Лекарственный патоморфоз эндокринной части поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете

Морфометрический анализ проводили с помощью компьютерной программы «Видео ТестМорфо-4» (Россия). Определяли объемную долю (ОД, %) островков по отношению к экзокринной части железы; площадь островков (S, мкм²), объёмную долю эндокриноцитов А и В по отношению к площади островков (ОД, %), удельное количество В-клеток панкреатических островков по отношению ко всей клеточной популяции островков (%), площадь ядер эндокриноцитов В (S, мкм²), а также объёмную долю (ОД, %) и диаметр (Д, нм) секреторных гранул при ультраморфометрии. Проводили определение индекса апоптоза и пролиферации, путем подсчёта каспаза-3-, TUNEL-, Ki-67-, и PCNA-позитивных эндокриноцитов панкреатических островков от общего количества клеток островков (%).

Результаты экспериментов обрабатывались методами базисного статистического анализа на ПК с использованием программ Excel Microsoft Office (Microsoft, USA) и STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc., USA). Анализ параметров при нормальном распределении значений проводили с помощью критерия Стьюдента с вероятностью ошибки р<0, 05, анализ непараметрических количественных признаков - с помощью критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использовали критерии ч2 и Фишера. Проводили анализ корреляционной зависимости между морфометрическими и иммуногистохимическими показателями [Кучеренко В.З., 2006].

Результаты исследования и их обсуждение. Развитие аллоксан-, стрептозотоцин-, стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного и иммунозависимого СД по сравнению с контрольной интактной группой животных сопровождалось статистически достоверными (р<0, 05) изменениями клинико-биохимическими показателей: снижением массы тела, увеличением потребления жидкости, гипергликемией и уменьшением концентрации инсулина и С-пептида плазмы крови, увеличением концентрации гликозилированного гемоглобина.

Течение аллоксан-индуцированного диабета во все сроки наблюдения сопровождалось микроскопически явлениями полнокровия, отека и деструктивных изменений панкреатических островков с тенденцией к уменьшению на 14 сутки эксперимента. Морфометрически с 7 по 14 сутки эксперимента отмечалось статистически достоверное уменьшение объёмной доли и удельного количества В-клеток и достоверное увеличение объёмной доли А-клеток желудочного и селезеночного отделов поджелудочной железы. На 21 сутки объёмная доля и удельное количество В-клеток были достоверно снижены во всех отделах, а объёмная доля А-клеток - увеличена. Достоверных изменений в объёмной доле островков их размеров и площади ядер не отмечалось на протяжении всего эксперимента. При иммуногистохимическом исследовании наряду с выраженными некротическими изменениями клеток островков поджелудочной железы определялось увеличение апоптогенной активности эндокриноцитов в период с 7 по 14 сутки. Отмечалось умеренное цитоплазматическое окрашивание при использовании антител к каспазе-3, Bax и негативное окрашивание к белкам p53, TRAIL и Bcl-2. Различия интенсивности иммунного окрашивания клеток, вступающих в апоптоз при определении белка р53 и каспазы 3, вероятнее всего, можно объяснимы тем, что активация апоптоза не сопровождается накоплением протеина р53 в количествах необходимых для его визуализации или осуществляется без его участия. Каспаза 3, напротив, является ключевым ферментом каскадного цикла, участвующим в протеолизе белков ядра и цитоплазмы клетки, и может экспрессироваться не только при активации гена р53, но и при активации других сигнальных путей [Петров С.В., Райхлин Н.Р., 2004]. В эндотелии кровеносных капилляров визуализировалась умеренная экспрессия эндотелиальной NOS-3, что согласуется с литературными данными об участии оксида азота (NO) в цитотоксических эффектах, так как низкая концентрация NO в клетках ингибирует индуцибельные формы NO-синтазы, уменьшая повреждение ДНК [Cnop M., 2008]. Индекс апоптоза по сравнению с интактной группой достоверно увеличивался во все сроки наблюдения и достигал максимума (17, 4±0, 9%) на 7 сутки. Происходило уменьшение экспрессии ядерных белков NF-kB и MDM2, что свидетельствовало о развитии оксидативного стресса [Mariappan N., 2010]. К 21 суткам интенсивность экспрессии маркеров апоптоза значительно уменьшалась. При проведении TUNEL-метода, обнаруживалось увеличение количества клеток с позитивно окрашенными ядрами во все сроки эксперимента (рис. 1). Начиная с 7 суток эксперимента, в панкреатических островках происходило достоверное увеличение (р<0, 05) количества PCNA-позитивных клеток по отношению к интактной группе. Достоверных изменений количества Ki-67-позитивных эндокриноцитов по сравнению с группой интактного контроля не отмечалось на протяжении всего эксперимента (рис. 2). Увеличение количества PCNA-позитивных клеток на фоне низкой пролиферативной активности можно расценивать как активацию внутриклеточных репаративных процессов в эндокриноцитах В, т.к. ядерный антиген пролиферирующих клеток экспрессируется не только при делении клеток, но и при репарации ДНК [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004; Essers J. et al., 2005].

Из литературных данных известно, что токсичность аллоксана обусловлена образованием активных форм кислорода и перекиси водорода, что сопровождается окислением SH-групп белков и повреждением ДНК, с выраженным развитием некротических изменений В-клеток [Szkudelski T., 2001; Szkudelski T., 2012]. Однако, важным эффектом аллоксановой цитотоксичности является нарушение интрацеллюлярного гомеостаза кальция, что влечет за собой поступление кальция из внеклеточной жидкости и его мобилизацией из внутриклеточных депо, в силу деполяризации клеточных мембран и мембран митохондрий В-клеток [Sakurai K. et al., 2001; Srinivasan K., Ramarao P., 2007]. На этом фоне сверхсинтез белка-промотора Вах приводит к дестабилизации мембран митохондрий с высвобождение цитохрома С в цитоплазму и активацией эффекторных каспаз [Wu H.C., et al., 2011], что ведет к завершению митохондриального сигнального пути апоптоза, вызванный повреждением ДНК [Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003; Nakayama T. et al., 2004; Karp G., 2010].

Развитие стрептозотоцин-индуцированного СД сопровождалось характерными патогистологическими изменениями в виде выраженных некробиотических изменений эндокриноцитов островков в период с 7 по 21 сутки эксперимента. По сравнению с интактным контролем начиная с 7 суток происходило статистически значимое уменьшение объёмной доли и удельного количества В-клеток во всех изучаемых отделах железа, с достоверным увеличением объёмной доли А-клеток только в селезеночном отделе. В островках селезеночного отдела поджелудочной железы также прослеживалось увеличение площади ядер эндокриноцитов. Иммуногистохимически в большинстве эндокриноцитов отмечалось выраженное иммунное окрашивание к проапоптотическим белкам - каспаза-3, TRAIL, NOS-3 и Bax на 7 сутки, которое уменьшалось к 21 суткам эксперимента.

В многочисленных экспериментах показано, что основной причиной индуцированной стрептозотоцином гибели B-клеток является алкилирование ДНК за счет образования таких токсических соединений как супероксид анион, пероксинитрит и оксид азота [Bedoya F. et al., 1996; Elsner M. et al., 2000]. Таким образом, избирательная цитотоксичность стрептозотоцина обусловлена разрушением системы антиоксидантной защиты и фрагментацией ДНК B-клеток и не имеет индивидуальной вариабельности, так как он повреждает В-клетки у всех животных разных видов [Morgan N.G. et al., 1994]. На клеточном уровне токсические эффекты стрептозотоцина реализуются за счет развития некротических процессов и апоптоза. Выраженная экспрессия проапоптогенных протеинов каспаза-3 и TRAIL свидетельствует об инициации внешнего рецепторного пути активации апоптоза, так как экстрацеллюлярная активация апоптоза осуществляется в результате взаимодействия специфических лигандов с соответствующими клеточными рецепторами, в том числе и TRAIL [Baud V., Karin M., 2001; Alladina S.J. et al., 2005; Кротова Ю.Н., Каркищенко В.Н., Хлопонин Д.П., 2005; Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007]. Доказано, что активация каспазного каскада может осуществляться при экспрессии протеина TRAIL, однако, эффективность TRAIL-индуцированного апоптоза определяется процессами синтеза и распада эндогенного фактора NF-kB [Рыжов С.В., Новиков В.В., 2002; Alladina S.J. et al. 2005]. Протеин NF-kB один из главных внутриклеточных мишеней при гипергликемии и окислительном стрессе, который играет ключевую роль в реакции воспаления, иммунном ответе и апоптозе В-клеток [Evans J. L., 2002]. Известно, что ингибирование синтеза белка NF-kB защищает в-клетки панкреатических островков человека от рецепторного пути активации апоптоза [Giannoukakis N. et al., 2000], также имеются экспериментальные данные по ингибированию индуцированного фактором NF-kB В-клеточного апоптоза на очищенной культуре инсулиноцитов крыс [Heimberg H. et al., 2001; Maedler K. et al., 2002].

TUNEL-позитивные клетки обнаруживались как в центральных, так и в периферических отделах островков на протяжении всего периода исследования. Экспрессия протеинов Bcl-2, MDM2, NF-kB была значительно снижена. На 7 сутки статистически достоверно увеличивался индекс апоптоза с тенденцией к уменьшению к 21 суткам наблюдения (рис. 1). Во все сроки наблюдения отмечалось умеренная экспрессия эндотелиальной NOS-3 в капиллярах панкреатических островков, что расценивается как признак эндотелиальной дисфункции [Calles-Escandon J., 2001; Hadi A.R., 2007]. PCNA- и Ki-67-позитивно окрашенные клетки определялись в составе эндокриноцитов панкреатических островков, а также встречались единичные иммунопозитивные клетки среди ацинарной ткани и эпителия внутридольковых протоков, что свидетельствует об активации регенераторных процессов. Однако, наличие единичных внеостровковых инсулиноцитов может встречаться в поджелудочной железе интактных животных [Trucco М., 2005].

По сравнению с контрольной интактной группой индекс пролиферации оставался достоверно выше (рис. 2). Что согласуется с литературными данными о подавлении синтеза ДНК и пролиферации клеток, ингибированием митоза и активацией апоптоза на фоне действия стрептозотоцина [Szkudelski T., 2012].

Патогистологические изменения при иммунозависимом диабете во все сроки наблюдения свидетельствовали о значительном уменьшении объёмной доли и удельного количества В-клеток на 46, 7 % (Р<0, 01) и на 67, 5 % (Р<0, 01) соответственно по сравнению с контрольной группой, за счёт выраженных некробиотических изменений клеток и воспалительной инфильтрации панкреатических островков на 7 и 14 сутки. В селезеночном отделе железы на протяжении всего периода наблюдения отмечалось статистически значимое увеличение объёмной доли эндокриноцитов А, а на 21 сутки - в желудочном. С 14 суток определялись частично склерозированные островки. При электронной микроскопии отмечалось набухание митохондрий, кариопикноз, визуализировались фрагменты разрушенной гранулярной эндоплазматической сети (ГЭС) и комплекса Гольджи (КГ). В отдельных эндокриноцитах В ядерный хроматин конденсировался и располагался в периферических отделах ядра, в цитоплазме отмечалось появление единичных липидных включений, элементы ГЭС и КГ были резко расширены и вакуолизированы. Секреторные гранулы располагались неравномерно в виде небольших скоплений у разных полюсов клетки, их объемная доля составляла 10, 3%, а диаметр 302, 5±43, 4 нм. Аналогичные ультрамикроскопические изменения инсулиноцитов обнаруживаются при исследовании биопсий поджелудочной железы человека и экспериментальных животных при сахарном диабете [Севергина Э.С., 2002; Pavelka M., 2010].

При иммуногистохимическом исследовании во все сроки эксперимента отмечалось отсутствие или сомнительная экспрессия протеинов p53, Bax, MDM2 и Bcl-2 в единичных инсулоцитах. В большинстве эндокриноцитов В на 7 и 14 сутки происходило увеличение экспрессии проапоптогенного протеина TRAIL и каспазы 3 с незначительным уменьшением к 21 суткам, увеличение TUNEL-позитивных ядер, визуализирующихся во многих островковых клетках. Разница в количестве TUNEL-позитивных клеток и клеток, экспрессирующих каспазу-3, объяснима с позиций развития стадий апоптоза. По литературным данным процесс апоптоза занимает несколько часов, в течение которых последовательно осуществляются все стадии запрограммированной клеточной гибели: сигнальная, эффекторная и деградация [Karp G., 2010; Reed J.C., Green D.R., 2011]. Однако активация эффекторной каспазы-3 осуществляется раньше, чем происходит олигонуклеосомальная фрагментация ДНК, чем и обусловлена разница в количестве В-клеток, выявляемых при проведении иммуногистохимического исследования и гибридизации in situ [Манских В.Н., 2004].

Индекс апоптоза во все сроки наблюдения был достоверно увеличен по сравнению с интактной контрольной группой (рис. 1). Усиливалась экспрессия NO-синтазы в эндотелии капилляров панкреатических островков во все сроки наблюдения. Отмечалась умеренная экспрессия факторов пролиферации клетках островков Лангерганса. Достоверное увеличение PCNA-позитивных клеток отмечалось на протяжении всего эксперимента, а Ki-67-позитивных - только на 14 сутки (рис. 2).

При экспериментальном стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете отмечались мозаичные незначительные деструктивные изменения эндокриноцитов панкреатических островков с уменьшением удельного количества В-клеток на 21, 8 % (р<0, 05) во всех отделах поджелудочной железы и объемной доли на 26, 9 и 27, 4%, соответственно, в желудочном и селезеночном отделах на 21-28 сутки эксперимента. При этом определялось увеличение площади ядер В-клеток на протяжении всего наблюдения и во всех отделах железы. В части островков на 21-28 сутки исследования визуализировались очаговые склеротические изменения. Выявлялось умеренное количество TUNEL-позитивных ядер эндокриноцитов в части панкреатических островков. При иммуногистохимическом исследовании во все сроки эксперимента отмечалось отсутствие или сомнительная экспрессия проапоптогенных протеинов, за исключением умеренно выраженной экспрессии каспазы-3. Индекс апоптоза был незначительный (рис. 1). Достоверных изменений с контрольной интактной группой в экспрессии протеинов Ki-67 и PCNA не отмечалось на протяжении всего эксперимента (рис. 2).

В отличие от модели стрептозотоцин-индуцированного диабета превентивное введение никотинамида непосредственно перед инъекцией стрептозотоцина, минимизирует его повреждающее действие и оказывает цитопротективное действие на инсулиноциты островков Лангерганса. Механизм действия никотинамида связан с угнетением активности поли (АДФ-рибозо) полимеразы и (моно)АДФ-рибозилтрансфераз, что предотвращает снижение уровня NAD⁺ и АТФ в В-клетках и препятствует их некрозу [Полторак В.В., 2001; Szkudelski Т., 2012]. В литературе описаны важные цитопротекторные свойства никотинамида, которые заключаются в снижении повреждений ДНК, обусловленных действием стрептозотоцина [Bedoya F.J. et al., 1996; Chi T.S. et al., 2007]. По данным ряда авторов, терапия никотинамидом приводит к существенному увеличению частоты клинической ремиссии СД со снижением потребности в экзогенном инсулине [Pozzilli P., 1997; Crino A., 2004]. Однако клинико-экспериментальные исследования о профилактическом действии никотинамида противоречивы и требуют дальнейшего уточнения.

Рис. 1. Сравнительная характеристика индекса апоптоза эндокриноцитов при экспериментальном сахарном диабете. Примечание: Аллоксан - аллоксан-индуцированный диабет; СТЗ - стрептозотоцин-индуцированный диабет; Иммунозависимый - иммунозависимый диабет; СТЗ-НА - стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный диабет. * - достоверно по отношению к контролю.

Рис. 2. Сравнительная характеристика индекса пролиферации эндокриноцитов при экспериментальном сахарном диабете. Примечание: Аллоксан - аллоксан-индуцированный диабет; СТЗ - стрептозотоцин-индуцированный диабет; Иммунозависимый - иммунозависимый диабет; СТЗ-НА - стрептозотоцин-никотинамид-индуцированный диабет. * - достоверно по отношению к контролю.

На фоне введения изучаемых групп лекарственных средств (сенситайзеры инсулина, антиоксиданты, секретогены, инкретиномиметики) отмечались статистически достоверные изменения в динамике клинико-биохимических показателей: увеличивалась массы тела (на 14 сутки), уменьшалось потребление жидкости (на 7 сутки), нормализовались уровень глюкозы крови (на 7 сутки), концентрация инсулина (на 7 сутки) и С-пептида (на 21 сутки) плазмы крови, уменьшался уровень гликозилированного гемоглобина (на 28 сутки).

Морфофункциональные изменения панкреатических островков под действием сенситайзеров инсулина (бигуаниды) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. При гистологическом исследовании в ткани поджелудочной железы признаки воспаления отсутствовали. Площадь панкреатических островков и их объёмная доля достоверно не изменялись как по отношению к интактному контролю, так и по отношению к группе диабета во все сроки наблюдения. Определялось достоверное уменьшение объёмной доли и удельного количества В-клеток по сравнению с интактной контрольной группой в селезеночном отделе на 7 и 21 сутки на 26, 3% (р<0, 05) и 21, 5% (р<0, 05) соответственно, а в желудочном на 21 сутки на 32, 2% (р<0, 05). При этом отмечалась статистически значимое увеличение площади ядер эндокриноцитов В во всех отделах железы с 7 по 21 сутки). По сравнению с группой сахарного диабета значимых статистических изменений морфометрических параметров не отмечалось. В отдельных островках определялись единичные TUNEL-позитивные В-клетки. При иммуногистохимическом исследовании во все сроки эксперимента отмечалась умеренно выраженная экспрессия каспазы-3. Индекс апоптоза был сопоставим с группой сахарного диабета (табл. 4). Достоверных изменений с контрольной группой и группой экспериментального диабета по уровню экспрессии протеинов Ki-67 и PCNA не отмечалось (табл. 4).

В последнее время широко применяется комбинированная терапия, включающая в себя, помимо ПСМ, несульфанилмочевинные стимуляторы секреции инсулина и бигуаниды, однако препараты этих групп могут оказывать действие только в присутствии эндогенного инсулина, восстанавливая раннюю секрецию инсулина.

Бигуаниды не обладают панкреатотропным действием, а снижают гипергликемию путём угнетения образования глюкозы (глюконеогенеза) в печени, т.е. подавляют глюконеогенез в печени и увеличивают периферическую утилизацию глюкозы [Kirpichnikov D. et al., 2002; Robinson J.T. et al., 2005].

Учитывая литературные данные об отсутствии достоверных изменений в уровне апоптотической и пролиферативной активности В-клеток, увеличение площади ядер эндокриноцитов В во всех отделах железы вполне объяснимо с позиций их компенсаторной гипертрофии.

Таблица 4 Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения сенситайзеров инсулина (бигуаниды).

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0, 05).

Морфофункциональные изменения панкреатических островков под действием сенситайзеров инсулина (ванадий содержащий комплекс) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. При микроскопическом исследовании отмечалось умеренное полнокровие капилляров островков. ОД островков по отношению к интактному контролю достоверно снижалась в желудочном и селезеночном отделах, а по сравнению с группой животных с экспериментальным диабетом - достоверно увеличивалась только в селезеночном отделе железы. Определялась мозаичность повреждения островков и эндокриноцитов: нормальные по гистологическому строению островки чередовались с островками с признаками деструкции (ранние сроки наблюдения) или с частично склерозированными островками в отдаленные сроки эксперимента. Отмечено увеличение площади ядер инсулиноцитов на 23, 9% (р<0, 05) в кишечном отделе железы по сравнению с интактным контролем. При иммуногистохимическом исследовании выявлялись единичные TUNEL-позитивные клетки. В отдельных эндокриноцитах определялась незначительная экспрессия каспазы-3. Индекс апоптоза был низкий, пролиферативная активность увеличивалась незначительно (табл. 5). Таким образом, структурные изменения поджелудочной железы на фоне введения ванадий содержащего комплекса характеризуются не только увеличением объёмной доли панкреатических островков, но и гипертрофией их ядер.

Таблица 5 Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения сенситайзеров инсулина (ванадий содержащий комплекс).

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0, 05).

Морфофункциональные изменения панкреатических островков под действием секретогенов (производные сульфонилмочевины) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. При микроскопическом исследовании отмечались мозаичные изменения в виде деструкции единичных В-клеток отдельных островков в ранние сроки наблюдения и очаговые склеротические изменения в поздние сроки. По отношению к интактному контролю объемная доля островков Лангерганса оставалась достоверно уменьшена, а по сравнению с СД - достоверно увеличивалась. Происходило уменьшение удельного количества и ОД В-клеток во всех отделах железы с достоверным увеличением по отношению к контрольной группе площади ядер В-клеток на протяжении всего эксперимента. Индекс апоптоза составлял от 2, 4% до 4, 5% (табл. 6), т.к. определялись единичные TUNEL-позитивные и каспазы-3 позитивные клетки. Индекс пролиферации был сопоставим с группой СД (табл. 6).

Таблица 6 Динамика пролиферативной активности и индекса апоптоза эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном диабете на фоне введения секретогенов (производные сульфонилмочевины).

* - достоверно по отношению к интактному контролю (р<0, 05).

Поскольку производные сульфонилмочевины (ПСМ) влияют на способность стимулировать секрецию инсулина В-клетками поджелудочной железы [Eherli A.M., 1990; Мамедов М.Н., 2006] результатом их действия становится высвобождение запасов инсулина из внутриклеточных гранул и выброс инсулина в кровь [Галстян Г.Р., 2007]. Проведенные ранее гистологические исследования инсулярного аппарата поджелудочной железы на интактных животных выявляли панкреатотропное действие препаратов сульфонилмочевины 2-го поколения, которое заключалось в гипертрофии островков и В-клеток, слабой активации пролиферативных процессов, усилении миграции секреторных гранул и высвобождении инсулина с последующим истощением функционального резерва инсулиноцитов [Pfeiffer E.F. et al., 1974; Балаболкин М.И., 2007; Уильямз Г., Пикап Д., 2007]. Результаты нашего исследования указывают на возможность развития аналогичных структурных изменений островкового аппарата при патоморфозе стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета.

Морфофункциональные особенности панкреатических островков при введении секретогенов (Диабенол) на модели стрептозотоцин-никотинамид-индуцированного диабета. На протяжении всего э...