Размещено на http://www.allbest.ru/

КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ CHELIDONIUM MAJUS (ЧИСТОТЕЛА БОЛЬШОГО)

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Чомаев Хаджи-Мурат Пахарбиевич

Саратов 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Бородулин Владимир Борисович;

доктор медицинских наук, профессор Свистунов Андрей Алексеевич.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гладилин Геннадий Павлович;

доктор медицинских наук, профессор Яворский Александр Николаевич.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава».

Защита состоится «___» ___________ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета К 208.094.01 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан «___» ___________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Бородулин В.Б.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Одной из основных причин смертности в большинстве стран мира являются злокачественные новообразования. В общей структуре летальности они составляют до 15-20 %. По данным ВОЗ, заболеваемость различными опухолями колеблется от 150 до 400 случаев на 100 тыс. населения (Балаж А., 1987; Лемеш В.М., 1996). В настоящее время достигнуты существенные успехи в химиотерапевтическом лечении опухолей (Trevisan 2002; Kovala-Demertzi 2003).

Однако применение лекарственных средств синтетического происхождения нередко приводит к побочным реакциям, вызывая интоксикацию организма (Трапезников Н.Н., 1992). Лекарственные средства растительного происхождения имеют широкий спектр действия, менее токсичны, экономически более доступны для больных. Растительные лекарственные средства можно применять длительно, так как не наступает эффекта их кумуляции в организме или привыкания больных к подобным лекарственным препаратам (Kinura T., 1992).

В настоящее время известно о 72 лекарственных растениях обладающих противоопухолевой активностью, например: аконит, календула, полынь, настой крапивы и другие.

Как правило такие растения содержат в своем составе алкалоиды: сангвинарин, бербирин, пальматин, способные взаимодействовать с ферментами и нуклеиновыми кислотами (Гудима С.О., 1994). Несомненный интерес представляет чистотел большой, экстракт которого обладает выраженной антибластомной активностью (Буршина С.Н., 1999).

Одним из перспективных источников таких средств является надземная часть чистотела большого Chelidonium majus L. Сем. Papaveraceae. Лекарственное сырье (трава) этого вида обладает многосторонней фармакологической активностью и применяется в научной и народной медицине как в России, так и за рубежом (Соколов С.Я., Замотаев И. П., 1993). Трава чистотела применяется при лечении многих кожных заболеваний, она обладает противозудным, противовоспалительным, эпителизирующим, антимикробным, фунгистатическим, болеутоляющим действием (Крылов А.А., Марченко В.А., Максютина и соавт., 1991; Турова А.Д., Сапожникова Э.Н., 1983; Жоголев Д.Т., Галин Л.Л., Добросердова И.И., 1994). Заслуживает внимания опыт использования травы чистотела в качестве противоопухолевого средства (Балицкий К.П., Воронцова А.Л., 1976; Балицкий К.П., 1976). Экспериментально доказано, что препараты чистотела задерживают рост злокачественных опухолей и могут использоваться также в дополнительной терапии злокачественных заболеваний, оказывая противометастатическое действие (Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Исаков В.Г. и др., 1991). Это действие очень актуально, так как одной из основных причин смертности в большинстве стран мира являются злокачественные новообразования. В общей структуре летальности они составляют до 15-20%. По данным ВОЗ, заболеваемость различными опухолями колеблется от 150 до 400 случаев на 100 тыс. населения.

Столь разнообразное медицинское применение травы чистотела обусловлено богатым набором биологически активных веществ, прежде всего алкалоидов, содержание которых в сырье достигает 2,0 % (Растительные ресурсы СССР / Под ред. А.А. Федорова, 1985; Акопов И.Э., 1990; Беркало Л.А., 1990; Соколов С.Я., Замотаев И.П., 1993), а также флавоноидов и аскорбиновой кислоты. На фоне большой популярности растения следует признать явно недостаточным использование в официальной российской медицине лишь одной лекарственной формы - настоя травы чистотела большого. Сырьевые запасы данного растения в Саратовской области представлены в большом объеме (Атлас ареалов и ресурсов лекарственных растений СССР, 1983; Эколого-ресурсный атлас, 1996; Забалуев А.П., 2000; Энциклопедия Саратовского края, 2002). Алкалоидный состав чистотела, произрастающего в вышеупомянутом регионе, не изучался, тогда как существует достаточное количество литературы по исследованию качественного и количественного состава алкалоидов чистотела большого из различных мест произрастания (Базук Г.Н., Ловкова М.Я., Сабирова Н.С. и соавт., 1991).

Следует отметить, что изучение влияния экстракта чистотела большого на центральные клетки мишени - нуклеиновые кислоты и плазмидные ДНК, а также исследования тонких биохимических процессов, инициируемых биологически активными соединениями, которые содержатся в экстракте чистотела большого, в настоящее время не производилось. Вышеизложенное позволило нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Целью настоящей работы является выделение алкалоидов из чистотела большого, произрастающего в Саратовской области, а также выяснение клинико-биохимических основ действия экстракта чистотела большого на модельных системах in vivo и in vitro.

Задачи исследования

1. Разработать наиболее оптимальные методы экстрагирования биологически активных соединений из лекарственного растения чистотела большого. чистотел биологический активный пиелонефрит

2. Провести хроматографическое разделение биологически активных соединений, содержащихся в экстракте чистотела большого.

3. Изучить биохимические показатели плазмы крови белых беспородных мышей-самцов после введения им экстракта чистотела.

4. Исследовать противоопухолевую и цитотоксическую активность экстракта чистотела на культурах клеток.

5. Исследовать изменение активности диагностического фермента лактатдегидрогеназы in vitro в плазме крови доноров в присутствии различных концентраций чистотела.

6. Изучить антибактериальное действие чистотела на клетки E. coli, выделенные от больных хроническим пиелонефритом.

7. Изучить взаимодействие биологически активных соединений чистотела с нуклеиновыми кислотами и плазмидными ДНК, выделенными из бактериальных клеток E. coli больных хроническим пиелонефритом.

Научная новизна

Исследована биологическая активность соединений экстракта чистотела большого. Проведено исследование цитотоксичной и противоопухолевой активности экстракта чистотела. Изучено антибактериальное действия экстракта чистотела. Исследованы процессы взаимодействия биологически активных соединений экстракта чистотела с нуклеиновыми кислотами и диагностическим ферментом - лактатдегидрогеназой.

Практическая ценность

Разработаны наиболее оптимальные методы прямой экстракции биологически активных соединений из лекарственного растения чистотела большого.

Обнаружена антибактериальная и антибластомная активность экстракта чистотела большого.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Экстрагирование биологически активных соединений чистотела лучше осуществлять в водные растворы, по сравнению с органическими растворителями.

2. Тонкослойная хроматография является равноценным методом наряду с колоночной хроматографией для выделения биологически активных соединений чистотела.

3. Экстракт чистотела оказывает биологический эффект на прокариотические, эукариотические клетки и многоклеточные организмы.

4. Алкалоиды чистотела взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и плазмидными ДНК.

5. Экстракт чистотела изменяет активность диагностического фермента лактатдегидрогеназы.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на 65-й научно-практической конференции студентов и молодых специалистов СГМУ: «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2004).

Публикации

По результатам проведенных исследований опубликовано 6 работ в центральной и местной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения и методов исследования; четырех глав, отражающих результаты собственных исследований; заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 65 отечественных и 13 зарубежных источников.

Работа иллюстрирована 40 рисунками и 3 таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Объект исследования

Для исследований использовали сбор чистотела большого, обнаруживаемого в районе Кумысной поляны города Саратова. Сбор проводили в начале цветения (май), так как именно в этот период в растении содержится наибольшее количество алкалоидов (Бузук Г.Н., Ловкова М.Я., Булатов А.А. и соавт., 1990). Собранные растения подвергали естественной сушке в тени. Отделяли листья и измельчали в фарфоровой ступке. Для получения водного экстракта навеску растительного материала 1,0 г заливали 10 мл дистиллированной воды. Экстракция осуществлялась в течение 15 минут при температуре 80⁰ С. Для получения хлороформного экстракта 0,5 г растительного материала подвергали экстрагированию 50 мл хлороформа в течение 15 минут при комнатной температуре.

Методы хроматографии и спектрофотометрического анализа для идентификации алкалоидов чистотела большого

Для определения наличия алкалоидов в экстракте чистотела были проведены качественные реакции на алкалоиды. Прежде всего - это общеалкалоидная реакция с кремневольфрамовой кислотой, проводимая непосредственно с экстрактом. Затем был проведен качественный анализ экстракта методом ТСХ (пластинки «Silufol», Cavalie, Чехия) и колоночной хроматографии (молселект Г-25, Reanal, Венгрия) с использованием элюента - бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (4:1:1) (Кирхнер Ю., 1981). Спектральные характеристики соединения изучались с помощью УФ- и видимой спектрометрии (Specord UV-VIS, Германия). Спектральные характеристики исследуемого вещества сравнивали со спектрами поглощения алкалоидов известного строения: сангвинарина, берберина, пальматина.

Проточная цитометрия для определения цитотоксического и противоопухолевого действия экстракта чистотела большого

Приготовление клеточных суспензий. Метод проточной цитометрии позволяет сканировать от 100 до нескольких тысяч клеток в секунду, благодаря чему появляется возможность получения достаточно достоверных результатов за минимальный срок (Cram L.G., Gomez E.R., Thoen C.O. et al., 1976; Lewis D.E. and Rickman W.J., 1992). Однако таким способом можно анализировать только сильно разбавленные клеточные суспензии, поэтому солидные ткани сначала дезагрегировали. Клетки монослоя диспергировали обработкой трипсином в присутствии ЭДТА.

Дезагрегация свежих солидных опухолей. Для получения неочищенных клеточных суспензий использовали аспираты солидных опухолей, взятые с помощью шприца. Эти суспензии затем обрабатывали следующим образом.

Препарат помещали на сеточку из нержавеющей стали с ячейками размером 0,5 мм, расположенную в чашке Петри, и разрезали его на части (1-2 мм3), увлажняли разрезанный препарат модифицированной средой Игла (МЕМ), содержащей 5%-ную сыворотку плода коровы, и осторожно продавливали через сеточку. Сеточку промывали 4 мл МЕМ. Полученную грубую суспензию собирали шприцем на 5 мл, последовательно пропускали через иглы №№19,21,23 и 25. Суспензию фильтровали через найлоновый фильтр с диаметром пор 35 мкм и разводили ее до концентрации 250000 клетка/мл.

Окрашивание ДНК. Процедуру окрашивания ДНК объединяли с дезагрегацией солидных опухолей, что позволяло получать результаты всего за один час.

1. Суспендировали клетки в МЕМ, содержащей 5%-ную сыворотку плода коровы, чтобы концентрация составила примерно 2,5^.10⁵ клеток/мл.

2. Для каждого разведения чистотела брали три маркированные пластиковые пробирки; в две из них наливали по 2 мл суспензии, а в третью - 2 мл среды.

3. Во вторые и третьи пробирки добавляли по 2^.10⁵ лимфоцитов периферической крови человека в 0,1 мл среды. Таким образом, для каждого разведения экстракта имелись три пробирки со следующим содержанием: пробирка А: 10⁶ опухолевых клеток в 2 мл среды; пробирка В: 10⁶ опухолевых клеток и 2^.10⁵ лимфоцитов в 2, 1 мл среды; пробирка С: 2^.10⁵ лимфоцитов в 2,1 мл среды.

4. В каждую из пробирок добавляли 0,5 мл окрашивающего раствора, содержащего: 250 мкг/мл йодистого пропидия (ИП), 1 мг/мл РНК-азы; 1%-ый тритон X-100 в воде.

Таким образом, конечная концентрация этих веществ составляла: ИП - 50 мкг/мл; РНК-аза - 200 мкг/мл; тритон X-100 -2 мг/мл.

5. Суспензию хорошо перемешивали и оставляли на 30 минут для окрашивания при комнатной температуре в защищенном от света месте.

6. Непосредственно перед проведением проточной цитометрии продавливали суспензию через шприц с иглой № 25, чтобы дезагрегировать сгустки.

7. Через цитометр пропускали не менее 104 клеток, регистрировали флуоресценцию ДНК, а также светорассеяние в прямом направлении и под углом 900.

Определение доли клеток, находящихся в S-фазе. Определение клеток в S-фазе митоза проводили с помощью проточного цитофлюориметра ICP 22 фирмы PHYWE (Германия) согласно (Молекулярная клиническая диагностика, 1999). Суть метода состоит в построении прямоугольника, вписывающегося в прстранство между G₁- и G₂-пиками. Высота этого прямоугольника определяется числом клеток, находящихся на 10 центральных каналах области S-фазы, из которого вычислялось среднее число клеток на канал (рис 1).

Рис. 1 Определение доли клеток миеломы в S-фазе митоза: G₁ - диплоидные клетки; G₁/G₀ - тетраплоидные клетки; S, G₂+М - клетки, находящиеся в S, G₂- и М- фазах клеточного цикла

Определение противоопухолевого действия экстракта чистотела. Для определения противоопухолевого действия экстракта чистотела готовили серию разведений в 10, 100 и 1000 раз. Затем клеточные суспензии (приготовление см. выше) инкубировали в присутствии 100 мкл экстракта чистотела соответствующего разведения в течение 30 мин. Количество клеток миеломы мышей линии Sp-2X, находящихся в S-фазе митоза, в присутствии экстракта чистотела определяли методом проточной цитометрии (Молекулярная клиническая диагностика, 1999) после инкубации клеток с исследуемым экстрактом чистотела.

Определение цитотоксического действия экстракта чистотела. Определение цитотоксического действия экстракта чистотела проводили на спленоцитах мышей линии Balb-C с помощью проточного цитофлюориметра. К приготовленным клеточным суспензиям добавляли 100 мкл экстракта чистотела в разведении 10, 100, и 1000, затем суспензии инкубировали в течение 30 мин. Цитотоксическое действие экстракта чистотела определяли методом проточной цитометрии (Молекулярная клиническая диагностика, 1999) после инкубации спленоцитов мышей линии Balb-C c экстрактом чистотела.

Методы исследований биохимических показателей сыворотки крови

Исследовали влияние экстракта чистотела на биохимические показатели крови белых беспородных мышей. Контрольные и экспериментальные группы формировали из самцов. Возраст животных составлял 3-4 месяца, масса - 20±3 г. Всего были составлены
1 контрольная и 4 экспериментальных группы. Каждая группа включала 5 животных.

Животным первой группы перорально вводили экстракт чистотела в объеме 25 мкл, второй групп - в объеме 50 мкл, третьей - 100 мкл и четвертой - 150 мкл. Животные контрольной группы не подвергались никаким воздействиям. Дозы вводили в течение 7 дней.

В клинико-лабораторных исследованиях анализировалась сыворотка крови. Для этого кровь забирали из вены saphena задней лапки мыши по протоколу Laboratory Animals (1998, v.32, p.364-368) в сухую чистую пробирку без использования антикоагулянтов. Для ускоренного образования кровяного тромба пробирку со смешанной кровью помещали на 10 минут в термостат с температурой 37⁰С. Затем, используя тонкую стеклянную палочку, тромб аккуратно отделяли от стенок пробирки. После этого пробирку помещали в центрифугу и центрифугировали в течение 10 минут. Полученную сыворотку переносили в сухую чистую пробирку и использовали для дальнейшего проведения клинико-лабораторного исследования.

Для проведения лабораторного исследования сыворотки крови доноров и сыворотки крови опытных животных использовали биохимический анализатор “Hospitex” (Швейцария), предназначенный для определения биохимических параметров крови: глюкозы, общего белка, лактатдегидрогеназы, мочевины, щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, креатинина, холестерина, г-глутамилтрансферазы, аспартатаминотрансферазы, лактата, альбумина, б-амилазы, креатинкиназы. Методы являются унифицированными (Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и соавт., 1987).

Определение антибактериального действия соединений чистотела на бактериальные клетки штамма E. coli, выделенного от больного Н., страдающего хроническим пиелонефритом, проводили в бактериологической лаборатории Областной клинической больницы г. Саратова.

В эксперименте использовали бактериальные клетки E. coli. Единичная колония выращивалась в 10 мл LB-среды (10 г бактотриптон, 10 г NaCl, 50 мг NaOH фирмы «Реахим» доводилось до 1 л дистиллированной водой и до рН 7,5) при 37 ^оС в течение 18 часов. 5 мкл выращенной культуры помещали в 10 мл LB-среды в полипропиленовом стакане объемом 50 мл, фирма “Nunk”, и выращивали при 37 ^оС в течение 3-4 часов при интенсивном встряхивании до оптической плотности 0,2-0,4 о.е. (л = 600 нм). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «КФК-3». Данная оптическая плотность соответствовала логарифмической фазе роста клеток.

Твердая питательная среда готовилась из LB-среды и агара “Bacto Mac Concey Agar Base” (фирма “Difco”) в пропорции 1 л LB-среды на 20 г агара и автоклавировалась в течение 30 мин при 2 атм., разливалась в чашки Петри диаметром 60 и 90 мм (по 10 или 20 мл соответственно), чашки стерилизовались ультрафиолетом в течение 30 мин. В эксперименте использовались также свежеприготовленные питательные среды.

Непосредственно перед проведением экспериментов по ингибированию готовили серию разведений экстракта чистотела в концентрации от 2Ч10-³ М до 2Ч10-⁶ М в LB-среде. 10 мкл раствора соединений чистотела соответствующей концентрации смешивали с 10 мкл раствора, содержащего около 500-1000 клеток в LB-среде в полипропиленовых пробирках на 0,5 мл (фирма “Eppendorf”) и выдерживали при 20 ^оС в течение 3 часов. Затем 10 мкл бактериальной культуры наносили с помощью автоматической пипетки с полированным наконечником на слой агара в центр чашки и равномерно распределяли по всему слою агара изогнутой стеклянной палочкой. Чашки выдерживали 18 часов при 37^оС, затем подсчитывали абсолютное число выросших колоний. Концентрацию бактериальных клеток в контроле подбирали таким образом, чтобы число выросших колоний составляло 500-1000 колоний на чашке. Учитывая, что процедура посева на каждую чашку занимает несколько минут и при этом продолжается рост клеток, в каждой серии экспериментов по ингибированию ставилось два контроля - в начале и в конце серии.

Подсчет колоний производили на чашках Петри. Статистическая обработка результатов и достоверность полученных данных определяли согласно статистическим методам.

Определение ингибирования роста клеток штамма E. coli соединениями чистотела, полученными двумя различными способами, проводили путем подсчета выросших колоний на твердой питательной среде. Для этого бактериальные клетки после разведения в соответствующее число раз высевались на твердый агар с последующим подсчетом выросших клеточных колоний. В качестве контроля в каждой серии экспериментов по определению антибактериальной активности исследуемых препаратов, взятых в определенной концентрации, ставили контроль - культуру клеток E.coli без экстракта чистотела.

После подсчета клеточных колоний на чашках производилась статистическая обработка полученных результатов. Формула для расчета взята согласно (П.Ф. Рокицкий. Биологическая статистика. - Минск: Изд-во «Высшая школа», 1973):

Размещено на http://www.allbest.ru/

где ч² - критерий соответствия,

О₁ и О₂ - полученные из эксперимента величины общего числа бактериальных клеток, выросших на чашках в контроле и опыте соответственно.

С помощью критерия соответствия определяли величину Р - вероятность значения ч² (величина табличная). Сравнение между собой числа клеточных колоний в контроле и опыте с использованием критерия соответствия ч² указывает на достоверное различие между фактическими и теоретически ожидаемыми результатами (P < 0,001). Это свидетельствует о достоверности полученных результатов.

Статистические методы исследования

Статистическая обработка данных включала расчет следующих параметров [Рокин]:

М - средняя арифметическая, m - ошибка средней арифметической, - среднее квадратичное отклонение

О достоверности отличий учитываемых показателей контрольной и опытной групп судили по величине t - критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

При проведении гель-хроматографии на сефадексе-75 получили нечеткое разделение соединений, входящих в экстракт чистотела. Спектр поглощения появлялся во фракции №3 и№4, объемом по 3 мл. Однако оценить этот спектр достаточно сложно, поскольку он имеет размытые контуры (рис. 3).

Проведение гель-хроматографии на молселекте позволило обнаружить более четкую картину разделения соединений, входящих в состав экстракта чистотела (рис. 2). Фракция №1 имела пики в длинах волн 36,6см (273 нм) и 29,4 см (340 нм), что совпадает с максимумами поглощения пальматина (274 нм и 343 нм). Однако размытость обоих «горбов» не позволяет сделать однозначное заключение об истинном местоположении максимумов поглощения выделенного компонента экстракта чистотела. Соотношение максимумов поглощения близко к 1,5, что ближе к соотношению пиков поглощения сангвинарина. Величина, характерная для пальматина, соответствует 1,0 при сравнении максимумов поглощения этого соединения.

273 нм 340 нм

Рис. 2 Спектр поглощения фракций экстракта чистотела большого после их разделения на молселекте: 1 - вода дистиллированная; 2 - 30 мкл фракции №1; 3 - 60 мкл фракции №1; 4 - фракция №2; 5- фракция №3; 6 - фракция №4; 7 - фракция №5; 8 - фракция №6



265 279 312 347 нм

Рис. 3 Спектр поглощения фракций экстракта чистотела большого после их разделения на сефадексе-75: 1 - фракция N3; 2 - фракция N4

250 267 274 286 306 328 нм

Рис. 4 Спектр поглощения водного экстракта чистотела большого: 1- 30 мкл из исходного экстракта; 2- 60 мкл из исходного экстракта

Спектральные характеристики соединений выделяемых экстракцией из чистотела большого

При проведении ТСХ на хроматограмме экстрактов чистотела (10 мкл) обнаруживается доминирующее пятно вещества желтого цвета с величиной R_f около 0,25, имеющее ярко-желтую флуоресценцию при просмотре хроматограммы в УФ-свете (366 нм).

На пластинку “Silufol” наносили маркерные образцы алкалоидов: сангвинарин, берберин, пальматин, папаверин. Для сравнения использовали витамин В₂ - рибофлавин, содержащий в своей структуре гидрофобное кольцо - изоаллоксазин. Процедуру тонкослойной хроматографии проводили в различных элюентах: изопропанол - вода в соотношении компонентов 1:1, рис 8; изопропанол - водный раствор 0,5м (1 М) NaCl 2:1, рис 9-10; бутанол - уксусная кислота - Н₂О в соотношении 4:1:1, рис 11-12. Расчет подвижности R_f определялся соотношением расстояния Х₁, пройденного зоной вещества от стартовой линии до центра зоны, к расстоянию X_f, пройденному растворителем за то же время (X_f равно расстоянию от стартовой линии до границы фронта растворителя к концу опыта):

R_f = X₁/X_f

В таблице 1 даны сравнительные оценки различных значений R_f для стандартных алкалоидов.

Таблица 1

Значения R_f для алкалоидов при разных условиях ТСХ

Подвижная фаза ТСХ	Rf
	Сангв.	Бербер.	Пальмат.	Гиндар.	Папав.	В2
Изопропанол - Н2О 1:1	0,029		0,029		0,029		0,088			0,073		0,014
Изопропанол - 0,5 М NaCl в Н2О 2:1	0,396		0,428		0,333	0,492	0,603	0,396		0,603		0,382 0,746
Изопропанол - 1 М NaCl в Н2О 2:1	0,128		0,202		0,15 0,231		0,313	0,917		0,287	0,356	0,193 0,270

Обращают на себя внимание факт присутствия более размытых полос всех алкалоидов в случае использования смеси изопропанол - 0,5 М - 1м NaCl в Н₂О в соотношении 2:1, а также отсутствие движения образцов в случае проведения ТСХ элюентом изопропанолом - Н₂О в соотношении 1:1. По всей видимости катионы Na⁺ и Cl- необходимы для придания заряда алкалоидам, что ускоряет их подвижность в растворимой среде при ТСХ.

Использование элюента - бутанол: уксусная кислота: Н₂О в соотношении 4:1:1 приводит к разделению алкалоидов. При данном элюенте имеет место продвижение соединений, выделенных из чистотела одним пятном, сравнимым по скорости с пятном сангвинарина R_f (чистотела) = R_f (пальматин), 0,25 и 0,21 соответственно (рис. 6).

Следует отметить, что независимо от исходной формы экстракции чистотела в воду или в бутанол - скорость движения экстрагированных соединений оказалась примерно одинаковой в одном и том же элюенте ТСХ - бутанол: уксусная кислота: Н₂О при соотношении компонентов - 4:1:1.

Для соединений, выделенных в воду, R_f составила 0,25, а для соединений, выделенных в бутанол, R_f составила 0,253 (табл. 2).

Таблица 2

Значения R_f для соединений чистотела в элюенте- бутанол: уксусная кислота: Н₂О и хлороформ при различных способах экстракции алкалоидов из чистотела

Элюент	Rf
	Растворители, используемые для экстракции алкалоидов из чистотела
	вода	бутанол
Бутанол: уксусная к-та: Н2О - 4:1:1	0,25	0,253
Хлороформ (CHCl3)		0,285

Спектры поглощения соединений, которые выходят из чистотела в бутанол и в хлороформ - подобны между собой. Обращает на себя внимание отсутствие пиков поглощения в видимой области у водных растворов алкалоидов (рис. 4), выделенных из чистотела, в сравнении с растворами в бутаноле и в хлороформе. По всей видимости, обнаруживаемые в растворах бутанола и хлороформа пики в длинноволновой области соответствуют поглощению хлорофилла, который также экстрагируется вместе с алкалоидами из чистотела в органические растворители (рис. 5).

Рис. 5 Спектры поглощения экстрактов чистотела большого в бутаноле (1) и в хлороформе (2)

1 2 3 4

Рис. 6 Хроматограмма водного экстракта чистотела на пластинке «Silufol». Элюент бутанол - уксусная кислота - H₂O (4:1:1):

1- пальматин;

2- сангвипарин;

3- витамин В₂;

4- экстракт чистотела

Методика количественного определения суммы алкалоидов в настойке чистотела

20 мл настойки чистотела помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 мл и упаривают под вакуумом на ротационном испарителе до 1/4 исходного объема. Полученный остаток количественно переносят в делительную воронку вместимостью 50 -100 мл, прибавляют 8 мл 25 %- го раствора аммиака и алкалоиды трижды извлекают хлороформом (порциями по 20, 20 и 10 мл соответственно). Объединенные хлороформные извлечения дважды обрабатывают 5%- ным раствором серной кислоты в делительной воронке вместимостью 50-100 мл порциями по 20 мл. К объединенным сернокислым извлечениям прибавляют 8 мл 25%-го раствора аммиака и основания алкалоидов вновь трижды экстрагируют хлороформом в делительной воронке вместимостью 50-100 мл порциями по 20, 20 и 10 мл соответственно. Объединенные хлороформные извлечения переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 и 250 мл и отгоняют хлороформ досуха под вакуумом.

Сухой остаток количественно переносят в стакан для титрирования последовательно с помощью 5 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл ацетонитрила и титрируют потенциометрически раствором хлорной кислоты (0.05 моль/л). Параллельно проводят контрольный опыт.

Массовую долю Х (в %) суммы алкалоидов в пересчете на сангвинарин и хелеретрин в препарате вычисляют по формуле:

Х = (V-V₁)* 0.01765*100,

где 0.01765 - количество суммы алкалоидов в пересчете на сангвинарин и хелеретрин, соответствующее 1 мл раствора хлорной кислоты (0.05 моль/л), г, V - объем хлорной кислоты (0.05 моль/л), пошедшей на титрирование суммы алкалоидов, мл; V₁ - объем хлорной кислоты (0.05 моль/л), пошедшей на титрирование в контрольном опыте, мл.

Разработанная методика была апробирована на пяти образцах настойки чистотела, заложенных на хранение для изучения стабильности содержания алкалоидов и других показателей качества данного препарата. При этом содержание суммы алкалоидов в настойке колеблется в пределах 1%.

Произведем подсчет концентрации алкалоидов (по всей вероятности, сангвинарина и хелеретрина), содержащихся в экстракте чистотела. Поскольку навеска составляла 1 грамм, а количество алкалоидов составляло 1%, легко рассчитать количество алкалоидов в 1 г травы чистотела большого:

1 г - 100 %

х г - 1 %

х = 1Ч1/100 = 10-² г

Известно, что молекулярная масса сангвинарина составляет 353 г/М, а молекулярная масса хелеретрина равна 367 г/М. Отсюда можно рассчитать концентрацию алкалоидов в 10 мл растворителя (исходный объем растворителя для экстракта чистотела большого). Усредним молекулярные массы сангвинарина и хелеретрина: (353 + 367)/2 = 360 г/М.

Размещено на http://www.allbest.ru/

где С_М - концентрация алкалоидов в М/л, m - масса алкалоида в г,
М - молекулярная масса алкалоидов в г/М, V₀ - объем используемого растворителя в л.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Такая концентрация алкалоидов обнаруживается в 10 мл раствора, приготовленного описанным выше методом.

При проведении капиллярной газово-жидкостной хроматографии с масс-селективным детектором НР 5890/5972; Тин = 200⁰ С; t нач = 3мин; Т нач = 50⁰С; Т кон = 280⁰С; Т = 10⁰С/мин; газ носитель - гелий, v = 1мл/мин экстракта чистотела обнаружены сигналы различных молекулярных ионов и продуктов их фрагментации. Однако анализ полученных пиков через специализированный каталог химических соединений `` PBM Search of Library не выявляет присутствие сангвинарина или подобных ему алкалоидов в экстракте чистотела (рис. 13).

Этот факт отнюдь не указывает на отсутствие данных соединений в экстракте чистотела, но скорее отражает большую вероятность физико-химического превращения в первую очередь эфирных масел или соединений иной природы, которые находятся в экстракте чистотела. В пользу данного предположения говорит процент соотношения гипотетических соединений, которые обнаруживаются в библиотеке химических соединений: эйкозаноиды -70,68,20,15%; гексадекан -25%; циклопентан - 25%, 15% и другие соединения алифатического ряда.

Антибактериальное действие экстракта чистотела

Из изученных водорастворимых соединений чистотела только чистотел в концентрации 10-³ М вызывал снижение роста бактерий штамма E. coli на 40% (Р < 0,001) (табл. 3).

Таблица 3

Число клеточных колоний E. coli, выросших на 1%-ном агаре после высевания из жидкой среды^* в присутствии водорастворимых соединений чистотела

Соединение чистотела	О1	СМ, М	О2	Р
Экстракт чистотела	590±25	10-3 10-4 10-5 10-6	342±15 570±30 581±20 595±13	<0,001 >0,05 >0,05 >0,05

^* - Условия культивирования: LB-среда, 37 ^оС

О₁ и О₂ - полученные из эксперимента величины общего числа клеток.

Р - вероятность значения ч²; С_М - молярная концентрация препарата, М

Из водорастворимых соединений чистотела достоверным антибактериальным действием обладало соединение в концентрации 10-³ М (P<0,001) независимо от способа экстракции. Отсутствие антибактериального эффекта водорастворимых соединений чистотела в более низких концентрациях можно объяснить низкой проницаемостью клеточных мембран бактерий для этих препаратов.

Цитотоксическое действие экстракта чистотела большого

Использованный в данном исследовании экстракт чистотела большого, разведенный в 10, 100 и 1000 раз, не оказывал значительного действия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C. Общее число спленоцитов при инкубации клеток с экстрактом чистотела изменялось в пределах 100,5-113,6% от контроля (100 %), что соответствовало норме (табл. 4, рис. 7).

Таблица 4

Число спленоцитов белых линейных мышей Balb-C, которые образуются при культивировании с экстрактом чистотела

Экстракт чистотела	Контроль	Опыт	Число клеток, %
I	1220±36,5	1386±37,5	113,6
II	1220±36,5	1227±30,8	100,5
III	1220±36,5	1275±54,7	104,5

I - разведение исходного экстракта в 10 раз

II - разведение исходного экстракта в 100 раз

III - разведение исходного экстракта в 1000 раз.

Таким образом, можно заключить, что изученный экстракт чистотела во всех трех разведениях не оказывал токсического действия на спленоциты белых линейных мышей Balb-C

Противоопухолевое действие экстракта чистотела большого

Действие экстракта чистотела большого выявляли на клетках миеломы мышей линии Sp-2X. Жизненный цикл любой клетки включает два основных периода: подготовку клетки к делению - интерфаза и собственно деление - митоз. Интерфаза, в свою очередь, подразделяется на три этапа: G₁, S и G₂. В течение G₁ этапа происходят интенсивные процессы биосинтеза: образование митохондрий, эндоплазматического ретикулума, лизосом, аппарата Гольджи. Клетка растет и образует вещества, подавляющие или стимулирующие начало следующей S-фазы. В течение S-фазы происходят репликация ДНК, синтез белков-гистонов, с которыми связывается каждая нить ДНК, каждая хромосома превращается в две хроматиды. G₂ этап характеризуется интенсивными процессами биосинтеза; делением митохондрий; увеличением энергетических запасов. Затем происходит ядерное деление, и клеточный цикл заканчивается делением цитоплазмы.

Важным показателем противоопухолевого действия препарата является изменение числа клеток в S-фазе. Известно, что чем больше опухоль, тем больше клеток опухоли находится в S-фазе, поэтому уменьшение числа клеток в S-фазе является доказательством противоопухолевого действия препарата. Так, экстракт чистотела большого в разведении 1:10 вызывает уменьшение числа клеток миеломы в S-фазе митоза на 45 % от контроля (100%) (таблица 5, рис. 8).

Таблица 5

Число клеток миеломы мышей линии Sp-2X в S-фазе, которые образуются при культивировании с экстрактом чистотела

Экстракт чистотела	Контроль	Опыт	Число клеток, %
I	1174±21	638±27	54,34
II	1174±21	1041±42	88,67
III	1174±21	1148±18	97,78

I - разведение исходного экстракта в 10 раз

II - разведение исходного экстракта в 100 раз

III - разведение исходного экстракта в 1000 раз



Рис. 7 Процентное соотношение выживших спленоцитов мышей линии Balb-C после инкубации с экстрактом чистотела большого в разведениях 1:10 (I), 1:100 (II), 1:1000 (III):

I - концентрация экстракта - 2,8Ч10-⁴ М;

II - концентрация экстракта - 2,8Ч10-⁵ М;

III - концентрация экстракта - 2,8Ч10-⁶ М

Рис. 8 Процентное соотношение выживших миеломных клеток после инкубации с экстрактом чистотела большого в разведениях 1:10 (I), 1:100 (II), 1:1000 (III):

I - концентрация экстракта - 2,8Ч10-⁴ М;

II - концентрация экстракта - 2,8Ч10-⁵ М;

III - концентрация экстракта - 2,8Ч10-⁶ М

В разведениях 1:100 и 1:1000 не выявлено достоверного ингибирования деления клеток миеломы в S-фазе митоза.

Смесь сингвинарина и хелеритрина, преобладающая в составе алкалоидов исследуемого экстракта чистотела, является природным ДНК-интеркалятором, что представляет собой редкое явление среди растительных алкалоидов. ДНК-интеркаляторы являются ингибиторами таких реакций, как репликация ДНК и двуспиральной РНК, транскрипция, ферментативная деградация двойных спиралей, репарация и рекомбинация ДНК.

Исследование влияния экстракта чистотела большого на биохимические показатели

Для изучения влияния экстракта чистотела на биохимические показатели сыворотки крови результаты исследования сравнивали с контрольными данными, которые представлены на рис. 32.

Препарат применяли в дозах, рекомендованных Фармакологическим комитетом (Кудрина Г.П., Алтынбаева Р.Д., Буров Ю.В. и др., 1992; Методические рекомендации по оценке токсического действия фармакологических средств, 1997): 25 мкл, 50 мкл, 100 мкл и 150 мкл. При введении животному дозы, превышающей 150 мкл, наблюдали токсическое действие экстракта: тошноту, рвоту.

Для оценки влияния экстракта на ткани печени, почек, поджелудочной железы, сердца in vivo было проведено определение активности трансаминаз в сыворотке крови белых мышей. Трансаминазы представлены в клетках цитозольными и митохондриальными изоферментами. АлАТ присутствует во многих органах млекопитающих; наибольшая удельная активность отмечается в основном в клетках печени, но также присутствует в клетках почек, скелетных мышц, миокарда.

В контрольной группе животных активность АлАТ в сыворотке крови составила 50 ед/л. Экстракт в дозах 25 мкл, 50 мкл, 100 мкл, 150 мкл вызывает увеличение активности АлАТ в сыворотке крови мышей. По степени увеличения активности АлАТ в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (580 %) > 100 мкл (420%) > 50 мкл (240 %) > 25 мкл (200 %).

В контрольной группе животных АсАТ сыворотки крови составила 120 ед/л. Экстракт в дозе 25 мкл не вызывал достоверных изменений активности АсАТ; в дозах 50 мкл и 150 мкл вызывал увеличение активности АсАТ до 330 % и 490 % от контрольной величины соответственно; в дозе 100 мкл наблюдалось самое большое увеличение активности АсАТ - до 816 %.

Повышение активности аминотрансфераз отмечено при ряде патологических процессов, в которые вовлечена печень.

В контрольной группе животных активность КК сыворотки крови составила 129 ед/л. По степени увеличения активности КК в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (1300 %) > 100 мкл, 50 мкл (387 %) > 25 мкл (321 %).

Таким образом, объединив данные исследования активности АлАТ, АсАТ и КК, можно предположить, что наибольший вклад в увеличение активности АлАТ сыворотки крови вносят клетки печени. Кроме АлАТ, было проведено исследование активности амилазы. Фермент характеризуется выраженной органоспецифичностью. В организме основные источники амилазы - поджелудочная и слюнные железы. Определение активности амилазы в сыворотке крови - наиболее распространенный тест диагностики острого панкреатита.

В контрольной группе животных активность амилазы сыворотки крови составила 1444 ед/л. Самая высокая активность амилазы - 149 % от контроля - наблюдается после введения экстракта в дозе 150 мкл. При введении 25 мкл, 50 мкл и 100 мкл активность амилазы уменьшается. Полученные экспериментальные данные показывают, что экстракт во всех четырех дозах оказывает влияние на панкреатические клетки.

В контрольной группе животных активность ГГТ составила 27 ед/л. Экстракт во всех четырех дозах вызывал увеличение активности ГГТ в сыворотке крови. По степени увеличения активности ГГТ в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (370 %) > 100 мкл (296 %) > 50 мкл, 25 мкл (222%).

Необходимо отметить, что для всех доз экстракта установлено увеличение содержания азотистых продуктов белкового обмена (креатинина) и для 150 мкл экстракта - увеличение мочевины. Для доз 25 мкл и 50 мкл отмечено пониженное содержание мочевины, для 100 мкл достоверных отличий от контроля не выявлено. По степени содержания креатинина в сыворотке крови в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 150 мкл (3017 %) > 100 мкл (2125 %) > 50 мкл (1162 %) > 25 мкл (737 %).

Повышение уровня креатинина и мочевины крови - признак почечной недостаточности. В то же время определение содержания креатинина - более надежный тест, так как повышение концентрации в крови происходит раньше, чем повышение концентрации мочевины. Образование креатинина не связано с метаболизмом экзогенного белка, в то время как мочевина - основная катаболическая форма белка пищи. Мочевина образуется в печени, фильтруется гломерулярным фильтром и активно реабсорбируется в тубулярные части нефрона, поэтому содержание мочевины в крови зависит не только от нефрогенных факторов.

Проведенные исследования показали, что содержание альбумина в сыворотке крови не отличается от контроля, а содержание общего белка незначительно увеличивается после введения животным 100 мкл и 150 мкл экстракта.

ЩФ проявляет высокую удельную активность в клетках эпителия почечных канальцев, гепатоцитах и остеобластах. Этот фермент также как ГГТ локализуется в плазматической мембране, является эктоэнзимом. Нами была определена активность ЩФ в сыворотке крови контрольных животных, которая составила 396 ед/л.

Экстракт чистотела в дозах 50 и 100 мкл не вызывал достоверного отличия от контрольной величины, а в дозах 25 и 150 мкл активность ЩФ в сыворотке крови увеличивалась до 134 % и 194 % от контроля соответственно.

Проводили определение еще одного биохимического теста - активности ЛДГ в сыворотке крови. У животных контрольной группы ЛДГ составила 2301 ед/л. 25 мкл; 50мкл и 100 мкл экстракта не оказывают достоверного влияния на активность ЛДГ в сыворотке крови мышей. Доза 150 мкл вызывает повышение активности ЛДГ до 276 % по сравнению с контролем (100 %). ЛДГ - цинксодержащий фермент, обратимо катализирующий окисление лактата в пируват. ЛДГ участвует в окислении лактата в пируват в тканях с аэробным типом метаболизма (миокард, мозг, почки, эритроциты, тромбоциты). ЛДГ также оптимизирована природой для превращения пирувата в лактат в тканях с высоким уровнем гликолиза (скелетные мышцы, печень). Активность ЛДГ в сыворотке крови - чувствительный индикатор гепатоцеллюлярного поражения, увеличение его активности обычно наблюдается при гепатите, гипоксии печени (включая застой печени вследствие сердечной недостаточности), лекарственной интоксикации, циррозе, опухолях и травме (Добровольский А.П., Доценко В.Л., Панченко Е.П., 2002).

С целью тестирования степени повреждающего действия экстракта чистотела было проведено исследование содержания глюкозы в крови как чувствительного показателя выраженности деструктивных процессов в ткани поджелудочной железы. В контрольной группе животных содержание глюкозы в сыворотке крови составило 5,5 ммоль/л. Экстракт в дозах 25 мкл и 50 мкл не оказывал достоверного влияния на содержание глюкозы в сыворотке крови, в дозах 100 и 150 мкл - повышал содержание глюкозы до 152 % и 248 % соответственно по сравнению с контролем (100 %).

В контрольной группе животных содержание лактата в сыворотке крови составило 5,5 ммоль/л. По степени увеличения лактата в сыворотке крови в сравнении с контролем (100 %) дозы экстракта составляют следующий ряд: 50 мкл (260 %) > 100 мкл (246 %) > 150 мкл (200 %) > 25 мкл (148 %).

В результате проведенных исследований было обнаружено повышение активности ферментов, локализованных преимущественно в печени (АсАТ, АлАТ, ГГТ, ЩФ). Это может быть результатом повышения проницаемости клеточных мембран под действием экстракта чистотела большого. Биосинтетическая функция печени при этом не нарушается, так как содержание альбумина остается в норме. Увеличение содержания креатинина в сыворотке крови свидетельствует о влиянии экстракта чистотела большого на функции почек. Обнаруженные изменения содержания глюкозы и лактата в сыворотке крови свидетельствуют о развитии гипоксического состояния. При этом основным путем превращения глюкозы становится анаэробный гликолиз, идущий с накоплением молочной кислоты.

При анализе внутренних органов, извлеченных из мышей, которые получали 100 мкл экстракта чистотела в разведении 1:10 и 1:100 от исходного раствора, обнаруживаются изменения как в размере органа, так и в его консистенции и цвете.

Происходит увеличение в размерах поджелудочной железы. Увеличивается размер сердца и печени. Изменяются консистенция и цвет печени; этот орган становится темно-вишневого цвета, рыхлый на ощупь, что, по всей вероятности, указывает на застойные и цитолитические явления в этом органе. Почки также увеличиваются в размерах. Таким образом, экстракт чистотела действует на все основные органы белых беспородных мышей, изменяя их метаболизм, что отражается как на изменении биохимических показателей, так и на морфологии ткани органов.

Изучение активности диагностического фермента крови - ЛДГ плазмы крови доноров в присутствии экстракта чистотела

Изучено взаимодействие диагностического фермента - ЛДГ с соединениями, находящимися в экстракте чистотела. Плазма крови доноров в количестве 1 мл инкубировалась в течение 30 мин при 37 ^оС в присутствии экстракта чистотела в его разведениях 1:10 и 1:100 от исходной концентрации. Обнаружено снижение активности ЛДГ прямо пропорционально концентрации добавленного экстракта на 15, 22 и 28 % от исходной активности (рис. 9).

Рис. 9 Изменение активности ЛДГ при добавлении экстракта чистотела в различных концентрациях: K - контроль; 1- экстракт чистотела в разведении 1:100; 2- экстракт чистотела в разведении 1:10; 3- экстракт чистотела без разведения

Взаимодействие экстракта чистотела большого с нуклеиновыми кислотами

Изучение взаимодействия экстракта чистотела большого с нуклеосомной ДНК, выделенной из клинического штамма

Нативную высокополимеразную ДНК из E. coli получали по стандартным методам (Р. Девис, 1984).

Соотношение амплитуд спектра КД ДНК оставалось постоянным, что указывает на отсутствие выраженных конформационных перестроек в структуре ДНК. Обнаруженные изменения в структуре нуклеиновой кислоты можно интерпретировать как взаимодействие хромофора с парами оснований ДНК, что приводит к возмущению электронной структуры последних и выражается в искажении спектров дисперсии оптического вращения, основной вклад в которые дают спектры поглощения азотистых оснований, образующих двуспиральный тент ДНК. Наблюдается гиперхромизм в спектре кругового дихроизма нуклеосомной ДНК, выделенной из бактерий E. coli больного пиелонефритом. Одновременно обнаруживается небольшой батохромный сдвиг в спектре КД нуклеосомной ДНК - с 280 нм до 283 нм. Подобные спектральные изменения могут указывать на электронные взаимодействия между хромофорами, расположенными на близком расстоянии друг от друга. Хромофорами ДНК являются азотистые основания, а хромофорами алкалоидов выступают их ненасыщенные ароматические кольца.

Метод кругового дихроизма является более чувствительным по сравнению с методом спектрального поглощения (рис. 10, 11). На спектрах поглощения ДНК в присутствии экстракта чистотела наблюдается небольшой сдвиг в спектральной картине, что также указывает на взаимодействие алкалоидов чистотела с ДНК.

В то же время отсутствие конформационных переходов в нуклеиновой кислоте может свидетельствовать о том, что сахарофосфатный остов ДНК не претерпевает существенных искажений в процессе адсорбции лигандов на двуспиральной ДНК. Можно предположить, что препараты, входящие в состав экстракта чистотела или интеркалируют между парами оснований ДНК, или взаимодействуют с парами оснований со стороны широкой бороздки ДНК.

Нельзя также исключить, что молекула хромофора либо не проникает в бороздки ДНК, а электростатически взаимодействует с сахарофосфатным остовом ДНК с внешней стороны последней, либо интеркалирует хотя бы частично между парами оснований ДНК, располагаясь в одной с ними плоскости по отношению к нормали двуспирального цилиндра ДНК, стабилизируя тем самым сахарофосфатный остов нуклеиновой кислоты.

...