Роль цитокинов и иммуно-эндокринные взаимодействия при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза

Задачи исследования

1 Оценить местные и системные уровни цитокинов (интерлейкинов 1, 2, 4, 6, фактора некроза опухоли , интерферонов и ), направленность Th1/Th2-поляризации иммунного ответа при воспалительных процессах конъюнктивы и роговицы, обусловленных вирусом простого герпеса, аденовирусами и Chlamydia trachomatis.

2 Выявить общие закономерности и особенности изменений локального и системного содержания цитокинов в зависимости от локализации герпес-индуцированого воспалительного процесса в оболочках глаза.

3 Определить роль цитокинов и простагландина Е2 в развитии воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза.

4 Изучить содержание гормонов гипофиза (тиреотропного гормона, пролактина), щитовидной железы (трийодтиронина, тироксина, тиреоглобулина), стероидных гормонов (кортизола, тестостерона), антител к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе при воспалении увеального тракта и оценить межсистемные иммуно-эндокринные взаимодействия.

5 Дать оценку системному цитокиновому реагированию при дистрофических процессах роговицы.

6 Изучить местные и системные уровни цитокинов при дистрофических процессах в сетчатке, приведших к ее отслойке, в зависимости от их характера, распространенности и срока давности развития отслойки.

7 Обосновать иммунологические критерии прогнозирования течения воспалительных процессов в роговице, индуцированных вирусом простого герпеса, и в сосудистой оболочке глаза при системных ревматических заболеваниях.

Научная новизна

Впервые показано, что для воспаления конъюнктивы, роговицы и сосудистой оболочки глаза характерно сходство в профиле цитокинов (интерлейкинов (IL) 1, фактора некроза опухоли (TNF-), IL-6, IL-2, интерферона (IF) и IF-) и направленности иммунного ответа, но имеется различие в степени выраженности местного и системного реагирования.

Установлено, что при герпес-индуцированном воспалительном процессе в роговице большая степень выраженности местного и системного иммунного реагирования коррелирует с рецидивом заболевания и глубокой локализацией воспаления.

Впервые при патологии глаз установлено, что закономерности нарушения системы цитокинов при персистирующих вирусной (герпетической) и хламидийной (Chlamydia trachomatis) инфекциях имеют сходство в спектре цитокинов и направленности иммунного ответа, характер которых определяется активностью инфекционного процесса.

Показана сопряженность изменений содержания гормонов (кортизола, тестостерона - у мужчин, тиреоглобулина и антител к нему, свободного трийодтиронина и антител к тиреопероксидазе) в сыворотке крови, местного и системного уровней основных цитокинов и васкулоэндотелиального фактора роста с этиологией воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза.

Впервые при воспалении увеального тракта установлена зависимость содержания простагландина Е2 в сыворотке крови и слезной жидкости от пола пациентов и развития рецидива заболевания.

На основе выявления взаимосвязей между показателями иммунной и эндокринной систем методом корреляционного анализа впервые предложено рассматривать воспаление сосудистой оболочки глаза как процесс, связанный с десинхронизацией функций иммуно-эндокринной регуляции.

Установлено, что дистрофические процессы в сетчатке при миопии средней и высокой степени и периферической витреохориоретинальной дистрофии, приведшие к ее отслойке, сопровождаются изменениями содержания цитокинов на местном и системном уровнях, характер которых обусловлен типом офтальмопатологии, приведшей к отслойке сетчатки, ее величиной и сроком давности развития.

Определены иммунологические критерии неблагоприятного течения воспалительного процесса в роговице, обусловленного вирусом простого герпеса (высокая концентрация TNF- в слезной жидкости и дефицит местного и системного содержания IL-4), и сосудистой оболочке глаза при системных ревматических заболеваниях (содержание васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови ? более 750 пг/мл). Значения этих показателей могут служить основой прогнозирования течения воспаления увеального тракта.

Научно-практическая значимость работы

Установлены нарушения цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови и тканей глаза у пациентов с воспалительными и дистрофическими процессами в оболочках глаза. Определена важная роль в этом процессе нарушения цитокиновой сети, регулирующей баланс Th1/Th2-пути антигенспецифического иммунного ответа. Выявлен дисбаланс уровней цитокинов, простагландина Е2 и гормонов в сыворотке крови, сопряженных с этиологией заболевания, при воспалении увеального тракта. Методом корреляционного анализа установлена взаимосвязь показателей функционального состояния иммунной и эндокринной систем при воспалительных процессах сосудистой оболочки глаза. Выявлены иммунологические факторы, обусловливающие риск прогрессирования и хронизации воспаления при его развитии в роговице и сосудистой оболочке глаза. Определены сходство и различия в нарушениях системы цитокинов при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза, обусловленные их анатомо-функциональными отличиями.

Полученные результаты представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения воспалительных и дистрофических заболеваний глаз, а также к коррекции дисбаланса локального и системного содержания цитокинов, своевременной профилактики развития хронических форм заболеваний и осложнений, возникающих при длительном воспалении.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты работы легли в основу методических рекомендаций Министерства здравоохранения Республики Башкортостан «Иммунный и гормональный статус больных герпетическим кератитом и коррекция его изменений» (Уфа, 2001), «Состояние интерферонового статуса как обоснование применения циклоферона в терапии больных офтальмогерпесом» (Уфа, 2005); изложены в двух монографиях, предназначенных для практических врачей. По материалам диссертации получено 5 патентов Российской Федерации (РФ) на изобретения.

Материалы комплексных исследований используются в работе консультативной поликлиники, клинических отделений Уфимского НИИ глазных болезней и офтальмологической службы поликлиники № 52 г. Уфы.

Основные положения и выводы диссертационной работы включены в программу обучения студентов, интернов, аспирантов и используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации по инфекционным и воспалительным заболеваниям глаз для врачей-офтальмологов на базе Уфимского НИИ глазных болезней.

Основные положения, выносимые на защиту

1 Для воспалительных и дистрофических процессов в оболочках глаза характерны изменения системы цитокинов на местном и системном уровнях, регулирующих тип, длительность и степень выраженности иммунного ответа.

2 Активация местного и системного иммунного ответа при реактивации персистирующей герпетической и хламидийной инфекции выражается значимым увеличением концентрации IL-1, IL-2, TNF-, IL-6, IF- в сыворотке крови и слезной жидкости.

3 Цитокиновый профиль при герпес-индуцированных воспалительных процессах характеризуется ростом местного и системного уровней цитокинов (IL-1, TNF-, IL-6, IL-2, IF- и IF-) с более значимым повышением локального и системного содержания IF- и IF- при воспалении роговицы и TNF-, IL-6, IL-2 - сосудистой оболочки глаза.

4 Развитие воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза, характеризующиеся изменениями местного и системного уровней IL-1, IL-2, TNF-, IL-6, IF-, связано с этиологией заболевания. Дисбаланс содержания простагландина Е2 в сыворотке крови и слезной жидкости сопряжен с полом пациентов и развитием рецидива заболевания.

5 Воспаление увеального тракта сопровождается транзиторным изменением содержания гормонов (кортизола, тестостерона, тиреотропного гормона, общего трийодтиронина, свободного тироксина) и антител к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе в сыворотке крови, а также наличием достоверных корреляционных связей уровней цитокинов и гормонов, опосредующих межсистемные иммуно-эндокринные взаимодействия.

6 Развитие дистрофических процессов в роговице при ее эндотелиально-эпителиальной дистрофии сопровождается статистически значимым увеличением содержания IL-4 в сыворотке крови и смещением баланса в сторону Th2-типа иммунного ответа.

7 Дистрофические процессы сетчатки, приведшие к ее отслойке, сопровождаются изменениями содержания цитокинов (IL-1, IL-2, TNF-, IL-6, IL-4) на местном и системном уровнях, характер которых обусловлен типом офтальмопатологии, приведшей к развитию отслойки сетчатки, ее величиной и сроком давности развития.

8 Риск развития неблагоприятного течения воспалительного процесса в роговице, вызванного вирусом простого герпеса, сопряжен с повышением уровня TNF- в слезной жидкости и недостаточной местной и системной мобилизацией IL-4; воспаление сосудистой оболочки глаза, ассоциированное с системными ревматическими заболеваниями, совпадает с высоким (более 750 пг/мл) содержанием васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Ерошевские чтения» (Самара, 2002); конференции «Офтальмология в начале XXI века» (Саратов, 2002); Всероссийской научной конференции «Перфторуглеродные соединения в экспериментальной и клинической медицине» (Санкт-Петербург, 2004); научно-практических конференциях «Воспалительные заболевания органа зрения» (Челябинск, 2004), «Достижения в офтальмологии» (Москва, 2008); научно-практической конференции с международным участием «Современные технологии лечения заболеваний переднего и заднего сегментов глаза» (Уфа, 2008); научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии» (Уфа, 2009).

Диссертация апробирована на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава» (протокол № 7 от 25.06.2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 53 научные работы, в т.ч. 2 монографии: «Хламидийный конъюнктивит: клиника, диагностика, лечение» (Уфа, 2003), «Цитокины в офтальмологии» (Уфа, 2008); 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 5 патентов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 241 странице. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов и, практических рекомендаций. Работа содержит 40 таблиц и 34 рисунка. Список литературы включает 287 источников (101 отечественный и 186 иностранных).

Диссертационная работа выполнена по основному плану НИР Государственного учреждения «Уфимский НИИ глазных болезней» Академии наук Республики Башкортостан.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Основу работы составляют результаты комплексного иммунологического обследования 312 пациентов с воспалительными и дистрофическими заболеваниями органа зрения, находившихся на стационарном лечении в Уфимском НИИ глазных болезней Академии наук Республики Башкортостан в период с 2000-го по 2008-й годы.

В зависимости от наличия воспалительного или дистрофического процесса в тканях глаза все обследуемые больные были разделены на две группы. Первую составил 261 пациент в возрасте от 21 года до 69 лет с воспалительными реакциями в конъюнктиве и роговице глаза (165 человек) и в увеальном тракте (96 человек) Во вторую группу вошел 51 пациент с дистрофическими процессами: 18 человек с дистрофическими изменениями роговицы и 33 - сетчатки (возраст ? от 30 до 70 лет).

Клинико-биомикроскопическое исследование стадий воспалительного процесса проводили д.м.н., проф. В.Б. Мальханов, к.м.н. Г.Х. Зайнутдинова, к.м.н. З.Р. Марванова, к.м.н. Э.А. Латыпова. Клиническую диагностику верифицировали на основании данных определения антигенов вируса простого герпеса (ВПГ), аденовирусов и Chlamydia trachomatis в соскобе с конъюнктивы методом флуоресцирующих антител, уровня специфических антител к ВПГ (иммуноглобулины (Ig) классов M и G) и хламидиям (IgA и IgG), специфических аутоантител к IgG и к антигенам ДНК в крови методом иммуноферментного анализа, заключения ревматолога. Диагноз эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы устанавливался к.м.н. З.Р. Марвановой и к.м.н. Н.А. Никитиным, регматогенной отслойки сетчатки ? к.м.н. О.В. Вавиловой на основании данных анамнеза, клинической картины заболевания, использования офтальмологических методов исследования.

Группу пациентов с офтальмоинфекциями составили: 72 человека - с поражением роговицы вирусом простого герпеса (ВПГ) - герпетическим кератитом, 34 - с поражением конъюнктивы и роговицы аденовирусами (эпидемический кератоконъюнктивит) и 59 - с развитием воспаления конъюнктивы при ее инфицировании хламидиями (хламидийный конъюнктивит).

Пациенты с офтальмогерпесом были распределены на группы в зависимости от частоты и глубины поражения роговицы ВПГ: развитие воспаления в роговице впервые отмечали в 45,8% случаев, его рецидив - в 54,2 %; локализацию воспаления в поверхностных слоях роговицы наблюдали в 38,9%, в глубоких - в 61,1 % случаев. Изучение цитокинового статуса пациентов с герпесом глаза проводилось совместно с к.м.н. З.Р. Марвановой.

У 22 (37,3 %) пациентов с хламидийной инфекцией конъюнктивы отмечали острое, у 37 (62,7 %) ? хроническое течение инфекции глаз.

Было обследовано 96 пациентов с воспалительными процессами увеального тракта различной этиологии, в том числе ассоциированными с системными ревматическими заболеваниями (РЗ) - 27 (28,1 %) человек, инфекционной - 23 (24,0 %) и неясной этиологии - 46 (47,9 %). При воспалении увеального тракта, ассоциированного с РЗ, иммунологические исследования проводили в острую стадию воспаления глаза. Общее системное РЗ при этом находилось в стадии ремиссии, а его спектр был представлен ревматоидным артритом, реактивными артритами и различными видами спондилоартритов.

В группе с развитием дистрофических процессов в оболочках глаза был 51 пациент: 18 человек с вторичной эндотелиально-эпителиальной дистрофией (ЭЭД) роговицы III?IV стадий и 33 - с дистрофическими процессами в сетчатке, которые привели к ее отслойке. У 8 (44,4 %) пациентов была отмечена ЭЭД роговицы, у 10 (55,6 %) - ЭЭД, осложненная воспалением увеального тракта.

Пациенты с дистрофическими процессами сетчатки были распределены в зависимости от вида дистрофических процессов, приведших к ее отслойке: 12 (36,4 %) пациентов, у которых отслойка сетчатки развилась на фоне миопии средней и высокой степени, 15 (45,5 %) - на фоне пролиферативной витреохориоретинальной дистрофии. У 14 (51,9 %) пациентов была диагностирована локальная отслойка сетчатки, площадью 1-2 квадранта, и у 13 (48,1%) - тотальная, площадью 3?4 квадранта. У 12 (44,4 %) пациентов срок развития отслойки не превышал 1 месяца, у 10 (37,0 %) - от 1 до 3 месяцев и у 5 (18,6 %) - со времени развития отслойки сетчатки прошло более 3 месяцев (исследования были проведены совместно с к.м.н. О.В. Вавиловой). Группу сравнения составили 6 (18,2 %) пациентов того же возраста с посттравматической отслойкой сетчатки.

В таблице 1 представлены данные о количестве пациентов с воспалительными и дистрофическими процессами в тканях глаза, в биологических жидкостях которых было проведено иммунофенотипирование лимфоцитов крови, определение местных и системных уровней цитокинов. У больных с воспалением увеального тракта осуществляли также определение гормонального статуса.

Контрольную группу составили 37 практически здоровых лиц в возрасте от 20 до 69 лет, сопоставимых по полу с обследуемыми группами пациентов. В контрольную группу для ЭЭД роговицы вошли 7 практически здоровых лиц в возрасте 58?69 лет.

Взятие крови осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых больных в стерильных условиях в 2 пробирки (по 5 мл), в одну из которых добавляли 20 мкл гепарина. Слезную жидкость собирали из конъюнктивальной полости пациентов с помощью меланжера. Субретинальную жидкость получали во время оперативного вмешательства по поводу отслойки сетчатки.

Таблица 1 - Распределение пациентов в соответствии с использованными методами исследования

Определение уровней цитокинов - IL-1, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-, IF-, IF-, VEGF - в сыворотке крови (СК) и слезной жидкости (СЖ) пациентов проводили методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, прилагаемым производителями тест-систем («Procon», С.-Петербург, Россия; «Вектор-Бест», Россия; «CYTELISA», США). Учет результатов осуществляли с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan» при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пг/мл.

Иммунофенотипирование лимфоцитов крови по CD-маркерам (СD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD71+, CD95+, HLA-DR+) проводили методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител фирмы «Сорбент» (Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства). Результаты выражали в абсолютных и относительных значениях [Имельбаева Э.А. и др., 2004].

При серологических исследованиях уровней иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови применяли метод радиальной иммунодиффузии по Манчини, а также иммуноферментный анализ с использованием диагностических тест-систем («Вектор-Бест», Россия).

Определение содержания гормонов - кортизола, тестостерона, пролактина, тиреотропного гормона (ТТГ), тироксина (Т4), трийодтиронина (Т3), а также антител к тиреоглобулину (анти-ТГ) и тиреопероксидазе (анти-ТПО) - в сыворотке крови пациентов с воспалением увеального тракта осуществляли с помощью тест-систем («Вектор-Бест», Россия) методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, прилагаемым производителями. Результаты выражали в стандартных единицах, принятых для каждого показателя.

Определение содержания простагландина Е2 в сыворотке крови проводили с помощью тест-системы «R@D» (CША) методом иммуноферментного анализа согласно инструкции производителя. Результаты выражали в пг/мл.

Математико-статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием стандартных методов параметрической и непараметрической статистики с использованием пакета современных прикладных программ [Боровиков В.П., 2001; Реброва О.Ю., 2006]. Она включала определение дескриптивных статистических данных: среднее выборочное значение (М); средне квадратичное отклонение (SD), показывающее изменчивость вариационного ряда. Для выявления значимой корреляции использовались методы однофакторного и многофакторного параметрического дисперсионного анализа, основанного на разложении общей дисперсии на составляющие: факторальную дисперсию и случайную. На основании расчетов определялся коэффициент влияния контролирующего фактора - доля вариационных данных (по отношению к общим значениям), вызванная действием фактора, которым можно манипулировать или контролировать. В многофакторной схеме влияние факторов распределяется различным их сочетанием.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Роль цитокинов в развитии воспалительных процессов при вирусном и хламидийном поражении конъюнктивы и роговицы глаз

Профиль цитокинов при герпес-индуцированном воспалении роговицы

В настоящее время герпес рассматривается как приобретенная патология иммунной системы, при которой длительная персистенция вируса сопровождается инфицированием всех видов ее клеток, приводя к их функциональной недостаточности и развитию иммунодефицита.

Проведенные нами исследования субпопуляционного состава лимфоцитов крови показали, что реактивация латентной герпетической инфекции в организме, вызывающая развитие воспалительной реакции в роговице, сопровождалась тенденцией к повышению относительного количества CD8+-лимфоцитов крови при статистически значимом (p<0,001) снижении содержания CD4+-клеток и значения иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+). О выраженной активации иммунной системы свидетельствовало статистически значимое (р<0,001) увеличение относительного количества клеток с высокой пролиферативной активностью - CD71+-лимфоцитов; клеток, экспрессирующих CD95+(FAS/APO-1)-рецептор; HLA-DR-клеток и выявленная корреляционная связь (r=0,49, р=0,016) между содержанием CD95+- и HLA-DR-лимфоцитов. Статистически значимо (р<0,01) повышалась концентрация IgМ в сыворотке крови.

Исследование цитокинового статуса пациентов показало, что стадия развития герпетического воспаления роговицы сопровождалась поляризацией иммунного ответа в сторону Th1-типа, увеличением локального и системного уровня IL-1, IL-6, TNF-, IL-2, IF- и IF- (таблица 2), характер и направленность изменений которых в целом согласуются с концепцией типовых механизмов развития воспалительного процесса.

Таблица 2 - Содержание цитокинов на местном и системном уровне при герпес-индуцированном воспалении роговицы (MSD)

Была отмечена большая степень выраженности иммунного реагирования на местном уровне, по сравнению с системным, для IL-1 (соответственно в 4,2 и 2,0 раза), IL-2 (в 2,9 и 1,8 раза) и аналогичные изменения для TNF- (в 2 раза), IF- (в 13 раз) и IF- (более чем в 3 раза). Герпес-индуцированное воспаление роговицы сопровождалось значительно выраженным дисбалансом содержания альтернативных цитокинов: величина соотношения уровней IF-г/IL-4 в разгар инфекции составляла в сыворотке крови 19,2±1,1 единицы против 10,9±0,7 ед. - в контроле, в слезной жидкости - соответственно 44,7±4,8 и 19,2±1,5 (р<0,05) единицы. Завершение воспаления сопровождалось снижением величин данного соотношения в сыворотке крови до 5,2±0,3 ед. и слезной жидкости - до 13,7±1,6 ед., свидетельствуя о постепенном уменьшении востребованности в провоспалительных цитокинах и восстановлении их баланса.

Проведенное нами исследование показало, что содержание цитокинов на местном и системном уровне при воспалении роговицы, вызванном ВПГ, было обусловлено частотой развития рецидивов герпетической инфекции и имело однонаправленный характер: рецидив воспаления характеризовался более высокими уровнями в сыворотке крови и слезной жидкости всех изучаемых цитокинов, за исключением IL_4, имеющего различную динамику локальной и системной принадлежности (рисунок 1).

А Б

первая атака рецидив

Рисунок 1 ? Содержание цитокинов в сыворотке крови (А) и слезной жидкости (Б) при герпес-индуцированном воспалении роговицы в зависимости от частоты рецидивов герпетической инфекции

Вероятно, это обусловлено длительной стимуляцией макрофагов образующимися комплексами ВПГ-IgG, что приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов, усиливая ангиогенез и воспаление [Hayashi K. et al., 2009]. Дисбаланс содержания IF- и IL-4 в сыворотке крови был более значим при рецидиве офтальмогерпеса, чем при первой атаке вируса (соответственно 28,2±3,6 и 13,1±1,2 ед.), а в слезной жидкости - при первом развитии заболевания (соответственно 117,9±10,3 и 18,9±2,7 единицы, р<0,01).

Профиль цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости определялся также и глубиной локализации герпетического воспалительного процесса в роговице (рисунок 2), имея одинаковую направленность, но большую степень выраженности при глубоких формах офтальмогерпеса.

А Б

поверхностная локализация воспаления глубокая локализация воспаления

Рисунок 2 ? Содержание цитокинов в сыворотке крови (А) и слезной жидкости

(Б) при герпес-индуцированном воспалении роговицы в зависимости от глубины его локализации

Коэффициент соотношения содержания IF-г относительно уровня IL-4 в сыворотке крови при глубоком и поверхностном поражении роговицы ВПГ составлял соответственно 17,1±2,0 и 17,1±1,8 ед., в слезной жидкости - соответственно 122,0±9,4 и 57,4±3,5 (р<0,05) единицы. Возможно, распространение герпетического поражения в глубокие слои роговицы обусловлено более значимым местным накоплением провоспалительных цитокинов и недостаточной для адекватного иммунного ответа уровнем противовоспалительного IL-4.

Динамика изменения содержания цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости по мере распространения герпетического воспалительного процесса вглубь роговицы также имела одинаковую направленность, отличаясь более выраженной активацией местного и системного иммунного реагирования при глубокой локализации воспаления. При этом максимальное накопление IL-1, IL-6 и TNF- в сыворотке крови и слезной жидкости отмечался в более поздние сроки, чем при поверхностном воспалении.

Итак, при взаимодействии иммунной системы с ВПГ в реакциях адаптивного иммунитета установлено участие цитокинов на местном и системном уровне, которое заключается в регуляции типа, длительности и степени выраженности локального и системного иммунного ответа в зависимости от глубины развития воспаления в слоях роговицы, частоты реактивации латентной герпетической инфекции. Выявленные изменения, представленные в виде схемы (рисунок 3), могут являться следствием нарушения иммунологического равновесия, необходимого для адекватного реагирования организма на вирусную инфекцию, а также могут быть причиной нарушения коммуникации иммунокомпетентных клеток путем изменения функциональной активности лимфоцитов на молекулярном уровне. Определение уровней цитокинов и их баланса при развитии герпетического воспаления роговицы является информативным показателем при прогнозе развития глубоких форм герпетического кератита, открывая дополнительные возможности для контроля течения воспалительного процесса.

Цитокины при аденовирусной инфекции глаз

Исследование иммунологических показателей в крови пациентов при поражении конъюнктивы и роговицы аденовирусами типов 8, 19 и др. (эпидемический кератоконъюнктивит - ЭКК) показало, что воспалительный процесс характеризовался статистически значимым (р<0,01) повышением содержания относительного числа лимфоцитов крови. Выявлена корреляционная взаимосвязь средней степени (r=0,65, р=0,048) между содержанием СD95+- и CD8+-лимфоцитов и статистически значимое (р<0,05) повышение сывороточных концентраций IgA и IgМ, по сравнению с контролем. Полученные результаты являются доказательством адекватной реакции организма в ответ на вирусную инфекцию.

Изучение цитокинового статуса пациентов с ЭКК показало, что воспалительный процесс при аденовирусной инфекции глаз характеризовался статистически значимым (р<0,001) увеличением содержания в сыворотке крови и слезной жидкости (более чем в 3 раза) только IL-6 (рисунок 4).

По мере элиминации аденовируса из организма и завершения воспалительного процесса наблюдалось статистически значимое (р<0,05) снижение уровня IL-6 в сыворотке крови и слезной жидкости при практически неизменном содержании IL-1 и TNF-.

Рисунок 4 ? Содержание цитокинов в сыворотке крови (А) и слезной жидкости (Б) при аденовирусной инфекции глаз

Нами установлена однонаправленность цитокинового реагирования при герпетической и аденовирусной инфекциях глаз, характеризующаяся Th1-типом иммунного ответа с дисбалансом локального и системного содержания цитокинов. Отличительной особенностью воспаления при поражении оболочек глаза аденовирусами является значительно менее выраженные изменения уровней цитокинов цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости, по сравнению с таковыми при офтальмогерпесе. Проведенные нами исследования показали, что изменения в системе цитокинов являются отражением выраженности реакции организма на инфицирование аденовирусами оболочек глаза.

Роль цитокинов в развитии хламидийной инфекции конъюнктивы

Одним из патогенов, часто вызывающих развитие воспаления в конъюнктиве глаза, является Chlamydia trachomatis. Так же как и аденовирусы, хламидии обладают тропизмом к эпителию слизистой оболочки, но, в отличие от аденовирусов, они длительное время персистируют в организме хозяина, что в некотором роде сближает их с вирусом простого герпеса.

Проведенные нами при хламидийной инфекции конъюнктивы исследования показали статистически значимое (р<0,05) повышение в крови относительного числа лимфоцитов, тенденцию к снижению содержания CD4+-, CD16+-клеток и значения иммунорегуляторного индекса. Отмечена существенная активация иммунной системы, что проявлялось в повышении относительного содержания CD71+- и CD95+-лимфоцитов. Наблюдалась тенденция к росту концентрации IgМ в сыворотке крови.

Было установлено, что развитие воспалительного процесса в конъюнктиве при ее инфицировании Chlamydia trachomatis сопровождалось сдвигом иммунологического реагирования в сторону Th1-типа, что проявлялось статистически значимым (р<0,05) увеличением содержания IL-1 в сыворотке крови, по сравнению с контролем (таблица 3).

Таблица 3 ? Уровни цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при хламидийной инфекции конъюнктивы (MSD)

Свидетельством значительной активации иммунной системы в ответ на хламидии является взаимосвязь уровня IL-1 и содержания СD71+- лимфоцитов (r=0,48, p=0,05). Также было отмечено статистически значимое (р<0,01?0,001) повышение уровней IL-6 (в 3,6 раза), IF- (в 7,1 раза) и IF_ (в 2,6 раза) в сыворотке крови. Выявлена взаимосвязь между уровнем TNF- и содержанием общих CD3+-лимфоцитов (r=0,71, р<0,03). На стадии завершения воспаления в сыворотке крови была отмечена нормализация концентрации IL-1, TNF-, IF-.

Поражение конъюнктивы Chlamydia trachomatis сопровождалось существенным (в 2,6 раза) увеличением концентрации IL-4 в сыворотке крови. При этом хронические формы офтальмохламидиоза (персистенция хламидий) сопровождались более высокими уровнями IL-4 в сыворотке крови, по сравнению с благоприятно протекающими ? 138,716,4 пг/мл и 81,212,5 пг/мл соответственно. Выявлена взаимосвязь содержания IL-4 в сыворотке крови с числом CD95+-лимфоцитов (r=0,43, p=0,05), подтверждающая участие данного цитокина в реализации апоптических процессов.

Проведенными исследованиями установлено, что хламидийная инфекция конъюнктивы характеризовалась значимым проявлением локального иммунного реагирования, при этом содержание IL-1, IL-6 и TNF- в слезной жидкости в острый период развития воспаления возрастало в 1,5?1,8 раза, по сравнению с контролем. Завершение воспалительного процесса сопровождалось нормализацией содержания IL-1 и TNF- при продолжающемся росте уровня IL-6 в слезной жидкости. Содержание противовоспалительного IL-4 в слезе, в отличие от такового в сыворотке крови, существенно не менялось. Коэффициент соотношения уровней противоположных пулов цитокинов IF-/IL-4 в острый период хламидийной инфекции глаза в сыворотке крови и слезной жидкости составлял соответственно 11,2±0,4 и 34,9±7,1 (р<0,05) ед., при выздоровлении - соответственно 8,7±0,6 и 26,7±4,2 (p<0,05) единицы.

Сравнительный анализ содержания IL-1, TNF-, IL-6 в сыворотк крови и слезной жидкости при вирусных (герпетической, аденовирусной) и хламидийной (Chlamydia trachomatis) офтальмоинфекциях показал их сходство в профиле цитокинов и направленности иммунного ответа с преобладанием его на локальном уровне. Отмечено различие в степени выраженности иммунологического реагирования (рисунок 5).

цитокин герпес воспаление глаз

- - - - слезная жидкость _____ сыворотка крови

Рисунок 5 ? Уровни цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при офтальмоинфекциях, пг/мл (1 - при поверхностных формах офтальмогерпеса, 2 - при глубоких формах офтальмогерпеса, 3 - при аденовирусной и 4 - хламидийной инфекциях глаз)

Однотипные реакции при вирусной (герпетической) и хламидийной инфекции глаз могут быть обусловлены длительной персистенцией их возбудителей в организме человека, часто хроническим течением заболевания. Сопоставление содержания цитокинов с клиническим течением этих офтальмоинфекций выявило ассоциацию более высоких уровней TNF-, IL-1, IL-6, IF- и IF- в сыворотке крови и слезной жидкости с неблагоприятным (глубокие формы, рецидивы) течением заболевания, что может иметь важное прогностическое значение. Выявленная взаимосвязь уровней цитокинов с глубиной локализации воспаления в тканях роговицы при герпесе глаза обусловлена, возможно, активацией иммунологически неактивных в норме клеток интраокулярных тканей, в том числе эндотелия роговицы, что вызывает каскад цитокиновых реакций и способствует выраженному повреждению тканей глаза [Zheng M., Atherton S.S., 2005; Dace D.S. et a.l, 2007].

2 Значение цитокинов и иммуно-эндокринные взаимодействия в развитии воспалительных процессов в сосудистой оболочке глаза

Профиль цитокинов при воспалительных процессах в сосудистой оболочке глаза

Развитие воспалительных процессов в сосудистой оболочке глаза (увеальный тракт) обусловлено наличием большого количества разветвленных сосудов, где резко снижается скорость кровотока, создавая условия для оседания и фиксации в нем различных бактериальных и токсических агентов.

При воспалении сосудистой оболочки глаза нами была установлена тенденция к снижению соотношения иммунокомпетентных клеток крови (CD4+/CD8+), статистически значимое (р<0,05) повышение относительного числа CD95+-лимфоцитов, увеличение содержания В-клеток крови и IgА- и IgG-гипериммуноглобулинемия. Выявленная взаимосвязь числа В-клеток (CD19+) с содержанием IgМ (r=0,7731, p=0,024) в период максимального развития воспаления, вероятно, свидетельствует о продукции антиувеальных аутоантител, относящихся к этому классу иммуноглобулинов.

Воспаление сосудистой оболочки глаза (увеит) сопровождалось смещением баланса цитокинов в пользу их продукции Th-1 иммунными клетками крови, что проявлялось значимым повышением уровней IL-1, TNF-, IL-6, IL-2, IF- и IF- в сыворотке крови относительно практически здоровых лиц (таблица 4). Выявленные взаимосвязи (r=0,4652, р=0,028) уровня TNF- с содержанием CD4+-лимфоцитов, а также уровня IL-1 с концентрацией IgМ (r=0,7620, р=0,024) в сыворотке крови характеризовали активное участие различных компонентов иммунитета в развитии воспалительного процесса. Купирование воспаления нестероидными противовоспалительными препаратами приводило к восстановлению баланса цитокинов.

Как и при воспалении конъюнктивы и роговицы, дисбаланс локального уровня цитокинов при воспалительном процессе в увеальном тракте отличался большей степенью выраженности, чем системный. При этом период развития воспаления характеризовался статистически значимым (р<0,05) повышением содержания IL-1, TNF-, IL-6, IL-1RA (в 2-3 раза) и тенденцией к повышению уровней IL-2 в слезной жидкости, по сравнению с таковым в контроле, что соответствует классическим представлениям об активации иммунной системы. Коэффициент соотношения уровней IF-/IL-4 в разгар воспаления в сыворотке крови и слезной жидкости составлял соответственно 15,1±2,8 и 20,5±3,5 ед., при завершении - соответственно 7,2±0,6 и 9,0±0,9 единиц.

Таблица 4 ? Уровни цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при воспалительных процессах сосудистой оболочки глаза (MSD)

Особенности дисбаланса местного и системного содержания провоспалительных цитокинов при воспалении сосудистой оболочки глаза определяются его этиологией: выявлено значимое увеличение их уровней при аутоиммунной патологии - системных ревматических заболеваниях (РЗ), в сравнении с герпетической инфекцией (рисунок 6).

Отличием герпетического воспаления в увеальном тракте от воспаления, ассоциированного с РЗ, являлся статистически значимый рост уровней в сыворотке крови и слезной жидкости IF- (соответственно в 9,9 и 13,2 раза) и IF- (соответственно в 3,4 и 3,6 раза), которые оставались повышенными и при завершении воспаления. Это связано с высоким их содержанием в тканях глаза, обусловленном особенностями патогенеза вирусной инфекции, в том числе длительной персистенцией ВПГ в нервных ганглиях, приводящей к продолжительной продукции интерферонов [Акберова С.И., 2001]. Выявленная взаимосвязь уровня продукции TNF- и числом CD95+-лимфоцитов (r=0,78, p=0,054) крови при герпес-индуцированном воспалении сосудистой оболочки глаза свидетельствует об участии данного цитокина в регуляции апоптоза [Симбирцев А.С., 2004; Wang L. et al., 2007].

Рисунок 6 ? Сравнительная характеристика уровней цитокинов в cыворотке крови и слезной жидкости при воспалении сосудистой оболочки, ассоциированного с вирусом простого герпеса и системными ревматическими заболеваниями

Важную роль в патогенезе воспаления сосудистой оболочки глаза играют нарушения гемодинамики и ангиогенеза. Установлено участие васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) в развитии РЗ без вовлечения в патологический процесс органа зрения [Марченко Ж.С., Лукина Г.В., 2005; Nakahara Н. еt al., 2003]. Проведенные нами исследования также выявили существенное повышение уровня VEGF в сыворотке крови при воспалении увеального тракта, наиболее выраженное при развитии увеита на фоне системных ревматических заболеваний (таблица 5).

Таблица 5 ? Содержание васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови при воспалении сосудистой оболочки глаза (MSD)

Примечание - * различие с контролем статистически значимо (р<0,05); ** - р<0,01;

*** - p<0,01.

В сыворотке крови у больных с рецидивом увеита был отмечен более высокий уровень VEGF (в среднем 762,459,2 пг/мл), по сравнению с таковым у впервые заболевших пациентов (в среднем 237,634,8 пг/мл, р<0,001). При этом содержание VEGF в сыворотке крови в интервале 550?1750 пг/мл отмечали у 16,7 % впервые заболевших пациентов, тогда как при рецидиве заболевания - в 66,7 % случаев, что, вероятно, является неблагоприятным признаком и имеет прогностическое значение.

Рисунок 7 ? Содержание цитокинов в сыворотке крови в зависимости от локализации воспалительного процесса в оболочках глаза

Сравнительный анализ содержания цитокинов в сыворотке крови выявил зависимость их уровня от анатомо-функционального строения оболочки глаза, вовлеченной в воспалительный процесс (рисунок 7). Наименьшие концентрации IL-6, TNF- и IL-1 в сыворотке крови отмечали при развитии воспаления в конъюнктиве, наибольшие - в сосудистой оболочке глаза, отличающейся наличием густой сети кровеносных сосудов, возможностью миграции антигенов, Т- и В-лимфоцитов, медиаторов межклеточных реакций из тканей глаза в кровь [Катаргина Л.А., Архипова Л.Т., 2004].

Нами было проведено исследование участия одного из медиаторов воспаления ? простагландина Е2 (ПГЕ2) в иммунологических реакциях при увеитах. Установлено статистически значимое увеличение содержания ПГЕ2 в сыворотке крови на всех стадиях воспалительного процесса (в контроле - 340,0±49,4 пг/мл, р<0,01) (рисунок 8). При герпетической этиологии увеита концентрация ПГЕ2 в сыворотке крови составила в среднем 1025,4±203,6 пг/мл, при ассоциации увеита с РЗ ? 1361,7±154,2 пг/мл, при неясной этиологии воспаления ? 1405,6±163,9 пг/мл. В слезной жидкости уровень ПГЕ2 на стадии развития воспаления также статистически значимо превышал контрольный, который составлял 175,8±21,7 пг/мл (р<0,05). Рецидив заболевания сопровождался менее значимым повышением содержания ПГЕ2 в сыворотке крови и более высоким - в слезной жидкости, по сравнению с развитием воспаления впервые.

Рисунок 8 ? Сравнительная характеристика уровней простагландина Е2 в сыворотке крови и слезной жидкости в зависимости от частоты развития воспаления в сосудистой оболочке глаза

Выявлено наличие полового диморфизма в содержании ПГЕ2, которое проявлялось более значимым повышением уровня ПГЕ2 в сыворотке крови и слезной жидкости на стадии развития воспаления у женщин, по сравнению с мужчинами (сыворотка крови - соответственно 1586,0±142,9 пг/мл и 1172,9±130,1 пг/мл, слеза - соответственно 635,8±54,8 пг/мл и 217,3±37,2 пг/мл, р<0,01). Благоприятное течение воспалительного процесса в увеальном тракте, с купированием признаков воспаления в короткие сроки, ассоциировалось с достоверной корреляционной связью содержания ПГЕ2 в сыворотке крови с уровнями VEGF (r=0,9659, р=0,034) и TNF- (r=0,7889, р=0,035). При неблагоприятном затяжном течении таких взаимосвязей выявлено не было.