Особливості перебігу лімфом із урахуванням поліморфізму генів Tp53, L-myc, CYP2D6, CYP2C19

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА “ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ НАМН УКРАЇНИ”

САЛАХ А.А. АБУШАНАБ

УДК 616.155-006.441-097:575.113

ОСОБЛИВОСТІ ПЕРЕБІГУ ЛІМФОМ ІЗ УРАХУВАННЯМ ПОЛІМОРФІЗМУ ГЕНІВ Tp53, L-myc, CYP2D6, CYP2C19

14.01.31 - гематологія і трансфузіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2016



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Національній медичній академії післядипломної освіти імені. П.Л. Шупика МОЗ України, м. Київ.

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор Видиборець Станіслав Володимирович, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри гематології та трансфузіології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, доцент Сивак Любов Андріївна, Національний інститут раку МОЗ України, завідувач науково-дослідного відділення хіміотерапії солідних пухлин;

доктор біологічних наук, професор Мінченко Жанна Миколаївна, ДУ «Національний науковий центр радіаційної медицини НАМН України», завідувач лабораторії імуногенетики відділу гематології та трансплантології.

Захист відбудеться «28» грудня 2016 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» за адресою: 04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» за адресою: 04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12.

Автореферат розісланий «25» листопада 2016 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Р.П. Павлюк



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Останнім часом у світі спостерігається збільшення захворюваності на неходжкінські лімфоми (НХЛ) (C. K. Bichakjian et al., 2016). Аналогічна тенденція відстежується і в Україні. Так, в 2014 році в Україні було зареєстровано 3,43 випадків захворювання на лімфоми на 100 000 населення, а в 2015 - 3,7 випадків на 100 000 населення (В. Л. Новак та співавт., 2015). Недивлячись на досягнуті позитивні результати в діагностиці та лікуванні НХЛ, що полягають у збільшенні виживання пацієнтів і покращенні якості їх життя, проблема повного виліковування пацієнтів із НХЛ залишається невирішеною, насамперед через развиток рефрактерних форм захворювання і неефективною відповіддю на першу лінію терапії (Л. А. Сивак, С. М. Гайдукова, 2008; E. И. Дорохина и соавт., 2016; K. H. Young et al., 2014). В середньому, тільки 40-60 % пацієнтів досягають повної або часткової ремісії при проведенні першої лінії терапії. Виникнення рефрактерних форм НХЛ внаслідок неефективної відповіді на лікування не тільки суттєво погіршує індивідуальний прогноз пацієнта, але і сприяє нераціональному використанню ліків при наданні медикаментозної медичної допомоги таким пацієнтам. У останні роки стало зрозуміло, що у всіх прогностично несприятливих випадках НХЛ необхідна інтенсифікація поліхіміотерапії (ПХТ), що дозволяло би збільшити тривалість життя пацієнтів (И. А. Крячок и соавт., 2010; Ю. А. Алексеева, 2012; Я. К. Мангасарова и соавт. 2016; D. H. Yoon et al., 2010; A. Younes et al., 2014). Різнорідність НХЛ проявляється не тільки цитологічним, а і генетичним розмаїттям, яке в більшій мірі, ніж цитологічне, відбивається на клінічному перебізі і прогнозі (С. В. Андреева, 2014; Ж. А. Мішаріна, В. В. Вітько, Ж. М. Мінченко та співавт., 2015; И. В. Абраменко и соавт., 2016; О. А. Гаврилина и соавт., 2016; K. K. Wong et al. 2014; Z. Y. Xu-Monette et al., 2015).

Особливо актуальною є проблема своєчасної діагностики і лікування дифузної В-крупноклітинної лімфоми (Д-В-ККЛ), так як вона є найпоширенішим типом НХЛ, а її питома вага, в середньому, складає 30-40 %. Не менш актуальною проблемою для гематологічної клініки є проблема діагностики і лікування лімфом із малих лімфоцитів (ЛМЛ) або хронічного лімфолейкозу (ХЛЛ), особливо у осіб похилого та старечого віку (Л. Д. Гриншпун, А. В. Пивник, 2011-2012; В. П. Поп, 2015; U. Vitolo, A. Chiappella, E. Brusamolino et al., 2011; U. Vitolo, A. Chiappella, A. J. Ferreri et al. 2011; U. Vitolo et al. 2014; T. E. Witzig et al., 2015).

Чисельні дослідження молекулярно-генетичних особливостей Д-В-ККЛ, що були проведені останнім часом, дозволили авторам виявити біологічну різнорідність та виділити декілька генетичних підтипів означеного захворювання, які відрізнялися за перебігом і прогнозом (Е.Н. Воропаева и соавт., 2014; О. А. Гаврилина и соавт., 2015; Е. Н. Воропаева и соавт., 2016; J. N. Winter et al. 2010; M. C. Vegliante et al., 2013: A. Tzankov et al., 2014; H. Tilly et al., 2015; S. E. Trabucco et al., 2015; E. N. Voropaeva, 2015).

Гетерогенність захворювань, що об'єднані в групу Д-В-ККЛ, обумовлює необхідність диференційованого підходу до вибору програми ПХТ відповідно до того, наявні чи відсутні фактори несприятливого прогнозу (И. В. Поддубная, 2007; В. П. Поп, 2015; О. А. Гаврилина и соавт., 2016; C. Thieblemont et al., 2011; C. A. Thompson et al., 2014; G. Thanarajasingam et al., 2016).

У клінічній практиці для вибору препаратів першої лінії терапії Д-В-ККЛ і ЛМЛ застосовують аналіз результатів клініко-гематологічного обстеження і лабораторні тести, але такий підхід не дозволяє прогнозувати вірогідну ефективність лікування у первинних пацієнтів (М. А. Волкова, 2007; О. А. Рукавицын, 2015; R. Sharma et al., 2009; P. J. Stiff et al., 2011; G. X. Sun et al., 2012; J. D. Soumerai et al., 2014; D. W. Scott et al. 2015). Розробка нових підходів до вибору оптимальної програми хіміотерапії першої лінії залишається актуальною. Загальна ефективність препаратів і стандартних схем, що застосовуються при лікуванні Д-В-ККЛ і ЛМЛ, із урахуванням генетичних особливостей пацієнтів вивчена недостатньо (E. И. Дорохина и соавт., 2016; L. H. Sehn et al., 2011; J. M. Schuetz et al., 2013; L. F. Porrata et al., 2014; C. S. Sauter et al., 2014). Цілісна картина з даного питання наразі не сформувалась, що пов'язано зі складністю метаболізму і механізму комплексного впливу цитостатичних препаратів, і наявністю схем лікування, до складу яких входить декілька препаратів (И. А. Крячок и соавт., 2010; Я. К. Мангасарова и соавт., 2016; F. Peyrade et al., 2011; G. S. Nowakowski et al., 2014; G. S. Nowakowski, M. S. Czuczman, 2015; G. S. Nowakowski et al., 2015; F. Offner et al., 2015). Недивлячись на значні успіхи в лікуванні Д-В-ККЛ і ЛМЛ, цілий ряд питань залишаються невирішеними. Застосування ПХТ завжди представляє баланс між протипухлинною активністю і частими клінічно значимими ускладненнями, насамперед, гематологічними (U. Vitolo et al., 2011; L. J. Nastoupil et al., 2012; L. J. Nastoupil, R. Sinha, C. R. Flowers, 2012; N. Mounier et al., 2013; U. Vitolo et al., 2014; Z. Zhou, L. et al., 2014; M. Boi et al., 2015). Важливою проблемою для клініки, як і раніше, залишається подолання токсичних ефектів ПХТ на печінку, нирки, серцевий м'яз. Гепатологічна токсичність і нефротоксичність при застосуванні ПХТ для лікування пацієнтів із НХЛ, також можуть бути неподоланними перешкодами і впливати на показники смертності (J. K. McCloskey et al., 2013; S. Limat et al., 2014; M. J. Maurer et al., 2014; J. Meissner et al., 2014; C. Mamot et al., 2015; M. J. Maurer et al., 2016).

Саме тому, з урахуванням проаналізованої літератури нами відібрані гени - Tp53, L-myc, CYP2D6, CYP2C19, які мають відношення до метаболізму цитостатичних препаратів, які включають до стандартних схем лікування пацієнтів із НХЛ, зокрема, Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Особливості перебігу Д-В-ККЛ і ЛМЛ із урахуванням поліморфізму генів Тр53, L-myc, CYP2D6, CYP2С19 з метою прогнозування перебігу і підвищення ефективності їх лікування (зменшення ризику розвитку токсичних ефектів, відповіді на лікування) на підставі оцінки клініко-лабораторних характеристик і поліморфізму вище перелічених генів раніше комплексно не вивчались.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалося в межах планової тематики науково-дослідних ініціативно-пошукових робіт кафедри гематології та трансфузіології Національної медичної академії післядипломної освіти імені П. Л. Шупика МОЗ України: «Вивчення закономірностей формування і удосконалення методів діагностики, лікування хронічних мієлопроліферативних, лімфопроліферативних захворювань і депресій кровотворення» № державної реєстрації 0110U000320 (терміни виконання 2010-2014 рр.); «Вивчення закономірностей формування і удосконалення методів діагностики, лікування хронічних мієлопроліферативних, лімфопроліферативних захворювань і депресій кровотворення і оптимізація їх лікування та трансфузіологічного забезпечення», № державної реєстрації 0115U002159 (терміни виконання 2015-2019 рр.).

Мета дослідження. Підвищення ефективності прогнозування перебігу і лікування Д-В-ККЛ, ЛМЛ (зменшення ризику розвитку токсичних ефектів, відповіді на лікування) на основі оцінки клініко-лабораторних характеристик і поліморфізму генів CYP2D6*4 (G1934A), CYP2C19*2 (G681A), Тр53 (PIN3 ins 16 bp, C742T), L-myc (T3109G).

Задачі дослідження:

Дослідити та порівняти клініко-лабораторні показники у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ при проведенні ПХТ для оцінки перебігу захворювання.

Співставити клініко-лабораторні параметри у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ залежно від проявів токсичних ефектів при проведенні ПХТ.

Вивчити поширеність поліморфних варіантів генів CYP2D6*4 (G1934A), CYP2C19*2 (G681A) залежно від перебігу захворювань і розвитку токсичних ефектів.

Оцінити вплив поліморфних варіантів гена Тр53 (PIN3 ins 16 bp, C742T) на перебіг Д-В-ККЛ та ЛМЛ і ризики виникнення токсичних ускладнень при проведенні ПХТ.

Охарактеризувати можливі асоціації поліморфних варіантів гена L-myc (T3109G) із особливостями перебігу Д-В-ККЛ і ЛМЛ із ризиком розвитку токсичних ускладнень.

Проаналізувати поєднаний вплив клініко-лабораторних маркерів і генетичного поліморфізму на ризик розвитку токсичних ускладнень при проведенні ПХТ у пацієнтів із Д-В-ККЛ та ЛМЛ.

Об'єкт дослідження. Кров, кістковий мозок пацієнтів із Д-В-ККЛ, ЛМЛ.

Предмет дослідження. Частота та поширеність поліморфних варіантів генів CYP2D6*4 (G1934A), CYP2C19*2 (G681A), Тр53 (PIN3 ins 16 bp, C742T), L-myc (T3109G) у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ різного віку та статі на різних стадіях захворювання, токсичні ускладнення при застосуванні різних терапевтичних засобів ПХТ; клінічний перебіг Д-В-ККЛ і ЛМЛ.

Методи дослідження: клінічні, морфологічні, цитологічні, молекулярно-генетичні, інструментальні (УЗД, МРТ, КТ), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Розширені наукові дані відносно внеску генетичної компоненти у патогенез Д-В-ККЛ і ЛМЛ як факторів генетичної схильності до ризику виникнення токсичних ускладнень при проведенні ПХТ при лікуванні пацієнтів залежно від стадії захворювання, початкових показників кількості тромбоцитів, креатиніну, АЛТ, що дозволило рекомендувати їх як прогностичні маркери.

Установлено, що токсичні ускладнення не були взаємопов'язані з ефективністю ПХТ.

Уперше проведено аналіз поліморфних варіантів генів цитохромоксидаз залежно від наявності токсичних ефектів у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Виявлено вплив генотипів 1934GA і 1934AA на виникнення ризику токсичних ускладнень, а наявність генотипу 1934GG - зменшував даний ризик. Установлено, що генотип 1934GA збільшував ризик виникнення гематологічної токсичності майже в чотири рази, а генотип 1934GG - зменшував ризик розвитку гематологічної токсичності.

Продемонстровано, що комбінації генотипів по гену CYP2D6*4 і гену CYP2C19*2 модифікували ризик розвитку токсичних ефектів. Комбінація генотипів 1934GG+681GG зменшувала ризик розвитку гематологічної токсичності, а комбінація генотипів 1934GA+681GG, навпаки, збільшувала такий ризик.

Доповнено дані щодо ролі мутацій в гені Tp53 у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Установлено, що у пацієнтів із означеними мутаціями, частіше спостерігалися екстранодальні вогнища, в процес залучалось більше двох груп лімфовузлів, у них був знижений показник рівня гемоглобіну і підвищений рівень креатиніну в період маніфестації захворювання. Виявлено, що на ризик розвитку токсичних ускладнень і відповідь на лікування поліморфізм даного гена не впливав.

Визначено асоціативний зв'язок ризику виникнення токсичних ускладнень з носійством комбінацій генів16 ins/dup+1934GG по генах Тр53 (PIN3 ins 16 bp) і CYP2D6*4 (G1934A).

У пацієнтів із токсичними ускладненнями була підвищена частота поширення комбінації генотипів 16 ins/dup+1934GG по генах Тр53 (PIN3 ins 16 bp) і CYP2D6*4 (G1934A). Вперше продемонстровано, що ризик розвитку нефрологічної токсичності асоціювався з 3109GG генотипом по гену L-myc, і з генотипами 3109TG+3109GG. Для розширення уявлень про ризики розвитку токсичних ускладнень у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ вперше було проаналізовані моделі ген-генної, ген-факторної взаємодії. Найдостовірнішою моделлю ризику розвитку гематологічної токсичності виявилась трьохкомпонентна, що включала поліморфізм гена CYP2D6*4, середній рівень тромбоцитів і ЛДГ в період маніфестації захворювання. Едина достовірна модель ризику розвитку гепатологічної токсичності містила три компоненти поліморфізм гена CYP2D6*4, АЛТ, ЛДГ. Установлено також, що достовірними моделями ризику розвитку нефрологічної токсичності були однокомпонентна (ген L-myc) і трьохкомпонентна, що включала поліморфізм гена L-myc, стадію захворювання і ЛДГ, яка відрізнялась більшою точністю. Продемонстровано, що при всіх перелічених моделях ризику розвитку нефрологічної токсичності, збільшення числа локусів підвищувало точність отриманих результатів.

Практичне значення отриманих результатів. У роботі представлені дані, що можуть бути використані для прогнозування виникнення токсичних ефектів у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ при проведенні стандартних курсів ПХТ.

Запропоновано прогностичні критерії виникнення гематологічної, гепатологічної та нефрологічної токсичності залежно від поєднання генів Тр53, L-myc, CYP2D6, CYP2C19 у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ.

Значення роботи полягає також в тому, що її результати розширюють уявлення про асоціативний зв'язок комбінацій генотипів по гену CYP2D6*4 і гену CYP2C19*2 на виникнення токсичності при проведенні ПХТ у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Встановлені ризики виникнення гематологічної, гепатологічної і нефрологічної токсичності залежно від комбінації генів Тр53, L-myc, CYP2D6, CYP2C19 рекомендовано враховувати в практичній роботі. Врахування генотипу пацієнтів по комбінації генів Тр53, L-myc, CYP2D6, CYP2C19 дозволить, окрім прогнозування вірогідності виникнення токсичних ускладнень, оцінювати резерви КМ для можливості проведення ПХТ у випадках рецидиву захворювання.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто визначено актуальність теми, вибрані та виконані дослідження - клінічний огляд хворих, взяття матеріалу, цитологічний аналіз мазків периферичної крові та КМ, проведено інтерпретацію результатів лабораторних та інструментальних методів обстеження, сформульовано завдання, відібрані клінічні групи хворих, здійснена клінічна оцінка результатів молекулярно-генетичних обстежень, комплексний аналіз отриманих даних, розроблено в співавторстві та впроваджено в роботу гематологічного відділення методику прогнозування виникнення токсичних ускладнень у пацієнтів з урахуванням поліморфізму генів. Особисто провів статистичне опрацювання результатів досліджень, разом з науковим керівником сформулював висновки та практичні рекомендації. Автор висловлює вдячність співробітникам відділення гематології (зав. - к. мед. н., доцент Гартовська І. Р.) комунального підприємства Київської обласної ради «Київський обласний онкологічний диспансер» (головний лікар - к. мед. н., доцент Ременнік О. І.) і «Референс - центру з молекулярної діагностики Міністерства охорони здоров'я України» (зав. - к. мед. н. - Россоха З. І.) за допомогу в проведенні клінічних і молекулярно-генетичних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на міжнародних та вітчизняних наукових форумах. Зокрема, вони були викладені на: ІV міжнародному медичному конгресі «Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоров'я України» (Київ, 15-17 квітня 2015 року); V ювілейному міжнародному медичному конгресі «Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоров'я України» (Київ, 19-21 квітня 2016 року); ХІІІ з'їзді онкологів та радіологів України (26-28 травня 2016 року); науково-практичних конференціях з міжнародною участю: «Нове у медицині сучасного світу» (Львів, 27-28 листопада 2015 року), «Актуальні питання медичної теорії і практики» (Дніпропетровськ, 11-12 грудня 2015 року), «Сучасні проблеми світової медицини та її роль у забезпеченні здоров'я світового співтовариства» (Одеса, 19-20 лютого 2016 року); «Нове та традиційне у дослідженнях сучасних представників медичної науки» (Львів, 26-27 лютого 2016 року).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 15 друкованих праць: 7 статей (з них 4 - міжнародні публікації в наукометричних журналах, 3 - у фахових виданнях, рекомендованих ДАК України), 8 тез доповідей на конгресах, з'їздах і конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 139 сторінках принтерного тексту (113 сторінок основного тексту) та складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалу і методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел літератури, який містить 27 вітчизняних та 186 іноземних першоджерел. Робота ілюстрована 33 таблицями, 7 рисунками, 4 клінічними прикладами.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

лімфома поліхіміотерапія ген

Матеріали та методи дослідження. Обстежено 70 пацієнтів із Д-В-ККЛ і 51 пацієнт із ЛМЛ. Критеріям включення до дослідження відповідали 34 пацієнти з Д-В-ККЛ і 29 пацієнтів із ЛМЛ (табл. 1).

Таблиця 1 - Структура обстежених пацієнтів із Д-В-ККЛ та ЛМЛ залежно від віку та статі

Стать, вік	Пацієнти із Д-В-ККЛ (n=34)	Пацієнти із ЛМЛ (n=29)
Стать: чоловіки жінки	22 (64,71 %) 12 (34,29 %)	19 (65,52 %) 10 (34,48 %)
до 50 років	(7) чоловіки - 4, жінки - 3	(2) чоловіки - 2, жінки - 0
50 - 60 років	(9) чоловіки - 6, жінки - 3	(7) чоловіки - 5, жінки - 2
старше 60 років	(18) чоловіки - 12, жінки - 6	(20) чоловіки - 12, жінки - 8

Всім пацієнтам діагноз було встановлено на підставі критеріїв класифікації пухлин кровотворної і лімфоїдної тканин ВООЗ (2008). Для проведення запланованого наукового дослідження із впливу генетичного поліморфізму на ризик розвитку токсичних ефектів були визначені критерії включення для пацієнтів - відсутність ВІЛ-інфікування, а також попередніх, до початку лікування, захворювань внутрішніх органів і органної недостатності (кардіальної, легеневої, печінкової і ниркової), зниження кількості лейкоцитів, що потребувало змін числа і тривалості курсів ПХТ, особливо для пацієнтів старшого віку. Контрольну групу для оцінки лабораторних параметрів склали 25 первинних донорів станції переливання крові Південно-Західної залізниці.

У обстеженій групі домінували пацієнти вікової групи, що старші 60 років. Аналізувалися вікові, статеві, загально-клінічні (спадковий анамнез, конституційні симптоми, динаміка змін загального аналізу крові з лейкоцитарною формулою, пальпаторні відхилення, наявність ускладнень), а також дані інструментальних обстежень внутрішніх органів (УЗД, МРТ, КТ). Появу клінічних ознак гематологічної і не гематологічної токсичності визначали відповідно до змін клініко-лабораторних показників впродовж перших чотирьох курсів ПХТ. За їх результатами пацієнтів об'єднували для статистичного аналізу в підгрупи за принципом наявності або повної відсутності токсичних проявів і/або виду токсичних ускладнень, а також їх загальної кількості.

При проведенні порівняльного аналізу стану кровотворної системи до призначення ПХТ і після її закінчення за даними загального аналізу крові оцінювали показник концентрації гемоглобіну, число нейтрофілів, лімфоцитів і тромбоцитів.

В пунктаті КМ досліджували клітинність аспірату, число бластних клітин, сумарну кількість клітин еритроїдного, гранулоцитарного, мегакаріоцитарного паростків, їх співвідношення, виразність дисплазії в трьох паростках кровотворення (за критеріями МДС ВООЗ (2008)).

При гістологічному дослідженні трепанобіоптатів визначали клітинність КМ, величину еритроїдного гранулоцитарного і мегакаріоцитарного паростків кровотворення, їх співвідношення, оцінювали ступінь дозрівання основних ліній мієлопоеза, уточнювали ознаки дисплазії еритроїдного і мегакаріоцитарного паростків, їх локалізацію. При оцінці вторинних змін строми визначали перебудову структури кісткових балок, вогнищеву резорбцію кістки, ступінь набряку, крововиливи в стромі і розширення синусів, лімфоїдну дифузну, інтерстиціальну, нодулярну інфільтрацію. Наявність однієї - двох ознак умовно вважали як помірні зміни строми, а більше трьох - виразними вторинними змінами строми.

За ознаки мієлотоксичності враховували гіпоклітинність КМ, що вперше з'явилася, звуження еритроїдного, мегакаріоцитарного і гранулоцитарного паростків, ознаки дисплазії в означених паростках, а також вторинні зміни строми. Випадки змін мієлопоезу, що початково мали місце і зберігалися після ПХТ або були відсутні після ПХТ - не враховували.

Для верифікації діагнозу Д-В-ККЛ використовували загально уживані діагностичні маркери, що властиві для даного захворювання - імунофенотип CD20+, CD45+, CD3-; маркери отримані при гістохімічному дослідженні - СD20 (L26/Pan B), CD3, CD5, CD10, bcl-2, bcl-6, MIB1 (Ki-67), MUM1; маркери отримані при цитофлуориметричному аналізі - kappa/lambda, CD45, CD3, CD5, CD19, CD10, CD20. В окремих випадках додатково враховували результати цитогенетичного/FISH аналізу для виявлення транслокацій t(14;18), t(3;v), t(8;14) і молекулярно-генетичного аналізу - для реаранжирування генів антигенного рецептора bcl-1, bcl-2, с-myc.

Для підтвердження діагнозу ЛМЛ проводили біопсію лімфовузла. Поверхневі клітинні маркери для цитофлуориметричних досліджень включали каппа/лямбда, CD19, CD20, CD5, CD23, CD10. Для встановлення діагнозу додатково, при можливості, оцінювали циклін D1 або наявність t(11;14) для виключення лімфоми з клітин мантії. В окремих випадках проводили імуногістохімічне дослідження парафінових зрізів. Рекомендована імуногістохімічна панель включала CD3, CD5, CD10, CD20, CD23 і циклін D1.

Типовий імунофенотип ХЛЛ/ЛМЛ - CD5+, CD10-, CD19+, CD20-, слабо позитивний поверхневий імуноглобулін, CD23+, CD43+/- і циклін D1/+.

Ознаки мієлотоксичності, гепатотоксичності та нефротоксичнсті оцінювали згідно рекомендацій (CTCAE, 2009), а лікування пацієнтів проводили згідно протоколів (наказ МОЗ України № 647 від 30.07.2010 року Про затвердження протоколів надання медичної допомоги хворим зі спеціальності «Гематологія»).

Дослідження виконували спільно із співробітниками гематологічного відділення КЗ КОР «Київський обласний онкологічний диспансер».

Взяття периферичної крові проводили в моновети об'ємом 2,7 мл із розчином калієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти в якості антикоагулянту («Sarstedt», Німеччина). Геномну ДНК для молекулярно-генетичного дослідження виділяли із лейкоцитів периферичної крові за допомогою комерційної тест-системи «ДНК-сорб-В». До цільної крові додавали розчин, що викликає лізис, і сорбент на силікогелі. Після лізису, відмивали зразки розчинами для відмивання № 1 і № 2 відповідно до інструкції. Для елюції ДНК із сорбента додавали ТЕ-буфер. Отриманий супернатант, що містив очищену ДНК, використовували для проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Для визначення поліморфізмів: T3109G (rs3134613) (дослідження проводили за I. Yaylim-Eraltan et al., 2008); в гені L-myc, C742T (Arg248Trp; rs121912651) (дослідження проводили за L. Ouyang et al., 2009); PIN3 ins 16 bp (rs17878362) (дослідження проводили за Wu X. et al., 2002); в гені Tp53; G1934A (rs3892097) (дослідження проводили за Matthew A. Brown et al., 2000); в гені CYP2D6*4; G681A (rs4244285) (дослідження проводили за Xian-E. Peng et al., 2015) в гені CYP2C19*2 використовували модифіковані протоколи із застосуванням методу ПЛР. Поліморфні варіанти генів L-myc (T3109G), Tp53 (C742T), CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) аналізували, використовуючи після ПЛР подальший аналіз поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (ПЛР-ПДРФ). Специфічні фрагменти досліджуваних поліморфізмів ампліфікували із використанням комерційного набору DreamTaq Green PCR Master Mix (фірми «Thermo Scientific», США), дотримуючись умов проведення реакції (табл. 2).

Таблиця 2 - Режими ампліфікації фрагментів ДНК

Ген (мутація)	Етап	Температура	Час	Кількість циклів
L-myc (T3109G)	Передплавлення	950С	2 хв.	X 30
	Плавлення	950С	30 с
	Випалювання	550С	30 с
	Синтез	720С	30 с
	Пролонгація синтезу	720С	2 хв.
Tp53 (C742T)	Передплавлення	940С	1 хв.	X 30
	Плавлення	940С	30 с
	Випалювання	640С	30 с
	Синтез	720С	30 с
	Пролонгація синтезу	720С	2 хв.
Tp53 (PIN3 ins 16 bp)	Передплавлення	950С	1 хв.	X 30
	Плавлення	950С	30 с
	Випалювання	550С	30 с
	Синтез	720С	30 с
	Пролонгація синтезу	720С	2 хв.
CYP2D6*4 (G1934A)	Передплавлення	940С	2 хв.	X 35
	Плавлення	940С	30 с
	Випалювання	600С	30 с
	Синтез	720С	30 с
	Пролонгація синтезу	720С	1 хв.
CYP2C19*2(G681A)	Передплавлення	940С	2 хв.	X 40
	Плавлення	940С	20 с
	Випалювання	540С	20 с
	Синтез	720С	20 с
	Пролонгація синтезу	720С	2 хв.

Продукти ампліфікації фрагментів ДНК генів L-myc (T3109G), Tp53 (C742T), CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) підлягали гідролітичному розщепленню за допомогою ендонуклеаз рестрикції (табл. 3).

Таблиця 3 - Аналіз ПДРФ досліджуваних поліморфізмів

Ген	Поліморфізм	Ендонуклеаза рестрикції	Розмір рестрикційних фрагментів
L-myc	T3109G	Фермент EcoRI	Генотип TT: 139 и 128 п.н. Генотип TG: 267,139 и 128 п.н. Генотип GG: 267 п.н.
Tp53	C742T	Фермент MspI	Генотип CC: 290, 220 и 170 п.н. Генотип CT:460, 290, 220 и 170 п.н. Генотип TT: 460 и 220 п.н.
CYP2D6*4	G1934A	Фермент MvaI	Генотип GG: 183, 161 и 77 п.н. Генотип GA: 344, 183, 161 и 77 п.н. Генотип AA: 344 и 77 п.н.
CYP2C19*2	G681A	Фермент SmaI	Генотип GG: 118 и 49 п.н. Генотип GA: 167, 118 и 49 п.н. Генотип AA: 167 п.н.



Після гідролітичного розщеплення продуктів ампліфікації гена L-myc (T3109G) фрагменти ДНК із молекулярною масою 139 п.н. і 128 п.н. відповідали генотипу TT, з молекулярною масою 267 п.н., 139 п.н. і 128 п.н. - генотипу ТG, а з молекулярною масою 267 п.н. - генотипу GG (рис.1).

Рис. 1 - Електрофореграма продуктів рестрикційного аналізу поліморфізму гена L-myc (T3109G): 1 - маркер молекулярної маси, зразки 2, 4-5 - генотип TT, зразки 3, 6-7, 9-14, 16-17 - генотип ТG, зразки 8, 15 - генотип GG

Фрагменти ДНК після гідролитичного розщеплення із молекулярною масою 290 п.н., 220 п.н. і 170 п.н. відповідали генотипу СС, а з молекулярною масою 460 п.н. і 220 п.н. - генотипу ТT гена Tp53 (C742T) (рис. 2).

Рис. 2 - Електрофореграма продуктів рестрикційного аналізу поліморфізму гена Tp53 (C742T): зразки 1-6, 8-16 - генотип СС, зразок 7 - генотип ТТ, 17 - маркер молекулярної маси

Рестрикційні фрагменти ДНК гена CYP2D6*4 (G1934A) із молекулярною масою 183 п.н., 161 п.н. і 77 п.н. відповідали генотипу GG, із молекулярною масою 344 п.н. і 77 п.н. - генотипу AA, а з молекулярною масою 344 п.н., 183 п.н., 161 п.н. і 77 п.н. - генотипу GA (рис. 3).

Рис. 3 - Електрофореграма продуктів рестрикційного аналізу поліморфізму гена CYP2D6*4 (G1934A): зразки 1, 10, 13 - генотип GA, зразки 2-4, 6-9, 11-12, 14-15 - генотип GG, зразок 5 - генотип AA, 16 - маркер молекулярної маси

Фрагменти ДНК після гідролітичного розщеплення з молекулярною масою 118 п.н. і 49 п.н. відповідали генотипу GG, а з молекулярною масою 167 п.н. - генотипу AA гена CYP2C19*2 (G681A) (рис. 4).

Рис. 4 - Електрофореграма продуктів рестрикційного аналізу поліморфізму гена CYP2C19*2 (G681A): 1 - маркер молекулярної маси, зразки 3, 5-6, 8-10, 12-16 - генотип GG, зразки 4, 7, 17, 19 - генотип GA, зразки 2, 18 - генотип AA

Ампліфіковані фрагменти ДНК із молекулярною масою 196 п.н. відповідали наявності інсерції PIN3 ins 16 bp, а з молекулярною масою 180 п.н. - відсутності даної інсерції в гені Tp53. Стан ампліфікованих фрагментів поліморфізму PIN3 ins 16 bp гена Tp53 аналізували в 3 % агарозному гелі (агароза фірми «Thermo Scientific», США), із додаванням бромистого етидію, маркера молекулярної маси GeneRuler 50 bp DNA Ladder («Thermo Scientific», США) і подальшою візуалізацією в транілюмінаторі і комп'ютерною обробкою (рис. 5).



Рис. 5 - Електрофореграма розподілу ампліфікованих фрагментів гена Tp53 (PIN3 ins 16 bp) в 3 % агарозному гелі: 1 - маркер молекулярної маси; зразки 2, 4-5, 8, 10, 13-15 - інсерція 16 п.н. не виявлена; зразки 3, 6-7, 9, 11-12 - інсерція 16 п.н. виявлена в гетерозиготному стані

Дані, отримані в результаті досліджень, були опрацьовані з використанням параметричних і непараметричних методів варіаційної статистики. Статистичні розрахунки проводили з використанням комп'ютерних програм Microsoft Excel 2007 та Statistica 6.0 (США).

Результати власних досліджень, їх аналіз та узагальнення.

Клінічні особливості перебігу дифузних В-крупноклятинних лімфом і лімфом із малих лімфоцитів.

У клінічній картині Д-В-ККЛ і ЛМЛ найчастішими симптомами були слабкість, втомлюваність, порушення працездатності, нічна пітливість, зниження маси тіла, свербіж шкіри, збільшення розмірів лімфатичних вузлів, селезінки, яке виявлено у всіх хворих на час включення в дослідження. Слід відмітити, що для маніфестації ЛМЛ було характерно генералізоване збільшення лімфатичних вузлів, в той час як Д-В-ККЛ частіше локальними лімфаденопатіями, які поєднувалися із ураженням внутрішніх органів.

Вплив поліморфізму генів CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) на ризик розвитку гематологічної і негематологічної токсичності у пацієнтів із Д-В-ККЛ.

Появу клінічних ознак гематологічної і не гематологічної токсичності у хворих на Д-В-ККЛ визначали впродовж перших чотирьох курсів ПХТ на основі стандартних критеріїв (СТСАЕ, 2009). Всім хворим було проведено генетичне тестування поліморфних варіантів генів CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) у співставленні з проявами означених ускладнень - мієло-, гепато- та нефротоксичності. Встановлено значимо підвищену поширеність генотипу 1934GA по гену CYP2D6*4 (табл. 4).

Таблиця 4 - Частота поліморфних варіантів генів CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) залежно від наявності токсичних ефектів

Наявність проявлення	CYP2D6*4 (G1934A)	CYP2C19*2 (G681A)
	GG	%	GA	%	AA	%	GG	%	GA	%	AA	%
Було (n=42)	25	59,52	15	35,71	2	4,76	28	66,67	13	30,95	1	2,38
Не було (n=21)	18	85,71	2	9,52	1	5,00	14	66,67	6	28,57	1	4,76

Отримані дані свідчать, що ризик появлення досліджених токсичних ефектів збільшується більш ніж в 5 разів при носійстві генотипу 1934GA (ч2=4,87, p=0,027, OR=5,28, 95 % СI (1,08-25,83)), що дозволило віднести його до прогностичних критеріїв ризику виникнення ускладнень даного типу. В той же час генотип 1934GG по даному гену, частіше ідентифікований за відсутністю токсичних ефектів, мав проективну функцію відносно розвитку будь якого виду токсичності (ч2=4,43, p=0,035, OR=0,25, 95 % СI (0,06-0,96)).

Частоту розподілу комбінацій генотипів за генами CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) та проявів токсичних ефектів у обстежених нами пацієнтів наводимо на рис. 6.

Рис. 6 - Частота розподілу комбінацій генотипів за генами CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) залежно від наявності токсичних ефектів

Дослідження моделей успадкування для ризику розвитку токсичних ефектів у обстежених хворих було проведено у зв'язку із необхідністю оцінки впливу генотипу 1934АА. Як видно із наведених вище даних, індекс Аікайке був найкращим для домінантної моделі успадкування (AIC=13,08; OR=4,08; 95 % СI (1,15-19,36)), тобто установлено, що ризик розвитку токсичних ефектів збільшувався і при наявності у пацієнтів генотипу 1934АА по гену CYP2D6*4.

Згідно отриманим даним (табл. 5), за критерієм Аікайке, ризик розвитку гематологічної токсичності зростав в 5 разів при домінантній моделі успадкування, тобто, у пацієнтів із генотипами 1934GA або 1934AA по гену Cyp2D6*4 (ч2=4,06, p=0,044, OR=5,14; 95 % СI (1,33-25,9)). Виявлені за допомогою додаткового статистичного аналізу відмінності вказують на те, що носії мутантних алелей (в гомозиготному або гетерозиготному стані, у яких знижена ферментативна активність, знаходяться в групі підвищеного ризику і потребують профілактичних заходів.

Таблиця 5 - Асоціація домінантної моделі успадкування по гену Cyp2D6*4 із розвитком гематологічної токсичності у пацієнтів після курсів ПХТ

Генотип	гематологічної токсичності не було (n=21)	гематологічна токсичність була (n=26)	СШ	p-value	AIC
1934GG	18 (85,7 %)	14 (53,8 %)	1,00
1934GA+1934AA	3 (14,3 %)	12 (46,2 %)	5,14 (1,33-25,9)	0,03	12,35

Аналіз поліморфних варіантів гена Тр53 для прогнозу ризику виникнення токсичних ускладнень при лікуванні пацієнтів з неходжкінськими лімфомами.

В табл. 6 представлені результати поширення вивчених нами генотипів по поліморфними варіантам гена Tp53 у хворих із Д-В-ККЛ і ЛМЛ.



Таблиця 6 - Частота поліморфних варіантів гена Tp53 в групах порівняння

Ген /Поліморфізм	Гено- тип	Групи порівняння	Значимість відмінностей
		Пацієнти із Д-В-ККЛ (n=34)	Пацієнти із ЛМЛ (n=29)	ч2	p	OR	95 % CI
Tp53 (PIN3 ins 16 bp)	dup	10 (29,41 %)	9 (31,03 %)	0,02	0,892	1,08	0,37-3,18
	ins	24 (70,59 %)	20 (68,97 %)	0,02	0,892	0,93	0,31-2,72
Tp53 (C742T)	CC	34 (100 %)	28 (96,55 %)	0,01	0,936
	CT	0 (0,00 %)	0 (0,00 %)
	TT	0 (0,00 %)	1 (3,45 %)

При проведені порівняльного аналізу поліморфних варіантів гена Тр53 у хворих на Д-В-ККЛ і ЛМЛ значимих відмінностей у поширенням досліджених генотипів не встановлено (ч2=0,46, p=0,497, OR=0,58 (0,19-1,76)).

Таким чином, нами проведено аналіз впливу поліморфних варіантів гена Тр53 (PIN3 ins 16 bp (rs17878362); C742T (rs121912651)) на ризик розвитку гематологічної і негематологічної токсичності при проведенні ПХТ у хворих із Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Комбінація генотипів 16 ins/dup по гену Тр53 із генотипом 1934GG по гену CYP2D6*4 у обстежених пацієнтів значимо зменшувала ризик розвитку токсичних ефектів при проведенні ПХТ. Як видно із викладеного вище, мутаційний статус гена Тр53 впливав на окремі клініко-лабораторні показники перед початком лікування.

Дослідження поліморфізму гена L-myc (T3109G) у прогнозуванні ризику виникнення токсичних гематологічних і не гематологічних ускладнень ускладнень при лікування пацієнтів з неходжкінськими лімфомами.

Проведеними дослідженнями із впливу поліморфних варіантів гена L-myc (T3109G) на ризик розвитку гематологічної і не гематологічної токсичності при проведенні ПХТ при Д-В-ККЛ і ЛМЛ установлено, що сумарна частота виявлення клінічних випадків гематологічної і негематологічної токсичності не відрізнялась у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ, і не асоціювалась із поліморфізмом досліджуваного гена. Поліморфізм гена L-myc (T3109G) визначав поширеність пухлинного процесу, ризик розвитку II-IV стадії захворювання у пацієнтів, які частіше виявляли при генотипах 3109ТG и 3109GG.

Оцінка клініко-лабораторних показників і генетичних маркерів у прогнозуванні токсичних ускладнень при лікуванні пацієнтів з неходжкінськими лімфомами.

При проведенні попереднього аналізу ми встановили, що генотипи 1934GА і 1934АА по гену CYP2D6*4 асоціювалися із підвищеним ризиком розвитку токсичних ефектів при проведенні ПХТ у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Ризик розвитку токсичних ефектів зростав при наявності у пацієнтів генотипів 1934GА і 1934АА по гену CYP2D6*4 майже в 5 разів, а генотип 1934GG по цьому гену зменшував ризик токсичних ефектів. Генотипи 1934GА і 1934АА по гену CYP2D6*4 асоціювалися також із п'ятикратним зростанням ризику виникнення гематологічної токсичності, а генотип 1934GG по даному гену знижував ризик токсичних ефектів. Комбінація генотипів 1934GG+681GG по генах CYP2D6*4 і CYP2C19*2 значимо знижувала ризик розвитку гематологічної токсичності у обстежених нами пацієнтів.

Найкращою моделлю для ризику розвитку токсичності, за нашими даними, була трьохкомпонентна модель, що включала CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ, яка враховувала для прогнозу поєднаний аналіз поліморфізму гена CYP2D6*4 (G1934A), кількості тромбоцитів і ЛДГ до початку лікування указана модель мала 100 % відтворюваність і прогностичну цінність 82,58 %.

Найкращою моделлю для ризику розвитку гематологічної токсичності була трьохкомпонентна модель, що включала CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ, кількості тромбоцитів і ЛДГ до початку лікування. Означена трьохкомпонентна модель мала 100 % відтворюваність і прогностичну цінність 82,58 % (табл. 7).

Таблиця 7 - Моделі ген-генної і ген-факторної взаємодії в прогнозуванні ризику розвитку гематологічної токсичності у хворих НХЛ при проведенні ПХТ

Число показників в моделі	Комбінації показників в прогностичній моделі	Відтворюваність моделі	Точність моделі, %
1*	CYP2D6*4 (G1934A)	10/10	78,73 %
2	CYP2D6*4 (G1934A) / Тр53 (PIN3 ins 16 bp)	6/10	59,57 %
3*	CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ	10/10	84,78 %
4	CYP2D6*4 (G1934A) / ЛДГ / креатинін / АЛТ	6/10	54,85 %

Примітка. * - достовірна модель з найкращою прогностичною цінністю.

Отримані дані явились підґрунтям для розробки моделі ген-генної і ген-факторної взаємодії в ризику виникнення нефрологічної токсичності у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ при проведенні ПХТ (табл. 8).

Нефрологічна токсичність, виходячи із даних аналізу ген-генної і ген-факторної взаємодії, зв'язана із прогресією пухлинного процесу і поліморфізмом по гену L-myc (T3109G), що представлено в достовірній трьохкомпонентній моделі - L-myc (T3109G) / стадія захворювання / ЛДГ. Відтворюваність і прогностична цінність представленої моделі становлять 90 % і 72,56 % відповідно.

Таблиця 8 - Моделі ген-генної і ген-факторної взаємодії в ризику виникнення нефрологічної токсичності у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ при проведенні ПХТ

Число показників в моделі	Комбінації показників в прогностичній моделі	Відтворюваність моделі	Точність моделі, %
1*	L-myc (T3109G)	9/10	68,54 %
2	L-myc (T3109G) / стадія захворювання	8/10	63,38 %
3*	L-myc (T3109G) / стадія захворювання / ЛДГ	9/10	72,56 %
4	L-myc (T3109G) / стадія захворювання / ЛДГ / втрата маси тіла	6/10	52,74 %

Примітка. * - достовірна модель із найкращою прогностичною цінністю.

Аналіз ген-генної і ген-факторної взаємодії в ризику розвитку гепатологічної токсичності виявився найменш ефективним, а єдина виявлена трьохкомпонентна модель CYP2D6*4 (G1934A) / АЛТ / ЛДГ не відрізнялась високою прогностичною точністю (64,86 %).

Аналіз і обговорення результатів дослідження.

Таким чином, нами проаналізовані моделі ген-генної і ген-факторної взаємодії у виникненні ризику розвитку токсичних ефектів (гематологічних, гепатологічних і нефрологічних) при проведенні ПХТ у пацієнтів з Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Визначені достовірні прогностичні моделі ризику розвитку токсичних ефектів.

Проведено аналіз асоціативного зв'язку поліморфізму гена L-myc (T3109G) на ризик розвитку гематологічної і не гематологічної токсичності при проведенні поліхіміотерапії у пацієнтів з Д-В-ККЛ і ЛМЛ. Виявлено асоціацію генотипів 3109ТG і 3109GG по гену L-myc із підвищенням ризику розвитку нефрологічної токсичності. Поліморфізм гена L-myc (T3109G) у пацієнтів впливав на поширеність пухлинного процесу, ризик розвитку II-IV стадії захворювання, які частіше виявляли у пацієнтів із генотипами 3109ТG і 3109GG. А наявність у пацієнтів генотипу 3109GG, очевидно обумовлювала втрату маси тіла у пацієнтів і мала вплив на підвищення кількості лейкоцитів у період маніфестації захворювання, перед проведенням курсів ПХТ.

Проаналізовано асоціативний зв'язок поліморфізму генів CYP2D6*4 (G1934A) і CYP2C19*2 (G681A) на ризик розвитку гематологічної і не гематологічної токсичності у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ для оцінки їх перспективного використання як прогностичних маркерів. Виявлено асоціативний зв'язок носійства гена CYP2D6*4 із підвищеним ризиком розвитку токсичних ефектів при проведенні курсів ПХТ у пацієнтів. Ризик розвитку токсичних ефектів зростав при наявності у пацієнтів генотипів 1934GА і 1934АА по гену CYP2D6*4 майже в 5 разів, а генотип 1934GG по цьому гену знижував ризик виникнення токсичних ефектів. Несприятливі поліморфні варіанти гену CYP2D6*4 асоціювалися з п'ятикратним зростанням ризику гематологічної токсичності, а поширений геномний поліморфний варіант 1934GG по даному гену зменшував ризик виникнення токсичних ефектів. Комбінація генотипів 1934GG+681GG по генах CYP2D6*4 і CYP2C19*2 значимо знижувала ризик розвитку гематологічних токсичних ефектів у обстежених пацієнтів, а комбінація генотипів 1934GA+681GG за вказаними генами збільшувала такий ризик майже в 9 разів. Аналіз поліморфізму гена CYP2D6*4 може бути рекомендовано в клінічній практиці для прогнозування гематологічної токсичності.

Проведено аналіз впливу поліморфних варіантів гену Тр53 (PIN3 ins 16 bp (rs17878362); C742T (rs121912651)) на ризик розвитку гематологічної і не гематологічної токсичності при проведенні ПХТ у пацієнтів із Д-В-ККЛ і ЛМЛ.

Комбінація генотипів 16 ins/dup по гену Тр53 із генотипом 1934GG по гену CYP2D6*4 у обстежених пацієнтів значимо знижувала ризик розвитку токсичних ефектів при проведенні ПХТ, що склало підставу до віднесення даного комплексу параметрів до прогностично сприятливих критеріїв перебігу захворювання.

Нами було показано, що протестовані гени мали значимий вплив на окремі клініко-лабораторні показники перед початком лікування у обстежених пацієнтів і прогресію пухлинного процесу, що указало на необхідність у проведенні поєднаного аналізу означених показників і результатів генетичного тестування.

Таким чином, на основі аналізу ген-генної і ген-факторної взаємодії нами побудовані прогностичні моделі ризику розвитку токсичних ускладнень (CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ), ризику розвитку гематологічної (CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ), гепатологічної (CYP2D6*4 (G1934A) / АЛТ / ЛДГ), а також нефрологічної токсичності (L-myc (T3109G) / стадія захворювання / ЛДГ) у пацієнтів із Д-В-ККЛ, що дозволить застосовувати їх в клінічній практиці.



ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі на підставі поєднаного аналізу клініко-лабораторних показників і вивчення генетичного поліморфізму генів CYP2D6*4 (G1934A), CYP2C19*2 (G681A), Тр53 (PIN3 ins 16 bp, C742T), L-myc (T3109G) проведено теоретичне узагальнення та нове вирішення науково-практичної задачі - підвищення ефективності прогнозування виникнення токсичних ускладнень (гематологічної і не гематологічної токсичності) у пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами і лімфомами із малих лімфоцитів при проведенні поліхіміотерапії.

Частота виникнення токсичних ускладнень при проведенні поліхіміотерапії у пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами була наступною: гематологічні токсичні ускладнення мали місце у 50,00 % пацієнтів, гепатотоксичність спостерігали у 29,41 %, а нефротоксичність - у 38,24 %. Для пацієнтів із ЛМЛ аналогічні показники, відповідно, були наступними: 31,03 %, 20,69 % та 31,03 %, і достовірно не відрізнялися (p>0,05).

Доведено, що прогностичними клініко-лабораторними маркерами ризику виникнення і розвитку токсичних ускладнень у пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами є: IV стадія захворювання, середні значення показника кількості тромбоцитів (230,63 ± 10,43)·109/л в периферичній крові, креатиніну (110,56 ± 9,87) мкмоль/л і АЛТ (32,10 ± 5,16) од/л в плазмі крові. Достовірних відмінностей з аналогічними показниками у пацієнтів із ЛМЛ нами не виявлено (p>0,05).

Показано, що ризик розвитку токсичних ефектів зростав при наявності у пацієнтів генотипів 1934GА і 1934АА по гену CYP2D6*4 (OR=7,8; 95 % СI (1,97-40,39)), а генотип 1934GG знижував ризик виникнення і розвитку токсичних ефектів (ч2=6,74, p=0,009, OR=0,13, 95 % СI (0,03 - 0,56)). Генотип 1934GА гена CYP2D6*4 асоціювалися із п'ятикратним збільшенням ризику виникнення і розвитку токсичних ускладнень при проведенні поліхіміотерапії (ч2=4,87, p=0,027, OR=5,28, 95 % СI (1,08-25,83)), зокрема, гематологічної токсичності (ч2=3,89, p=0,047, OR=5,94, 95 % СI (1,13-31,15)). Доведено, що виникнення токсичних ефектів не залежало від наявності гена CYP2C19*2 (G681A).

Продемонстровано відсутність достовірного асоціативного зв'язку поліморфних варіантів гена Тр53 (PIN3 ins 16 bp; C742T) з ризиком виникнення токсичних ускладнень у пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами (p>0,05). Комбінація генотипів 16 ins/dup по гену Тр 53 із генотипом 1934GG по гену CYP2D6*4 значимо знижувала ризик розвитку токсичних ефектів у пацієнтів при проведенні поліхіміотерапії (ч2=4,37, p=0,036, OR=0,22, 95 % СI (0,06-0,8)).

Доведено, що ризик розвитку нефрологічної токсичності у пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами і лімфомами із малих лімфоцитів асоціювався із генотипами 3109ТG і 3109GG по гену L-myс (ч2=4,65, p=0,032, OR=8,56, 95 % СI (1,56-58,74)).

Прогресування захворювання до II-IV стадії спостерігали при генотипі 3109GG і 3109ТG. Наявність генотипу 3109GG асоціювалась із втратою маси тіла і підвищенням показника кількості лейкоцитів в периферичній крові в період маніфестації захворювання, порівняно із наявністю генотипу 3109ТТ (p<0,05).

На підставі аналізу ген-генної і ген-факторної взаємодії побудовані прогностичні моделі ризику розвитку токсичних ускладнень (CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ), ризику виникнення і розвитку гематологічної (CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ), гепатологічної (CYP2D6*4 (G1934A) / АЛТ / ЛДГ), а також нефрологічної токсичності (L-myc (T3109G) / стадія захворювання / ЛДГ) у пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами.

Найкращою прогностичною моделлю ризику розвитку токсичності була трьохкомпонентна - CYP2D6*4 (G1934A) / тромбоцити / ЛДГ, що враховувала для прогнозу поєднаний аналіз поліморфізму гена CYP2D6*4 (G1934A), кількості тромбоцитів і рівню ЛДГ до призначення лікування. Указана трьохкомпонентна модель мала 100 % відтворюваність і прогностичну цінність 82,58 %.



ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

За технічної можливості у комплекс обстеження пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами і лімфомами із малих лімфоцитів пропонується впровадити в клінічну практику роботи гематологічних відділень лікарень методику поєднаного аналізу клініко-лабораторних показників і поліморфізму генів CYP2D6*4 (G1934A), CYP2C19*2 (G681A), Тр53 (PIN3 ins 16 bp, C742T), L-myc (T3109G) для прогнозування можливості виникнення токсичних ускладнень при проведенні поліхіміотерапії.

За наявності у пацієнтів із дифузними В-крупноклітинними лімфомами і лімфомами із малих лімфоцитів поєднання несприятливих клініко-лабораторних і молекулярно-генетичних маркерів рекомендуємо їх відносити до групи ризику стосовно виникнення токсичних ускладнень при проведенні поліхіміотерапії та своєчасно проводити їх профілактику.

Врахування генотипу пацієнтів за комбінацією генів Тр53, L-myc, CYP2D6, CYP2C19 дозволить, окрім прогнозування вірогідності виникнення токсичних ускладнень, оцінювати резерви кісткового мозку для можливості проведення поліхіміотерапії у випадках рецидиву захворювання.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Salach A. A. Abushanab. Modern advance for B-lymphocytopoiesis [Текст] / Salach A. A. Abushanab // Сімейна медицина. - 2015. - № 3 (59). - С. 246-250.

2. Влияние генетических факторов на развитие различных клинических проявлений токсичности у пациентов с неходжкинскими лимфомами [Текст] / Салах А. А. Абушанаб, С. В. Выдыборец, Н. Г. Горовенко, И. Р. Гартовская, С. П. Кирья-ченко, З. И. Россоха // Гематология Трансфузиология Восточная Европа. - 2015. - № 3 (03). - С. 48-61. (Дисертанту належить ідея та завдання дослідження, збір та обробка матеріалу, узагальнення результатів, формулювання висновків, написання статті).

3. Анализ полиморфных вариантов гена Тр53 в прогнозировании токсических осложнений при лечении неходжкинских лимфом [Текст] / Салах А. А. Абушанаб, С. В. Выдыборец, Н. Г. Горовенко, И. Р. Гартовская, С. П. Кирьяченко, З. И. Россоха // Гематология Трансфузиология Восточная Европа. - 2016. - Т. 2, № 1. - С. 155-165. (Дисертанту належить ідея та завдання дослідження, збір та обробка матеріалу, узагальнення результатів, формулювання висновків, написання статті та підготовка її до публікації).

4. Исследование полиморфизма гена L-myc (T3109G) в прогнозировании риска токсических осложнений при лечении неходжкинских лимфом [Текст] / Салах А. А. Абушанаб, С. В. Выдыборец, Н. Г. Горовенко, И. Р. Гартовская, С. П. Кирьяченко, З. И. Россоха // ScienceRise: Medical Science. - 2016. - Т. 5 (1). - С. 36-44. (Дисертанту належить ідея та завдання дослідження, збір та обробка матеріалу, узагальнення результатів, формулювання висновків, написання статті).

5. Анализ полиморфных вариантов гена Тр53 в прогнозировании токсических осложнений при лечении неходжкинских лимфом [Текст] / Салах А. А. Абушанаб, С. В. Выдыборец, Н. Г. Горовенко, И. Р. Гартовская, С. П. Кирьяченко, З. И. Россоха // Гематология Трансфузиология Восточная Европа. - 2016. - Т. 2, № 2. - С. 198-206. (Дисертанту належить ідея та завдання дослідження, збір та обробка матеріалу, узагальнення результатів, формулювання висновків, написання статті та підготовка її до публікації).

6. Салах А. А. Абушанаб. Клинико-гематологическая характеристика больных В-крупноклеточными лимфомами [Текст] / Салах А. А. Абушанаб // Сімейна медицина. - 2016. - № 3 (65). - С. 39-41.

7. Салах А. А. Абушанаб. Состояние гемопоеза у больных неходжкинскими лимфомами [Текст] / Салах А. А. Абушанаб // Рецепт. - 2016. - № 3. - С. 333-338.

8. Салах А. А. Абушанаб. Результати оцінки токсичності схеми R-CHOP при лікуванні пацієнтів на неходжкінські лімфоми за клінічними і лабораторними даними [Текст] / Салах А. А. Абушанаб // Матеріали ІV міжнар. мед. конгр. «Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоров'я України», (Київ, 15-17 квіт. 2015 р.). - К., 2015. - С. 68.

9. Салах А. А. Абушанаб. Современные представления о В-клеточном лимфоцитопоэзе [Текст] / Салах А. А. Абушанаб // Матеріали ІV міжнар. мед. конгр. «Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоров'я України», (Київ, 15-17 квіт. 2015 р.). - К. : ВЦ «КиївЕкспоПлаза», 2015. - С. 68.

...