Скоротливість міометрія матки при експериментальній імунокомплексемії та залізодефіцитній анемії у мишей

Синдром Черджа-Стросса - легеневий та системний васкуліт малих судин із позасудинними гранульомами і гіпереозінофілією, що зустрічається у пацієнтів з астмою та алергічним ринітом [185]. Зазвичай спостерігається недоношеність плода, у більшості таких пацієнтів роди нормальні, але новонароджені мають низьку вагу. Пацієнти з початком захворювання під час вагітності мають високий рівень виникнення ускладнень [83].

Вузликовий поліартеріїт (ВП) - некротичне запалення артерій середнього або дрібного розміру [185]. Кілька клінічних випадків вагітності у хворих на ВП описано в останні роки [200]. Вважають, що хворі пацієнти мають високий ризик смерті, тому рекомендовано робити аборт [185].

Хвороба Бехчета (ХБ) - хронічний, рецидивуючий, мультисистемний, запальний процесс, що характеризується повторюваними оральними та генітальними виразками, неврологічними проявами і тромбозом. Переважно вражає молодих жінок під час дітородного віку [185]. У пацієнтів із ХБ частота ускладнень вагітності складає 26 %, а частота спонтанних абортів - 20,8 % випадків [176]. Інші ускладнення вагітності у хворих ХБ: гіпертензія та гестаційний цукровий діабет. З іншого боку, є дані, що до 60 % пацієнтів з ХБ мають деяке поліпшення під час вагітності (але у 30 % наступає рецидив, який може бути серйозним, аж до церебрального венозного тромбозу). Вказують на невисокий рівень (близько 5 %) передчасних пологів при ХБ, в 5-15% роди проходили за допомогою кесаревого розтину [177].

Таким чином, на основі проведеного аналізу даних літератури можна зробити такі узагальнення:

1. Імунокомплексні процеси призводять до поліорганної дисфункції з системними ушкодженнями судин.

2. NO, утворений різними шляхами, відіграє важливу роль у розвитку імунокомплексних ушкоджень.

3. Відмічено роль ПАРП при численних імуноопосередкованих хворобах, проте не досліджено активацію та участь ПАРП в патогенезі імунокомплексних захворювань.

4. У хворих на реакції гіперчутливості ІІІ типу збільшується ризик рецедивів, ускладнень і фатальних наслідків для жінок і плоду під час вагітності.

5. Подальші дослідження з використанням експериментальних моделей повинні бути спрямовані на розробку нових підходів оцінки системної імунокомплексемії та з'ясування її механізмів і наслідків для репродуктивної функції, а також для тестування нових терапевтичних заходів за умов імунокомплексного запалення.

6. Практично не досліджено зміни скоротливості матки за умов системного запалення судин, спричиненого ІК. Є необхідним більш повне уявлення про механізми та наслідки таких змін для репродуктивної функції.

1.3 Препарати наночастинок заліза за умов залізодефіцитної анемії

Нанотехнології є новим напрямком науки і технологій, що надзвичайно швидко розвивається. Наночастинки -- це органічні та неорганічні структури розміром менше 100 нм. Важливе місце серед них належить наночастинкам заліза (НЧЗ), які володіють cуперпарамагнетизмом, підвищеною реакційною здатністю, протианемічними та антибактеріальними властивостями і є відносно не токсичними. Завдяки своїм характеристикам вони набувають все більшого застосування в сферах медицини, електроніки, сільського господарства та ін., проте ефективність та ризик їх профілактичного і терапевтичного застосування не є вивченим. Мало відомостей про механізми взаємодії НЧЗ з клітинами і субклітинними структурами та про їх вплив на генетичний матеріал клітини. Тому питання ефективності та безпечності впливу нанозаліза на організм залишається відкритим і вимагає ретельних досліджень.

1.3.1 Застосування препаратів наночастинок оксиду заліза для лікування залізодефіцитної анемії

Залізодефіцитна анемія (ЗА) сьогодні за даними ВООЗ визнана однією із важливих соціальних проблем світового масштабу [76, 216]. Близько 2 мільярдів людей на нашій планеті страждають на ЗА. До основних груп ризику розвитку ЗА відносяться жінки репродуктивного віку, вагітні жінки, діти з перших років життя [28]. Друге місце за розповсюдженістю після ЗА займає анемія хронічних захворювань. Цей вид анемії супроводжує хронічні інфекції, запальні захворювання та неопластичні процеси.

На даний час сучасний ринок лікарських препаратів представлений значним арсеналом протианемійних препаратів заліза, що характеризуються різним вмістом в них заліза та наявністю допоміжних компонентів, які впливають на фармакокінетику різних лікарських форм. За формою заліза існуючі препарати розділяють на дві групи: препарати солей заліза та препарати залізовмісних комплексів.

Анемія, як правило, супроводжує усі стадії хронічного захворювання нирок і пов'язана з недостатнім утворенням нирками еритропоетину, а також залізодефіцитом. Ферумокситол (Feraheme™, AMAG Pharmaceuticals) - це ін'єкційний препарат для лікування ЗА у дорослих хворих із хронічним захворюванням нирок. Ферумокситол відноситься до групи надмалих суперпарамагнітних наночастинок оксиду заліза з нестехіометричним магнетитом (17-31 нм). Магнетит покритий карбоксиметилдекстраном, що ізолює біоактивне залізо препарату від плазми крові поки ферумокситол не буде захоплений макрофагами селезінки, печінки і кісткового мозку [110]. Ферумокситол також може застосовуватися для магнітно-резонансної ангіографії у якості контрастного агенту (діагностика аневризм аорти, тромбозу вен нижніх кінцівок) [140].

Аскорбінова кислота підвищує ефективність препаратів заліза при лікуванні ЗА, збільшуючи біодоступність солей заліза в шлунково-кишковому тракті шляхом зміни ступеня окиснення іонів заліза. Наночастинки магнетиту розміром 5 нм покриті аскорбіновою кислотою використовуються при лікуванні ЗА. Встановлено, що введення даної субстанції тваринам є ефективним при інтраперитонеальному і пероральному введенні - спостерігається зростання рівня гемоглобіну і еритроцитів, відсутні появи токсичності [142]. Інший препарат на основі НОЗ - феромагніт-35, який в дозі 35 мг на першу добу і 70 мг на 14 добу запобігає розвитку залізодефіцитних станів у поросят [39].

Антианемічні засоби мають ряд недоліків: низький рівень засвоюваності, висока частота проявів побічних ефектів (нудота, анорексія, металевий присмак у роті, запори, диспепсичні розлади), значна тривалість курсу прийому препаратів (до 2-3 місяців) для досягнення терапевтичного ефекту. Усі ці побічні ефекти значно впливають на комплаєнтність існуючих протианемійних препаратів заліза, тобто на дотримання кратності та режиму прийому. Тому сучасні препарати заліза не можуть повністю задовольнити клініцистів, що спонукає до розробки нових протианемічних лікарських засобів на основі наночастинок.

1.3.2 Наночастинки заліза

Нанозалізо - це загальне поняття, яке охоплює матеріали з нанометровими лінійними розмірами на основі заліза: наночастинки нуль-валентого заліза, або наночастинки Fe0 (zero-valent iron nanoparticles, НЧЗ), наночастинки оксиду заліза (iron oxide nanoparticles, НОЗ) або суперпарамагнітні наночастинки оксиду заліза (superparamagnetic iron oxide nanoparticles), композитні наноматеріали [45].

Наночастинки Fe0 зазвичай представлені структурою за схемою «ядро-оболонка». Ядро складається з нуль-валентного (металічного) заліза, тоді як оболонка, яка утворюється внаслідок окиснення металічного заліза, представлена гідроксидами або оксидами заліза Fe(II) та Fe(III). Fe0 у хімічних реакціях виступає донором електронів, тоді як оболонка бере участь в утворенні хімічних комплексів (хемосорбції). Залізо у навколишньому середовищі існує переважно в окисненому стані, тоді як відновлене Fe0 є штучно створеним матеріалом [93].

Для синтезу наночастинок Fe0 застосовують як підхід «зверху-вниз», так і підхід «знизу-вверх». Наночастинки Fe0 отримують шляхом розпилення у вакуумі, відновлення частинок гематиту воднем за високих температур, за допомогою розкладання пентакарбонілу заліза (Fe(CO)5) в органічних розчинниках або аргоні, а також шляхом електролітичного осадження солей заліза (ІІ). До підходу «знизу-вверх» відноситься метод відновлення солей закису (Fe(II)) і окису (Fe(III)) заліза борогідридом натрію [81]:

4Fe3+ + 3BH4? + 9H2O > 4Fe0 v + 3H2BO3? + 12H+ + 6H2 ^

Метод простий у зв'язку із застосуванням лише двох реагентів, а також не потребує спеціального обладнання [81].

Унікальні магнітні властивості, зокрема магнітовпорядкований стан притаманні нанозалізу. Атоми наночастинок мають нескомпенсовані власні магнітні моменти, які можуть набувати певної впорядкованої просторової орієнтації, що обумовлює наявність спонтанної намагніченості. При зменшенні розміру магнітного матеріалу відбувається зміна магнітних властивостей на супермагнітні, при цьому наночастинки здатні до орієнтування зовнішнім магнітним полем, а також до значного посилення магнітного потоку [82, 134].

Наявність магнітних властивостей зумовлює агрегацію наночастинок, що є важливим параметром, що визначає їх токсичність. Більш високі концентрації можуть давати більш високу агрегацію НЧЗ, тим самим зменшуючи їх реакційну здатність і їх антимікробну дію. Крім того, збільшення часу дії призводить до підвищення окислення і пасівації наночастинок, що в кінцевому результаті, знижує їх реактивність [151].

Важливою властивістю наночастинок є також їх велика площа поверхні, яка відбивається їх підвищеною реактивністю [212]. Крім цього, нанозалізо володіє високою хімічною реакційною здатністю, що робить можливим застосовувати цей наноматеріал для прискорення (каталізу) хімічних реакцій [45].

Вищеописані магнітні властивості, висока хімічна реакційна здатність, невисока токсичність та вартість нанозаліза, здатність до біодеградації у організмі, обумовили його застосування в багатьох напрямках біології та медицини, таких як магнітно-резонансна томографія (в якості контрастних агентів), магнітна гіпертермія у онкології, доставка лікарських засобів, тканинна інженерія, лабораторні дослідження тощо [73, 142].

Серед наноматеріалів, наночастинки Fe0 являють собою нове покоління продуктів, використовуваних для стратегій з відновлення навколишнього середовища, оскільки воно є відмінним донором електронів та має високу активність у окисно-відновних процесах, тому використовується для очищення навколишнього середовища [88, 130]. Тому воно вважаються допустимим варіантом для очищення забруднених грунтів і систем грунтових вод [63]. Нестача досліджень, які оцінюють вплив на здоров'я та екологічні ризики використання наночастинок Fe0 в даний час перешкоджає його комерціалізації [119].

1.3.3 Препарати наночастинок оксиду заліза

Наночастинки оксидів заліза (НОЗ) завдяки хімічній стабільності та низькій токсичності, порівняно із наночастинками Fe0 частіше використовуються в медицині. Ядро НОЗ представлене оксидом заліза (ІІ,ІІІ) магнетитом (Fe3O4) та/чи оксидом заліза (ІІІ) маґгемітом (гFe2O3), які володіють подібними магнітними властивостями і складається із аморфної і кристалічної частин. Магнетит у складі НОЗ може окиснюватися до маґгеміту, супроводжується зміною кольору речовини з чорно-коричневого на червоно-коричневий. На поверхні НОЗ є покриття, яке забезпечує стабільність і біосумісність наночастинок [150, 198].

Розміри НОЗ визначають їх фізичні, біологічні, фармакологічні та токсикологічні властивості, більші наночастинки краще захоплюються макрофагами [74, 198], проте менші - довше циркулюють у крові та здатні проходити через стінку судин [77]. Тому наночастинки за розміром розподіляють на три типи: 1) надмалі суперпарамагнітні наночастинки оксиду заліза, 10-50 нм (сюди відносять і монокристалічні наночастинками оксиду заліза); 2) малі або стандартні суперпарамагнітні наночастинки оксиду заліза, 60-150 нм; 3) великі частинки оксиду заліза, 300 нм-3,5 мкм [175].

1.3.4 Механізми дії наночастинок нуль-валентного заліза (Fe0)

Основний механізм дії наночастинок Fe0 все ще залишається предметом дискусій [211]. Ключовим етапом взаємодії наночастинок із клітиною є проникнення через біомембрану. Проникнення може бути фагоцитарним чи нефагоцитарним через пасивне захоплення чи адгезивні взаємодії і залежить від розміру, заряду і концентрації наночастинок [208]. Нефагоцитарне захоплення ініціюється силами Ван дер Ваальса, електростатичними зарядами, ефектами поверхневого натягу, що призводить до впливу наночастинок на цитоплазматичні білки і органели. При цьому наночастинки можуть виявлятися в зовнішній мембрані, цитоплазмі, мітохондріях, ліпідних везикулах, ядрі [72]. Показано, що частинки розміром 2,5-10 мкм накопичуються у великих цитоплазматичних вакуолях, розміром - до 100 нм виявляються в органелах, зокрема мітохондріях [212]. Залежно від локалізації та концентрації всередині клітини наночастинки можуть впливати на органели чи ДНК і, за певних умов призводити до загибелі клітини [72].

Електричний заряд наночастинок також є важливою складовою при взаємодії з клітиною. Bстановлено, що від'ємно заряджені аніонні наночастинки викликають конформаційні зміни молекул фосфатидилхоліну, зменшуючи кут між гідрофільною і гідрофобною частинами молекули, при цьому підвищується щільність ліпідної мембрани і відбувався перехід у гелеву фазу. Під дією позитивно заряджених наночастинок фосфатидилхолін зазнає протилежних конформаційних змін, знижується щільність мембрани і відбувається перехід у рідку фазу (золь) [157]. Модуляція ліпідного шару плазматичної мембрани під дією наночасточок може бути одним із механізмів їх впливу на органели клітин. Приєднання магнітних наночастинок до поверхні клітин і застосування зовнішнього магнітного поля дозволяє керувати функціями клітин [99].

Поряд із дослідженнями перспективності застосування наночастинок з метою впливу на функції клітин і органів, проводяться дослідження по вивченню його токсичної дії. Є невелика кількість робіт, що встановлюють дози токсичного впливу та його механізми на клітини. У дослідженні ефекту часткового окиснення («старіння») та модифікації поверхні наночастинок Fe0 на потенційну нейротоксичність за умов in vitro на культурах клітин мікроглії і нейронів гризунів було встановлено, що наночастинки Fe0 спричиняють найвищу активність оксидативного стресу в клітинах мікроглії та понижують вміст АТФ у нейронах порівняно із наночастинками магнетиту (Fe3O4). При цьому в клітинах мікроглії спостерігали набухання мітохондрій, прояви апоптозу, а в нейронах - перинуклеарні включення та гранульованість цитоплазми. Тобто, часткове або повне окиснення наночастинок Fe0 призводить до пониження їхньої окисно-відновної активності, що ймовірно понижує токсичність відносно клітинних культур ссавців [167].

Реакція Фентона лежить в основі цитотоксичності заліза. Це окисно-відновна реакція між перекисом водню і Fe(II) у ролі каталізатора, в результаті якої перекис водню розщеплюється на іон гідроксиду і вільний гідроксильний радикал:

Н2О2 + Fe2+ > яОН + ОН- + Fe3+

Гідроксильний радикал (яОН) належить до АФК, має короткий період напівжиття (10-9 с), володіє дуже високою реакційною здатністю і може пошкоджувати біологічні молекули. Вільні електрони передаються від однієї молекули до іншої та запускають каскад пошкоджувальних реакцій [67, 116]. АФК утворюються наночастинками безпосередньо на їх поверхні, коли водночас там присутні окисники і вільні радикали, за умов реакцій Фентона [190].

На теперішній час переважна більшість досліджень була присвячена ля встановленню можливих механізмів токсичності наночастинок Fe0 по відношенню до бактерій, в тому числі оцінювали порушення цілісності клітинних мембран, вплив на дихання, пошкодження ДНК, білків, по генерації АФК визначали окисний стрес [102, 189]. Нещодавні дослідження показали, що токсичність НЧЗ для бактерій залежить від розміру, дози [63] та форми [211].

У бактерій початковий етап прояву токсичності наночастинок Fe0 включає ушкодження клітинної стінки [67, 151]. За допомогою технік "Omic" були оцінені маркери токсичності - гени, що беруть участь у циклі азоту (нітрат-редуктаза і нітрит-редуктази), реплікації ДНК (гіраза), гліколізу (піруваткіназа). Встановлено, що у бактерії Pseudomonas stutzeri експресія даних генів не змінилася в порівнянні з контрольним геном (16S рРНК) при дії FeNPs, проте експресія katB (каталази) була значно збільшена (5,7 рази вище, ніж в контролі). Каталаза є ферментом, який бере активну участь в детоксикації окисного стресу в клітині. Наночастинки можуть генерувати АФК, які в свою чергу, можуть викликати окислювальну стрес-відповідь [151]. За умов Fe0-індукованого стресу у бактерій P. Stutzeri пригнічується модуляція мембранних білків і активуються білки, що беруть участь у захисті від окислювального стресу та різні детоксикаційні ферменти [61, 148].

За умов дії наночастинок Fe0 у Pseudomonas stutzeri значно знижується активність багатьох мембранних та транспортних білків, відбувається пригнічення ABC-транспортеру заліза, периплазматичних білків, TonB-залежних рецепторів, які беруть участь у поглинанні заліза [151]. Спостерігається пригнічення метаболічних ферментів, що беруть участь у забезпеченні попередників біосинтезу для ДНК та / або РНК в тому числі, альфа субодиниці дифосфат рибонуклеотид-редуктази і інозин-5'-монофосфат-дегідрогенази (IMPDH). Обидва ферменти належать до оксидоредуктаз і активність їх може бути порушена окисним стресом, створеним Fe0 [109]. Крім того, IMPDH каталізує швидкість синтезу гуанозинтрифосфату [199], що дозволяє припустити, що Fe0-індукований стрес призводить до порушення синтезу білка [151].

Elham Barzan et al. (2014) теж прийшли до висновку, що цитотоксичний ефект НЧЗ (20-50 нм) може бути опосередкований проникненням частинок через клітинну стінку, з подальшою їх взаємодією з внутрішньоклітинним киснем, призводячи до окисного стресу і в кінцевому результаті до загибелі бактеріальної клітини [67]. Встановлено, що НЧЗ володіють бактерицидною дієї по відношенню до бактеріальних штамів, як грам-позитивних (Bacillus subtilis var. Niger), так і грам-негативних (Pseudomonas fluorescens, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli,) [67, 95]. Зменшення бактерицидного ефекту НЧЗ, після його окислення, пояснюють утворенням шару окисленого заліза на наночастинці [65]. Слід зазначити, що чорний колір НЧЗ жовтіє, після окислення [207]. Крім того, наночастки Fe0 не є мутагенними при низьких концентраціях [67].

Отже, вплив наночастинок заліза на клітини залежить від розміру, форми, заряду та концентрації ноночастинок. Завдяки унікальних біологічним властивостям наночастинки заліза виступають багатофункціональними кофактороми білків у окисно-відновних реакціях, проте водночас є цитотоксичними, адже призводять до розвитку окисного стресу. У основі фізіологічного та токсичного впливу нанозаліза лежить утворення АФК переважно внаслідок реакції Фентона. Не виключений механізм прямої взаємодії наночастинок із клітинними мембранами. Перспективним є вивчення більш тонких механізмів взаємодії наночастинок Fe0 із клітиною, розроблення нових препаратів на основі нанозаліза, а також розвиток математичного прогнозування властивостей таких наночастинок.

Таким чином, на основі опрацьованих літературних даних досліджуваної проблеми про препарати наночастинок заліза для лікування ЗА зроблено такі узагальнення:

1. Вплив нанозаліза залежить від розміру, форми, заряду та концентрації ноночастинок. Проте, на сьогодні біологічний ефект наночастинок Fe0 за умов in vitro та in vivo є вивчений недостатньо і потребує подальшого вияснення.

2. При вивченні потенційних протианемійних властивостей субстанції НЧЗ актуальності набуває оцінка їх впливу на функціональний стан органів жіночої репродуктивної системи, зокрема скоротливість міометрія при моделюванні залізодефіцитної анемії у тварин.

Отже, опрацювання літературних джерел згідно теми дисертаційної роботи робить актуальними дослідження та вимагає проведення експериментів з використанням тварин для вивчення скоротливості ОВ і ЦВ матки за фізіологічних умов, при моделюванні імунокомплексного процесу та залізодефіцитної анемії. А також за умов коригуючих впливів: блокування ферменту ПАРП-1, зміни функціонального стану мітохондрій та введення наночастинок нуль-валентного заліза при даних модельованих процесах.

Розділ 2. Матеріали та методи

Досліди проводились із дотриманням основних положень Конвенції Ради Європи про охорону хребетних тварин, що використовуються в експериментах та в інших наукових цілях, від 18.03.1986 р., Директиви ЄС №609 від 24.11.1986 р., Наказу МОЗ України №66 від 13.02.2006 р. та Закону України «Про захист тварин від жорстокого поводження» від 21.02.2006 № 3447-IV. Дослідження проведенні на 100 невагітних статевозрілих самицях мишей лінії СВА, а також на 50 самицях мишей лінії ВАLB/с масою 18-22 г.

2.1 Фазно-графічний метод дослідження скоротливості міометрія матки

З метою дослідження особливостей скоротливої активності різних регіонів матки в нормі та за різних експериментальних умов використовували метод фазно-графічного аналізу [170].

Відпрепаровували матку, виділяли ОВ і ЦВ матки (рис.2.1.) і поміщали в холодний розчин Кребса (4оС, pH 7,29) такого складу (в мілімолях на 1 л): NaCl - 120, KCl - 5,9, NaHCO3 - 15,5, NaH2PO4 - 1,2, MgCl2 - 1,2, CaCl2 - 2,5, глюкози - 11,5 (Sigma, США) .

Рис.2.1.Будова матки у мишей.

Смужки міометрія переносили до експериментальної камери. Рівномірну перфузію розчину здійснювали перистальтичним насосом НП-1М. Ізометричну силу скорочень вимірювали механо-електричним перетворювачем (FT 106) і реєстрували швидкодіючим самописцем Н3021-3. Датчик відкалібровували, його статична характеристика мала невеликий зсув (0 - 2,0 В) і нахил (0,05 - 0,1В/мН). Візуальний контроль досліджуваних параметрів здійснювали за допомогою осцилографа С1-83. Водночас проводили комп'ютерну реєстрацію скорочень за допомогою програми IRIS Waveware версії 2.6.1. Базову активність реєстрували протягом 20-30 хв.

Рис. 2.2. Типове фазне скорочення міометрія (верхня крива) і його перша похідна (нижня крива). Параметри скорочення міометрія:

"Fmax " - амплітуда скорочення, мН;

" CVmax"- позитивний пік першої похідної скорочення (макс. швидкість скорочення), мН/с;

"RVmax"- негативний пік першої похідної скорочення (макс. швидкість розслаблення), мН/с.

Т - час, між максимальною активацією (CVmax) і дезактивацією (RVmax) скорочення (с).

Для кількісної характеристики фазних скорочень досліджувались такі параметри скоротливості ОВ і ЦВ матки: амплітуда скорочення (Fmax, мН), частота скорочення (кількість за секунду), тривалість активного стану - час між максимальною активацією (CVmax) і дезактивацією (RVmax) скорочення (Т, с), швидкість скорочення і розслаблення (CVmax, RVmax, мН/с), індекс скоротливості (IС, як добуток Fmax на CVmax/RVmax, мН) [170] (Рис.2.2).

З метою визначення особливостей скоротливості різних відділів матки, вивчали скоротливість міометрія у інтактних мишей, а також за таких експериментальних впливів:

1) довготривала імунізація бичачим сироватковим альбуміном (БСА), що відтворювала системну імунокомплексемію (реакцію гіперчутливості ІІІ типу за класифікацією Кумбса і Джелла);

2) дія блокатора ПАРП-1 та зміна функціонального стану мітохондрій при експериментальній системній імунокомплексемії;

3) експериментальна залізодефіцитна анемія, що відтворювала хронічну нестачу заліза у харчовому раціоні людини;

4) застосування наночасточок заліза як у нормі, так і при імунізації БСА та залізодефіцитній анемії.

2.2. Моделювання системної імунокомплексемії та імунологічні методи її оцінки

2.2.1 Відтворення системної імунокомплексемії

Системний імунокомплексний процес відтворювали за допомогою імунізації мишей зростаючими дозами антигену - БСА (Sigma, USA) раз на тиждень внутрішньовенно (в/в) протягом 6 тижнів за такою схемою:

І введення - 150 мг БСА/кг маси миші; ІІ - 200 мг/кг; ІІІ - 250 мг/кг; ІV - 250 мг/кг; V - 300 мг/кг; VІ - 300 мг/кг маси миші.

Контрольними були миші, яким замість БСА вводили фізіологічний розчин у відповідному об'ємі згідно схеми імунізації.

На 7 добу після останньої імунізації тварин піддавали ефірному наркозу і вилучали матеріал: матку (для визначення скоротливості, імуноцитохімічних та цитологічних досліджень), аорту, печінку, нирки, селезінку, тимус, пахові лімфовузли, перитонеальний ексудат та сироватку крові для подальших досліджень.

2.2.2 Методи дослідження стану імунної системи

Активацію вроджених та адаптивних імунних процесів досліджували за показниками лейкограми крові, НСТ-тесту, визначення катіонних білків та фагоцитарної активності клітин неспецифічної резистентності, реакції гальмування адгезії лімфоцитів (РГАЛ), утворення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) та оцінки фіксації імуноглобулінів в тканинах.

Дослідження лейкограми проводили за стандартною методикою на мазках крові забарвлених за Романовським-Гімза [18], підраховували відносну кількість лейкоцитів крові.

Рівень циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) в сироватці визначали загальноприйнятим методом преципітації в розчині поліетиленгліколю-6000 (в мікромодифікації). Оптичну густину проб визначали за допомогою EIA Multi-well Reader II (“Sigma Diagnostics”, USA) при 405 нм з референс-фільтром 630 нм. Результати виражали в умовних одиницях - у.о. (оптична густина проб х 1000).

Тест відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест). Каплю крові, нанесену на покривне скло, інкубували 20 хв. при 37°С у вологій камері. Відмивали 0,15 М NaCl. Далі інкубували 30 хв. у вологій камері при 37°С , висушували, фіксували 60 с в метанолі. Фарбували протягом 5 хв. 0,7% сафраніном (в 28% розчині гліцерину). Підраховували відсоток клітин з відкладеннями формазану (НСТ-позитивні клітини) при дослідженні під світловим мікроскопом 100 нейтрофілів - (об.100 х ок.12,5) [18]. По кількості відкладеного в клітинах фармазану оцінювали їх активність в умовних одиницях і розраховували індекс активації: ІА= (0 х Н0 + 1 х Н1 + 2 х Н2 + 3 х Н3)/100, де Н0, Н1, Н2, Н3 (%) - кількість нейтрофілів з активністю 0, 1, 2, і 3 бали відповідно.

Аналіз катіонних білків проводили на мазках крові мишей із підрахунком середнього цитохімічного коефіцієнту (СЦК) [18]. Мазки висушували без фіксації і опускали на 15 хв в розчин стійкого зеленого. Далі фарбували 15 с у водному 0,25% розчині азура А. Інтенсивність забарвлення гранул нейтрофілів оцінювали під світловим мікроскопом (об.100 х ок.12,5). СЦК катіонних білків нейтрофілів вираховували за формулою Астальді і Верга: СЦК= (3а + 2,5б + 2в + 1,5г + 1д + 0,5е + 0ж) / 100, де а-ж - число однотипних клітин з катіонними гранулами; 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 - ступінь заповнення цими гранулами цитоплазми. 100 - загальна кількість підрахованих клітин.

Оцінку фагоцитозу проводили за поглинанням часток латексу загальноприйнятим методом з деякими модифікаціями [22]. Суспензію клітин перитонеального ексудату (1*106 в об'ємі 100 мкл, життєздатність у тесті з трипановим синім була не меншою 98 %) вносили до лунок та інкубували у вологій камері 1 год при 37°С для адгезії макрофагів. Після відмивання клітин, що не адгезували, до лунок вносили по 100 мкл середовища RPMI-1640 (Sigma, США) і 50 мкл 1%-го латексу («ПанЄко», Росія, діаметр латексових часток 1,5 мкм) і культивували 1 год при 37°С. Після промивання від латексу препарати висушували, фіксували етиловим спиртом (96°) і фарбували азур-еозином за Романовським . Під світловим мікроскопом (об. 100 х ок.12,5) підраховували 100 макрофагів. Розраховували фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток макрофагів, які поглинули частки латексу (від загального їх числа), а також фагоцитарне число (ФЧ) Райта - це середнє число часток латексу, поглинуте одним макрофагом.

Реакція гальмування адгезії лімфоцитів (РГАЛ) здійснювали за модифікованим методом «лічильної камери» [18]. До клітин, виділених з пахових лімфовузлів (106 в 50 мкл середовища RPMI 1640) додавали 50 мкл 0,2% розчину антигену БСА і 100 мкл нормальної сироватки і інкубували на водяній бані з шейкером 30 хв. при 37° С. До контрольних проб замість БСА додавали середовище. Після інкубації суспензію вносили в камеру Горяєва, витримували 1 годину при 37° С у вологій камері та підраховували загальну кількість клітин. Неадгезовані клітини ретельно відмивали та підраховували адгезовані клітини в тих же квадратах камери Горяєва. Визначали показник пригнічення адгезії лімфоцитів (ППАЛ): ППАЛ=(А-В)/Вх100, де А - % адгезованих клітин в присутності БСА, В - % адгезованих клітин в контрольних пробах.

Імунофлуоресцентну оцінку фіксації імуноглобулінів проводили на відбитках селезінки, печінки, аорти, нирок, матки, а також на ендотелії синовіальної оболонки колінного суглоба. Препарати фіксували 1% спирт-пікриновою сумішшю та обробляли міченими ФІТЦ-антитілами до імуноглобулінів мишей (Sigma, USA). Застосовували напівкількісний метод оцінки інтенсивності флуоресценції клітин та їх тканинного оточення і відносної кількості клітин, що світяться, за наступною шкалою світіння: 0 - відсутнє; 1 - слабке, 2 - помірне; 3 - виражене; 4 - сильне.

Дослідження шляхів загибелі імунокомпетентних клітин (ІКК) проводили методом прижиттєвого подвійного забарвлення флуоресцентними барвниками нуклеїнових кислот Хехст 33342 і йодид пропідіума (Sigma, USA) [182]. Йодид пропідіума проникає тільки у клітини з ушкодженими мембранами і забарвлює їх ядра в оранжевий колір, що вказує на некроз. Хехст 33342 проникає і через неушкоджені мембрани і забарвлює ядра живих клітин в синій колір. Зв'язані з хроматином барвники дають змогу оцінити морфологічні особливості ядерного матеріалу, притаманні апоптозу: периферичне розташування хроматину, його конденсацію, фрагментацію ядер, а також розпад клітин на апоптотичні тільця. Проводили оцінку не менш як 200 клітин за допомогою люмінесцентного мікроскопу „Люмам И-1” (ЛОМО, Росія) з водно-імерсійним об'єктивом х85 та з відеосистемою передачі зображення на комп'ютер.

Рівень експресії Fas-рецептора (CD 95) визначали на фіксованих метанол-ацетоном (1:1) препаратах клітин тимуса та лімфовузлів імуноцитохімічним методом з використанням моноклональних анти-CD-95 антитіл миші (BD Biosciences). Інкубацію цитопрепаратів з первинними антитілами проводили при 4оС протягом 18 год, з вторинними (міченими пероксидазою антитілами до IgG мишей, Sigma, USA) - протягом 1 год при кімнатній температурі. Візуалізацію реакції проводили за допомогою діамінобензидину, її інтенсивність оцінювали напівкількісним методом у балах -- від 0 до 4 з підрахунком СЦК за формулою: СЦК=(0хА+1хБ+2хВ+3хГ+4хД)/100, де 0, 1, 2, 3 та 4 - ступінь забарвлення, А, Б, В, Г, Д - кількість клітин відповідної інтенсивності забарвлення.

Оцінку активації полі(АДФ-рибозо) полімерази в клітинах міометрію проводили за імуноцитохімічним виявленням полі-АДФ рибози, що утворюється ферментом ПАРП [57] з деякими модифікаціями. Відбитки матки фіксували 2 хв в суміші метанол-ацетон, 1:1 при кімнатній температурі (То кімн) з наступним промиванням в забуференому фосфатами фізіологічному розчині (ЗФР). Ендогенну пероксидазу блокували протягом 30 хвилин (0,3% Н2О2, 0,1% азид натрію в ЗФР). Блокування неспецифічного зв'язування антитіл проводили в 3% розчині БСА з 0,1% азиду натрію протягом 30 хв. Після промивання в ЗФР препарати інкубували протягом 18 год при Т 4о С з первинними антитілами (polyclonal rabbit anti-PAR antibody, BD Pharmingen). Після ретельного відмивання в ЗФР (двічі по 10 хв.) проводили інкубацію з вторинними антитілами (мічені пероксидазою кролячі антимишачі антитіла, "Sigma", USA, 1:100) протягом 60 хв. Зразки відмивали в ЗФР (двічі по 10 хв). Візуалізацію реакції проводили при інкубації препаратів з діамінобензидином за загальноприйнятою методикою. Негативним контролем слугували зразки, які не інкубували з первинними антитілами. Підраховували не менш як 200 клітин в кожному препараті. Результати реакції оцінювали напівкількісно з розрахунком СЦК, як для експресії CD 95.

2.3 Моделювання експериментальної залізодефіцитної анемії у мишей

2.3.1 Відтворення експериментальної залізодефіцитної анемії (ЗА)

Відомо декілька способів відтворення ЗА у лабораторних тварин, а саме: шляхом повторних кровопускань, застосування медикаментів (дефероксаміну), або утримування тварин на залізодефіцитній дієті. Із вказаних способів було обрано моделювання шляхом утримування тварин на залізодефіцитній дієті, оскільки згідно даних ВООЗ саме хронічна нестача заліза у харчовому раціоні є найбільш розповсюдженою причиною розвитку ЗА при відсутності супутньої патології. З цією метою було застосовано корм (комбікорм) для тварин зі зниженим вмістом заліза виготовлено у ПП «Резон-1» згідно рецепту № ПК 120-3 26.09.2012р.

Експериментальну ЗА моделювали шляхом утримування самок мишей лінії BALB/c із початковою масою 15-16 г на залізодефіцитній дієті протягом 2 місяців. Корм зі зниженим вмістом заліза та воду тварини отримували ad libitum. Контрольних мишей утримували на дієті з нормальним вмістом заліза [97, 203].

Маркерні показники крові, що засвідчують розвиток ЗА у мишей, визначали наступними методами:

Концентрацію гемоглобіну (г/л) в крові оцінювали геміхромним методом із використанням набору стандартного діагностикуму для клініко-діагностичних та біохімічних лабораторій виробництва ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика» (Дніпропетровськ, Україна) згідно протоколів виробника. Вимірювання оптичної щільності проб здійснювали за допомогою фотоелектроколориметра КФК-3 (Росія).

Підрахунок еритроцитів та визначення гематокриту в крові проводили за стандартними методиками згідно [18].

2.4 Дослідження дії наночастинок нуль-валентного заліза (НЧЗ)

2.4.1 Характеристика препарату НЧЗ

Експериментальну субстанцію сферичних наночастинок Fe0 синтезували в Інституті біоколоїдної хімії ім.Ф.Д. Овчаренка НАН України за оригінальним протоколом методом хімічної конденсації у водному середовищі шляхом відновлення хлориду заліза (ІІІ). Перевагами даного підходу над іншими методами синтезу наночастинок металів медичного призначення є можливість отримувати стерильні, біосумісні, монодисперсні та стабільні у часі субстанції[24].

На рис. 2.3 представлені результати трансмісійної електронної мікроскопії (рис. 2, А) та рентгеноструктурного мікроаналізу (рис. 2, Б), що характеризують розмір, форму та хімічний склад використаної в роботі субстанції НЧЗ. Вони мають сферичну форму, середній розмір 40 нм та характеризуються 100% вмістом заліза (Fe). Відсутність в складі частинок кисню є свідченням того, що вони є частинками нуль-валентного заліза.

Рис. 2.3. Фізико-хімічна характеристика субстанції наночастинок заліза: А - електронно-мікроскопічне зображення; Б - рентгеноструктурний мікроаналіз хімічного складу частинки.

Субстанція НЧЗ була охарактеризована як біобезпечна і біосумісна за показниками цитотоксичності, генотоксичності, мутагенності, фізіологічного маркера «стан мікрофлори шлунково-кишкового тракту людини» та біохімічних параметрів (ATФ-aзна і лактатдегідрогеназна активність) відповідно до критеріїв та протоколів Методичних рекомендацій «Оцінка безпеки лікарських нанопрепаратів», затверджених Науково-експертною радою Державного експертного центру МОЗ України (протокол №8 від 26.09.2013 р.) [38].

Субстанція належить до V класу токсичності (практично нетоксичних речовин) - LD50 при внутрішньо шлунковому введенні самкам мишей лінії BALB/c перевищує 5000 мг/кг [120].

2.4.2 Застосування НЧЗ як протианемічного засобу

Дослідження проведено на 50 самицях мишей лінії BALB/c із початковою масою 15-16 г. З них 40 тварини протягом 2 міс. утримували на дієті зі зниженим вмістом заліза, 10 мишей отримували дієту із нормальним вмістом заліза, після чого починали курс експериментального лікування за умов внутрішньовенного та перорального введення НЧЗ. Середня маса тварин на початку курсу введення НЧЗ становила 23,2±0,4 г.

Як препарат порівняння було застосовано зареєстрований в Україні протианемічний лікарський засіб, діючою речовиною якого є заліза (III) гідроксиду полімальтозний комплекс («Феррум Лек» виробництва підприємства «Лек» компанії «Сандоз», Польща/Словенія). Матеріали для аналізу отримували після евтаназії тварин шляхом декапітації під хлороформним наркозом.

Розрахунок добової умовно-терапевтичної дози НЧЗ для лабораторних тварин здійснювали шляхом перерахунку рекомендованої середньої добової терапевтичної дози препарату порівняння - заліза (III) гідроксиду полімальтозного комплексу - для дорослої людини (2,85 мг/кг) з урахуванням коефіцієнту видової стійкості за таким алгоритмом:

1. Константа біологічної активності (Ка) розрахована за формулою:

Ка = R / DE,

де R - коефіцієнт видової стійкості, DE - ефективна доза речовини.

Згідно довідкової інформації R для людини (Rл) становить 0,45. DEл = 2,85 мг/кг.

Звідси Ка = Rл / DEл = 0,45 / 2,85 ? 0,158.

2. Так як згідно довідкової інформації R мишей (Rм) становить 2,64, врахувавши отримане значення Ка, розраховано DE (тобто добову умовно-терапевтичну дозу) (DEм):

DEм = Rм / Ka = 2,64 / 0,158 = 16,8 мг/кг.

Таким чином, за умови перорального введення мишам, використано дозу 16,8 мг/кг (концентрація розчину - 2,5 мг/мл), як добову умовно-терапевтичну дозу субстанції НЧЗ і препарату порівняння.

2.5 Використані речовини

В дослідах використовували:

- розчин Кребса (ммоль/л): NaCl - 120; KCl - 5,9; NaHCO3 - 15,5; NaH2PO4 - 1,2; MgCl2 - 1,2; CaCl2 - 2,5; глюкоза - 11,5;

- 4-гідроксиквіназолін, 4-ГК - блокатор ПАРП (Sigma, USA), 100 мг/кг;

- L-норвалін - специфічний блокатор аргінази ІІ (Sigma, США), 50мг/кг;

- препарат «Мексидол» (етилметилгідроксипіридин сукцинат, ГС) ("Фармасофт", Російська Федерація) - антиоксидант, мембранопротекрор, енергізатор мітохондрій та ін., 100 мг/кг;

- препарат «Феррум Лек» («Сандоз», Польща/Словенія) - протианемічний засіб, 16,8 мг/кг/добу;

- субстанція наночастинок нуль-валентного заліза (Інститут біоколоїдної хімії ім.Ф.Д. Овчаренка НАН України ) - сферичної форми, розмір 40 нм та 100% вміст заліза (Fe), 16,8 мг/кг/добу.

2.6 Схема експерименту

У першій серії експериментів досліджували особливості скоротливості ОВ і ЦВ матки та показники імуно-запальних процесів за умов імунізації мишей БСА. Розподіл тварин по групах та схема експериментів представлені в табл. 2.1.

Таблиця 2.1.

Дослідження особливостей скоротливості ОВ і ЦВ матки та показників імуно-запальних процесів за умов імунізації мишей БСА

Групи тварин	І гр. - контроль (в/в введення фізіологічного розчину (фіз. р-ну) у відповідному об'ємі замість БСА, згідно схеми імунізації, n=8); ІІ гр. - імунізація БСА (в/в, шестикратно, раз на тиждень, зростаючою дозою антигену - 150, 175, 200, 250, 250, 300 мг/кг, n=8);
Забір матеріалу	7 день після імунізації
Дослідження скоротливості матки
Об'єкт	Методи та досліджувані параметри:
ОВ і ЦВ матки	Фазно-графічний аналіз. Параметри скоротливої активності: амплітуда, індекс скоротливості, частота скорочень; тривалість активного стану, швидкість скорочення, швидкість розслаблення.
Оцінка функціонального стану імунної системи
I) Кров	А) лейкограма крові; Б) рівень ЦІК; В) активність киснезалежного метаболізму нейтрофілів за НСТ-тестом; Г) вміст катіонних білків у нейтрофілах;
II) Перитонеальна рідина	Д) фагоцитарна активність макрофагів перитонеального ексудату;
ІІI ) Лімфовузли	E) життєздатність, апоптоз і некроз клітин пахових лімфовузлів; Е) експресія Fas-рецептора
ІV) Тимус	Є) життєздатність, апоптоз і некроз клітин пахових лімфовузлів; Ж) експресія Fas-рецептора
V) Відбитки тканин: матка, аорта, нирки, суглоби, селезінка, печінка.	З) імунофлюоресцентний аналіз фіксації Ig

У другій серії експериментів проводили дослідження функціонального стану матки за умов імунізації БСА та введення блокатора ПАРП-1, 4-ГК. Схема експерименту представлена в табл.2.2.

Таблиця 2.2

Дослідження скоротливості ОВ і ЦВ матки за умов імунізації БСА та введення блокатора ПАРП

Групи тварин	І гр. - контроль (в/в введення фіз. р-ну замість БСА + вн/оч замість 4-ГК, у відповідних об'ємах згідно схеми імунізації та введення 4-ГК, n=8); ІІ гр. - імунізація БСА (в/в, 1раз в тиждень зі зростаючою дозою антигену (150, 175, 200, 250, 250, 300 мг/кг, n=8); ІІІ гр -введення тваринам, що були імунізовані БСА, 4-ГК (вн/оч, 100 мг/кг, двічі на тиждень, при співпаданні з імунізацією - за 1 год до БСА, n=9).
Забір матеріалу	7 день після імунізації
Дослідження функціонального стану матки
ОВ і ЦВ матки	А) Оцінка активності ПАРП у міометрії; Б) Імунофлюоресцентний аналіз депозитів Ig; В) Фазно-графічний аналіз

У третій серії експериментів дослідження були направленні на встановлення особливостей скоротливості ОВ і ЦВ матки за умов зміни функціонального стану мітохондрій, за допомогою введення етилметилгідроксипіридин сукцинату (ГС) та блокатора аргінази ІІ (L-норваліну) на тлі введення БСА. Схема експерименту представлена в табл.2.3.

Таблиця 2.3.

Дослідження особливостей скоротливості ОВ і ЦВ матки за умов зміни функціонального стану мітохондрій при імунізації мишей БСА

Групи тварин	І гр. - контроль (в/в введення фіз. р-ну замість БСА, згідно схеми імунізації, n=8); ІІ гр. - введення етилметилгідроксипіридин сукцинату (ГС, вн/оч, раз на тиждень, 100 мг/кг) згідно схеми імунізації (n=8); ІІІ гр. - введення блокатора аргінази ІІ L-норваліну (вн/оч, раз на тиждень, 50 мг/кг) згідно схеми імунізації (n=4). ІV гр. - імунізація БСА (1 раз в тиждень зі зростаючою дозою антигену (150, 175, 200, 250, 250, 300 мг/кг) (n=8); V гр. - введення ГС тваринам, що були імунізовані БСА (шестикратно, вн/оч, раз на тиждень, за 1 год до БСА, 100 мг/кг) (n=8); VІ гр. - введення L-норваліну за умов дії ГС при імунізації БСА (шестикратно, в/в, раз на тиждень, 50 мг/кг, в день після введення БСА і ГС згідно схеми імунізації) (n=8).
Забір матеріалу	7 день після імунізації
Дослідження скоротливості матки
ОВ і ЦВ матки	Фазно-графічний аналіз

У четвертій серії експериментів досліджували вплив НЧЗ на скоротливість ОВ і ЦВ матки при експериментальній залізодефіцитній анемії. Схема експерименту представлена в табл.2.4.

Таблиця 2.4

Дослідження впливу НЧЗ на скоротливість ОВ і ЦВ матки при експериментальній залізодефіцитній анемії

Групи тварин	Група І - контрольні тварини (введення фіз. р-ну, n=10). Група ІІ - експериментальна модель ЗА (n=10). Група ІІI - тварини із ЗА, яким через день в/в вводили розчин субстанції НЧЗ по 16,8 мг/кг через день, 5 ін'єкцій на курс) (n=10). Група IV - тварини із ЗА, яким протягом 10 діб per os вводили розчин субстанції НЧЗ (16,8 мг/кг на день, щоденно) (n=10). Група V - тварини із ЗА, яким протягом 10 діб per os вводили препарат порівняння («Феррум Лек», 16,8 мг/кг/добу) (n=10).
Забір матеріалу	Через день після останнього введення НЧЗ
Дослідження скоротливості матки
ОВ і ЦВ матки	Фазно-графічний аналіз.

У п'ятій серії експериментів вивчали скоротливості міометрія ОВ і ЦВ за умов введення НЧЗ та імунізації мишей БСА. Схема експерименту представлена в табл.2.5.

Таблиця 2.5

Дослідження скоротливості міометрія ОВ і ЦВ матки за умов введення НЧЗ та імунізації мишей БСА

Групи тварин	І гр. - контроль (введення фіз. р-ну, n=8); ІІ гр. - імунізовані БСА (1 раз в тиждень зі зростаючою дозою антигену (150, 175, 200, 250, 250, 300 мг/кг, n=8); ІІІ гр - введення НЧЗ тваринам, що були імунізовані БСА (шестикратно, в/в, раз на тиждень, за 1 год до БСА, 1,68 мг/кг, n=8). IV гр. - введення НЧЗ (вн/вен, 1,68 мг/кг, n=8).
Забір матеріалу	7 день після імунізації
Дослідження скоротливості матки
ОВ і ЦВ матки	Фазно-графічний аналіз.

2.7 Статистична обробка результатів

Перевірку отриманих даних на нормальність розподілу проводили за тестом Колмогорова - Смирнова. За нормального розподілу статистичну обробку результатів при порівнянні двох груп даних проводили з використанням критерію t Стьюдента, при більшій кількості груп даних за допомогою однофакторного дисперсійного аналізу ANOVA з подальшим порівнянням середніх значень між групами за тестом Ньюмена-Кейлса (Newman-Keuls post hoc test) за допомогою програми GraphPad Prism version 5.00 for Windows (GraphPad Software, San Diego California, USA). Результати виражали як M±SD (середнє ± стандартне відхилення). р<0,05 вважалося статистично вірогідним. При визначенні зв'язків між показниками використовували лінійний кореляційний аналіз за Пірсоном.

Результати досліджень гальмування адгезії лімфоцитів, які не мали нормального розподілу, а також дані імунофлуоресцентного визначення фіксації Ig в тканинах напівкількісним методом, аналізували з застосуванням непараметричного аналогу ANOVA - тесту Крускала-Уоллеса, з подальшим порівнянням між групами з використанням тесту множинних порівнянь Данна та виражали як середнє та розкид (мінімальне та максимальне значення) [8].

Розділ 3. Скоротливість оваріального та цервікального відділів матки у мишей за різних експериментальних умов

Методом фазно-графічного аналізу досліджували особливості скоротливої функції ОВ і ЦВ матки у інтактних мишей. З метою виявлення особливостей реакції різних регіонів матки визначали зміни скоротливості за різних експериментальних умов.

3.1 Особливості скоротливості ОВ і ЦВ у мишей за фізіологічних умов

Встановлено, що за фізіологічних умов амплітуда та ІС є вищими у ЦВ матки. Амплітуда у ЦВ становить 1,80±0,20 мН порівняно з ОВ - 1,30±0,15 мН (р<0,05), а ІС - 2,64±0,21 мН у порівнянні з ОВ 1,90±0,14 мН (р<0,01, n=8). Значення амплітуди та індексу скоротливості ОВ і ЦВ матки інтактних мишей представлені на рис.3.1.

Рис.3.1. Величини амплітуди та індексу скоротливості оваріального (ОВ) і цервікального (ЦВ) відділів матки.

Примітка: *- р<0,05, **- р<0,01 - вірогідність відмінностей величин в ЦВ відносно ОВ матки.

Встановлено, що швидкість скорочення та швидкість розслаблення є вищими у ЦВ (0,41±0,11 мН/с та 0,28±0,06 мН/с, р<0,05 в обох випадках, n=8) порівняно з величинами ОВ (0,28±0,05 мН/с та 0,19±0,04 мН/с відповідно). Величини швидкості скорочення і швидкості розслаблення ОВ і ЦВ матки інтактних мишей представлені на рис.3.2.

Рис.3.2. Величини швидкості скорочення та швидкості розслаблення оваріального (ОВ) і цервікального (ЦВ) відділів матки.

Примітка: *- р<0,05 ? вірогідність відмінностей величин в ЦВ відносно ОВ матки.

Встановлено, що показники тривалості активного стану та частота скорочень є вищими у ОВ і становлять - 11,75±1,58 с, у ЦВ - 9,62±1,06 с, у ОВ - 0,041±0,005, у ЦВ - 0,029±0,006 кількості скорочень/с (р<0,01 при порівнянні ОВ і ЦВ для обох показників, n=8). Дані, що характеризують тривалість активного стану і частоту скорочень ОВ і ЦВ міометрія інтактних тварин представлені на рис.3.3.



Рис.3.3. Величини тривалості активного стану і частоти скорочень оваріального (ОВ) і цервікального (ЦВ) відділів матки.

Примітка: **- р<0,01 - вірогідність відмінностей величин в ЦВ відносно ОВ матки.

Оригінальний запис фазних скорочень ОВ і ЦВ міометрія представлений на рис.3.4.

Рис. Оригінальний запис фазних скорочень оваріального (А) і цервікального (Б) відділів матки.

Також встановлено різний характер скорочень досліджуваних відділів матки. У ЦВ скоротлива активність має вигляд одиноких фазних скорочень, а в ОВ міометрія вони є більш регулярними і рівномірними як за частотою, так і за амплітудою.

Таким чином, параметри амплітуди, швидкості скорочення і розслаблення та індексу скоротливості є вищими у ЦВ, а тривалість активного стану та частоти скорочень в ОВ матки.

3.2 Скоротливість ОВ і ЦВ матки за умов експериментальної імунокомплексемії

Досліджували зміни скоротливої активності ОВ і ЦВ міометрія за умов довготривалої імунізації мишей зростаючими дозами чужорідного білка - БСА, що відтворює реакцію гіперчутливості ІІІ типу, опосередковану імунними комплексами.

3.2.1 Характеристика моделі експериментальної імунокомплексемії

В дослідженнях спиралися на відтворення імунокомплексного запалення на щурах [47]. В сумісних дослідженнях з співробітниками відділу імунофізіології було адаптовано схему імунізації, терміни введення та дози БСА для мишей лінії СВА та охарактеризовано ефективність застосованого підходу для моделювання системного імунокомплексного процесу за низкою імунологічних методів.

Імунізація призводила до активації клітин як природного, так і адаптивного імунітету. Встановлено значне посилення функціонально-метаболічної активності клітин неспецифічної резистентності. Методом НСТ-тесту виявлено, що кількість формазан-позитивних нейтрофілів периферичної крові мишей збільшується з 25,5±5,9 % в контролі до 63,6±6,9% при введенні БСА (р<0,001, n=8). За умов імунізації індекс активації нейтрофілів зростав до 1,05±0,19 у.о. при 0,34±0,09 в контролі (р<0,01 n=8).

На препаратах крові мишей проводили дослідження катіонних білків нейтрофілів, які є модифікаторами дихальних та ферментативних процесів клітини, медіаторами запалення. За умов введення БСА відбувається збільшення СЦК катіонних білків до 0,27±0,03 при 0,05±0,012 в контролі (р<0,001, n=17), що свідчить про активацію нейтрофільних гранулоцитів.

На клітинах перитоніального ексудату показано посилення фагоцитозу у імунізованих тварин за показниками фагоцитарного індексу (ФІ) - відсотка фагоцитуючих клітин та фагоцитарного числа (ФЧ) Райта - середньої кількості часток латексу, поглинутої однією клітиною. Так, за умов імунізації БСА відбувається збільшення ФІ до 93,3±2,4% при 43,0±3,5% в контролі (р<0,001, n=8), а ФЧ зростало до 11,0±1,0 при 7,7±2,2 в контролі (р<0,01, n=8) - в 2,2 рази і 1,4 рази відповідно.

З метою оцінки стану клітин адаптивного імунітету визначали реакцію гальмування адгезії лімфоцитів (РГАЛ), яка заснована на припиненні адгезії сенсибілізованих лімфоцитів у присутності відповідних антигенів [41]. За умов інкубації з БСА у контрольних мишей посилювалось прилипання до скла клітин лімфовузлів на 10,51% (n=8, розкид від -28,40% до +45,10%). В той же час для суспензії лімфоцитів імунізованих тварин встановлено зменшення кількості адгезованих клітин на 33,61 % (n=8, розкид від -75,0% до -5,5 %, р<0,01 в порівнянні з контролем), що свідчить про активацію специфічних до БСА лімфоцитів.

Оскільки посилення імунних процесів зазвичай призводить до клітинної загибелі (активаційний апоптоз), проводили оцінку життєздатності, апоптозу та некрозу імунокомпетентних клітин (ІКК) методом їх прижиттєвого подвійного забарвлення. За умов імунізації БСА відбувається посилення клітинної загибелі: кількість живих клітин, виділених із лімфовузлів, зменшувалась до 76,9±1,2 в порівнянні з 87,1±1,5 в контролі (р<0,001, n=8), а виділених із тимуса - до 87,6±1,4 при 91,7±0,8 у контролі (р>0,05, n=8). Встановлено збільшення кількості клітин лімфовузлів з ознаками апоптозу з 8,9±3,2 % до 12,9±1,2 % (р<0,01, n=8) та некрозу з 5,0±3,2 % до 9,9±1,2 % у імунізованих тварин в порівнянні з контрольними (р<0,001, n=8). Показано також посилення апоптотичної загибелі клітин тимуса з 5,6±2,1 % до 8,5±1,2 % (р<0,05, n=8).

Оскільки одним з визначальних механізмів вилучення активованих імуноцитів, з метою обмеження імунних реакцій, є Fas-опосередкована їх загибель, визначали рівень експресії Fas-рецептору (CD 95) в клітинах тимусу та лімфовузлів. За умов імунізації БСА збільшується СЦК інтенсивності імуноцитохімічної реакції з моноклональними анти-Fas антитілами, як для клітин тимуса до 0,21±0,06 у.о при 0,06±0,03 у.о. в контролі (р<0,01, n=8), так і для клітин виділених з лімфовузлів до 0,49±0,11 у.о при 0,19±0,05 у.о. в контролі (р<0,05, n=8). Ці дані свідчать про індукцію Fas-опосередкованого апоптозу клітин тимуса і лімфовузлів за умов впливу антигенного стимулу (БСА).

...