Сравнительная эффективность современных иммунологических методов исследования цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СОВРЕМЕННЫХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НЕЙРОСИФИЛИСА

14.01.10 - кожные и венерические болезни

Катунин Георгий Леонидович

Москва - 2012

Работа выполнена в отделе инфекций, передаваемых половым путем, и в отделе лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем, и болезней кожи Федерального государственного бюджетного учреждения "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

Наталия Владиславовна Фриго, доктор медицинских наук.

Научный консультант:

Олег Семенович Левин, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой неврологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России.

Официальные оппоненты:

Анна Васильевна Резайкина, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отделения клинической иммунологии ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России;

Константин Михайлович Ломоносов, доктор медицинских наук, профессор, кафедра кожных и венерических болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО "Первый МГМУ им. И.М. Сеченова".

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов, г. Москва.

Защита диссертации состоится "____" ______________ 2012 г. в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.115.01 при ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан "____" _____________2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова.

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на тенденцию к снижению заболеваемости сифилисом в целом по Российской Федерации, наблюдаемую в последнее десятилетие, заболеваемость нейросифилисом имеет тенденцию к росту.

В Российской Федерации показатель заболеваемости сифилисом в 2010 году составил 44,9 случаев на 100 тыс. населения, что в 6,2 раза ниже аналогичного показателя 1997 года (Стародубов В.И., Кубанова А.А., 2011). Однако снижение общей заболеваемости сифилисом в настоящее время сопровождается ростом случаев нейросифилиса. В 1997 году в России был зарегистрирован 81 случай нейросифилиса, в последующие годы отмечено увеличение числа больных сифилисом со специфическим поражением нервной системы, которое в 2010 году составило 862 случая (Какорина Е.П., Кубанова А.А., Гречко А.В. и соавт., 2005; Хальфин Р.А., Кубанова А.А., Михайлова Ю.В. и соавт., 2006; Хальфин Р.А., Кубанова А.А., Михайлова Ю.В. и соавт., 2007; Кривонос О.В., Михайлова Л. А, Михайлова Ю.В. и соавт., 2009; Скворцова В.И., Стародубов В.И., Кубанова А.А., 2010; Стародубов В.И., Кубанова А.А., 2011). По данным государственной статистической отчетности, кроме увеличения общего числа вновь зарегистрированных случаев нейросифилиса, с 2002 года отмечается рост поздних форм нейросифилиса: в 2002 году в России было зарегистрировано 282 случая позднего нейросифилиса, в 2010 году аналогичный показатель составил уже 604 случая.

Своевременное выявление нейросифилиса во многом зависит от эффективных методов исследования цереброспинальной жидкости (Шамбуров Д.А., 1954; Фридман А.П., 1971; Прохоренков В.И. и соавт., 1999; Самцов А.В. и соавт., 2006; Фриго Н.В. и соавт., 2008; Lukehart S. et al., 1988; MacLean S. et al., 1996; Luger A. et al., 2000; Marra C. et al., 2004; Castro R. et al., 2008; Sparling P., 2010) и приобретает особое значение в связи с изменением течения заболевания в последние десятилетия, наличием скрытых, малосимптомных и атипичных форм поражения нервной системы, при которых зачастую только исследование цереброспинальной жидкости делает возможной постановку окончательного диагноза (Прохоренков В.И., 2002; Дубенский В.В., Яковлев Н.А., 2004; Родиков М.В., 2009; Залевская О.В. 2010; Красносельских Т.В., Соколовский Е.В., 2010; Weinert L.S., et al., 2008; Marra C., 2009; Ghanem K.G., 2010).

Клинические методы исследования (цитологическое исследование и определение количества белка) являются важными для диагностики нейросифилиса, но не подтверждают специфичность поражения, поэтому большое значение придается иммунологическим методам исследования цереброспинальной жидкости.

В настоящее время при диагностике сифилиса применяют спектр иммунологических тестов, направленных на выявление противотрепонемных антител, однако, некоторые из этих тестов (РМП, РПГА, иммуноблоттинг) до настоящего времени не были регламентированы для исследования цереброспинальной жидкости с целью диагностики нейросифилиса и не были включены в стандарты диагностики нейросифилиса на территории Российской Федерации.

Одним из современных методов исследования, направленных на одновременное дифференцированное определение антител к нескольким антигенам бледной трепонемы, является метод иммуноблоттинга. Количество публикаций, посвященных исследованию цереброспинальной жидкости методом иммуноблоттинга, ограничено. Отмечен положительный результат исследования цереброспинальной жидкости методом иммуноблоттинга у детей с симптомами врожденного сифилиса (Sanchez P.J. et al., 1992), больных менинговаскулярным нейросифилисом (Bollensen E., Albrecht S., Beuche W., et al., 1993), больных поздним скрытым сифилисом (Kotnik V., Jordan K., Stopinsek S. et al., 2007). По мнению авторов (Kotnik V., Jordan K., Stopinsek S. et al., 2007), метод иммуноблоттинга может быть полезен для выявления асимптомного нейросифилиса. В настоящее время, как в России, так и за рубежом исследование цереброспинальной жидкости методом иммуноблоттинга с целью диагностики нейросифилиса не регламентировано нормативными документами, что определяет необходимость проведения исследований по оценке диагностической эффективности данного метода у больных нейросифилисом.

Таким образом, для диагностики нейросифилиса путем исследования цереброспинальной жидкости разработаны и применяются в России и за рубежом клинические (определение содержания цитоза, количества белка) и иммунологические (нетрепонемные и трепонемные) методы исследования.

Ситуация, сложившаяся в настоящее время с исследованием цереброспинальной жидкости иммунологическими методами для диагностики нейросифилиса в России, требует оптимизации. Это связано с отсутствием нормативных документов и стандартов, четко регламентирующих применение для диагностики нейросифилиса таких современных методов, как РПГА и иммуноблоттинг, отсутствием результатов сравнительных исследований диагностической эффективности РСК и РМП, доказывающих преимущества РМП над РСК.

Все вышеизложенное определяет актуальность проведения исследований, направленных на разработку рекомендаций и алгоритма обследования пациентов для диагностики нейросифилиса путем исследования цереброспинальной жидкости с помощью современных иммунологических методов.

Цель работы: оценить эффективность современных нетрепонемных и трепонемных методов исследования цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса и разработать алгоритм их применения.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту использования регламентированных методов исследования цереброспинальной жидкости в медицинских организациях дерматовенерологического профиля Российской Федерации.

2. Изучить частоту выявления различных клинических форм нейросифилиса на современном этапе.

3. Провести сравнительное изучение диагностической значимости РМП, РПР, РПГА, иммуноблоттинга и регламентированных методов (РСК, РИФц, ИФА, РИБТ) при исследовании цереброспинальной жидкости.

4. Разработать алгоритм применения современных нетрепонемных и трепонемных методов исследования цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса.

Научная новизна. Впервые в Российской Федерации в сравнительном аспекте изучена диагностическая значимость иммунологических методов РМП, РПР, РСК, РИФц, ИФА, РИБТ, РПГА и иммуноблоттинга при исследовании цереброспинальной жидкости, осуществляемом для диагностики нейросифилиса.

Дано научное обоснование целесообразности применения алгоритма выявления больных асимптомным нейросифилисом, предусматривающего осуществление трепонемных и нетрепонемных тестов, в том числе не включенных в утвержденные нормативные документы, таких как иммуноблотинг, реакция пассивной гемагглютинации, реакция микропреципитации или тест быстрых плазменных реагинов.

Установлены особенности современного течения и клинические особенности нейросифилиса, характеризующиеся высокой частотой асимптомного нейросифилиса (48,7 %), преобладанием среди манифестных форм нейросифилиса менинговаскулярного нейросифилиса (94,7 %), малосимптомными клиническими формами, что может быть использовано в практической работе врачей дерматовенерологов для своевременного установления диагноза нейросифилиса.

Практическая значимость. На основании сравнительного изучения показателей диагностической эффективности иммунологических нетрепонемных и трепонемных методов при исследовании цереброспинальной жидкости с целью диагностики асимптомного нейросифилиса разработан диагностический алгоритм выявления антител к различным антигенам возбудителя сифилитической инфекции с использованием методов иммуноблоттинга, РПГА, РМП, РПР. Применение разработанного алгоритма в практическом здравоохранении будет способствовать оптимизации исследований для лабораторной диагностики нейросифилиса.

В проект Стандарта оказания медицинской помощи больным нейросифилисом включены РМП и РПГА - иммунологические методы исследования цереброспинальной жидкости, обладающие высокой диагностической эффективностью, что позволит повысить качество диагностики нейросифилиса, осуществляемой в специализированных медицинских организациях дерматовенерологического профиля Российской Федерации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В общей структуре регламентированных методов исследования цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса наиболее часто используется метод ИФА (44 %); другие методы исследования (РИФц, реакция Вассермана, клинические методы исследования: цитологическое исследование и определения количества белка, - применяются значительно реже (соответственно 18 %, 5 % и 6 %). В ряде лабораторий (16 %) вообще не осуществляют исследование цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса лабораторными методами.

2. Клиническое течение нейросифилиса в настоящее время характеризуется нерезко выраженной клинической симптоматикой, преобладанием в структуре манифестных форм заболевания менинговаскулярного нейросифилиса (94,7 %), высокой частотой асимптомного нейросифилиса (48,7 % среди всех форм).

3. Среди современных иммунологических тестов наиболее высокой диагностической эффективностью при исследовании цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом обладают: нетрепонемный тест РМП и трепонемные тесты: РПГА и иммуноблоттинг. В иммуноблоттинге с цереброспинальной жидкостью наиболее часто обнаруживаются антитела к рекомбинатным антигенам бледной трепонемы с молекулярной массой 17 и 47 кДа.

4. Для исследования цереброспинальной жидкости с целью диагностики асимптомного нейросифилиса может быть использован алгоритм, включающий последовательное применение трепонемных и нетрепонемных методов: иммуноблоттинга, РМП или РПР и РПГА.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на II Всеросийском конгрессе дерматовенерологов, С. Петербург, 25-28.09.07г.; научно-практической конференции ФГБУ "ГНЦДК Минздравсоцразвития России", Москва, 04.2009г; XVII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", Москва, 12.04-16.04.2010 г.

Внедрение результатов исследования. Иммунологические методы исследования цереброспинальной жидкости внедрены в работу отдела лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем и болезней кожи ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России. Полученные в ходе выполнения исследования результаты используются в практической работе врачей дерматовенерологов отдела инфекций, передаваемых половым путем ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития и обучающих программах сертификационных курсов для дерматовенерологов, на занятиях с клиническими ординаторами и аспирантами, на циклах общего и тематического усовершенствования ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития.

На основании результатов работы, касающихся изучения диагностической значимости иммунологических методов исследования цереброспинальной жидкости, осуществляемых для диагностики нейросифилиса, в проект Стандарта оказания медицинской помощи больным нейросифилисом включены: нетрепонемный тест РМП и трепонемный тест РПГА.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автором подготовлен обзор данных отечественной и зарубежной литературы по теме исследования, разработан дизайн исследования. Проведены: набор и клинико-лабораторное обследование больных основной группы и пациентов группы сравнения. Осуществлена интерпретация результатов лабораторного исследования сыворотки крови и цереброспинальной жидкости лиц, включенных в исследование. Проведена оценка диагностической эффективности иммунологических методов исследования цереброспинальной жидкости у пациентов с установленным диагнозом нейросифилиса и лиц без клинико-лабораторных признаков нейросифилиса, включенных в исследование. Проанализированы результаты анкетного опроса медицинских организаций дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации. Сформулированы выводы и практические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа изложена на 152 страницах компьютерного текста, включает 6 таблиц и 15 рисунков. Указатель литературы содержит 286 источников, из них 95 - отечественных и 191 - иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Дизайн, объект, материалы и методы исследования. Исследование проводилось в 3 этапа:

1 этап - оценка частоты использования регламентированных методов исследования цереброспинальной жидкости в медицинских организациях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации (по результатам анкетного опроса руководителей 41-й медицинской организации);

2 этап - изучение частоты выявления различных клинических форм нейросифилиса на современном этапе в сравнении с данными литературы;

3 этап - сравнительное изучение диагностической значимости РМП, РПР, РПГА, иммуноблоттинга и регламентированных методов (РСК, РИФц, ИФА, РИБТ) при исследовании цереброспинальной жидкости в группе больных нейросифилисом (образцы сыворотки крови и цереброспинальной жидкости 37 больных нейросифилисом и 31 пациента без нейросифилиса), разработка алгоритма применения методов исследования цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса на основании сравнительного изучения диагностической чувствительности, специфичности и эффективности нетрепонемных и трепонемных тестов.

Объектом исследования служили пациенты, проходившие обследование в отделении сифилидологии ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России в период с 2007 по 2011 годы: 37 больных нейросифилисом (основная группа) и 31 пациент без нейросифилиса (группа сравнения), в том числе 22 - со стойким сохранением позитивности нетрепонемных серологических тестов (РМП/РПР) в сыворотке крови после специфического лечения различных форм сифилиса без данных за сифилитическое поражение нервной системы и 9 больных с впервые установленным сифилисом без данных за сифилитическое поражение нервной системы.

Материалами исследования служили:

- результаты анкетного опроса, медицинских организаций дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации;

- образцы сыворотки крови и цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом и лиц группы сравнения.

Анкеты включали вопросы о методах, применяемых для лабораторного исследования цереброспинальной жидкости с целью исключения нейросифилиса, а также о количестве исследований, проведенных в медицинских организациях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации в 2010 году.

Образцы сыворотки крови и цереброспинальной жидкости пациентов исследовали в отделе лабораторной диагностики инфекций, передаваемых половым путем и заболеваний кожи ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России.

Забор крови пациентам производился в процедурном кабинете ФГБУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России натощак по стандартной методике. Образцы цереброспинальной жидкости получали после проведения пациентам люмбальной пункции в стационарных условиях неврологического отделения ГКБ № 54 Департамента здравоохранения г. Москвы на основании договора о совместной деятельности с целью оптимизации оказания квалифицированной медицинской помощи больным со специфическим поражением нервной системы в соответствие с Приказом №291 МЗ РФ "О мерах по предупреждению распространения инфекций, передаваемых половым путем" от 30.07.2001 года и руководствуясь Приложением №4 к Приказу "Тактика взаимодействия врачей дерматовенерологов, неврологов и других специалистов по диагностике и лечению больных ранним нейросифилисом". Люмбальная пункция проводилась пациентам с клиническими симптомами поражения нервной системы при скрытых, поздних формах сифилиса, при вторичном сифилисе с клиническими проявлениями в виде алопеции и лейкодермы, а также в случае сохранения позитивности нетрепонемных серологических тестов (РМП/РПР) в сыворотке крови после специфического лечения ранних форм сифилиса даже при отсутствии клинической неврологической симптоматики (Лечение и профилактика сифилиса (методические указания), МЗ РФ, ЦНИКВИ, Москва 1999; Приказ Минздравсоцразвития № 829 от 08. 12. 2006 г. Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с поздним сифилисом (при оказании специализированной помощи); Дерматовенерология (клинические рекомендации), РОДВ, Москва, 2007, 2008, 2010).

В работе применялись методы:

- метод анкетирования;

- методы клинического обследования пациентов;

- иммунологические методы исследования сыворотки крови и цереброспинальной жидкости: РМП, РПР, РСК, РИФц, РИБТ, ИФА, РПГА, иммуноблоттинг;

- клинические методы исследования цереброспинальной жидкости: определение количества белка и цитологическое исследование;

- статистические методы (в том числе расчет показателей диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС) и диагностической эффективности (ДЭ).

Метод анкетирования был применен с целью получения информации о методах исследования церебоспинальной жидкости, применяемых для диагностики нейросифилиса в специализированных медицинских организациях дерматовенерологического профиля субъектов Российской Федерации, и о частоте использования каждого метода.

Анкеты были разосланы по почте и путем электронных рассылок на адреса 83-х специализированных медицинских организаций дерматовенерологического профиля. Ответы были получены из 41-й лаборатории специализированной медицинской организации дерматовенерологического профиля, что составило 49,4 % от общего количества опрошенных организаций.

Клиническое обследование пациентов включало изучение анамнеза жизни и заболевания, объективный осмотр. Больные были консультированы неврологом, по показаниям психиатром, офтальмологом и другими специалистами. При необходимости им проводилось дополнительное инструментальное обследование: магнитно-резонансная томография (МРТ) или компьютерная томография (КТ) головного и спинного мозга.

Лабораторные методы исследования. Исследование сыворотки крови пациентов проводилось с использованием нетрепонемных серологических тестов: РМП ("Сифилис-АгКЛ-РМП", производства ЗАО "ЭКОлаб", Россия) или RPR (фирма "Human GmbH", Германия) и трепонемных - РПГА ("Люис РПГА тест", производства ООО "НИАРМЕДИК ПЛЮС", Россия) и ИФА (с наборами "РекомбиБест антипаллидум - суммарные антитела", производства ЗАО "Вектор-Бест", Россия). Постановка и учет результатов серологических тестов проводились в соответствие с Приказом Минздрава РФ №87 от 26.03.2001 г. "О совершенствовании серологической диагностики сифилиса".

Для подтверждения сифилитического поражения нервной системы образцы цереброспинальной жидкости исследовали с помощью клинических (цитологическое исследование и определение количества белка) и иммунологических тестов.

Нормальными показателями клинических методов исследования цереброспинальной жидкости считались: количество форменных элементов (цитоз) до 5-8 клеток в мм ³, количество белка до 0,46 г/л (Приказ №291 МЗ РФ "О мерах по предупреждению распространения инфекций, передаваемых половым путем" от 30.07.2001 года, Приложение №4 к Приказу "Тактика взаимодействия врачей дерматовенерологов, неврологов и других специалистов по диагностике и лечению больных ранним нейросифилисом"; Дерматовенерология (клинические рекомендации), РОДВ, Москва, 2007, 2008, 2010).

Исследование цереброспинальной жидкости с помощью иммунологических тестов проводилось с использованием следующих диагностикумов: РМП: "Сифилис-АгКЛ-РМП", производства ЗАО "ЭКОлаб", Россия, RPR: фирма "Human GmbH", Германия, РСК: "Антиген трепонемный ультраозвученный для РСК", "Сифилис-АгКЛ-РСК", "Комплемент сухой", "Сыворотка диагностическая гемолитическая кроличья жидкая для РСК" производства ЗАО "ЭКОлаб", Россия, РПГА: "Люис РПГА тест", производства ООО "НИАРМЕДИК ПЛЮС", Россия, ИФА: набор реагентов "РекомбиБест антипаллидум - суммарные антитела", производства ЗАО "Вектор-Бест", Россия, РИФц: "ЛюмиБест антипаллидум", ЗАО "Вектор-Бест", Россия. Постановка РИБТ с цереброспинальной жидкостью осуществлялась по классической микроанаэростатной методике (Приказ Минздрава РФ № 87 от 21.03.2001 г.); в качестве антигена применяли взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса, полученную из 7-дневного орхита у лабораторных кроликов, в качестве комплемента - сыворотку крови лабораторных морских свинок. В реакции также использовались эритроциты барана (получены в соответствии с методическими рекомендациями "Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис", утв. приказом Минздрава РФ №87 от 26 марта 2001 г.) и "Сыворотка диагностическая гемолитическая кроличья жидкая для РСК" производства ЗАО "ЭКОлаб", Россия.

Постановка и учет результатов регламентированных иммунологических методов исследования цереброспинальной жидкости: РСК, РИФц, ИФА, РИБТ проводились в соответствие с Приказом Минздрава РФ №87 от 26.03.2001 г. "О совершенствовании серологической диагностики сифилиса".

Исследование цереброспинальной жидкости методами РМП, RPR, РПГА проводили с соответствие с указаниями Инструкции фирм производителей.

При исследовании цереброспинальной жидкости методом иммуноблоттинга был использован диагностикум "INNO-LIA^TM Syphilis Score" (фирма "Innogenetics NV", Бельгия) с рекомбинатными антигенами T.рallidum - Tp47, Tp17, Tp15 и синтетическим пептидом TmpA.

Оценку диагностической эффективности иммунологических методов исследования цереброспинальной жидкости проводили на основании расчетов показателей диагностической чувствительности (ДЧ), специфичности (ДС), эффективности (ДЭ), предсказательной ценности положительных (ПЦ+) и отрицательных (ПЦ-) результатов для пациентов с установленным диагнозом нейросифилиса (НС) и лиц без клинико-лабораторных признаков нейросифилиса (БНС) (Делекторская Л.Н. и соавт., 1992; Технологии лабораторные клинические. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов. ГОСТ Р 53022.3-2008). Вычисление показателей проводилось по следующим формулам:

Статистический анализ результатов исследования проводился путем определения средней величины, ошибки средней величины и средного квадратического отклонения по Е.В. Монцевичюте-Эрингене.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка частоты использования регламентированных методов исследования цереброспинальной жидкости в медицинских организациях дерматовенерологического профиля Российской Федерации.

Оценка частоты использования регламентированных методов исследования цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса проводилась по результатам анкетного опроса руководителей серологических лабораторий 83 специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля Российской Федерации. Ответы были получены из 41 лаборатории, что составило 49,4 % от общего количества опрошенных медицинских организаций.

Изучение представленных данных показало, что регулярное исследование цереброспинальной жидкости лабораторными методами с целью диагностики нейросифилиса проводили только 84 % лабораторий, 16 % - не проводили исследование цереброспинальной жидкости (рис. 1).

Рис. 1. Медицинские организации (%), осуществляющие и не осуществляющие диагностику нейросифилиса путем исследования цереброспинальной жидкости в субъектах Российской Федерации

На основании данных о количестве выполненных в 2010 году исследований была оценена относительная частота (доля) использования каждого вида лабораторных тестов среди общего количества исследований, применяемых для диагностики нейросифилиса (рис. 2).

Проведенный анализ показал, что при обследовании пациентов с применением лабораторных методов исследования цереброспинальной жидкости в общей структуре выполненных исследований наиболее часто применялся иммуноферментный анализ - 44 %; частота использования других трепонемоспецифических реакций значительно меньше: РИФц - 18 %, РПГА - 6 %. Среди нетрепонемных методов исследования для диагностики нейросифилиса наиболее часто использовали реакцию микропреципитации (17 % от общего количества исследований), РСК - 5 %, RPR - 0,04 %.

Рис. 2. Доля каждого лабораторного теста в общей структуре проведенных исследований по выявлению нейросифилиса (по данным 2010 года)

Частота использования клинических методов исследования (цитологического исследования и определения количества белка) составила 6 %, частота постановки реакции Панди - 3 %.

Таким образом, анализ предоставленных из медицинских организаций дерматовенерологического профиля сведений позволил оценить частоту использования регламентированных методов исследования цереброспинальной жидкости в лабораториях.

Следует отметить, достаточно частое (44 %) использование в общей структуре применяемых методов исследования при обследовании лиц с подозрением на нейросифилис ИФА - современного трепонемоспецифического теста, обладающего высокой чувствительностью. Лаборатории при исследовании цереброспинальной жидкости редко применяли (5 %) реакцию Вассермана.

Вместе с тем, ряд лабораторий (16 %) вообще не осуществляют исследование цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса лабораторными методами.

В диагностике нейросифилиса недостаточно часто применяется такой регламентированный иммунологический метод исследования, как РИФц, а также клинические методы исследования (цитологическое исследование и определения количества белка), частота использования которых в общей структуре лабораторных методов исследования цереброспинальной жидкости составляет соответственно 18 и 6 %.

В целях оптимизации диагностики нейросифилиса, осуществляемой в специализированных медицинских организациях дерматовенерологического профиля Российской Федерации, представляется необходимым:

- обеспечить всестороннее комплексное обследование больных с подозрением на нейросифилис с использованием регламентированных лабораторных методов исследования;

- включить в проект Стандарта оказания медицинской помощи больным нейросифилисом исследование цереброспинальной жидкости высокочувствительный и специфичный иммунологический метод РПГА, обладающий высокой диагностической эффективностью при выявлении данной формы заболевания.

Результаты изучения частоты выявления различных клинических форм нейросифилиса на современном этапе. Группу больных нейросифилисом (n = 37) составили лица в возрасте от 26 до 58 лет, из них 27 мужчин и 10 женщин. На основании данных о распределении больных нейросифилисом по полу и возрасту установлено, у мужчин нейросифилис наиболее часто встречался в возрасте от 40 до 50 лет (14 больных), у женщин от 30 до 40 лет (6 больных).

У 17 (46 %) больных нейросифилис был диагностирован среди лиц с впервые установленным диагнозом сифилиса. Среди них были: 1 (2,7 %) больной вторичным сифилисом кожи и слизистых оболочек с клиническими проявлениями в виде диффузной алопеции, 1 больной (2,7 %) ранним сифилисом скрытым, 8 больных (21,6 %) поздним сифилисом скрытым и 7 (19 %) больных скрытым сифилисом, неуточненным как ранний или поздний.

В 20 (54 %) случаях нейросифилис был диагностирован у больных, ранее получивших специфическое лечение по поводу различных форм сифилиса и имевших стойкое сохранение позитивности нетрепонемных серологических тестов (РМП/РПР) в сыворотке крови: в течение 2-х лет у 9-и больных, от 2-х до 10-и лет - у 11-и больных. Из общего числа этих пациентов 9 больных первоначально получили лечение по поводу "раннего скрытого сифилиса", 6 больных - по поводу "скрытого сифилиса, неуточненного как ранний или поздний", у 5 - и больных первоначальный диагноз не известен.

Учитывая представленные данные, можно констатировать, что наиболее многочисленную группу среди больных нейросифилисом составили больные, ранее получившие специфическое лечение по поводу различных форм сифилиса и имевшие стойкое сохранение позитивности нетрепонемных серологических тестов (РМП/РПР) в сыворотке крови. Среди лиц с впервые установленным диагнозом сифилиса нейросифилис в большинстве случав, диагностировался у больных поздним скрытым сифилисом и скрытым сифилисом, неуточненным как ранний или поздний. Приведенные результаты согласуются с данными литературы (Соколовский Е.В. и соавт., 1996; Тактамышева Э.Ш. 1999; Красносельских Т.В. и соавт., 2001; Аковбян В.А. и соавт., 2007; Иванова М.А. и соавт., 2009; Родиков М.В. 2009; Залевская О.В. и соавт., 2010), в которых отмечается увеличение частоты регистрации новых случаев нейросифилиса на фоне скрытых поздних и неуточненных форм сифилиса, а также выявление нейросифилиса у 30-50 % больных с серорезистентностью.

Установление диагноза нейросифилиса проводилось в соответствие с Международной классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем, десятого пересмотра (МКБ-X). В соответствие с МКБ-X, среди всех больных нейросифилисом было установлено:

- раннее поражение нервной системы - у 8-и больных - код А 51.4 (другие формы вторичного сифилиса);

- позднее поражение нервной системы - у 11-и больных - код А 52.1 (нейросифилис с симптомами);

- асимптомный нейросифилис - у 18-и больных-код А 52.2.

Согласно клинической классификации, принятой в дерматовенерологии (Шапошников О.К. (Ред.), 1991; Красносельских Т.В., Соколовский Е.В. (Ред.), 2001), к ранним формам нейросифилиса условно относят случаи специфического поражения нервной системы, развивающиеся в течение 5 лет от момента заражения, а к поздним формам нейросифилиса относят случаи, когда поражение нервной системы развивается спустя 5 и более лет с момента заражения.

В соответствие с клинической классификацией, у пациентов были установлены следующие формы нейросифилиса: асимптомный нейросифилис - у 18-и больных (48,7 %), ранний менинговаскулярный нейросифилис - у 8-и больных (21,6 %), поздний менинговаскулярный нейросифилис - у 10-и больных (27 %), прогрессивный паралич - у 1 больного (2,7 %).

Клиническая картина у больных менинговаскулярным нейросифилисом проявлялась преимущественным поражением сосудов, в большинстве случаев - хроническим прогрессирующим нарушением кровообращения головного или спинного мозга.

У 12-и больных (32,4 %) церебральным менинговаскулярным нейросифилисом клинические симптомы поражения мозговых оболочек были выражены нерезко. Больные предъявляли жалобы на головную боль, реже - на головокружение. Проявления специфического васкулита церебральных сосудов выражались расстройством памяти и сна, снижением работоспособности, быстрой утомляемостью и эмоциональной неустойчивостью. У некоторых больных отмечалась оглушенность, нарушение ориентации, невозможность быстро осмыслить складывающиеся ситуации, отсутствие критики к своему состоянию. Наблюдались нарушения чувствительной сферы в виде парестезий - онемения, покалывания, чаще локализованного, захватывающего отдельные участки кожи конечностей или лица, а также двигательные расстройства - парезы, чаще ограниченные, в области кистей, пальцев и стоп.

У 4-х больных (10,8 %) наблюдались острые нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу. У 3-х больных с развитием ишемического инсульта больших полушарий отмечались гемипарезы и нарушения чувствительности конечностей в сочетании с парезами мимической мускулатуры, а также расстройства речи. У 1-го больного с локализацией инсульта в мозжечке наблюдались нарушения координации движений и мышечная гипотония.

У 2-х больных (5,4 %) спинальным менинговаскулярным нейросифилисом наблюдался менингорадикулярный синдром со слабо выраженным болевым симптомом: больных беспокоили нерезко выраженные и непостоянные боли в спине, чаще в области поясницы; более выраженными были симптомы менингомиелита по типу двигательных и чувствительных нарушений в нижних конечностях с ощущением онемения в области голеней и стоп, снижением мышечной силы в ногах и нарушением походки.

Клиническая картина у 1-го больного (2,7 %) прогрессивным параличем складывалась из нарушений психической сферы и неврологических симптомов. Основными симптомами нейросифилиса у данного больного явились: нарастающее слабоумие с резко выраженным расстройством памяти, заторможенностью, изменением речи в виде звуковой неотчетливости во время произношения слов, а также двигательные расстройства - нарушения координации в сочетании с неуверенной и шаткой походкой.

Таблица 1. Частота выявления (%) клинических форм нейросифилиса у обследованных больных в сопоставлении с данными литературы

В целях оценки частоты выявления различных клинических форм нейросифилиса на современном этапе результаты обследования пациентов сравнивались с данными литературы за последние 10-15 лет (Таб. 1).

Проведенный анализ показал, что в сравнении с данными литературы у обследованных пациентов асимптомный нейросифилис регистрировался значительно чаще других форм, его частота составила 48,7 %.

Среди манифестных форм отмечено значительное преобладание менинговаскулярного нейросифилиса, частота выявления которого составила 94,7 %. При этом у большинства больных манифестным нейросифилисом субъективные ощущения были скудными, а объективная клиническая симптоматика носила малосимптомный и неспецифический характер.

Отмечено снижение частоты выявления раннего менинговаскулярного нейросифилиса (21,6 %) наряду с увеличением частоты регистрации позднего нейросифилиса (27 %).

Таким образом, результаты проведенных наблюдений позволили сделать вывод о том, что среди обследованных пациентов наблюдалась высокая частота регистрации асимптомных форм и преобладание поздних форм нейросифилиса над ранними, а клиническая картина нейросифилиса в большинстве случаев носила малосимптомный и неспецифический характер. Полученные результаты подтверждаются сообщениями ряда авторов (Самцов А.В. и соавт., 2006; Прохоренков В.И. и соавт., 2008; Родиков М.В. 2009; Залевская О.В. и соавт., 2010; Красносельских Т.В., Соколовский Е.В. 2010), которые также отметили преобладание в последние годы в структуре клинических форм заболевания асимптомного и малосимптомного нейросифилиса со скудными клиническими проявлениями, а также преобладание поздних форм нейросифилиса над ранними.

Результаты сравнительного изучения диагностической значимости иммунологических методов исследовании цереброспинальной жидкости для диагностики нейросифилиса.

Результаты исследования сывороток крови пациентов. При исследовании сывороток крови больных нейросифилисом были получены позитивные результаты как нетрепонемных (РМП/РПР), так и трепонемных тестов: РПГА, ИФА. Резко положительные (4+) результаты нетрепонемных тестов (РМП/РПР) были установлены у 35-и больных нейросифилисом, слабоположительные (2+) результаты РМП наблюдались у 2-х больных: у одного больного асимптомным нейросифилисом и одного больного поздним церебральным менинговаскулярным нейросифилисом.

У всех пациентов группы сравнения были получены позитивные результаты трепонемных тестов. В нетрепонемных тестах у 18-и пациентов отмечались резко положительные (4+) результаты, у 7-и пациентов положительные (3+), у 4-х пациентов слабоположительные и у 2-х пациентов отрицательные.

Величина титра антител в сыворотках крови больных нейросифилисом с резко положительными результатами нетрепонемных тестов (РМП/РПР) варьировала от 1: 2 до 1: 1024. Сравнительный анализ показал наличие различий в средней величине титров антител в сыворотке крови больных асимптомным, а также ранним и поздним менинговаскулярным нейросифилисом, однако выявленные различия оказались статистически недостоверными, что не позволило рекомендовать данный показатель в дифференциальной диагностике описанных клинических форм нейросифилиса.

Результаты изучения цереброспинальной жидкости пациентов. Исследование цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом с использованием клинических методов выявило увеличенное количество лимфоцитов только у больных менинговаскулярным нейросифилисом (10 человек, 27 %), в том числе у 7-и - ранним менинговаскулярным нейросифилисом и у 3-х - поздним менинговаскулярным нейросифилисом.

Уровень белка в цереброспинальной жидкости был повышен только у 1(2,7 %) больного прогрессирующим параличом.

При исследовании образцов цереброспинальной жидкости, полученных от лиц группы сравнения, патологических изменений в цереброспинальной жидкости, устанавливаемых с помощью клинических методов исследования, выявлено не было.

При исследовании образцов цереброспинальной жидкости, полученных от пациентов группы сравнения, с помощью нетрепонемных тестов у 2-х (6,4 %) человек был получен слабоположительный (2+) результат РСКк, у остальных пациентов были получены отрицательные результаты. При исследовании цереброспинальной жидкости этих пациентов трепонемными тестами были получены следующие результаты: РСКт слабоположительная (2+) у 3-х (9,6 %) пациентов, РИФц слабоположительная (2+) у 2-х (6,4 %) и сомнительная (1+) у 1-го (3,2 %) пациента, ИФА положительный у 8-и (25,7 %) пациентов, РИБТ сомнительная у 6-и (19,3 %) пациентов, РПГА слабоположительная (2+) у 1-го (3,2 %) пациента, неопределенный результат ИБ получен у 2-х (6,4 %) пациентов.

Отсутствие неврологических симптомов, нормальные результаты клинических методов исследования цереброспинальной жидкости, а также сомнительные, слабоположительные и/или дискордантные результаты иммунологических реакций в цереброспинальной жидкости пациентов группы сравнения позволили подтвердить у них отсутствие нейросифилиса.

Расчет показателей диагностической чувствительности, специфичности, предсказательной ценности положительных и отрицательных результатов и собственно показателя диагностической эффективности иммунологических тестов в общей группе больных нейросифилисом позволил отметить роль каждого из них в диагностике нейросифилиса (Таб. 2).

Таблица 2. Показатели диагностической эффективности иммунологических тестов при исследовании цереброспинальной жидкости в общей группе больных нейросифилисом, %

Примечание к таблице 2: зеленым цветом большей или меньшей интенсивности обозначены ячейки с высокими или относительно высокими (в сравнении с результатами однотипных методов исследования) значениями показателя; красным цветом обозначены ячейки с низкими значениями показателя; белым цветом обозначены ячейки со значениями показателей, занимающими промежуточное положение.

Исследование цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом нетрепонемными тестами (РПР, РМП, РСКк) выявило положительные результаты у большинства больных (24 человека, 64,8 %). При этом наиболее высокий показатель диагностической чувствительности нетрепонемных тестов был отмечен в РМП - 64,8 %, аналогичный показатель в РСКк составил 62,1 %, в RPR - 51,3 %. Более высокие показатели диагностической чувствительности были отмечены в трепонемных тестах: максимальные показатели - 100 % - были отмечены в РПГА, иммуноблоттинге и ИФА; в РИФц аналогичный показатель составил 97,3 %, в РИБТ - 91,8 %, в РСКт - 62,1 %.

Анализ диагностической специфичности нетрепонемных тестов показал, что наиболее специфичными тестами при установлении диагноза нейросифилиса были РМП и РПР (специфичность - 100 %), для РСКк данный показатель составил 93,5 %. Анализ диагностической специфичности трепонемных тестов показал, что наиболее высокой она была при использовании РПГА (96,7 %) и иммуноблоттинга (93,5 %), несколько ниже - при применении РИФц, РСКт (по 90,3 %) и РИБТ (80,6 %). Самый низкий показатель диагностической специфичности был отмечен в ИФА - 62,1 % (тест-система "РекомбиБест антипаллидум - суммарные антитела", производства ЗАО "Вектор-Бест", Россия).

Суммарный показатель диагностической эффективности нетрепонемных тестов при исследовании цереброспинальной жидкости был максимальным для РМП (80,9 %) и существенно более низким - для РСКк и РПР (76,4 и 73,5 % соответственно). Максимальная диагностическая эффективность со стороны трепонемных тестов отмечена в РПГА и ИБ (98,5 и 97 % соответственно); в РИФц, ИФА и РИТ данный показатель составил соответственно 94,1, 88,2 и 86,7 % и был самым низким в РСКт (75 %).

Показатель предсказательной ценности положительных результатов был наиболее высоким: со стороны нетрепонемных тестов - в РМП и РПР - 100 % (в РСКк - 92 %), со стороны трепонемных тестов: в РПГА (97,3 %), далее по степени убывания - в ИБ - 94,8 %, РИФц - 92,3 % и существенно ниже - в РСКт (88,4 %), РИБТ (85,0 %) и ИФА (82,2 %).

Показатель предсказательной ценности отрицательных результатов был наиболее высоким: со стороны нетрепонемных тестов - в РМП (70,4 %); в РПР и РСКк он составил соответственно 67,4 и 63,2 %; со стороны трепонемных тестов наиболее высоким данный показатель был в РПГА, ИБ, ИФА и РИФц (по 100 %) и наиболее низким - в РСКт (66,6 %).

При изучении цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом методом иммуноблоттинга антитела к рекомбинантному антигену Тр 17 выявлялись у всех пациентов (100 %), к антигену Тр 47 - у 86,1 % пациентов, к антигенам Тр 15 и ТmpA - у 69,4 % пациентов.

У единственного больного паренхиматозным нейросифилисом положительные результаты были получены во всех (100 %) нетрепонемных и трепонемных тестах, а в методе иммуноблоттинга антитела были выявлены ко всем антигенам T. рallidum.

В таблице 3 представлены результаты сравнительного исследования цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом в нетрепонемных и трепонемных иммунологических реакциях в зависимости от клинической формы нейросифилиса.

В результате исследования цереброспинальной жидкости больных асимптомным нейросифилисом с помощью иммунологических реакций было установлено, что нетрепонемные тесты, несмотря на высокую специфичность (по 100 % для РПР и РМП), все же не слишком пригодны для выявления асимптомного нейросифилиса ввиду низкой чувствительности (в пределах 33,3-44,4 %), низкой предсказательной ценности отрицательного результата (72,0-75,6 %) и низкой общей диагностической эффективности (73,4-77,5 %). Наиболее адекватными тестами для выявления асимптомного нейросифилиса, согласно результатам проведенного исследования, являются трепонемные тесты: РПГА и ИБ, которые обладают высокой (100 %) чувствительностью при выявлении больных асимптомным нейросифилисом, достаточно высокой специфичностью (96,7 % для РПГА и 93,5 % для ИБ) и диагностической эффективностью (97,9 % для РПГА и 95,9 % для ИБ), высокими (100 %) значениями предсказательной ценности отрицательных (в особенности) и положительных (94,7-90 %) результатов.

Для выявления больных ранним менинговаскулярным сифилисом можно использовать как нетрепонемные, так и трепонемные тесты; при этом как те, так и другие тесты являются высокочувствительными (100 % чувствительности) и высокоспецифичными (РМП, РПР - по 100 %, РПГА - 96,7, ИБ - 93,5 %) и обладают 100 %-ной предсказательной ценностью отрицательных результатов при выявлении данной формы нейросифилиса. Диагностическая эффективность является особенно высокой для РМП, РПР (по 100 %), РПГА (97,4 %) и ИБ (94,8 %); предсказательная ценность положительных результатов является особенно высокой со стороны нетрепонемных тестов РМП и РПР (по 100 %).

При выявлении больных поздним менинговаскулярным сифилисом наилучший результат при установлении диагноза нейросифилиса путем исследования цереброспинальной жидкости дают трепонемные тесты (ИФА, РПГА, ИБ, РИФц, РИБТ), обладающие при данной форме сифилиса 100 %-ной чувствительностью и предсказательной ценностью отрицательных результатов; нетрепонемные тесты для выявления данной формы нейросифилиса пригодны в меньшей степени ввиду их низкой чувствительности (40-70 %). Вместе с тем нетрепонемные тесты обладают при выявлении больных поздним менинговаскулярным сифилисом более высокой в сравнении с трепонемными тестами специфичностью и предсказательной ценностью положительных результатов (по 100 % для РМП и РПР), что обосновывает возможность их использования для подтверждения диагноза позднего менинговаскулярного сифилиса. В целом же для выявления данной группы пациентов наиболее значимыми являются: РПГА, ИБ и РМП (показатель диагностической эффективности соответственно 97,5, 95,1 и 92,6 %).

Таким образом, проведенные исследования показали, что при исследовании сыворотки крови в нетрепонемных и трепонемных тестах у абсолютного большинства больных нейросифилисом выявляются резко положительные результаты.

Отмечены более высокие значения титров антител, определяемых в сыворотке крови в нетрепонемных тестах у больных ранним менинговаскулярным нейросифилисом в сравнении с больными поздним менинговаскулярным нейросифилисом, однако выявленные различия оказались статистически недостоверными, что не позволило рекомендовать данный показатель в дифференциальной диагностике разных клинических форм нейросифилиса. Установлено отличие в частоте выявления антител, определяемых в нетрепонемных тестах одновременно в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости больных ранним и поздним менинговаскулярным нейросифилисом: при раннем менинговаскулярном нейросифилисе положительные результаты тестов в сыворотке крови и цереброспинальной жидкости были отмечены у всех пациентов, при позднем менинговаскулярном нейросифилисе положительные результаты нетрепонемных тестов при исследовании цереброспинальной жидкости обнаруживались значительно реже, чем при исследовании сыворотки крови: в РМП в 70 %, в RPR в 40 % случаев. Это наблюдение показывает, что при ранних формах нейросифилиса проницаемость гематоэнцефалического барьера для сывороточных противотрепонемных антител гораздо выше, чем при поздних формах инфекции, за счет более выраженных воспалительных изменений в сосудах головного мозга.

Таблица 3. Диагностическая эффективность иммунологических реакций при диагностике разных клинических форм нейросифилиса, %

Примечание к таблице 3: зеленым цветом большей или меньшей интенсивности обозначены ячейки с высокими или относительно высокими (в сравнении с результатами однотипных методов исследования) значениями показателя; красным цветом обозначены ячейки с низкими значениями показателя; белым цветом обозначены ячейки со значениями показателей, занимающими промежуточное положение.

Сравнительное изучение диагностической эффективности иммунологических методов исследования, использованных для установления диагноза нейросифилиса путем тестирования цереброспинальной жидкости, позволило установить: более высокую чувствительность и предсказательную ценность отрицательных результатов трепонемных тестов в сравнении с нетрепонемными; более высокую специфичность и предсказательную ценность положительных результатов нетрепонемных тестов в сравнении с трепонемными.

В результате проведенных исследований установлено, что при исследовании цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом наиболее высокие показатели диагностической эффективности получены в таких современных иммунологических методах, как РМП (80,9 %), РПГА (98,5 %) и иммуноблоттинг (97,0 %). При этом трепонемные тесты: РПГА и иммуноблоттинг, - обладают не только высокой диагностической эффективностью, но и высокой предсказательной ценностью положительных и отрицательных результатов.

РМП, РПГА и иммуноблотинг можно рассматривать как оптимальные иммунологические методы исследования спинномозговой жидкости, что позволяет рекомендовать включение данных методов в стандарты диагностики нейросифилиса на территории Российской Федерации.

В цереброспинальной жидкости больных нейросифилисом методом иммуноблоттинга, вне зависимости от наличия или отсутствия клинических проявлений и давности заражения сифилитической инфекцией, наиболее часто обнаруживаются антитела к антигенам Tp17 и Tp47 (соответственно в 100 и 86,1 % случаев).

Установлены приоритеты применения отдельных иммунологических методов исследования при диагностике асимптомного, раннего и позднего менинговаскулярного нейросифилиса. Наиболее адекватными тестами для выявления асимптомного нейросифилиса являются трепонемные тесты: РПГА и иммуноблоттинг, обладающие высокой диагностической эффективностью. Для выявления больных ранним менинговаскулярным нейросифилисом можно использовать как нетрепонемные, так и трепонемные тесты, при этом как те, так и другие тесты являются высокочувствительными и высокоспецифичными, а диагностическая эффективность является особенно высокой для РМП, РПР, РПГА и иммуноблоттинга. При выявлении больных поздним менинговаскулярным нейросифилисом наилучший результат при исследовании ликвора дают трепонемные тесты (ИФА, РПГА, ИБ, РИФц, РИБТ), обладающие при данной форме сифилиса 100 %-ной чувствительностью, нетрепонемные тесты для выявления данной формы нейросифилиса пригодны в меньшей степени ввиду их низкой чувствительности (40-70 %), однако их необходимо использовать для подтверждения специфичности поражения (специфичность - 100 %).

...