Нарушение функции иммунной системы при острой алкогольной интоксикации и алкоголизме

Приведенные выше данные позволяют сделать заключение, что этанол in vitro обладает способностью подавлять цитолитическую активность NK-клеток в широком диапазоне концентраций.

1.3. Влияние этанола на экспрессию активационных CD молекул

Исследовали влияние этанола in vitro на экспрессию активационных CD молекул (CD25, HLA-DR и CD38) на T- и B-лимфоцитах и NK-клетках, которую определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных CD4⁺, CD8⁺ Т-лимфоцитов, CD19⁺ В-лимфоцитов и CD3^-56⁺ NK-клеток. На весь период культивирования лимфоцитов цельной крови здоровых лиц (18 часов при 37°C в атмосфере влажности с 5% СО₂) в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях 6Ч10^-5; 6Ч10^-4; 6Ч10^-3; 6Ч10^-2 и 6Ч10^-1 мг/мл. Контролем служили соответствующие культуры клеток без внесения этанола.

Результаты исследования представлены в табл. 6. Как видно из таблицы, концентрации этанола, которые обладают наиболее выраженным эффектом усиления индуцированной Con A пролиферации T-лимфоцитов in vitro, приводят к статистически значимому снижению экспрессии HLA-DR молекул на CD4⁺ Т-лимфоцитах. Наиболее выраженный эффект снижения экспрессии HLA-DR молекул на CD4⁺ Т-лимфоцитах наблюдается при дозах этанола, вызывающих слабое (6Ч10^-2 мг/мл) и сильное (6Ч10^-1 мг/мл) опьянение. В то же время, как видно из табл. 6, этанол в концентрациях 6Ч10^-5-6Ч10^-1 мг/мл статистически значимо повышает экспрессию этих молекул на CD8⁺ Т-клетках и CD19⁺ B-лимфоцитах в сравнении с показателями культур без внесения этанола. Этанол в указанных концентрациях также статистически значимо усиливает экспрессию молекулы адгезии CD38 как на CD8⁺ Т-клетках, так и на CD19⁺ В-лимфоцитах (табл. 6).

Таблица 6.

Влияние этанола на экспрессию активационных молекул CD25, HLA-DR и CD38 на клетках периферической крови здоровых лиц in vitro (M±у)

Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,001 - статистически значимые отличия показателей экспрессии CD25, HLA-DR, CD38 на T- и B-лимфоцитах и NK-клетках в присутствии этанола в сравнении с контрольными культурами в отсутствии этанола; ^ - тенденция к увеличению и v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента

Под влиянием этанола на CD8⁺-лимфоцитах статистически значимо повышается экспрессия CD25-молекулы, причём это повышение отмечается при всех исследованных концентрациях этанола (6Ч10^-5-6Ч10^-1 мг/мл) в сравнении с контрольными культурами без внесения этанола. Изменений в экспрессии CD25 молекул на CD4⁺ Т-лимфоцитах не наблюдается (табл. 6).

Таким образом, этанол обладает тропностью к CD8⁺ Т-лимфоцитам, что проявляется усилением экспрессии активационных молекул на этих клетках и снижением их экспрессии на CD4⁺ Т-лимфоцитах. Усиление экспрессии активационных молекул на CD8⁺-цитолитических Т-лимфоцитах приводит к активации эффекторного (киллерного) механизма иммунной системы, что является в свою очередь определяющим моментом в развитии патологии органов и систем.

1.4. Влияние этанола на экспрессию молекул HLA I класса

Исследовано влияние этанола на экспрессию молекул HLA I класса на клетках крови in vitro, которую определяли по интенсивности флуоресценции всех позитивных клеток периферической крови (T- и В-лимфоцитов, NK-клеток, моноцитов и нейтрофилов). На весь период культивирования (18 часов при 37°C в атмосфере влажности с 5% СО₂) лимфоцитов цельной крови (от 10 здоровых лиц без синдрома зависимости от алкоголя) в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях 6Ч10^-5; 6Ч10^-4; 6Ч10^-3; 6Ч10^-2 и 6Ч10^-1 мг/мл. Контролем служили соответствующие культуры клеток без этанола (табл. 7). Обработку крови после 18-часовой инкубации с этанолом и без него проводили согласно протоколу фирмы “Becton Dickinson” (USA) с помощью моноклональных антител к молекулам HLA I класса.

Таблица 7.

Экспрессия молекул HLA I класса на клетках периферической крови здоровых лиц после воздействия различных доз этанола in vitro (M±у)

Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,001 - статистически значимые отличия показателя суммарной экспрессии молекул HLA I класса в присутствии этанола от показателя контрольных культур в отсутствии этанола; t-критерий Стьюдента

Результаты исследования представлены в табл. 7. Как видно из таблицы, этанол в концентрациях 6Ч10^-5-6Ч10^-1мг/мл, вносимый в культуры клеток крови in vitro, усиливает экспрессию молекул HLA I класса на всех клетках крови. Обнаружено, что наибольшим, статистически значимым, эффектом усиления экспрессии этих молекул, обладают дозы этанола, вызывающие слабое (6Ч10^-2 мг/мл) и сильное (6Ч10^-1) опьянение.

Таким образом, установлено, что этанол обладает способностью усиливать экспрессию молекул HLA I класса на клетках крови и, по-видимому, на многих других клетках организма, в широком диапазоне доз. Известно, что молекулы HLA I класса осуществляют контактные взаимодействия различных клеток организма человека с CD8⁺-лимфоцитами, что свидетельствует о влиянии этанола на процессы кооперации между этими иммунокомпетентными клетками и другими клетками организма.

1.5. Влияние этанола на хемилюминесценцию фагоцитов

Исследовали влияние этанола на способность фагоцитирующих клеток крови человека активироваться при воздействии на них зимозаном и ФМА in vitro. На весь период культивирования (18 часов при 37°C в атмосфере влажности с 5% СО₂) клеток цельной крови от 10 здоровых лиц в инкубационную среду вносили этанол в конечных концентрациях 6Ч10^-5-6Ч10^-1 мг/мл, контролем служили соответствующие культуры клеток без этанола.

Результаты исследования влияния этанола на кислородзависимую активность фагоцитирующих клеток in vitro представлены в табл. 8. Как видно из таблицы, этанол в концентрациях, вызывающих слабое (6Ч10^-2 мг/мл) и сильное (6Ч10^-1 мг/мл) опьянение, подавляет хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток, как спонтанную кислородзависимую, так и индуцированную зимозаном и ФМА. Причем, это подавление было статистически значимым по сравнению с показателями культур без этанола. Выявленные факты являются, по-видимому, следствием токсического эффекта высоких концентраций этанола. В то же время, этанол в концентрациях 6Ч10^-5-6Ч10^-3мг/мл не индуцирует спонтанную и статистически значимо подавляет зимозан-индуцированную хемилюминесценцию фагоцитов. Обнаружено также, что этанол, при внесении его в культуры фагоцитирующих клеток in vitro в концентрациях 6Ч10^-5-6Ч10^-1мг/мл, подавляет ФМА-индуцированную хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток.

Таблица 8.

Влияние этанола на хемилюминесценцию фагоцитирующих клеток после 18-часовой инкубации цельной крови здоровых лиц in vitro (M±у)

Примечание: * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия показателей хемилюминесценции фагоцитов в присутствии этанола от показателей контрольных культур в отсутствии этанола; t-критерий Стьюдента

Следовательно, проведенные исследования с использованием этанола в широком диапазоне концентраций выявили его прямое влияние на фагоцитирующие клетки крови человека. Установлено, что этанол при 18-часовой инкубации с клетками крови человека подавляет хемилюминесценцию, индуцированную зимозаном и ФМА, причем, в случае с ФМА этот эффект был более выражен и прослеживался при всех исследованных концентрациях этанола (6Ч10^{-1 -} 6Ч10^-5 мг/мл). Обнаруженные факты снижения кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток под влиянием этанола говорят о нарушении функционального потенциала этих клеток, а именно - поглотительной и переваривающей способности.

Таким образом, этанол в широком диапазоне доз (модель острой алкогольной интоксикации) оказывает деструктивное влияние на клетки иммунной системы, которое проявляется в нарушениях функциональной активности Т-хелперов, NK-клеток, их активационного состава, функциональной активности фагоцитирующих клеток и сопровождается усилением экспрессии молекул HLA I класса на поверхностной мембране клеток крови: T- и В-лимфоцитов, NK-клеток, моноцитов и нейтрофилов.

Особенности показателей иммунного статуса у здоровых добровольцев и больных алкоголизмом.

В этом разделе работы представлены результаты исследований иммунного статуса (показателей клеточного и гуморального иммунитета) здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя после нагрузки алкоголем и лиц, страдающих алкогольной зависимостью.

2. Особенности клеточного иммунитета

2.1. Особенности гемограммы

Анализ и сравнение параметров гемограммы показали, что как у добровольцев, употреблявших 0,2 л и более крепкого алкоголя, так и у больных алкогольной зависимостью (группы 1 и 2) после алкогольной интоксикации наблюдаются изменения этих параметров в сравнении с параметрами нормы (табл. 9). Напротив, у здоровых добровольцев подгруппы 1, однократно употреблявших 50 мл водки или 150 мл вина, и у больных в ремиссии (группа 3) показатели гемограммы соответствуют показателям нормы. Изменения параметров гемограммы у добровольцев подгрупп 2 и 3, а также у больных алкоголизмом группы 1 после алкогольной интоксикации выражаются статистически значимым увеличением количества эритроцитов, их объёма, гематокрита, повышением СОЭ и снижением количества лимфоцитов и тромбоцитов. Из табл. 9 также видно, что у больных алкогольной зависимостью в группе 2 после алкогольной интоксикации в крови проявляются более выраженные изменения показателей гемограммы и наблюдается статистически значимое снижение количества эритроцитов в периферической крови и повышение количества сегментоядерных лейкоцитов и СОЭ в сравнении с нормой.

Таким образом, как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация приводят к нарушениям гемограммы. Эти изменения напоминают картину, характерную для развивающегося воспаления. Увеличение количества эритроцитов, их объема, показателей гематокрита, лейкоцитоз, повышение СОЭ и снижение количества лимфоцитов и тромбоцитов являются одним из критериев оценки развития воспаления. У больных же алкоголизмом при более тяжёлой стадии зависимости (II стадия) изменения в показателях гемограммы соответствуют картине острого воспаления [Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2002]. В то же время, у добровольцев после однократного употребления 50 мл водки или 150 мл вина (за 17?19 часов до забора крови) и у больных в ремиссии все показатели гемограммы соответствуют норме.

Таблица 9.

Гематологические показатели у больных алкогольной зависимостью и добровольцев после острой алкогольной интоксикации в сравнении со здоровыми лицами без синдрома зависимости от алкоголя (M±у)

Примечание к табл. 9: здесь и далее представлены статистически значимые отличия (* - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001) показателей добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации от показателей нормы; ^ - тенденция к увеличению и v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента

Размещено на http://www.allbest.ru/

2.2. Особенности пролиферативной активности T- и В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток

Алкогольная интоксикация как у добровольцев подгрупп 2 и 3 (употребляли 0,2 и более крепкого алкоголя за 17?19 часов до забора крови), так и у больных с алкогольной зависимостью группы 1 и 2 приводит к нарушениям пролиферативной активности T- и В-лимфоцитов и активности NK-клеток в сравнении с нормой (табл. 10). Как у тех, так и у других в образцах периферической крови отмечается статистически значимое увеличение спонтанного пролиферативного ответа лимфоцитов (не индуцированного митогенными лектинами). В то же время у добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом группы 1 наблюдается статистически значимое снижение индекса стимуляции (ИС) T-лимфоцитов при активации митогенным лектином PHA, B-клеток - при активации LPS. Снижается цитолитическая активность NK-клеток и наблюдается увеличение ИС пролиферативного ответа при активации Con A (табл. 10). Последнее, подтверждает результаты исследований, полученных в экспериментах на культурах лимфоцитов здоровых лиц in vitro, что говорит о тропности этанола к CD8⁺-лимфоцитам, так как митогенный лектин Con A инициирует пролиферацию in vitro 75% этих клеток.

Таблица 10.

Индексы стимуляции пролиферативной активности T- и B-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток у добровольцев и у больных алкогольной зависимостью после алкогольной интоксикации в сравнении с нормой (M±у)

* - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия показателей добровольцев и больных алкоголизмом от нормы; ^ - тенденция к увеличению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента

В образцах периферической крови больных алкогольной зависимостью группы 2 отмечается статистически значимое снижение ИС T- и В-лимфоцитов в ответ на активацию всеми митогенными лектинами и значимо увеличивается цитолитическая активность NK-клеток в сравнении с показателями нормы. Напротив, у больных в ремиссии (группа 3) и добровольцев подгруппы 1 показатели пролиферативной активности T- и В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток соответствуют показателям нормы (табл. 10).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о существенных изменениях иммунореактивности организма как после острой, так и в результате хронической алкогольной интоксикации, что выражается в снижении пролиферативной активности Т-хелперов, В-лимфоцитов и NK-клеток. Отмеченные изменения функциональной активности этих иммунокомпетентных клеток in vitro коррелируют с нарушением их функций in vivo [Рабсон А. и др., 2006], что является предпосылкой снижения устойчивости организма к инфекциям и повышения риска развития онкологических заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

2.3. Особенности фенотипа клеток крови

Алкогольная интоксикация как у добровольцев (при нагрузке крепким алкоголем в количестве 0,2 л и более за 17?19 часов до забора крови), так и у больных с алкогольной зависимостью группы 1 и 2 приводит к изменению популяционного и субпопуляционного состава периферической крови. Как у тех, так и у других в образцах периферической крови значимо снижается процент CD3⁺4⁺ Т-хелперов относительно нормы (рис. 4а).

Рис. 4 а). Процент CD3⁺4⁺ , CD3⁺8⁺ - Т-лимфоцитов и CD19⁺B-клеток; б) отношение CD4⁺/CD8⁺ у добровольцев и больных алкогольной зависимостью после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; ** - p<0,001 - статистически значимые отличия от нормы; v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Примечание: здесь и на рисунках 5 - 10 обозначения по оси абсцисс: Н - норма, 1п. - подгруппа 1 добровольцев (однократно употребляли 50 мл водки или 150 мл вина), 2 п. - подгруппа 2 добровольцев (в течение дня употребляли 0,2-0,3 л крепкого алкоголя), 3 п. - подгруппа 3 добровольцев (в течение 2-3 дней употребляли 0,6-1 л крепкого алкоголя), I с. - больные алкогольной зависимостью I стадии, II с. - больные алкогольной зависимостью II стадии, Р - ремиссия

После алкогольной интоксикации на фоне существенного снижения содержания в образцах периферической крови Т-хелперов как у добровольцев, так и у больных не было выявлено значимых изменений в содержании Т-клеток с фенотипом CD3⁺8⁺ (рис. 4а.), в то же время у них наблюдалось значимое снижение отношения CD4⁺/CD8⁺-клеток (рис.4б.), главным образом за счет снижения количества клеток с фенотипом CD4⁺. У добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных групп 1 и 2 после алкогольной интоксикации обнаружено дополнительно статистически значимое увеличение в образцах периферической крови процента CD19⁺ - В-лимфоцитов (рис. 4а.). Для сравнения следует отметить, что у добровольцев подгруппы 1 и у больных алкоголизмом в ремиссии все показатели соответствуют показателям нормы (рис. 4а, б).

Таким образом, у добровольцев и у больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации выявлен существенный дисбаланс иммунорегуляторных клеток с преобладанием CD8⁺ Т-клеток, что свидетельствует об избирательном действии алкогольной интоксикации на эту популяцию Т-лимфоцитов. Снижение же содержания CD4⁺?Т-хелперов в периферической крови, безусловно, является причиной возникновения транзиторного иммунодефицитного состояния у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Рис. 5. Процент CD3^-16⁺56⁺ NK- и CD3⁺16⁺/56⁺ NKT-клеток киллеров в периферической крови добровольцев и больных алкогольной зависимостью после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; ^ - тенденция к увеличению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис. 4

У добровольцев после нагрузки крепким алкоголем в количестве 0,2 л и более (подгруппы 2 и 3) отмечается тенденция к увеличению в крови процента NK-клеток и статистически значимо снижается процент NKT-клеток киллеров. У больных же на начальной (I) стадии алкогольной зависимости спустя 17-19 часов после приёма последней дозы крепкого алкоголя (группа 1) в крови статистически значимо снижается не только процент NK-клеток с фенотипом CD3^-16⁺56⁺ (натуральные киллеры), но и процент CD3⁺16⁺/56⁺ NKT-клеток киллеров (рис. 5). У больных алкоголизмом группы 2 также статистически значимо снижается процент NKT-клеток киллеров и значимо увеличивается в периферической крови процент NK-клеток (рис. 5). У больных же в ремиссии и у добровольцев подгруппы 1 (однократное употребление алкоголя в количестве 50 мл водки или 150 мл вина) процент NK-клеток и NKT-клеток в крови соответствует показателям нормы (рис. 5).

Таким образом, после алкогольной интоксикации у лиц на начальной стадии алкогольной зависимости обнаружено значимое снижение в периферической крови содержания натуральных киллеров (NK-клеток) с фенотипом CD3^-16⁺56⁺ и CD3⁺16⁺/56⁺ (NKT-клеток киллеров), что обуславливает снижение противоопухолевого иммунитета, а также может явиться одной из причин снижения резистентности таких больных к инфекциям.

Алкогольная интоксикация влияет на активационный состав Т-лимфоцитов периферической крови, который напрямую связан с появлением на клетках HLA-DR молекул и рецептора к IL 2 (антигенный маркер CD25), а также других молекул активации [Алексеев Л.П., Хаитов Р.М., 2001]. Установлено, что в периферической крови добровольцев после нагрузки крепким алкоголем в количестве 0,2 л и более и больных алкоголизмом, после употребления ими крепкого алкоголя в количестве 0,3-0,6 литра, статистически значимо увеличивается процент Т-клеток с фенотипом CD8⁺DR⁺, несущих на своей поверхности HLA-DR молекулу (рис. 6). Однако у добровольцев подгруппы 1 и у больных в ремиссии содержание Т-клеток с фенотипом CD8⁺DR⁺ соответствует показателям нормы.

Рис. 6. Процент CD8⁺DR⁺, CD4⁺DR⁺ Т-лимфоцитов и CD3^-CD56⁺DR⁺ NK-клеток в периферической крови добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; ^ - тенденция к увеличению и v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис. 4

В периферической крови добровольцев подгрупп 2 и 3 и больных алкогольной зависимостью группы 1 после алкогольной интоксикации наблюдается статистически значимое снижение процента активированных Т-хелперов с фенотипом CD4⁺DR⁺ и активированных NK-клеток с фенотипом CD3^-CD56⁺DR⁺ (рис. 6). У добровольцев же в подгруппе 2 отмечается лишь тенденция к снижению в крови процента CD4⁺DR⁺ клеток. В крови больных алкоголизмом группы 2, напротив, увеличивается процент не только CD8⁺DR⁺-, но и CD4⁺DR⁺- и CD3^-CD56⁺DR⁺-клеток. В то время как у добровольцев подгруппы 1, так и у больных в ремиссии процент CD8⁺DR⁺-, CD4⁺DR⁺- и CD3^-CD56⁺DR⁺-клеток в периферической крови соответствует норме (рис. 6).

Следовательно, нами установлено, что алкогольная интоксикация влечёт за собой активацию CD8⁺ цитолитических Т-лимфоцитов, что может привести к активации эффекторного (киллерного) механизма иммунной системы. Последнее является, в свою очередь, определяющим моментом в развитии патологии органов и систем. Эти данные подтверждают результаты исследований, полученных в экспериментах на модели острой алкогольной интоксикации, воспроизведённой на культурах лимфоцитов крови здоровых лиц in vitro. Изменения же в активационном составе CD4⁺-хелперов и NK-клеток зависят от длительности предшествовавшей хронической алкогольной интоксикации и являются дифференцирующим иммунологическим критерием продолжительности алкогольного заболевания.

Обнаружено также, что в периферической крови добровольцев подгруппы 3 и больных с алкогольной зависимостью групп 1 и 2 после алкогольной интоксикации наблюдается нарастание процента T-лимфоцитов с фенотипом CD8⁺28⁺, экспрессирующих ко-стимуляционную молекулу CD28, которая также является молекулой активации (рис. 7). В то же время, у этих больных снижается процент клеток CD8⁺CD28^-, не экспрессирующих эту молекулу, по сравнению с нормой (рис. 7). Однако у добровольцев подгруппы 1 и больных в ремиссии содержание в крови CD8⁺28⁺- и CD8⁺28^--клеток соответствует норме (рис. 7).

Рис. 7. Процент CD8⁺28⁺, CD8⁺28^- Т-лимфоцитов в периферической крови добровольцев и больных алкогольной зависимостью после алкогольной интоксикации; * - p<0,05 - статистически значимые отличия от нормы; ^ - тенденция к увеличению и v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис. 4

Таким образом, можно заключить, что алкогольная интоксикация приводит к серьезным изменениям популяционного и субпопуляционного состава клеток периферической крови: как у добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя (употребляли 0,2 л и более крепкого алкоголя), так и у больных на начальной стадии алкогольной зависимости наблюдается активация CD8⁺ - Т-лимфоцитов. Об этом свидетельствует увеличение в крови процента активированных T-лимфоцитов с фенотипами CD8⁺25⁺, CD8⁺DR⁺ и CD8⁺28⁺. Из активированных CD8⁺-лимфоцитов впоследствии образуются эффекторные цитолитические Т-клетки киллеры (CD8⁺56⁺ - ЦТЛ). Поскольку острая алкогольная интоксикация приводит к активации CD8⁺ Т-клеток, то в условиях постоянной алкогольной интоксикации из этих лимфоцитов могут образоваться цитолитические Т-лимфоциты (ЦТЛ), которые распознают видоизмененные (под влиянием ацетальдегида или иммунных комплексов) клетки организма человека, несущие молекулу HLA I класса [Алексеев Л.П., Хаитов Р.М., 2001]. В результате этого распознавания может произойти цитолиз гепатоцитов печени или любых других видоизмененных клеток организма.

В то же время продолжительная ремиссия, у больных алкоголизмом, способствует полному восстановлению популяционного и субпопуляционного состава клеток иммунной системы.

2.4. Особенности функциональной активности фагоцитов

Сравнение показателей функциональной активности фагоцитирующих клеток здоровых добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации с показателями контрольной группы здоровых лиц выявило значительные различия в функциональных возможностях этих клеток. У добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом групп 1 и 2 статистически значимо увеличивается спонтанная кислородзависимая активность фагоцитирующих клеток в сравнении с нормой (рис. 8а).

Рисунок 8. а) спонтанная кислородзависимая хемилюминесценция; б) индексы стимуляции кислородзависимой хемилюминесценции, индуцированной ЗИМ и ФМА, фагоцитов периферической крови добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис. 4.

У больных алкоголизмом в фазе ремиссии и у добровольцев подгруппы 1 (употребляли однократно 50 мл водки или 150 мл вина за 17?19 часов до забора крови) спонтанная кислородзависимая активность фагоцитирующих клеток соответствует норме (рис. 8а). В то же время при активации клеток крови зимозаном или ФМА индексы стимуляции (ИС) кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток значимо снижаются, как у здоровых добровольцев подгруппы 3, так и у больных алкоголизмом групп 1 и 2 после алкогольной интоксикации. Аналогичная картина наблюдается и у добровольцев подгруппы 2, однако снижение ИС кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток в этом случае не было статистически значимым (рис. 8б). У больных же в ремиссии и у добровольцев подгруппы 1 индуцированная зимозаном или ФМА кислородзависимая активность фагоцитирующих клеток соответствует показателям нормы (рис. 8б).

Несмотря на увеличение, после алкогольной интоксикации, количества лейкоцитов в периферической крови добровольцев (употребляли в течение 2-3-х дней 0,6-1 л крепкого алкоголя) и больных алкоголизмом на I и II стадиях, у них наблюдается статистически значимое снижение способности фагоцитирующих клеток поглощать Candida albicans. У добровольцев подгруппы 2 также наблюдается снижение способности фагоцитирующих клеток поглощать Candida albicans, но оно не было значимым относительно нормы (рис. 9). У добровольцев же подгруппы 1 и у больных в ремиссии поглотительная активность фагоцитирующих клеток не изменяется, а соответствует показателям нормы (рис. 9).

Рис. 9. Поглотительная способность фагоцитов (ФИ - фагоцитарный индекс) у добровольцев и у больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис. 4

Таким образом, исследование функциональной активности фагоцитов показало, что алкогольная интоксикация приводит к усилению спонтанной кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток. Это может привести, в свою очередь, к кислородному взрыву и явиться одной из причин поражения органов и тканей организма у больных алкогольной зависимостью в результате образования свободных радикалов. Обнаруженные нарушения функциональной активности фагоцитов могут явиться одной из причин снижения резистентности организма к инфекциям и повышения риска развития болезней иммунных комплексов.

На основании представленных в этом разделе результатов исследования можно сделать заключение, что как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация приводят к серьезным нарушениям функции клеточного звена иммунной системы. Они проявляются изменениями параметров гемограммы, снижением пролиферативной активности T- и В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток, нарушениями популяционного и субпопуляционного состава клеток крови, увеличением кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток и снижением их поглотительной способности. Обнаруженные нарушения клеточного звена иммунной системы у лиц, злоупотребляющих алкоголем, могут привести к возникновению транзиторного иммунодефицитного состояния, неблагоприятными последствиями которого являются снижение резистентности к инфекциям и риск развития онкологических заболеваний. Важно отметить, что воздержание от приёма крепкого алкоголя приводит к восстановлению функциональных возможностей всех исследованных клеток иммунной системы.

3. Особенности гуморального иммунитета

3.1. Особенности иммуноглобулинового профиля

После алкогольной интоксикации у добровольцев (употребляли 0,2 л и более крепкого алкоголя), а также у больных с алкогольной зависимостью в периферической крови наблюдается статистически значимое увеличение содержания IgA в сравнении с нормой (рис. 10).

Рис. 10. Содержание IgA, IgM, IgG и общего IgE в сыворотке крови добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис. 4

Обнаружено, что увеличение содержания в крови здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя и больных алкогольной зависимостью IgA сопровождается снижением IgM и IgG. Снижение содержания в крови IgM и IgG является, вероятно, следствием острой интоксикации этанолом. При этом этанол или его комплексы с белками крови, прежде всего с альбумином, могут быть нейтрализованы в результате связывания со специфическими иммуноглобулинами классов M и G [Гамалея Н.Б. и др., 1997].

Острая алкогольная интоксикация у добровольцев подгрупп 2 и 3 и хроническая у больных групп 1 и 2 приводит к увеличению в крови содержания общего IgE по сравнению с контролем (рис. 10). При этом, как показало клиническое обследование, в анамнезе больных и здоровых добровольцев отсутствовали симптомы аллергии и бронхиальной астмы. У добровольцев же подгруппы 1 и у больных алкоголизмом в фазе ремиссии содержание IgA, IgM, IgG и общего IgE соответствует норме.

Таким образом, как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация приводят к нарушениям иммуноглобулинового профиля, что может явиться одной из причин повышения риска развития инфекционных и аллергических заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

3.2. Особенности показателей активности комплемента, компонентов комплемента, CRP, ASO, RF и ЦИК

Определение гемолитической активности комплемента после алкогольной интоксикации показало, что у всех добровольцев подгруппы 3 (в течение 2?3 дней употребляли 0,6?1 литр крепкого алкоголя) и у обследованных больных алкоголизмом группы 1 наблюдается статистически значимое увеличение гемолитической активности комплемента в сравнении с нормой. В подгруппе 2 добровольцев также отмечалось увеличение гемолитической активности комплемента, но оно не было значимым. Напротив, у больных алкоголизмом группы 2, наблюдается статистически значимое снижение этого показателя. У добровольцев же подгруппы 1 и у больных в ремиссии гемолитическая активность комплемента соответствует показателям нормы (рис. 11а).

Обнаружено, что у добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом групп 1 и 2 в сыворотке крови статистически значимо снижается содержание С4 компонента комплемента (рис.11б). Изменений в содержании C1 и С3 компонентов комплемента в сыворотке крови добровольцев подгрупп 2 и 3 и у пациентов группы 1 не было выявлено (рис. 11б.). В то же время, у больных группы 2 в крови наблюдается тенденция к увеличению содержания C1 и к снижению С3 компонентов комплемента (рис. 11б). У добровольцев же, после однократного приёма алкоголя в количестве 50 мл водки или 150 мл вина, и у больных в ремиссии содержание в крови C1, С3 и С4 компонентов комплемента соответствовало показателям нормы.

Рис 11. а) гемолитическая активность комплемента - CH50, б) содержание C1, C3 и C4 компонентов комплемента в сыворотке крови добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; ^ - тенденция к увеличению и v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис. 4

Таким образом, мы установили, что как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация приводят к изменению пути активации комплемента (с классического на лектиновый путь), о чём свидетельствует снижение в крови уровня С4 компонента комплемента, что может быть также одной из причин снижения резистентности к различным инфекциям лиц, злоупотребляющих алкоголем.

В сыворотке крови добровольцев после нагрузки алкоголем, а также больных на начальной стадии алкоголизма после алкогольной интоксикации и больных в фазе ремиссии не было выявлено изменений в содержании CRP, АSО и RF (рис. 12а.). Эти показатели соответствовали нормальным значениям. В тоже время, в сыворотке крови больных на II стадии зависимости после алкогольной интоксикации наблюдается статистически значимое увеличение титров С-реактивного белка, что свидетельствует о наличии воспалительного процесса в печени, так как именно её клетки (гепатоциты) являются основными продуцентами этого белка. Содержание АSО и RF в сыворотке крови больных группы 2 соответствуют показателям нормы (рис. 12а).

Алкогольная интоксикация у добровольцев подгрупп 2 и 3 и у больных алкоголизмом в группах 1 и 2 приводит к значительному повышению уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сравнении с нормой (рис. 12б.). В то же время, у здоровых добровольцев подгруппы 1 (употребляли однократно 50 мл водки или 150 мл вина за 17?19 часов до забора крови) и у больных алкоголизмом в ремиссии содержание в сыворотке крови ЦИК соответствует показателям нормы.

Рис. 12. а) содержание С-реактивного белка (CRP), антистрептолизина-О (ASO), ревматоидного фактора (RF), б) содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; ** - p<0,001; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; ^ - тенденция к увеличению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента. Обозначения см. рис.4

Следовательно, как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация приводят к увеличению в крови циркулирующих иммунных комплексов, что, прежде всего, связано с нарушением поглотительной способности фагоцитирующих клеток и может явиться одной из причин отложения иммунных комплексов в почках, печени и тканях организма человека с последующим нарушением их функции. В свою очередь, это может способствовать последующему цитолизу упомянутых видоизменённых клеток органов NK-клетками и цитолитическими CD8⁺ Т-лимфоцитами.

3.3. Особенности цитокинового профиля

При развитии иммунного ответа разные клетки взаимодействуют друг с другом через мембранные молекулы или при помощи медиаторов - цитокинов (интерлейкинов, IL) и хемокинов [Кадагидзе З.Г.,1996; Хаитов Р.М. и др., 2010; Ярилин А.А., 2010]. В этой связи, как у здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя, так и у больных алкогольной зависимостью мы сочли целесообразным исследовать в сыворотке крови содержание цитокинов - IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNF-б и IFN-г. Выбор данного цитокинового профиля был связан с тем, что, по результатам предварительного исследования как у добровольцев, так и у больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации содержание IL-10 в периферической крови соответствовало показателям нормы.

Установлено, что как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация приводят к нарушениям цитокинового профиля. У добровольцев подгруппы 3 и у больных алкоголизмом группы 1 в крови статистически значимо снижается содержание IL-2 и IFN-г, в подгруппе 2 отмечается тенденция к снижению этих цитокинов и у всех значимо увеличивается содержание IL-4, последний является ростовым фактором для В-лимфоцитов (рис. 13). В сыворотке крови больных алкоголизмом группы 2, напротив, статистически значимо увеличивается содержание IFN-г и IL-2. Содержание IL-4 ещё больше повышается. В то же время, у больных в ремиссии и у добровольцев подгруппы 1 уровень этих цитокинов соответствует норме.

Рис.13. Содержание IL-2, IL-4, IFN-г в сыворотке крови добровольцев и больных алкоголизмом после алкогольной интоксикации; * - p<0,05; *** - p<0,0001 - статистически значимые отличия от нормы; v - тенденция к снижению показателя от нормы; t-критерий Стьюдента.

Следовательно, как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация приводят к статистически значимому снижению в сыворотке крови содержания IL-2 и IFN-г как у здоровых добровольцев после высокой нагрузки последних крепким алкоголем, так и у больных на начальной стадии алкогольной зависимости. Известно, что продуцентами этих цитокинов являются Тh1-лимфоциты-хелперы и NK-клетки. В упомянутых группах обследованных лиц увеличивается содержание IL-4, который продуцируется Th2-лимфоцитами-хелперами. Это дает основание для заключения, что у здоровых добровольцев и у больных алкоголизмом на начальной стадии после алкогольной интоксикации иммунный ответ реализуется по 2 типу (гуморальному), для которого характерно увеличение продукции IL-4. В то же время, при II стадии зависимости в сыворотке крови увеличивается содержание не только IL-4, но также IL-2 и IFN-г, что свидетельствует о подключении к гуморальному иммунному ответу по типу 2 клеточных, эффекторных, механизмов иммунного ответа типа 1.

Таким образом, в данном разделе работы показано, что острая и хроническая алкогольная интоксикация приводят к нарушениям и гуморального иммунитета, включая цитокиновый профиль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные in vitro исследования влияния этанола на клетки иммунной системы, а также исследования клеточного и гуморального иммунитета у здоровых добровольцев после нагрузки различными количествами крепкого алкоголя и у больных алкоголизмом I и II стадии дают возможность объяснить неясные ранее вопросы о механизмах возникновения иммунодефицитного состояния, системной и органной патологии и риска развития онкологических и инфекционных заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем. Базирующаяcя на полученных результатах концепция о деструктивной роли иммунной системы в патогенезе органной и системной патологии при острой и хронической алкогольной интоксикации подтверждает предположение, что алкоголь и его метаболиты выступают в роли основных патогенных факторов, влияющих на клеточные и гуморальные составляющие иммунной системы. Очевидно, что как острая, так и хроническая алкогольная интоксикация являются причиной значимых нарушений функции иммунной системы: лимфоцитов, NK-клеток и фагоцитов, а также причиной нарушений популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов. В результате алкогольной интоксикации в периферической крови значимо снижается содержания CD4⁺-лимфоцитов-хелперов, отношение CD4⁺/CD8⁺-лимфоцитов при незначимом увеличении CD8⁺ Т-лимфоцитов, что приводит к разбалансировке иммунной системы и является одной из причин возникновения транзиторного иммунодефицитного состояния у лиц, злоупотребляющих крепкими алкогольными напитками. Острая и хроническая алкогольная интоксикация влияют на состав активированных Т-лимфоцитов, а именно: приводят к увеличению в периферической крови процента активированных CD8⁺-клеток и к снижению процента активированных CD4⁺ Т-лимфоцитов. Результатом этого является дисбаланс иммунорегуляторных клеток с превалированием CD8⁺-клеток над CD4⁺-лимфоцитами, что свидетельствует о тропности этанола к популяции CD8⁺ Т-лимфоцитов.

Обнаруженные факты усиления экспрессии молекул HLA I класса на клетках иммунной системы говорят о способности этанола влиять на контактные взаимодействия всех клеток организма человека с CD8⁺ иммунокомпетентными клетками. Следствием обнаруженного нами усиления экспрессии молекул активации на CD8⁺ Т-лимфоцитах может стать ускоренное образование из них эффекторных цитотоксических Т-клеток киллеров (CD8⁺56⁺ - ЦТЛ), распознающих видоизмененные, в частности, под действием ацетальдегида или иммунных комплексов, клетки организма человека, несущие на своей поверхности молекулы HLA I класса. Этот процесс, в свою очередь, может явиться одной из причин цитолиза видоизмененных гепатоцитов и других клеток организма. Алкогольная интоксикация оказывает влияние на функциональную активность фагоцитарного звена иммунной системы, что выражается усилением кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток и снижением их способности к поглощению патогенных микроорганизмов. Усиление кислородзависимой активности фагоцитов может обусловить разрушительное действие свободных радикалов на различные клетки и ткани, а снижение поглотительной способности фагоцитирующих клеток может привести к ослаблению иммунологической реактивности организма и явиться одной из причин частых инфекций и болезней иммунных комплексов.

Кроме того, острая и хроническая алкогольная интоксикация приводят также и к существенным нарушениям гуморального иммунитета, состояние которого определяется активностью иммунокомпетентных клеток. После алкогольной интоксикации в периферической крови как здоровых добровольцев без синдрома зависимости от алкоголя, так и больных алкоголизмом увеличивается содержание IgA и IgE и снижается уровень IgM и IgG. Снижение содержания IgM и IgG может явиться причиной возникновения серьёзных инфекций и респираторных заболеваний у лиц, злоупотребляющих алкоголем, а увеличение содержания IgE повышает риск развития аллергических заболеваний и бронхиальной астмы. Алкогольная интоксикация приводит к увеличению гемолитической активности комплемента, что также может способствовать лизису клеток организма и возникновению органной патологии. Кроме того, выявлено, что алкогольная интоксикация влияет на цитокиновый профиль, что выражается изменениями содержания IL-2, IL-4 и IFN-г в периферической крови и ведёт к изменению типа иммунного ответа.

Важно, однако, подчеркнуть, что прекращение употребления алкоголя больными алкоголизмом (фаза ремиссии) способствует полному восстановлению клеточного и гуморального звеньев иммунной системы.

Выявленные нарушения иммунного статуса у больных алкогольной зависимостью диктуют необходимость включения в терапевтическую программу иммуномодулирующих препаратов в случае продолжающегося употребления алкоголя.

Таким образом, в настоящей работе вскрыты патогенетические механизмы повреждающего действия острой и хронической алкогольной интоксикации на клеточные и гуморальные звенья иммунитета и обоснована деструктивная роль иммунной системы в развитии органной и системной патологии.

Часть VI. Выводы

Острая алкогольная интоксикация в культурах клеток крови in vitro оказывает угнетающее влияние на CD4⁺ Т-лимфоциты, NK-клетки киллеры и функциональную активность фагоцитирующих клеток. Показано, что этанол обладает тропностью к CD8⁺ цитолитическим Т-лимфоцитам, а именно: усиливает пролиферативную активность этих Т-лимфоцитов, индуцированную митогенным лектином Con A, и экспрессию на них активационных молекул ? CD25, HLA-DR и CD38.

Острая (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя) и хроническая алкогольная интоксикация характеризуются нарушениями гемограммы, пролиферативной активности CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитов, В-лимфоцитов и цитолитической активности NK-клеток. Снижение содержания CD4⁺ Т-лимфоцитов и их пролиферативной активности является предпосылкой возникновения транзиторного иммунодефицитного состояния.

Выявленные изменения активационного состава лимфоцитов при острой (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя) и хронической алкогольной интоксикации, а именно: повышение содержания CD8⁺DR⁺ и CD8⁺25⁺ Т-лимфоцитов в периферической крови приводит к активации эффекторного звена иммунной системы (цитолитических Т-клеток киллеров), результатом действия которого может явиться возникновение алкогольного поражения органов и тканей организма. Обнаруженные изменения CD4⁺DR⁺ Т-лимфоцитов и NKDR⁺-клеток зависят от длительности алкогольной интоксикации и, соответственно, от продолжительности алкогольного заболевания.

Острая (в дозах 0,2 л и более крепкого алкоголя) и хроническая алкогольная интоксикация существенно усиливают кислородзависимую активность фагоцитов и снижают их способность к поглощению патогенных микроорганизмов. Усиление кислородзависимой активности фагоцитирующих клеток может обусловить разрушительное действие фагоцитов на различные клетки и ткани, а снижение их поглотительной способности может привести к нарушению иммунологической реактивности организма и явиться одной из причин частых инфекций и болезней иммунных комплексов.

Алкогольная интоксикация приводит к увеличению в периферической крови содержания иммуноглобулинов классов A и E и к снижению уровня иммуноглобулинов классов M и G как у здоровых добровольцев после нагрузки крепким алкоголем в количестве 0,2 л и более, так и у больных алкоголизмом I и II стадии. Увеличение содержания IgE повышает риск развития аллергических заболеваний и бронхиальной астмы, а снижение уровней IgM и IgG может явиться причиной возникновения инфекций у лиц, злоупотребляющих алкоголем.