированными зондами (Вейко Н.Н. и соавт., 2003).

Оценка уровня экспрессии генов TLR9 и MyD88 методом ПЦР в реальном времени. РНК выделяли с использованием реагента Trizol. Концентрацию выделенной РНК определяли флуориметрически с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), возб487 нм, флу524 нм. Обратную транскрипцию проводили с помощью реактивов фирмы “Силекс" по стандартной методике. Для оценки уровня экспрессии TLR9 и MyD88 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по принципу TaqMan. В качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. ПЦР проводили на приборе Rotor Gene 300 (Corbett, Австр.). Полученные данные обрабатывали методом калибровочного графика и прямым сравнением данных с использованием программы прибора. Ошибка измерения составила ~ 2%.

Количество гиподиплоидных клеток в популяции лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии (окраска клеток пропидий йодидом) сотрудники ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА РФ.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics, Statistica 6.0 и StatPlus.

Результаты и обсуждение

1. Свойства вкДНК облучённых и интактных лимфоцитов

Концентрация вкДНК в среде культивирования лимфоцитов (~0,5·10⁶ клеток/мл среды) 23-х здоровых людей (вкДНК^К) через 3 часа культивирования варьировала от 2 до 398 нг/мл среды. Данные о количестве вкДНК целесообразно выражать в процентах от суммарного количества ДНК, которая содержится в клетках и среде культивирования (М_вкДНК). Для 22 образцов необлучённых лимфоцитов М_вкДНК варьирует от 0.04 до 3.1% (среднее 1.3 ± 1.0%, N = 22). Для образца №23 наблюдалось аномально высокое количество вкДНК^К (М_вкДНК = 8%). Для лимфоцитов двух доноров (№23 и №5) была определена концентрация вкДНК соответственно 7 раз и 4 раза в течение 2-х лет. Для донора №23 количество вкДНК в среде культивирования оставалось на протяжении этого периода стабильно высоким (5 - 10%), для донора №5 - стабильно низким (от 0.1 - 0.3 %).

После облучения лимфоцитов концентрация вкДНК^R варьировала от 5 до 130 нг/мл среды (N = 23) или от 0.1 до 2.6 % от общего количества ДНК. Сравнение распределений М_вкДНК^R и М_вкДНК^К по критерию Манна-Уитни не выявило достоверных различий ⁽p = 0.4; N = 23). Для лимфоцитов 4-х доноров отношение М_вкДНК^R/М_вкДНК^К достоверно больше 1 (от 2.5 до 7.1; 4.4 ± 2.2), для 4-х образцов концентрации вкДНК^R и вкДНК^К примерно одинаковы (p > 0.05). Для ~ 65% образцов детектировано достоверное снижение концентрации вкДНК после облучения (p < 0.05). Отношение М_вкДНК^R/М_вкДНК^К для этих образцов варьировало от 0.3 до 0.8 (0.6 ± 0.2; N = 15). Таким образом, облучение по-разному влияет на определяемые количества вкДНК^R в среде культивирования лимфоцитов здоровых людей.

Содержание повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНК^R по сравнению с вкДНК^K было проанализировано методом сравнительной дот-гибридизации для лимфоцитов двух доноров (№5 и №23). Использовали ДНК-зонды на теломерный, рибосомный повторы и на повтор сателлит III (1q12).

Содержание всех трёх повторов во вкДНК^R не отличается от такового во вкДНК^K (p > 0.1). Таким образом, не происходит существенного изменения состава последовательностей вкДНК после облучения лимфоцитов.

Размеры фрагментов вкДНК^К и вкДНК^R. На рис.1 приведена типичная для образцов вкДНК электрофореграмма. ВкДНК представлена фрагментами от 180 до 20000 п. н. Чётко детектируются длинные фрагменты (~20000 п. н.) и фрагменты длиной 180, 360 п. н. и т.д., соответствующие моно - и олигонуклеосомам.

Рис.1. Пример электрофореграммы образцов вкДНК^К и вкДНК^R. Слева цифрами указана длина фрагментов.

Рис.2. Линейная корреляция между изменением количества гиподиплоидных клеток (М_ГК^R/М_ГК^К) и уровня активности каспазы-3 (А_касп.3^R/А_касп.3^К).

клетка свидетель передача информация

После облучения количество коротких фрагментов увеличивается. "Нуклеосомная лесенка" на электрофореграммах вкДНК^К и вкДНК^R позволяет предположить, что большая часть вкДНК появляется в среде из апоптотических клеток.

2. Ионизирующее излучение индуцирует апоптоз лимфоцитов

Количество гиподиплоидных клеток, определенное методом проточной цитометрии в необлучённых лимфоцитах (М_гк^К), варьирует от 0.6 до 9.3% всех клеток (3.7 ± 2.5%; N = 23). После облучения (10 сГр) М_гк^R варьирует от 0.7 до 18.9% от общего количества клеток и возрастает для 22 образцов лимфоцитов (р < 0.05 по критерию Манна-Уитни). Увеличение для большинства образцов после облучения количества гиподиплоидных клеток в среднем в 1.5 раза показывает, что получившие повреждение клетки гибнут при последующем культивировании.

Активность каспазы-3 в белковых экстрактах необлучённых лимфоцитов варьирует от 1.5 до 4.9 ед. акт. (3.1 ± 0.9; N = 14). После облучения активность каспазы-3 варьирует от 1.7 до 9.7 ед. акт. (4.4 ± 1.9; N = 14). Сравнение двух распределений по методу Манна - Уитни показало, что при облучении происходит увеличение активности каспазы-3 (р< 0.05). Сопоставление двух параметров: изменение количества гиподиплоидных клеток (М_гк^R/М_гк^К) и изменение уровня активности каспазы-3 (А_касп.3^R/А_касп.3^К) после облучения клеток выявило линейную зависимость (рис.2). Таким образом, гиподиплоидные клетки - это, прежде всего, апоптотические клетки.

Нуклеазная активность в белковых экстрактах необлучённых лимфоцитов НА^K варьирует от 1.4 до 5.2 ед. акт. (3.1 ± 1.5; N = 10). После облучения НА^R увеличивается (p > 0.05 для каждой пробы) во всех клетках и варьирует от 1.8 до 7.8 ед. акт. (4.0 ± 1.9; N = 10). Показатель НА^R/НА^K изменяется от 1.1 до 1.5 (среднее 1.3 ± 0.1), что позволяет сделать вывод об увеличении НА в небольшой субпопуляции клеток культуры после облучения.

Апоптотические клетки - источник вкДНК^R. Апоптоз облучённых лимфоцитов играет значительную роль в появлении в среде фрагментов вкДНК^R (Choi J. J. et al., 2005). Блокирование апоптоза ингибитором каспазы-3 (Biotin-DEVD-FMK, 2 мкМ) приводит к снижению в несколько раз концентрации вкДНК^R. Для необлучённых клеток количество вкДНК^K практически не зависит от присутствия ингибитора (рис.3).

Рис.3. Зависимость концентрации вкДНК от присутствия в среде облучённых клеток ингибитора апоптоза (Biotin-DEVD-FMK). Приводятся данные для донора №23. Опыт повторён для 4-х доноров.

Таким образом, облучение (10сГр) стимулирует апоптоз в небольшой субпопуляции клеток культуры. Апоптоз сопровождается увеличением НА в клетках и "выщеплением" моно - и олигонуклеосомных фрагментов ДНК из апоптотических клеток. В клеточной популяции увеличивается количество гиподиплоидных клеток, а в среде увеличивается относительное содержание "нуклеосомных" фрагментов.

3. ВкДНК^R - фактор сигнализации в радиационном ЭС

Для анализа ответа лимфоцитов на действие малой дозы радиации и для доказательства участия вкДНК в ЭС изучены четыре эффекта, ранее описанные для облучённых клеток. Кроме того, в качестве аналога радиации, который вызывает окислительный стресс без прямого повреждения ДНК (Lubrich A. et al., 2010), была использована перекись водорода в концентрации 10 мкМ.

1) Перемещение локусов гомологичных хромосом. Известно, что начальная стадия клеточного ответа на действие рентгеновского излучения в малых дозах сопровождается транспозицией центромерных локусов гомологичных хромосом из примембранных областей ядра во внутреннюю и их сближением (Спитковский Д.М. и соавт., 2000; 2003; Abdel-Halim H.I. et al., 2004). Перемещение участков хроматина в ядре многие авторы связывают с регуляцией генной экспрессии в ответ на стресс (Tanabe H. еt al., 2002; Zimber A. еt al., 2004; Grattarola M. et al., 2006; Strasаk L. et al., 2009). Для регистрации перемещения хроматина использовали маркерный локус 1q12, поскольку ранее было показано, что данный локус в норме располагается примембранно, но при различных повреждающих воздействиях перемещается внутрь ядра (Leger I. еt al., 1994; Rupa D. S. et al., 1997; Barki-Celli L. et al., 2005). Использование данного эффекта позволяет количественно проанализировать ранний ответ всей популяции клеток на действие облучения. Положение локусов 1q12 в ядрах G₀-лимфоцитов человека были определены с помощью метода FISH (см. рис.4).

Рис.4. Препарат ядер лимфоцитов после FISH с зондом на участок 1q12, общий вид (А). Иллюстрация определяемых параметров: радиус-вектора меток (r1 и r2) и радиуса клеточного ядра (Б).

Основной параметр - значение нормированного к радиусу ядра радиус-вектора метки (r). Результат представляли в виде гистограмм кумулятивного частотного распределения сигнала (для 300-500 ядер) по значению r (рис.5). Большая часть ядер интактных лимфоцитов и лимфоцитов, инкубированных в присутствии среды культивирования интактных клеток или в присутствии вкДНК^К, характеризуется максимальными значениями r. Подобный профиль распределения изменяется при воздействии ионизирующего излучения (10 сГр), среды культивирования облучённых лимфоцитов, 10 мкМ Н₂О₂, вкДНК^R или вкДНК клеток, обработанных Н₂О₂ (вкДНК^ОХ): уменьшается количество ядер с примембранной локализацией зонда (0.8 < r ? 1) и увеличивается число ядер с r < 0.8. Помимо гистограмм распределения, эффект более наглядно может быть охарактеризован табличной величиной (F_r), отражающей частоту встречаемости значений r от 0.8 до 1 в процентах (рис.6).

Рис.5. (А) Кумулятивное частотное распределение гибридизационного сигнала локуса 1q12 по нормированному радиус-вектору r (0 - центр ядра), полученное для контрольных G₀-лимфоцитов (К), подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (R) и Н₂О₂ в концентрации 10 мкМ (Н₂О₂). Распределения r для (R) и (Н₂О₂) отличаются от (К): D = 0.58; б << 10^-5, D = 0.55; б << 10^-5 соответственно. (Б) Распределения r для клеток, обработанных вкДНК^К, вкДНК^R, вкДНК^ОХ (50 нг/мл, 3 часа). Распределения r для (вкДНК^R) и (вкДНК^ОХ) отличаются от вкДНК^К (D = 0.42; б << 10^-5) и (D = 0.44; б << 10^-5) соответственно. Использован тест Колмогорова-Смирнова.

Рис.6. Изменение значений F_r после воздействия на лимфоциты рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (R), Н₂О₂ (10 мкМ), среды культивирования облучённых и интактных клеток, а также фрагментов вкДНК из среды интактных (вкДНК^К), облучённых (вкДНК^R) и обработанных Н₂О₂ (вкДНК^ОХ) клеток (12 - 130 нг/мл, 3 часа). n - число независимых экспериментов.

В контрольных лимфоцитах F_r составляет ~ 60. После облучения или воздействия Н₂О₂ F_r уменьшается до 10-20 %. При культивировании интактных лимфоцитов в среде облучённых клеток F_r уменьшается до 12-13%, величина эффекта не зависит от количества инкубированных клеток (0.5 - 1.0 · 10⁶, 10⁵ и 10⁴ клеток/мл) которые продуцировали в среду факторы стресс-сигнализации после облучения. Среда интактных клеток не влияет на величину F_r. Таким образом, мы показали, что рассматриваемая клеточная реакция передается необлучённым клеткам по механизму ЭС, благодаря факторам, присутствующим в среде культивирования облучённых клеток. Добавление к интактным клеткам фрагментов вкДНК^R и вкДНК^ОХ вызывает те же эффекты, что и среда культивирования облучённых клеток, а также прямое действие радиации и Н₂О₂, величина данного эффекта практически не зависит от концентрации вкДНК^R и вкДНК^ОХ в интерваде 12 - 130 нг/мл. В то же время в присутствии вкДНК^К в среде культивирования интактных клеток, описываемые эффекты не наблюдаются. Эти эффекты также отсутствуют, если вкДНК^R, обработать ДНКазой-1 ("исчерпывающий" гидролиз).

2) Изменение площади Ag-окраски ядрышка. Ранний ответ лимфоцитов человека на действие радиации в малой дозе (Вейко Н.Н. и соавт., 2004) и других стимулирующих факторов сопровождается увеличением транскрипции рибосомных генов, что отражается в увеличении площади окрашиваемого серебром материала ядрышка, где локализованы рибосомные гены (Lйger I. et al., 1994; Derenzini М., Trerи D., 2001). Данный вариант регистрации увеличения активности рибосомных генов позволяет проанализировать поклеточно ответ всей популяции лимфоцитов. После воздействия рентгеновского излучения на лимфоциты в 2-3 раза увеличивается средняя суммарная площадь окрашиваемых серебром ядрышек и их число (рис.7). Причем величина средней суммарной площади (S_Ag) более адекватно отражает увеличение активности ядрышка.

Рис.7. Анализ активации рибосомных генов в G₀-лимфоцитах человека. (а) Общий вид окрашенного AgNO₃ препарата фиксированных ядер лимфоцитов. Примеры анализа ядер с одним (б) и несколькими ядрышками (в, г).

На рис.8 для сравнения представлены значения S_Ag для ядер лимфоцитов, подвергшихся "прямому" воздействию ионизирующего излучения или Н₂О₂, культуральной среды интактных и облучённых клеток, а также вкДНК среды культивирования. В клетках-свидетелях при инкубации в среде облучённых лимфоцитов (независимо от концентрации в ней облучённых клеток-мишеней) в 1.5 - 1.7 раза по сравнению с контролем увеличивается S_Ag, аналогичные изменения происходят при добавлении вкДНК^R и вкДНК^ОХ.

Рис.8. Изменение S_Ag в G₀-лимфоцитах человека после воздействия радиации в малой дозе (10 cГр), 10 мкМ Н₂О₂, среды культивирования облучённых (0.5 - 1.0 · 10⁶, 10⁵ и 10⁴ клеток/мл) и интактных клеток, а также фрагментов вкДНК^К, вкДНК^R и вкДНК^ОХ (12 - 130 нг/мл, 3 часа). n - число независимых экспериментов.

(3,4) Изменение активности TNF-б и концентрации нитрита. В связи с тем, что некоторые исследователи предполагают, что цитокин TNF-б (Morgan W. F., 2003; Natarajan M. et al., 2007; Luce A., 2009) и молекула окиси азота (NO) (Azzam E.I. et al., 2002; Matsumoto H. et al., 2007; 2010; Morgan W. F., 2010) являются сигнальными факторами в ЭС, было проанализировано изменение активности TNF-б и концентрации метаболита NO - нитрита после воздействия рентгеновского излучения и вкДНК. При прямом действии радиации, как и при добавлении вкДНК^R, происходит значительное увеличение концентрации цитокина TNF-б. Ионизирующее излучение и фрагменты вкДНК также стимулируют увеличение концентрации нитрита в среде культивирования (рис.9).

Рис.9. Относительные изменения активности TNF-б и концентрации нитритов в среде культивирования после воздействия на лимфоциты радиации в малой дозе (10 сГр) и фрагментов вкДНК из среды интактных (вкДНК^К) и облучённых клеток (вкДНК^R). n - число независимых экспериментов.

Таким образом, вкДНК, выделенная из среды культивирования облучённых клеток, вызывает те же изменения в интактных лимфоцитах, что и ионизирующее излучение:

(1) перемещение участков гетерохроматина первой хромосомы из примембранных областей ядра во внутреннюю;

(2) активацию транскрипции рибосомных генов;

(3) увеличение активности цитокина TNF-б;

(4) увеличение концентрации метаболита окиси азота.

ВкДНК^R можно рассматривать как фактор сигнализации в ЭС, который переносит информацию о повреждающем воздействии от облучённых лимфоцитов - необлучённым.

4. Роль апоптоза в раннем ответе лимфоцитов на действие радиации

Основной источник вкДНК^R - апоптотические клетки (Choi J. J. et al., 2005; Ермаков А.В. и соавт., 2007б). Блокирование апоптоза облучённых клеток сопровождается снижением концентрации вкДНК^R (см. п.2). Чтобы показать, что свойство вкДНК^R быть фактором сигнализации в ЭС зависит от её происхождения из апоптотических облучённых клеток, было исследовано влияние блокирования апоптоза на это свойство. Введение ингибитора (Biotin-DEVD-FMK, 2 мкМ) в среду за 30 мин. до облучения снижает в клетках активность каспазы-3 в 3 раза. Ингибирование апоптоза облучённых лимфоцитов приводит к полной блокировке раннего ответа клеток на действие облучения: локусы 1q12 не изменяют своего положения в ядре (рис.10), и не происходит увеличения площади S_Аg ядрышка (рис.11).

Рис.10. А - кумулятивное частотное распределение гибридизационного сигнала локуса 1q12 по нормированному радиус-вектору r полученное для контрольных G₀-лимфоцитов (К) и подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (R) в отсутствии и присутствии ингибитора каспазы-3. Распределения (К) и (R) достоверно различаются (D = 0.47; б <<10^-5). Б - изменение значений F_r после воздействия на лимфоциты радиации, вкДНК^К, вкДНК^R (12 нг/мл, 3 часа), а также вкДНК из среды культивирования лимфоцитов, в которых ингибирован апоптоз.

Рис.11. Изменение S_Ag после воздействия на лимфоциты радиации, вкДНК^К, вкДНК^R (12 нг/мл, 3 часа), а также вкДНК из среды культивирования лимфоцитов, в которых ингибирован апоптоз.

Если из среды, в которой культивировались облучённые лимфоциты с ингибитором апоптоза, выделить фрагменты вкДНК^R и добавить их к интактным клеткам, то они не будут обладать стимулирующей активностью: локусы 1q12 не меняют своего положения, и не происходит активации ядрышка (рис.10-11).

Также было показано, что процесс апоптоза важен не только для ответа клеток на действие радиации, но и для развития ЭС в присутствии вкДНК^R. Если к клеткам, в которых заблокирован апоптоз, добавить вкДНК^R, то, как и при "прямом" действии радиации, не происходит изменения положения локусов 1q12 и увеличения S_Аg (табл.1).

Таблица 1. Изменение положения локуса 1q12 и величины S^R_Ag в ядрах лимфоцитов, культивируемых в присутствии вкДНК^К, вкДНК^R и Biotin-DEVD-FMK

Варианты опытов	Fr, %	SRAg / SKAg
	Контроль	Biotin-DEVD-FMK	Контроль	Biotin-DEVD-FMK
вкДНКК (12 нг/мл)	66 ± 2	69 ± 3	1.0 ± 0.1	1.1 ± 0.1
вкДНКR (12 нг/мл)	12 ± 2*	69 ± 1	2.7 ± 0.3**	1.2 ± 0.1

(*) б << 10-⁵; (**) р < 0.001 (t-тест)

Рис.12. Изменение активности TNF-б и концентрации нитрита в среде культивирования, после воздействия на лимфоциты вкДНК^К, вкДНК^R, а также при добавлении вкДНК^R к лимфоцитам, в которых заблокирован апоптоз ингибитором Biotin-DEVD-FMK. (*) p < 0.05 (U-тест).

Блокирование апоптоза при действии вкДНК^R на лимфоциты сопровождается также блокированием другого эффекта - синтеза дополнительных количеств NO, который наблюдается в отсутствии ингибитора апоптоза. Активность цитокина TNF-б при таких условиях (вкДНК^R + ингибитор) по-прежнему возрастает (рис.12) по сравнению с контролем. Таким образом, апоптоз облучённых клеток является важной составляющей в реализации эффекта свидетеля и в появлении у вкДНК способности быть фактором сигнализации в ЭС.

5. Роль АФКиА в раннем ответе лимфоцитов на облучение

Ионизирующая радиация может оказывать прямое воздействие на ДНК, вызывая одно - и двунитевые разрывы при непосредственном попадании частицы в её макромолекулу, и непрямое, опосредуемое активными формами кислорода и азота (АФКиА), возникающими в процессе ионизации (Leach J. K. et al., 2001; Morgan W. F., Hartmann A., 2002; Slupphaug G., 2003; Lubrich A. et al., 2010). Чтобы понять значение синтеза АФКиА в раннем ответе клеток на радиацию, было исследовано сравнительное действие на лимфоциты радиации в малых дозах и Н₂О₂ в малых концентрациях (см. рис.5 и 6). Дополнительно была исследована реакция лимфоцитов на перечисленные выше воздействия в присутствии ингибитора АФКиА - б-токоферола (Меньщикова Е.Б. и соавт. 2006).

Рис.13. Кумулятивное распределение гибридизационного сигнала локуса 1q12 по радиус-вектору r, полученное для G₀-лимфоцитов в присутствии б-токоферола (10 мкМ): контрольных (К), подвергнутых воздействию радиации в дозе 10 сГр (R) и 10 мкМ Н₂О₂ (Н₂О₂). Распределения значений r для (R) и (Н₂О₂) статистически не отличаются от (К): D = 0.05; б = 0.8.

Рис.14. Отсутствие достоверных изменений значений F_r и S_Аg после воздействия на лимфоциты радиации, Н₂О₂, вкДНК^К, вкДНК^R, вкДНК^ОХ (12 нг/мл, 3 часа) в присутствии б-токоферола (100 мкМ). n - число независимых экспериментов.

После воздействия и радиации и 10 мкМ Н₂О₂ уменьшается количество ядер с примембранным расположением локусов и возрастает суммарная площадь S_Ag в ядре. Такие же изменения происходят при добавлении в среду интактных клеток вкДНК^R и вкДНК^ОХ (см. рис.5, 6,8). Блокирование АФКиА б-токоферолом полностью подавляет обе клеточные реакции как в случае прямых повреждений, так и при действии вкДНК^R или вкДНК^ОХ (рис.13, 14). Таким образом, синтез АФКиА - одна из главных составляющих ответа лимфоцитов и на "прямое" действие радиации и в реализации ЭС, опосредуемом вкДНК^R.

6. ДНК-узнающие рецепторы, опосредующие действие вкДНК^R

Возникает вопрос, каким образом фрагменты вкДНК^R (вкДНК^ОХ) влияют на клетки-свидетели? Для развития в клетках-свидетелях аналогичных с облучёнными лимфоцитами эффектов необходим контакт реципиентов с факторами сигнализации. Можно предположить, что в передаче сигнала при ЭС участвуют известные клеточные рецепторы TLR9, которые могут взаимодействовать с некоторыми из фрагментов вкДНК^R. (Hemmi H. et al., 2000; Ahmad-Nejad P. et al., 2002; Latz E. et al., 2004; Tobias P., Curtiss L. K., 2005; Krieg A. M., 2008; Hennessy E.I. et al., 2010; Barber G. N., 2011). Образование комплекса "ДНК-TLR9" инициирует клеточный сигнальный путь, связанный с активацией фактора транскрипции NF-кB посредством участия адаптерной молекулы MyD88, что сопровождается, в том числе, и синтезом АФКиА. Чтобы проверить предположение об участии TLR9 в развитии ответа клеток на облучение, проведены два эксперимента. В первом опыте измерялись относительные количества мРНК TLR9 и MyD88. Во втором опыте TLR9 блокировали двумя типами ингибиторов: хлорокином (изменяет pH в эндосомах, где и реализуется взаимодействие ДНК с TLR9) и олигонуклеотидом-супрессором 2088 (конкурент за связывание лигандов с TLR9, (Duramad O. et al., 2005)). Для оценки изменения количества мРНК TLR9 и MyD88 с помощью обратной транскриптазы из клеточной РНК была получена кДНК. Количество кДНК определяли методом количественной ПЦР (вариант TaqMan), внутренний стандарт - ген GAPDH, рис.15.

Ионизирующая радиация в малой дозе стимулирует в лимфоцитах экспрессию генов TLR9 и MyD88 в 3-4 раза. В присутствии Н₂О₂ также увеличивается количество мРНК этих генов в 1.5 - 4 раза в зависимости от концентрации агента (рис.15, А). Аналогичное действие на экспрессию генов TLR9 и MyD88 в лимфоцитах оказывает вкДНК^R (12 нг/мл), рис.15, Б. Для сравнения использовался классический лиганд для TLR9 - ДНК E. coli. (Hemmi H. et al., 2000). Во всех перечисленных случаях наблюдается достоверное увеличение в несколько раз количества мРНК TLR9 и MyD88.

При блокировании TLR9 олигонуклеотидом 2088 (3 мкг/мл) или хлорокином (2 мкг/мл) в лимфоцитах-свидетелях не происходит изменений примембранной локализации локусов 1q12 после добавления фрагментов вкДНК^R (табл.2).

Однако активация ядрышка имеет место: после внесения в инкубационную среду вкДНК^R, средняя площадь окрашенных серебром участков в ядрах возрастает в 2.3 и 2.7 раза при использовании соответственно хлорокина или олигонуклеотида. Добавление в культуральную среду необлучённых лимфоцитов олигонуклеотида или хлорокина не приводит к транспозиции локусов хромосом или активации ядрышка.

Таблица 2. Изменение значений F_r и S_Ag при культивировании лимфоцитов с вкДНК в присутствии ингибиторов TLR9

Опыт	Fr, %	SRAg / SKAg
	контроль	хлорокин	олигоN 2088	контроль	хлорокин	олигоN 2088
вкДНКК	66 ± 2	66 ± 1	68 ± 3	0.8 ± 0.1	1.2 ± 0.1	1.3 ± 0.1
вкДНКR	12 ± 2*	63 ± 2	69 ± 1	2.7 ± 0.2 **	2.3 ± 0.2 **	2.7 ± 0.2 **

(*) б << 10^-6; (**) р < 0.001 (t-тест)

Рис.15. Изменение количества мРНК TLR9 и MyD88 при действии на лимфоциты радиации, Н₂О_{2 (}А), а также при воздействии разных образцов ДНК (Б). Значения нормированы на величину в контроле. Время инкубации - 3часа. Все варианты достоверно отличаются от контроля (К и вкДНК^К), p < 0.05. n - число независимых экспериментов.

При блокировке рецепторов TLR9 не происходит увеличения активности TNF-б и увеличения концентрации нитрита в присутствии вкДНК^R по сравнению с контролем (рис.16). Очевидно, в реализации стимулирующего действия вкДНК^R на синтез TNF-б и окиси азота лимфоцитами-свидетелями задействован клеточный сигнальный путь, связанный с рецепторами TLR9.

Таким образом, в ответе клеток на действие радиации и вкДНК^R (ЭС) участвуют известные ДНК-узнающие рецепторы TLR9. Поскольку некоторые из реакций (активация ядрышка) не блокируются ингибиторами TLR9 в облучённых лимфоцитах и лимфоцитах-свидетелях, то можно предположить наличие дополнительных ДНК - узнающих рецепторов иной природы.



Рис.16. Влияние ингибирования TLR9 хлорокином (2 мкМ) и олигонуклеотидом 2088 (3 мкг/мл) на способность вкДНК^R стимулировать увеличение активности TNF-б и концентрации нитритов в среде культивирования (вкДНК^R, 50 нг/мл, 3 часа). (*) - обозначены варианты, которые достоверно отличаются от контроля (p < 0.05) (U-тест). n = 3.

7. Состав вкДНК влияет на эффекты, индуцируемые ионизирующей радиацией в лимфоцитах человека

Для ответа на вопрос о возможности моделирования клеточного ответа на воздействие радиации путём изменения состава последовательностей вкДНК, была проведена серия опытов, в которых на лимфоциты одновременно действовали ионизирующим излучением (10 сГр) и модельными фрагментами CpG-ДНК. В качестве источника CpG-ДНК использовали линеаризованную плазмиду, содержащую фрагмент ТОрДНК (участок от - 515 до 5321 нуклеотидов в соответствии с HSU 13369, "GeneBank") и встроенную в вектор pBR322. Препарат вводили в конечной концентрации 50 нг/мл. После облучения клеток и последующего их культивирования в среде, содержащей CpG-ДНК, профиль распределения r приближается к таковому для неэкспонированных лимфоцитов (рис.17, А). Также не происходит увеличения площади серебрящегося материала (рис.17, Б).

Рис.17. Изменение положения прицентромерного гетерохроматина локусов 1q12 и площади S_Ag в ядрах G₀-лимфоцитов человека после облучения (10 сГр) или совместного воздействия радиации и рибосомного повтора (10 сГр + ТОрДНК). Распределения значений r для (10 сГр) и (10 сГр + ТОрДНК) статистически отличаются от (К): D = 0.61; б << 10^--5 и D = 0.51; б << 10^--4 соответственно; (*) p < 0.05 (U-тест), n=3.

Совместное действие радиации и рибосомного повтора значительно снижает экспрессию TLR9 и MyD88 (рис.18, А). После совместного действия радиации и рибосомного повтора на лимфоциты уровень активности TNF-б значительно возрос по сравнению с контрольным (рис.18, Б).

Рис.18. А - изменение количества мРНК TLR9 и MyD88 при действии рентгеновского излучения (10 сГр) или совместного действия радиации и рибосомного повтора (10 сГр + ТОрДНК). Значения нормированы на величину в контроле. Все варианты достоверно отличаются от контроля, p < 0.05, n=3. Б - изменение активности TNF-б в инкубационной среде при аналогичных условиях. (*) - (p < 0.05) (U-тест), n = 3.

Таким образом, ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения можно значительно изменить, изменив состав вкДНК в среде облученных клеток, например, путем введения последовательностей, содержащих CрG - повторы.

Заключение

В ходе проведённой работы были проанализированы эффекты, сопровождающие ранний (3 часа) клеточный ответ на повреждающее воздействие, которые сравнивались с клеточными реакциями на действие депротеинизированных образцов внеклеточной ДНК, выделенной из среды культивирования клеток. Анализ этих результатов позволил предложить схему развития раннего ответа всей клеточной популяции на действие ионизирующего излучения в малой дозе (рис. 19). Интактные лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, исходно содержат поврежденные/апоптотические клетки. Культивирование этих клеток приводит к потере части хроматина. Фрагменты хроматина из таких клеток переходят в среду культивирования и образуют пул вкДНК^{K (}рис. 19, клетка №4). Через 3 часа от начала культивирования количество гиподиплоидных клеток составляет в среднем 3% от числа клеток всей популяции, количество вкДНК^K в среде - около 1% от суммарного количества ДНК клеток.

Частицы высоких энергий при облучении проходят через определённое количество клеток популяции (зависящее от дозы излучения) и вызывают первичные эффекты - повреждение биомолекул, в том числе индукцию одно - и двунитевых разрывов ДНК, и окислительный стресс (ОС). В экспонированных клетках активируются системы репарации. Повреждения, связанные с двунитевыми разрывами и окислительной модификацией ДНК, будут удалены, при этом есть вероятность, что в геноме такой клетки возникнут мутации (рис. 19, клетка №1). При невозможности репарации серьезных повреждений клетка гибнет по механизму апоптоза (рис. 19, клетка №3), и в среде появляются фрагменты вкДНК^R. Основное отличие этих фрагментов от вкДНК^К - это повреждение ДНК. Химическая природа повреждений ДНК в условиях окислительного стресса, вызванного радиацией или другим индуктором ОС (например, перекисью водорода), очень хорошо изучена (Dizdaroglu М., 1992; Breen A. P., Murphy J. A., 1995; De Bont R., van Larebeke N., 2004; Radulescu I. et al., 2004; Shi S. et al., 2007; Falk M. et al., 2008). Основная модификация - это образование 8-оксогуанозина и, в меньшем количестве, тимидингликоля. Кроме того, образуются внутри - и межмолекулярные сшивки, одно - и двунитевые разрывы. Очевидно, именно благодаря окислительной модификации, вкДНК^R (а также вкДНК^ОХ из среды клеток, обработанных перекисью) приобретает особые, по сравнению с вкДНК^К, свойства - она становится фактором стресс-сигнализации в клеточной культуре.

Рис. 19. Гипотетическая схема развития раннего ответа лимфоцитов на ионизирующее излучение в малых дозах.

Чтобы в популяции лимфоцитов наблюдались эффекты, связанные с облучением, необходимо обязательное соблюдение двух условий: (1) присутствие в клетке активных форм кислорода и азота (т.е. возможность окислительной модификации клеточной ДНК) и (2) протекание процесса апоптоза повреждённых клеток (т.е. переход ДНК апоптотической клетки в среду культивирования). Блокирование хотя бы одного из процессов - увеличение количества АФКиА (б-токоферолом) или апоптоза (ингибитором каспазы-3) приводит к тому, что вся клеточная популяция перестает отвечать развитием реакций раннего ответа на действие радиации. Таким образом, с точки зрения рассматриваемых в представленной работе клеточных реакций (перемещение локусов хромосом, активация ядрышка, увеличение активности в среде TNF-б и количества NO), "ранний ответ" лимфоцитов на облучение обязательно включает в себя эффект свидетеля, опосредуемый фрагментами "окисленной" вкДНК. Показано, что способность вкДНК^R стимулировать в интактных клетках эффекты, сходные с действием радиации, не является результатом существенного изменения её состава по сравнению с вкДНК^К. Не обнаружено изменения содержания трёх повторов генома во вкДНК^К и вкДНК^R по сравнению с геномной ДНК, выделенной из клеток.

Фрагменты вкДНК^R "выщепляются" эндонуклеазами из хроматина апоптотических клеток в среду культивирования, где взаимодействуют с ДНК - узнающими рецепторами интактных клеток (рис. 19, III). В литературе рассматривают несколько вариантов взаимодействия вкДНК с клеткой (Vlassov V. V. et al., 2007). Наиболее изучено взаимодействие вкДНК с рецепторами хорошо охарактеризованного семейства TLR (TLR9). Оказалось, что три исследованных эффекта (перемещение локусов хромосом, увеличение активности в среде TNF-б и количества NO) зависят от активности этих рецепторов. Введение в клетки двух известных ингибиторов TLR9 (хлорокин и олигоdN 2088) приводит к блокированию перечисленных эффектов. Стимуляцию сигнального пути, связанного с активацией TLR9 при действии радиации (опосредованном вкДНК^R), дополнительно подтверждают данные об увеличении экспрессии на уровне транскрипции двух основных участников ответа: белка TLR9 и белка-адаптора этого сигнального пути (MyD88). Но один эффект - активация транскрипции рибосомных генов - не зависит от присутствия ингибиторов TLR9. Таким образом, можно предположить, что имеются альтернативные пути воздействия вкДНК^R на интактные лимфоциты. Существование других типов рецепторов, опознающих фрагменты ДНК, было уже показано в ряде недавних работ других авторов (Wang L. et al., 2008; Barber G. N., 2011).

...