Достаточно трудно, при имеющихся неполных наших и литературных данных, ответить на вопрос о причинах появления у окисленной ДНК (вкДНК^R и вкДНК^ОХ) свойства выступать в роли лиганда TLR9. Этот вопрос требует дальнейшего исследования. Возможно, что TLR9 активируются не в результате связывания с лигандом, а в результате стимуляции другого клеточного каскада, звеном которого является путь, связанный с TLR9. Более вероятным, однако, кажется следующее объяснение. Окислительная модификация ДНК может приводить к нарушению баланса последовательностей лигандов и последовательностей ингибиторов TLR9 в составе геномной ДНК. Известно, что окисление гуанозина до 8-оксогуанозина идет преимущественно в составе последовательностей G_n (Murata M., Kawanishi S., 2002; Oikawa S. et al., 2002), но именно эти повторы являются эффективными ингибиторами связывания лигандов с TLR9 (Peter M. et al., 2008). В интактной ДНК в среднем, по очень заниженным подсчетам, на 1 последовательность-лиганд приходится 10-15 последовательностей-ингибиторов (Костюк С.В. и соавт., 2010). Реально это соотношение для геномной ДНК млекопитающих ещё выше, поскольку лигандом для TLR9 является только неметилированная CpG - содержащая последовательность, которой немного в ДНК вследствие высокого уровня её метилирования. Если ингибиторы G_n будут преимущественно модифицированы окислением и не смогут связаться с TLR9, чтобы их заблокировать, то способность ДНК к взаимодействию с TLR9 должна возрасти. Эта очень интересная гипотеза будет проверена в ближайшее время.

Взаимодействие TLR9 с лигандами запускает в клетке каскад событий, сопровождающийся синтезом АФКиА. Стимуляция рецепторов TLR9 сопровождается образованием радикала О₂^{- (}Henneke P. et al., 2002), выделением NOи АФК (Adachi Y. et al., 2006), в том числе пероксинитрита (Jozsef L. et al., 2006). Образующиеся малоактивные О₂^-, NOили Н₂О₂ в результате последовательных ферментативных процессов с участием металлосодержащих комплексов могут давать начало высокореакционным соединениям: OH, гипогалогенным кислотам и ¹О₂, NOи NO₂ (Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006). На возможное участие в ЭС реакции Фентона указывают также в работе (Matsumoto H. et al., 2007).

Таким образом, взаимодействие белков-рецепторов TLR9 с фактором стресс-сигнализации в составе вкДНК^R сопровождается вторичным ОС в клетках-свидетелях, в отличие от первичного ОС, вызванного прямым действием радиации. Очевидно, что вторичный ОС индуцирует в небольшом числе клеток те же события, что и первичный ОС - окислительную модификацию ДНК и гибель клеток с высоким уровнем повреждений продуктами ОС. Уровень гибели клеток при вторичном ОС будет ниже, чем при первичном действии радиации, т.к. повреждение клеток не осложняется наличием двунитевых разрывов. По-видимому, в результате активации в клетках антиокислительных систем со временем ответ на однократное действие радиации будет уменьшаться, поскольку будет снижаться уровень окислительной модификации ДНК и количество апоптотических клеток, которые являются донорами активных фрагментов вкДНК. Данные, полученные в предыдущих исследованиях, показывают, что наблюдаемые эффекты детектируются спустя 1-6 часов после облучения, а через 24 часа уменьшаются (Спитковский Д. М., 2005). Важно отметить, что способность вкДНК^R индуцировать в клетках-свидетелях наблюдаемые эффекты не зависит от концентрации вкДНК^R (в проверенном диапазоне от 12 нг/мл до 130 нг/мл), но зависит от синтеза АФКиА и апоптоза. Это подтверждает предположения о "третичном" окислительном стрессе и апоптозе, который посредством вкДНК^ОХ "поддерживает" сигнал от первичного (радиация) и вторичного (вкДНК^R) воздействия.

Таким образом, в ходе данного исследования показано, что внеклеточная ДНК, донором которой служат погибшие вследствие первичного повреждающего воздействия апоптотические клетки, действительно является растворимым фактором стресс-сигнализации в реализации эффекта свидетеля, вызванного действием ионизирующей радиации в малой дозе.

Описанная схема развития раннего ответа на ионизирующее излучение в популяции лимфоцитов была подтверждена для других типов культивируемых клеток человека в работах, проведенных в лаборатории молекулярной биологии МГНЦ РАМН. Эта схема справедлива для эндотелиальных клеток культуры HUVEC (Ermakov A. V. et al., 2011) и для мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (Ermakov A. V. et al., 2011а; Ермаков А.В. и соавт., 2010).

Очевидно, предложенная схема может объяснить не только действие радиации на популяцию лимфоцитов, но и некоторые другие эффекты, связанные с индукцией окислительного стресса в клеточных культурах и в организме. Например, недавно было показано, что вкДНК больных острым инфарктом миокарда (который всегда сопровождается высоким уровнем ОС) оказывает сильное биологическое действие на культивируемые клетки (нейроны крысы (Efremova L. V. et al., 2010)) и клетки HUVEC (Алексеева А.Ю. и соавт., 2010). ВкДНК^ОХ из апоптотических (вследствие ОС) клеток может выступать в организме в роли агента, непрерывно поддерживающего ОС. Это особенно актуально при патологии, сопровождающейся высоким уровнем ОС, а также при старении. В рамках настоящей работы показано, что изменение свойств вкДНК (например, добавление последовательностей ингибиторов или лигандов TLR9) может существенно изменить эффекты, индуцируемые ионизирующей радиацией.

ВЫВОДЫ

1. Действие ионизирующего излучения в малой дозе на лимфоциты человека сопровождается увеличением в среднем в 1.5 раза количества апоптотических клеток и увеличением эндонуклеазной активности клеток. В результате в среде культивирования появляется внеклеточная ДНК с изменёнными свойствами.

2. Внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых лимфоцитов - значимый фактор стресс-сигнализации при развитии эффекта свидетеля в клеточной популяции.

3. Для проявления сигнальной функции вкДНК, в облучённых лимфоцитах должны соблюдаться два основных условия: синтез активных форм кислорода/азота и апоптоз облучённых клеток.

4. В реализации сигнальной функции вкДНК в облучённых лимфоцитах принимают участие рецепторы TLR9.

5. Ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения в малых дозах зависит от содержания во вкДНК GC - богатых последовательностей генома.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Е.С. Ершова, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко. Фрагменты внеклеточной ДНК из среды инкубирования лимфоцитов человека, облученных в малых дозах, запускают развитие окислительного стресса и адаптивного ответа в необлученных лимфоцитах-свидетелях. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т.48. № 5. - С.553-564.

2. A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, M.S. Konkova, N.A. Egolina, E.M. Malinovskaya, N.N. Veiko. Factors of stress signaling X-irradiated and noniradiated human lymphocytes. // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2008 - V.1137. - P.41-46.

3. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Е.А. Калашникова, С.Н. Кокаровцева, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко. CpG-ДНК ингибирует клеточные реакции, сопровождающие развитие адаптивного ответа в лимфоцитах человека после воздействия рентгеновского излучения в малых дозах. // Радиационная биология. Радиоэкология - 2009. - Т.49. № 1. С.34-41.

4. A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, N.A. Egolina, L.V. Efremova, N.N. Veiko. Oxidative stress as a significant factor for development of an adaptive response in irradiated and nonirradiated human lymphocytes after inducing the bystander effect by low-dose X-radiation. // Mutation Research. - 2009. - V.669. № 1-2. - P.155-161.

5. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Е.С. Ершова, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Л.В. Ефремова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко. Реакция раковых стволовых клеток человека на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах. // Радиационная биология. Радиоэкология - 2009. - Т.49. № 5. С.528-537.

6. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Р.Н. Вейко, И.Ю. Кубасова, Л.Н. Любченко, Н.Н. Вейко. Развитие эффекта свидетеля в мезенхимальных стволовых клетках человека после воздействия рентгеновского излучения в адаптирующей дозе. // Радиационная биология. Радиоэкология - 2010. - Т.50. № 1. С.42-51.

7. С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Ефремова, М.С. Конькова, А.Ю. Алексеева, Л.В. Каменева, Н.Н. Вейко. Увеличение экспрессии INOS в эндотелиальных клетках человека при длительном культивировании с фрагментами внеклеточной ДНК. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. Т.149. № 9.151-156.

8. M.S. Konkova, A.V. Ermakov,L.V. Efremova, S.V. Kostyuk, N. N. Veiko Influence of X-ray and/or CpG-DNA induced oxidative stress on adaptive response in human lymphocytes. // International Journal of Low Radiation. 2010. Vol.7. № 6. P.446-452.

9. A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Efremova, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko. Development of the adaptive response and bystander effect induced by low-dose ionizing radiation in human mesenchymal stem cells. // in book: Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. Springer. 2011. P.225-231.

10. E.M. Malinovskaya, S.V. Kostyuk, A.V. Ermakov, M.S. Konkova, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, L.V. Efremova, A.Yu. Alekseeva, L.N. Lyubchenko, N.N. Veiko. Fragments of cell-free DNA (cfDNA) enhance transcription activity in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and inhibit their in vitro differentiation. // in book: Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum. Springer. 2011. P. 199-205.

11. A.V. Ermakov, M.S. Konkova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Efremova, N.N. Veiko. An extracellular DNA mediated bystander effect produced from low dose irradiated endothelial cells. // Mutation Research. 2011. [Epub ahead of print].

12. M.S. Konkova, A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, N.A. Egolina, E.M. Malinovskaya, N.N. Veiko. The cell-free DNA fragments are factors of stress-signaling from irradiated to non-irradiated human lymphocytes after exposure by low doses of the X-radiation. // CNAPS-V (“Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum”): Abstracts. - Moscow, 2007. - P.16.

13. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Н.А. Еголина, Н.А. Ляпунова, Н.Н. Вейко. Ранние изменения пространственной организации хроматина лимфоцитов человека при действии повреждающих факторов. // Цитология - 2007. - Т.49. - № 9 - С.744-745.

14. А.В. Ермаков, М.С. Конькова, С.В. Костюк, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко. Значение окислительного стресса для развития адаптивного ответа в облученных лимфоцитах человека и необлученных лимфоцитах-свидетелях после воздействия ионизирующей радиации в малых дозах. // Сборник трудов IVсъезда Рос. Общества биохимиков и мол. биологов. - Новосибирск. 2008, - С. 201.

15. M.S. Konkova, A.V. Ermakov, S.V. Kostyuk, L.V. Efremova, N.A. Egolina, N.N. Veiko. Low-dose X-ray induces an adaptive response in unirradiated bystander lymphocytes by DNA-signaling pathway. // 37ts Annual Meeting of the European Radiation Research Society: Abstracts. - Prague. 2009. - P.109.

16. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Л.В. Ефремова, Н.А. Еголина, Н.Н. Вейко. После воздействия рентгеновского излучения в малой дозе на лимфоциты человека посредством ДНК-сигнального пути в необлучённых лимфоцитах-свидетелях начинает развиваться адаптивный ответ. // Материалы Международной конференции "Биологические эффекты малых доз радиации и радиоактивное загрязнение среды". - Сыктывкар. 2009. - С.69-70.

17. M.S. Konkova, A.V. Ermakov, L.V. Efremova, S.V. Kostyuk, T.D. Smirnova, L.V. Kameneva, L.N. Lyubchenko, N. N. Veiko. Low-doses x-ray induces an adaptive response in human mesenchymal stem cells. // CNAPS-VI (“Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum”): Abstracts. - Hong Kong, 2009. - P.23.

18. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Н.Н. Вейко. Развитие эффекта свидетеля индуцированного малой дозой ионизирующего излучения в мезенхимальных стволовых клетках человека. // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. - Медицинская генетика. - 2010. С.90.

19. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Н.Н. Вейко. Структурно-функциональные изменения хроматина, индуцированные воздействием радиации, сопровождают развитие эффекта свидетеля в разных типах клеток человека. // Материалы XVI Всероссийского симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Цитология. - 2010. - Том 52. № 8. - C.664.

20. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В., Н.Н. Вейко. Фрагменты внеклеточной геномной ДНК - фактор стресс-сигнализации при радиационном эффекте свидетеля, развивающегося в монослойной культуре клеток человека. // Материалы VI съезда по радиационным исследованиям. Москва. 2010. - С.37.

21. М.С. Конькова, А.В. Ермаков, С.В. Костюк, Т.Д. Смирнова, Л.В. Каменева, Н.Н. Вейко. Реакция эндотелиоцитов человека на воздействие рентгеновского излучения в малой дозе. // Материалы 4 международной школы молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки". - Москва. 2010. - С.118-120.

Список использованных сокращений