Діагностичне та прогностичне значення хромосомних аномалій і мутації JAK2V617F при мієлофіброзі

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ НАМН УКРАЇНИ"

УДК:616.155.392.8-616.155.392-036.11:612

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

ДІАГНОСТИЧНЕ ТА ПРОГНОСТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ ХРОМОСОМНИХ АНОМАЛІЙ І МУТАЦІЇ JAK2V617F ПРИ МІЄЛОФІБРОЗІ

14.01.31 - гематологія і трансфузіологія

ЛОЗИНСЬКИЙ РОСТИСЛАВ ЮРІЙОВИЧ

Київ - 2016

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України".

Науковий керівник:

Масляк Звенислава Володимирівна, доктор медичних наук, старший науковий співробітник, ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України", завідувач відділення гематології з лабораторною групою.

Офіційні опоненти:

Видиборець Станіслав Володимирович, доктор медичних наук, професор, Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедри гематології та трансфузіології;

Клименко Сергій Вікторович, доктор медичних наук, старший науковий співробітник, Інститут експериментальної радіології ДУ "Національний науковий центр радіаційної медицини НАМН України", завідувач відділу медичної генетики.

Захист відбудеться "27" грудня 2016 р. о 12:00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 у ДУ "Інститут гематології та трансфузіології НАМН України" за адресою: 04060, м. Київ, вул. Берлинського, 12.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ "Інститут гематології та трансфузіології НАМН України" за адресою: 04060, м. Київ, вул. Берлинського, 12.

Автореферат розісланий "25" листопада 2016 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради P.П. Павлюк.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

1. Дослідити частоту та спектр цитогенетичних аномалій у пацієнтів із МФ.

2. Визначити частоту явища поліплоїдії при МФ та інших неоплазіях мієлоїдного паростка кровотворення.

3. Оцінити частоту мутації JAK2V617F у крові хворих на МФ при різному перебігу захворювання та залежно від наявності аномалій каріотипу.

4. Вивчити вплив цитогенетичних та молекулярно-генетичних аномалій на виживання пацієнтів при МФ.

5. Зменшити інвазивність і підвищити інформативність цитогенетичного дослідження при МФ під час встановлення діагнозу та моніторингу перебігу цього захворювання, а також вдосконалити діагностичний алгоритм із урахуванням виявлених генетичних особливостей хвороби.

Об'єкт дослідження. Кров, кістковий мозок і селезінка хворих на мієлоїдні неоплазії; культури клітин крові та кісткового мозку, мутації генів, хромосомні аномалії.

Предмет дослідження. Частота та спектр хромосомних аномалій, мутаційний статус периферичної крові та кісткового мозку в пацієнтів із МФ різного віку та статі, на різних стадіях захворювання та при застосуванні різних терапевтичних засобів; клінічний перебіг МФ.

Методи дослідження: аналіз медичної документації, клінічне обстеження, цитологічні, цитогенетичні, молекулярно-цитогенетичні, молекулярно-генетичні, статистичні.

Наукова новизна роботи. Підтверджено відсутність відмінностей при мієлофіброзі у спектрі хромосомних перебудов при одночасному цитогенетичному дослідженні в незрілих мієлоїдних клітинах-попередниках периферичної крові, стимульованих in vitro Г-КСФ, та в нестимульованому кістковому мозку. Показано, що серед аномалій окремих хромосом найчастіше спостерігається моносомія хромосоми 7 - у 8,8 % хворих та трисомія хромосоми 8 - у 7,0 %. Поліплоїдизація окремих не домінуючих субклонів клітин крові та кісткового мозку виявлялася ще частіше ? в 10,5 % хворих. Встановлено, що в поєднанні з поліплоїдними наборами хромосом інші хромосомні аномалії траплялися достовірно частіше, ніж без поліплоїдії (р=0,021). Доведено, що цитогенетичні аномалії в крові або кістковому мозку хворих на мієлофіброз пов'язані з коротшим загальним виживанням (p=0,022). Виявлено достовірно вищу частоту прогностично несприятливих за DIPSS-Plus цитогенетичних аномалій у хворих із мутацією JAK2V617F (p=0,049). Доведено потребу моніторингу каріотипу стимульованої in vitro Г-КСФ крові в динаміці, оскільки протягом 6-12 місяців у 33,3 % хворих з'являються нові цитогенетичні аномалії. Показано доцільність проведення цитогенетичного дослідження стимульованої in vitro Г-КСФ крові в хворих із сухим пунктатом кісткового мозку та наявністю не менше 12,0 % незрілих мієлоїдних клітин-попередників у лейкоцитарній формулі, оскільки при використанні цього підходу виявлено хромосомні аномалії в 50,0 % хворих, з них у 80,0 % - прогностично несприятливі за DIPSS-Plus.

Практичне значення отриманих результатів. Впроваджено методику отримання цитогенетичних препаратів із периферичної крові, стимульованої in vitro Г-КСФ у хворих на неоплазії мієлоїдного паростка кровотворення та визначення мутації за допомогою алель-специфічної ПЛР в клінічну практику гематологічного відділення клініки та консультативної поліклініки ДУ "ІПКТМ НАМН", гематологічного відділення 5-ої МКЛ м. Львова. Це дозволило збільшити кількість хворих, яким вдалося провести цитогенетичне обстеження. Використання комбінації цитогенетичного дослідження крові, кісткового мозку та молекулярно-генетичного визначення мутації гена JAK2 дало можливість виявити клональні маркери для уточнення діагнозу різних неоплазій мієлоїдного паростка кровотворення згідно з останніми рекомендаціями ВООЗ. Використання периферичної крові дозволило зменшити кількість і складність інвазивних процедур, розширити інформативність цитогенетичного аналізу в частини хворих, полегшити моніторинг прогресування захворювання та прогнозування його подальшого перебігу.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто визначено актуальність теми, вибрані та виконані дослідження - клінічний огляд хворих, взяття матеріалу, цитологічний аналіз мазків периферичної крові та кісткового мозку, аналіз результатів лабораторних та інструментальних методів обстеження, сформульовано завдання, відібрані клінічні групи хворих, розроблено в співавторстві та впроваджено оригінальні методики цитогенетичного аналізу, здійснена клінічна оцінка результатів цитогенетичних та молекулярно-генетичних обстежень, комплексний аналіз отриманих даних, статистичне опрацювання результатів досліджень та висновки. Автор висловлює вдячність співробітникам відділення гематології з лабораторною групою, молекулярно-генетичній лабораторії та спеціалізованій клініко-діагностичній лабораторії ДУ "ІПКТМ НАМН України", а також завідувачу діагностичної лабораторії медичного центру "ІГР" канд. біол. наук Гонтар Ю.В. за допомогу в проведенні генетичних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та обговорювались на міжнародних та вітчизняних наукових форумах. Зокрема, вони були викладені на 4-ій студентській міжнародній науковій конференції, м. Львів, 2004; на науково-практичній конференції "Актуальні проблеми гематології та транфузійної медицини" м. Львів, 2010; на 16-му з'їзді Європейської гематологічної асоціації (EHA), м. Лондон, Великобританія, 2011 (за роботу отримано грант EHA); на конференції "ELN Frontiers Meeting: Where Science Meets Clinical Practice", м. Берлін, Німеччина, 2014; на 19-му з'їзді EHA, м. Мілан, Італія (за роботу отримано грант EHA); на щорічній науково-практичній конференції "Перспективи діагностики і лікування гематологічних захворювань", м. Київ, 2015; на 20-му з'їзді EHA, м. Відень, Aвстрія, 2015; на VI з'їзді гематологів та трансфузіологів України з міжнародною участю, м. Львів, 2015.

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 22 праці: 10 статей (з них 7 - у фахових виданнях, рекомендованих ДАК України, 3 - міжнародні публікації в журналах, індексованих Scopus), 11 тез доповідей на з'їздах і конференціях, один патент України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих даних, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел літератури. Дисертація викладена на 158 сторінках, з яких 134 сторінки становить основний текст. Список використаної літератури містить 27 вітчизняних та 187 іноземних першоджерел. Робота ілюстрована 13 таблицями та 33 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Проведено обстеження 67 хворих віком від 23 до 83 років з діагнозом МФ. Хворі на МФ, молодші 40 років, становили найменшу частку з усіх пацієнтів - 7,0 %. В обстеженій групі домінували особи від 40 до 65 років. Діагноз встановлювали за критеріями ВООЗ 2008 р. Аналізувалися вікові, статеві, загально-клінічні (спадковий анамнез, конституційні симптоми, динаміка змін загального аналізу крові з лейкограмою, пальпаторні відхилення, наявність ускладнень), а також дані інструментальних обстежень внутрішніх органів (УЗД, МРТ, КТ). Дослідження виконували спільно зі співробітниками гематологічного відділення з лабораторною групою та лабораторії молекулярної генетики ДУ "ІПКТМ НАМН України", патолого-анатомічного відділення КЛШМД м. Львова.

Проводилося цитогенетичне дослідження в групі 57 хворих на МФ із використанням різних субстратів та методик культивування:

1) венозної крові із застосуванням гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора (Г-КСФ) за оригінальною методикою (заявка на винахід України № а 201505498 від 04.06.2015 р.) у 47 хворих, з яких 10 хворим одночасно проводилося культивування додаткових зразків крові без стимуляторів і з фітогемаглютиніном;

2) нестимульованого кісткового мозку в 37 хворих за стандартними методами з власною модифікацією (патент України на корисну модель № 82069 від 25.07.2013 р.).

Двом хворим верифікація результатів цитогенетичного дослідження із використанням G-методу диференціального забарвлення була проведена методом флюоресцентної гібридизації in situ (FISH).

Молекулярно-генетичне дослідження лейкоцитів периферичної крові проводилося після виділення та очищення ДНК методом фенольної екстракції. Для визначення мутації JAK2V617F використано алель-специфічну мультиплексну ПЛР із зондами до мутантного алеля фрагмента екзону 14 гена JAK2 у 50 хворих.

Препарати з цитотоксичною дією, які отримували хворі для лікування МФ, перед проведенням генетичних досліджень відмінялися. Тактика "спостерігати і чекати" в терапії хворих не використовувалася.

Дані, отримані в результаті досліджень, були опрацьовані з використанням параметричних і непараметричних методів варіаційної статистики. Статистичний аналіз проводили з використанням комп'ютерних програм Microsoft Excel 2007 та Statistica 6.0 (США).

Результати власних досліджень, їх аналіз та узагальнення. У клінічній картині найчастішим симптомом було збільшення розмірів селезінки, яке виявлено у всіх хворих на час включення в дослідження. У 81,0 % хворих були скарги на дискомфорт або біль в лівому підребер'ї. В 55,0 % пацієнтів спостерігалася анемія різної важкості. Зсув вліво лейкоцитарної формули виявлено в 73,0 % хворих.

Через виражене фіброзування кісткового мозку значній частині хворих на МФ (24,0 %) не вдалося аспірувати достатню його кількість при пункції. Оскільки в цих хворих спостерігався зсув лейкоцитарної формули периферичної крові вліво та виявлялися здатні до поділу клітини (бласти, промієлоцити), доцільним було проведення цитогенетичного аналізу зі застосуванням, як субстрату, крові замість кісткового мозку. Дослідження специфічно стимульованої Г-КСФ венозної крові дозволило провести дослідження каріотипу в 87,5 % хворих із сухим пунктатом кісткового мозку. При використанні цього підходу виявлено хромосомні аномалії в 50,0 % хворих (з них у 80,0 % - прогностично несприятливі за DIPSS-Plus). Дослідження контрольної групи підтвердило низьку ефективність цитогенетичного аналізу крові без будь-яких стимуляторів, так як застосування описаних у літературі методик із концентруванням лейкоцитів не дозволило отримати достатньо якісні препарати. Активність мітотичного поділу клітин венозної крові при культивуванні з Г-КСФ у досліджуваній групі хворих, яка відображалася кількістю метафазних пластинок у цитогенетичному препараті, корелювала з появою зсуву вліво в лейкоцитарній формулі (r=0,83, p=0,039), але не зі загальним рівнем лейкоцитів (р=0,065), що може непрямо вказувати на збільшений вміст стовбурових клітин у венозній крові. Отже, при МФ можна припустити існування зв'язку між кількістю патологічно змінених клітин із мітотичним потенціалом, та тих, які його втратили в процесі дозрівання. Для успішного проведення цитогенетичного аналізу венозної крові при МФ достатньою умовою була наявність хоча б 1,0 % бластних клітин й/або промієлоцитів у лейкоцитарній формулі, а обов'язковою умовою - наявність лейкоцитарного зсуву вліво. Таким чином, при виявленні бластів чи промієлоцитів у периферичній крові доцільне проведення цитогенетичного аналізу крові замість кісткового мозку, однак при використанні специфічного культивування клітин із застосуванням Г-КСФ. Кількість бластних клітин менше 1,0 % не була перешкодою для проведення цитогенетичного аналізу, хоча кількість метафазних пластинок в препараті крові в цьому випадку, як правило, була меншою. У частини хворих цитогенетичний аналіз стимульованої Г-КСФ венозної крові вдалося успішно провести за наявності лише паличкоядерного нейтрофільного зсуву вліво, при тому, що онтогенетично молодших гранулоцитарних попередників у лейкограмі при мікроскопічному дослідженні не спостерігалося. При вдалому цитогенетичному дослідженні крові з Г-КСФ найменша частка паличкоядерних нейтрофілів у лейкоцитарній формулі за умови ізольованого паличкоядерного зсуву вліво становила 12,0 %. Поясненням наявності мітотичної активності в периферійній крові хворих за відсутності незрілих клітин при підрахунку лейкограми може бути збільшення кількості чутливих до Г-КСФ стовбурових клітин, які не можна ідентифікувати цитологічно та які можуть морфологічно нагадувати лімфоїдні елементи. Зсув лейкоцитарної формули вліво може непрямо вказувати на збільшений вміст стовбурових клітин у венозній крові. Також не виключена наявність певної незначної кількості бластних клітин, які могли не виявлятися при цитологічному дослідженні.

Очевидно, використання Г-КСФ дозволяє активувати поділ клітин з мітотичним потенціалом, кількість яких значно менша за 1,0 % лейкоцитів крові. Це може мати практичне значення для стратифікації хворого на цитогенетичне дослідження крові або інвазивніше дослідження кісткового мозку без необхідності пошуку слідових кількостей змінених стовбурових клітин, бластів або промієлоцитів у рутинній практиці гематолога. Натомість можна враховувати загальну кількість дозріваючих елементів як предиктор успішного цитогенетичного дослідження крові та відсутності потреби у додатковій пункції кісткового мозку. При цьому неінформативність цитогенетичного дослідження при нормальній, або наближеній до неї, лейкоцитарній формулі вказує на недоцільність проведення цитогенетичного аналізу периферичної крові у цьому випадку та на потребу аспірації пунктату кісткового мозку.

Хромосомну патологію було знайдено загалом в 38,6 % хворих на МФ при дослідженні крові та кісткового мозку. Виявлено широкий спектр цитогенетичних аномалій із залученням більшості хромосом (табл. 1), що вказує на загальну нестабільність геному клітин крові та кісткового мозку пацієнтів із цим захворюванням. Несприятливі за DIPSS-Plus аномалії каріотипу виявлялися в 16,6 % хворих. Поліплоїдні клони клітин було знайдено в препаратах 10,5 % хворих. Загалом було виявлено 30 різних клональних цитогенетичних аномалій, як анеуплоїдій, так і структурних хромосомних аберацій, а також різні варіанти зміни плоїдності клітин.

Таблиця 1. Спектр цитогенетичних аномалій у крові та кістковому мозку хворих на мієлофіброз

Примітки:

1. Ж ? жіноча стать

2. Ч ? чоловіча стать

3. КМ ? кістковий мозок

4. ПК ? периферична кров

5. * ? цитогенетичне дослідження (периферичної крові або кісткового мозку) в динаміці через 6-12 місяців.

Із аномалій окремих хромосом найчастіше спостерігали моносомію хромосоми 7 - у 8,8 % хворих та трисомію хромосоми 8 - у 7,0 %, що може вказувати на існування певних особливостей каріотипу в хворих із України, оскільки в зарубіжних дослідженнях частіше виявляли делеції 20q та 13q. Також у 5,3 % хворих виявлялася прогностично несприятлива моносомія хромосоми 5. Вищезгадані аномалії часто присутні й у хворих на МДС та ХМЛ, що може вказувати на наявність певних спільних патогенетичних особливостей, які зумовлюють виникнення хромосомної патології при захворюваннях із ураженням мієлоїдного паростка кровотворення. У всіх хворих із хромосомними аномаліями було не менше двох цитогенетично різних клітинних клонів (один з яких міг бути цитогенетично нормальним), що вказує на генетичну гетерогенність кровотворних клітин при МФ та можливість в окремих хворих виявляти не домінуючі субклони клітин за допомогою G-методу цитогенетичного аналізу при даній патології. Аналіз результатів цитогенетичного дослідження дозволяє припускати мозаїчність каріотипу всіх хворих із аномаліями хромосом. Лише у 5,3 % хворих не було знайдено хоча б одної метафазної пластинки із нормальним каріотипом, що може вказувати, як на співіснування цитогенетично нормального та патологічного кровотворення переважної більшості хворих на МФ, так і на наявність окремих патологічних клонів клітин лише з молекулярно-генетичними аномаліями. Окремі субклони клітин були представлені лише трьома метафазними пластинками, причому одна з них могла мати додаткову хромосомну аномалію, не зазначену у таблиці за вимогами ISCN 2013 (Shaffer, 2013).

Частота мутації JAK2V617F у хворих на первинний МФ становила 58,1 %, а у хворих на вторинний МФ після трансформації справжньої поліцитемії - 100,0 %. Наявність мутації JAK2V167F зумовлювала коротше загальне виживання хворих, однак достовірної різниці з групою хворих без даної мутації встановити не вдалося (р=0,295). Мутацію JAK2V617F було виявлено у хворих всіх груп ризику за шкалою DIPSS-Plus. При цьому достовірних відмінностей у частоті цієї генетичної аномалії між різними групами не знайдено (p=0,234), що може вказувати на відсутність випадків появи даної мутації de novo у хворих із наростанням ризику DIPSS-Plus. Натомість, достовірно вища частота випадків трансфузійної залежності без мутації JAK2V617F (р=0,037) може бути чинником, який призводить до погіршення виживання даної групи хворих і нівелювання відмінностей у виживанні, порівняно з носіями цієї мутації.

Поєднання застосування молекулярно-генетичного та цитогенетичного дослідження дозволило виявити клональні маркери в 64,5 % хворих на первинний МФ. Встановлено достовірно вищу частоту несприятливих за DIPSS-Plus цитогенетичних аномалій (рис. 1) у хворих із мутацією JAK2V617F (p=0,0491). Часте виявлення аномалій хромосоми 9 в досліджуваній групі може пояснюватися взаємозв'язком між каріотипом та мутацією JAK2V617F, яка розміщується в цій хромосомі. Складніше пояснити часту трисомію хромосоми 8. Можливо, це створює клональні переваги за рахунок зміни експресії відомого онкогена с-MYC. Однак, при появі додаткової хромосоми 8, як і інших трисомій чи полісомій, описаних в дослідженні, змінюється кількість алелів багатьох генів. Саме спотворення взаємодії значної кількості генів може сприяти прогресуванню злоякісного процесу при МФ.

Рис. 1. Частка виявлених випадків мутації JAK2V617F серед хворих на мієлофіброз із несприятливими цитогенетичними аномаліями та без них: ¦ - нее виявлено мутації JAK2V617F, ¦ Наявність мутації JAK2V617F

Не виявлено відмінностей у спектрі аномалій каріотипу при цитогенетичному аналізі стимульованої Г-КСФ венозної крові та не стимульованого кісткового мозку, однак спостерігалися деякі відмінності у співвідношенні між різними клітинними клонами з цих двох субстратів. Ці результати були підтверджені методом FISH (рис. 2). Застосування цього методу також дозволяє підвищити чутливість детекції мінорних клітинних субклонів для точнішого прогнозу виживання хворих.

Явище поліплоїдії патологічних клітин є особливо важливим при МФ, оскільки може збільшуватися кількість копій генів, які зазнали мутації, наприклад, гена JAK2. Такі аномалії можуть призвести до появи клональних переваг шляхом підвищення здатності клітин до проліферації, що, в свою чергу призводить до зростання генетичної нестабільності через імовірніше порушення розходження хромосом під час мітозу. Це може зумовлювати подальші зміни кількості хромосом та генів, які розташовані в цих хромосомах. Однак, враховуючи відсутність домінування поліплоїдних клонів клітин, їх роль в лейкемічній трансформації, ймовірно, незначна. Натомість, клінічне значення поліплоїдії радше пов'язане із потенціюванням несприятливого впливу інших аномалій каріотипу та мутацій, який теоретично міг би реалізуватися через стимуляцію цитокінами інших аномальних клітин мієлоїдного паростка кровотворення.

Рис. 2. Патологічно змінені інтерфазні ядра клітин кісткового мозку (№ 9, табл. 1) з трисомією хромосом 3, 8, 9 при дослідженні методом FISH: А) по 3 флюоресцентні сигнали від хромосоми 3 (жовті) та хромосоми 9 (блакитні); Б) по 3 флюоресцентні сигнали від прицентромерних ділянок (червоні) та довгих плечей (блакитні) хромосоми 8

Проте, оскільки МФ є рідкісним, кількість хворих для встановлення статистично достовірного кореляційного зв'язку між появою явища поліплоїдії та несприятливим клінічним перебігом - недостатня. Аномальний каріотип зі зміненою плоїдністю показаний на рис. 3.

Рис. 3. Клітина з поліплоїдним набором хромосом у препараті крові хворого (№ 20, табл. 1). Каріотип: 73,XXYY,+X,-3Ч2,-4Ч2,-5Ч2,-6,-7,-10,-12,-13,-14Ч2,-15Ч2,-16,-17,-19Ч2,-22

Протягом 6-12 місяців при цитогенетичному дослідженні крові в динаміці в значної частки (33,3 %) хворих із наявністю цитогенетичних аномалій або з погіршенням загального стану з'являються нові аномалії хромосом. Оскільки генетичне пошкодження лежить в основі розвитку МФ, а наявність цитогенетичних аномалій має несприятливе прогностичне значення, можна зробити висновок про доцільність моніторування цитогенетичних аномалій в крові кожні 6-12 місяців. Даний підхід має особливу цінність у моніторингу МФ, враховуючи його низьку інвазивність та відсутність потреби пункції кісткового мозку.

Враховуючи відсутність відмінностей в спектрі цитогенетичних аномалій між кістковим мозком та стимульованою Г-КСФ кров'ю, для визначення ризику DIPSS-Plus оцінювали, як каріотип кісткового мозку, так і крові. Зберігалися достовірні відмінності (p<0,001 за методом ч²) щодо виживання між групою високого ризику та рештою груп хворих при використанні модифікації системи DIPSS-Plus із застосуванням цитогенетичного дослідження крові (рис. 4).

Рис. 4. Криві загального виживання в дослідній групі хворих на мієлофіброз, залежно від ризику DIPSS-Plus

При цьому, цитогенетичні аномалії найчастіше виявлялися якраз у групі високого ризику - в 57,9 % хворих, у яких було отримано дані каріотипування. Достовірних відмінностей загального виживання пацієнтів між групами низького, проміжного-1 та проміжного-2 ризику в нашому дослідженні не виявлено через низький рівень смертності в цих групах.

Цитогенетичні аномалії в крові або кістковому мозку хворих на МФ пов'язані з коротшим загальним виживанням. Виявлено достовірну відмінність рівня смертності в групі хворих із цитогенетичними аномаліями (p=0,022). Загальне виживання хворих, залежно від наявності хромосомних аномалій, зображене на рис. 5.

Терапія гідроксисечовиною або інтерфероном-б в низьких дозах дозволила досягнути повної гематологічної ремісії лише в хворих низького ризику за DIPSS-Plus. Поліплоїдні клони клітин зникали в усіх 3 хворих з неоплазіями мієлоїдного паростка при цитогенетичному дослідженні в динаміці через 6-12 місяців на фоні лікування гідроксисечовиною. Проте, гідроксисечовину в дозі ?1500 мг/д не вдавалося застосовувати безперервно понад 6 місяців у хворих на МФ, які брали участь в дослідженні через токсичність. Корекція дози або відміна препарату на короткий термін була необхідна для всіх пацієнтів, які отримували терапію цим препаратом.

Хоча в досліджуваній групі переважали хворі високого та проміжного-2 ризику (57,2 %) за міжнародною прогностичною шкалою DIPSS-Plus, а алогенна трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин не застосовувалася, загальне 2-річне виживання хворих із МФ від часу включення в дослідження становило 79,4 %.

Рис. 5. Крива Каплана-Маєра загального виживання хворих на мієлофіброз, залежно від наявності хромосомних аномалій

Виходячи з аналізу клінічних даних, цитогенетичного та молекулярно-генетичного досліджень виглядає вірогідним, що хоча б у частини хворих перебіг захворювання визначається не лише моногенними мутаціями, а й також патологічними змінами на інших рівнях організації генетичного апарату: хромосомному (аномалії окремих хромосом) та геномному (при порушенні плоїдності). Таким чином, пошук мутацій в окремих генах є, хоча й корисним діагностичним і дослідницьким підходом, все ж необхідні додаткові наукові інструменти для розуміння принципів розвитку та прогресування МФ, зокрема, цитогенетичний аналіз.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі запропоновано теоретичне узагальнення та нове вирішення науково-практичної задачі діагностичного та прогностичного значення аномалій каріотипу та мутації JAK2V617F при мієлофіброзі за допомогою комплексного визначення цитогенетичних аномалій у специфічно стимульованій Г-КСФ периферичній крові та нестимульованому кісткового мозку разом із молекулярно-генетичним дослідженням.

1. Встановлено клональні аномалії хромосом у 38,6 % пацієнтів. Серед аномалій окремих хромосом найчастіше спостерігали моносомію хромосоми 7 - у 8,8 % хворих та трисомію хромосоми 8 - у 7,0 %.

2. Виявлено, що в клітинах крові та кістковому мозку хворих на мієлофіброз найчастішою серед усіх аномалій каріотипу є поліплоїдія, яка траплялася у 10,5 % субклонів клітин. Встановлено, що в поєднанні з поліплоїдними наборами хромосом інші хромосомні аномалії виявляли достовірно частіше, ніж без поліплоїдії (р=0,021).

3. Доведено відсутність відмінностей у спектрі хромосомних перебудов при одночасному цитогенетичному дослідженні в незрілих мієлоїдних клітинах-попередниках периферичної крові, стимульованих in vitro Г-КСФ, та в нестимульованому кістковому мозку.

4. Підтверджено, що цитогенетичні аномалії в крові або кістковому мозку хворих на мієлофіброз пов'язані з коротшим загальним виживанням (p=0,022). Доведено потребу моніторингу каріотипу стимульованої in vitro Г-КСФ крові в динаміці, оскільки протягом 6-12 місяців у 33,3 % хворих з'являються нові клональні цитогенетичні аномалії не залежно від проведеного лікування.

5. Встановлено, що частка хворих із мутацією JAK2V617F при первинному мієлофіброзі серед обстеженої групи хворих складає 58,1 %. Мутацію було визначено у всіх групах ризику за шкалою DIPSS-Plus, зокрема в 37,1 % хворих без цитогенетичних аномалій. Виявлено достовірно вищу частоту прогностично несприятливих за DIPSS-Plus цитогенетичних аномалій у хворих із мутацією JAK2V617F (p=0,049).

6. Показано, що за наявності мутації JAK2V617F відсоток хворих залежних від трансфузій (9,7 %) достовірно менший (р=0,037), ніж серед хворих без цієї мутації (33,3 %).

7. Доведено доцільність включення в алгоритм діагностики та моніторингу мієлофіброзу цитогенетичного дослідження стимульованої in vitro Г-КСФ крові в хворих із неінформативним пунктатом кісткового мозку та наявністю не менше 12,0 % незрілих мієлоїдних клітин-попередників у лейкоцитарній формулі, оскільки при використанні цього підходу виявлено хромосомні аномалії в 50,0 % хворих, з них у 80,0 % - прогностично несприятливі за DIPSS-Plus.

Практичні рекомендації:

1. Цитогенетичне дослідження рекомендується як рутинне в діагностичній програмі при підозрі на мієлопроліферативне захворювання. Дослідження методом FISH крові або кісткового мозку є доцільним для уточнення виявлених цитогенетичних аномалій за допомогою G-методу.

2. Пропонується впровадити методику отримання цитогенетичних препаратів із периферичної крові, специфічно стимульованої in vitro Г-КСФ. Цю методику доцільно використовувати при обстеженні всіх хворих на МФ із виявленими бластами і/або промієлоцитами в мазках при цитологічному дослідженні. Наявність вираженого зсуву вліво лейкоцитарної формули без бластів чи промієлоцитів дозволяє використовувати цитогенетичне дослідження периферичної крові лише у випадку неуспішного дослідження препаратів кісткового мозку.

3. Хворим на МФ із наявністю цитогенетичних аномалій або з погіршенням загального стану доцільно кожні 6-12 місяців проводити цитогенетичне дослідження крові в динаміці для виявлення випадків прогресування захворювання і вчасного призначення паліативної терапії або алогенної трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин. У випадку проведеного цитогенетичного дослідження крові при наявності значної кількості метафазних пластинок (понад 20) не доцільно проводити дослідження кісткового мозку і навпаки, з огляду на однаковий спектр цитогенетичних аномалій з обох цих субстратів.

4. За технічної можливості необхідно комбінувати цитогенетичне дослідження крові або кісткового мозку з молекулярно-генетичним визначенням мутації JAK2V617F. Якісне визначення мутації JAK2V617F в динаміці є недоцільним, не зважаючи на проведення консервативного лікування, оскільки сучасна терапія не дозволяє досягнути молекулярних ремісій при МФ. Натомість, висока чутливість даного тесту дозволяє контролювати мінімальну залишкову хворобу після алогенної трансплантації гемопоетичних стовбурових клітин.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Study of Specifically Stimulated Venous Blood and Non-Stimulated Bone Marrow with Different Cytogenetic Methods in Patients with Myelofibrosis / R.Y. Lozynskyy, M.R. Lozynska, Y.V. Hontar, N.L. Huleyuk, Z.V. Maslyak, V.L. Novak [Текст]// Experimental Oncology. - 2016. - № 1. - P. 40-44. (Дисертанту належить ідея проведення, збір клінічного матеріалу, аналіз та узагальнення даних та оформлення статті до публікації).

2. Значення показників лейкограми для проведення цитогенетичного аналізу крові при мієлофіброзі / Лозинський Р.Ю. [Текст]// Клінічна та експериментальна патологія. - 2016. - № 1. - С. 74-77.

3. Інформативність поєднання молекулярно-ґенетичних і цитоґенетичних методів діаґностики мієлофіброзу / Р.Ю. Лозинський, М.І. Вороняк, Л.О. Полубень та ін. // Львівський клінічний вісник. - 2016. - № 1. - С. 22-26. (Дисертанту належить ідея проведення дослідження, збір клінічного матеріалу, аналіз та узагальнення даних та оформлення статті до публікації).

4. Застосування методу флюоресцентної гібридизації in situ для діагностики вторинного мієлофіброзу / Р.Ю. Лозинський, Ю.В. Гонтар, З.В. Масляк [Текст]// Acta Medica Leopoliensia. - 2016. - № 1. - С. 4-9. (Дисертанту належить ідея проведення, збір клінічного матеріалу, аналіз та узагальнення даних та оформлення статті до публікації).

5. Нові цитогенетичні підходи до моніторингу мієлофіброзу / Лозинський Р.Ю., Лозинська М.Р., Гулеюк Н.В. [Текст]// Вісник проблем біології і медицини. - 2015. - № 4. - С. 186-191. (Дисертанту належить ідея проведення дослідження, збір клінічного матеріалу, аналіз та узагальнення даних та оформлення статті до публікації).

6. Поліплоїдія та інші хромосомні аномалії стимульованих in vitro клітин периферичної крові при ідіопатичному мієлофіброзі / Р.Ю. Лозинський [Текст]// Гематологія і переливання крові: міжвідомчий збірник. - К., 2014. - Випуск 37. - С. 138-42.

7. Ґенетичні підходи до діаґностики хронічної мієлоїдної лейкемії та мієлодиспластичного синдрому / Р.Ю. Лозинський, В.Л. Новак, М.Р. Лозинська, З.В. Масляк [Текст]// Український медичний альманах. - 2009. - Том 12. - № 2 (додаток). - С. 139-140. (Дисертанту належить ідея проведення, збір клінічного матеріалу, аналіз та узагальнення даних та оформлення статті до публікації).

8. Особливості спектра цитогенетичних змін при різних варіантах мієлодиспластичного синдрому / М.Р. Лозинська, Я.І. Виговська, Н.Я. Томашевська, З.В. Масляк, Р.Ю. Лозинський, В.Л. Новак [Текст]// Цитологія і генетика. - 2009. - Т. 43. - № 1. - С. 61-68. (Дисертанту належить ідея врахування наявності поліплоїдних метафаз у каріотипі при оцінюванні перебігу захворювання, характеристика впливу процесу апоптозу на каріотип та оформлення статті до публікації).

9. Поєднання хронічного мієлопроліферативного та лімфопроліферативного захворювання в одного пацієнта. Опис клінічного випадку / Виговська Я.І., Бужерак Н.Ф., Лозинський Р.Ю., Горон Н.Ю., Виговська О.Я., Масляк З.В. [Текст]// Український журнал гематології та трансфузіології. - 2012. - № 5(16). - С. 29-32. (Дисертанту належить огляд літератури, аналіз та узагальнення даних та оформлення статті до публікації).

10. Прогностичне значення додаткових хромосомних аномалій у Ph позитивних клітинах кісткового мозку при хронічній мієлоїдній лейкемії / М.Р. Лозинська, З.В. Масляк, Л.М. Лукавецький, О.М. Цяпка, Р.Ю. Лозинський [Текст]// Цитологія і генетика. - 2005. - Т. 39. - № 1. - С. 26-33. (Дисертанту належить ідея врахування наявності поліплоїдних метафаз у каріотипі при оцінюванні перебігу захворювання та оформлення статті до публікації).

11. Polyploidy detection during cytogenetic investigation of bone marrow for the assessment of the course of some hematological malignancies / R. Lozynsky, M. Lozynska, Y. Vyhovska, Z. Maslyak [Текст]// Haematologica. - 2011. - Vol. 96 (s2). - P. 83.

12. Cytogenetic investigation of G-CSF-stimulated peripheral blood in patients with primary myelofibrosis / R. Lozynskyy, M. Lozynska, Y. Vyhovska, V. Novak // Haematologica. - 2014. - Vol. 99. - Suppl. 1. - P. 123.

13. Numerical and Structural Chromosomal Abnormalities of Peripheral Blood Cells of Myeloid Origin in Patients with Idiopathic Myelofibrosis / R. Lozynskyy, M. Lozynska, Z. Maslyak, Y. Vyhovska, V. Novak [Текст]// ELN Frontiers Meeting 2014 "Where Science Meets Clinical Practice" (16-17.10.2014. - Berlin, Germany): abstracts. - 2014. - P. 35.

14. Karyotype of circulating progenitor cells of myeloid lineage could be related to clinical course of myelofibrosis / R. Lozynskyy, M. Lozynska, Z. Maslyak, Y. Vyhovska [Текст]// Haematologica. - 2015. - Vol. 100 (Suppl. 1). - P. 536-537.

15. Evaluation of BCR/ABL mutations in resistant patients with CML: Prognostic and practical value of the method / K. Kotlyarchuk, L. Lukavetsky, A. Lukianova, O. Tsyapka, L. Vezdenko, R. Lozynskyy, Z. Maslyak [Текст]// XXV Zjazd Polskiego Towarzystwa Hematologуw i Transfuzjologуw-Streszczenia. Acta Haematol. Pol. - 2013. - Vol. 44. - Suppl.1. - P. 84.

16. Comparison of the Sokal and EUTOS prognostic scores in Patients with CML: one center's experience / K. Kotlyarchuk, Z. Maslyak, L. Lukavetskyy, A. Lukjanova, O. Danysh, R. Lozynsky [Текст]// Haematologica. - 2013. - Vol. 98 (s1). - P. 563-564.

17. Ґеномні маркери в оцінці кісткового мозку хворих з мієлодиспластичним синдромом / Лозинський Р.Ю., Масляк З.В., Лозинська М.Р., Лукавецький Л.М., Томашевська Н.Я. [Текст]// Збірник матеріалів ювілейної науково-практичної конференції "Актуальні проблеми гематології та транфузійної медицини", 27-28 травня 2010 р., Львів, Україна. - С. 113-114.

18. Алгоритми надання допомоги хворим з окремими гематологічними захворюваннями / Лукавецький Л.М., Виговська Я.І., Котлярчук К.Б., Бойко О.І., Лозинський Р.Ю., Масляк З.В. [Текст]// Матеріали ювілейної наук. -практ. конф. за участю міжнар. спеціалістів "Клінічні та експериментальні аспекти гематології та трансфузіології", присв. 85-річчю з дня народження проф. Б.В. Kачоровського (26-27 травня 2011 р.). - Львів, 2011. - С. 132-133.

19. Додаткові цитогенетичні маркери при мієлопроліферативних захворюваннях / Лозинський Р.Ю., Лозинська М.Р., Масляк З.В., Лукавецький Л.М., Виговська Я.І. [Текст]// Матеріали ювілейної наук. -практ. конф. за участю міжнар. спеціалістів "Клінічні та експериментальні аспекти гематології та трансфузіології", присв. 85-річчю з дня народження проф. Б.В. Качоровського (26-27 травня 2011 р.). - Львів, 2011. - С. 127-128.

20. Cytogenetic features of neoplastic process in the bone marrow of the patients with primary myelofibrosis / Р.Ю. Лозинський, В.Л. Новак, М.Р. Лозинська, Я.І. Виговська, З.В. Масляк [Текст]// Ukrainian Scientific Medical Youth Journal. - 2012. - № 3. - С. 77-78.

21. Хромосомні аномалії клітин периферичної крові мієлоїдного походження при ідіопатичному мієлофіброзі [Текст]/ Р.Ю. Лозинський, М.Р. Лозинська, З.В. Масляк, Я.І. Виговська, В.Л. Новак // Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоров'я України: III Міжнародний медичний конгрес: матеріали, 14-16 жовтня 2014 р. - Київ: КиївЕкспоПлаза, 2014. - С. 77.

22. Патент № 82069, Україна, МПК (2013.01) G01N 33/00 А 61В 5/00 / Р.Ю. Лозинський, М.Р. Лозинська // Спосіб культивування клітин аспірату кісткового мозку in vitro для отримання препаратів метафазних хромосом для цитогенетичного аналізу при онкогематологічних захворюваннях людини; заявник і патентовласник ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України" ДУ "Інститут спадкової патології НАМН України". - № u201213242; заявл. 20.11.2012; опубл. 25.07.2013, Бюл. № 14/2013. (Дисертант брав основну участь у розробці концепції корисної моделі та її клінічному впровадженні).

АНОТАЦІЯ

Діагностичне та прогностичне значення хромосомних аномалій і мутації JAK2V617F при мієлофіброзі. - Рукопис

Лозинський Р.Ю.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.31 - гематологія та трансфузіологія. - ДУ "Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України", Львів, 2016.

У дисертаційній роботі показано результати оцінки діагностичного та прогностичного значення аномалій каріотипу та мутації JAK2V617F при мієлофіброзі за допомогою комплексного визначення каріотипу специфічно стимульованої Г-КСФ периферичної крові та нестимульованого кісткового мозку разом із молекулярно-генетичним дослідженням. Наведені дані клінічного обстеження, цитогенетичного, молекулярно-цитогенетичного та молекулярно-генетичного дослідження пацієнтів. Показано відсутність відмінностей у спектрі хромосомних перебудов при одночасному цитогенетичному дослідженні в незрілих мієлоїдних клітинах-попередниках периферичної крові, стимульованих in vitro Г-КСФ, та в нестимульованому кістковому мозку. Виявлено, що найчастіше серед усіх аномалій каріотипу в крові та кістковому мозку хворих на мієлофіброз виявляється поліплоїдія (в 10,5 %) у субклонах клітин. Серед аномалій окремих хромосом при мієлофіброзі найчастіше спостерігали моносомію хромосоми 7 та трисомію хромосоми 8. Встановлено, що хромосомні аномалії достовірно частіше траплялися у поєднанні з поліплоїдними наборами хромосом, ніж без поліплоїдії. Підтверджено, що цитогенетичні аномалії в крові або кістковому мозку хворих на мієлофіброз пов'язані з коротшим загальним виживанням. Виявлено достовірно вищу частоту прогностично несприятливих за DIPSS-Plus цитогенетичних аномалій у хворих із мутацією JAK2V617F. Доведено необхідність моніторингу в динаміці каріотипу крові, стимульованої in vitro Г-КСФ, оскільки протягом 6-12 місяців у 33,3 % хворих з'являються додаткові цитогенетичні аномалії. Показано доцільність проведення цитогенетичного дослідження крові, стимульованої in vitro Г-КСФ в хворих із неінформативним пунктатом кісткового мозку та наявністю не менше 12 % незрілих мієлоїдних клітин-попередників у лейкоцитарній формулі, оскільки при використанні цього підходу виявлено хромосомні аномалії в 50 % таких хворих, з них у 80 % - прогностично несприятливі за DIPSS-Plus.

Ключові слова: первинний мієлофіброз, прогнозування, хромосомні аномалії, поліплоїдія, мутація JAK2V617F.

АННОТАЦИЯ

Диагностическое и прогностическое значение хромосомных аномалий и мутации JAK2V617F при миелофиброзе. - Рукопись

Лозинский Р.Ю.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.31 - гематология и трансфузиология. - ГУ "Институт патологии крови и трансфузионной медицины НАМН Украины", Львов, 2016.

В диссертационной работе приведены результаты оценки диагностического и прогностического значения аномалий кариотипа и мутации JAK2V617F при миелофиброзе с помощью комплексного определения кариотипа специфически стимулированной Г-КСФ периферической крови и нестимулированного костного мозга вместе с молекулярно-генетическим исследованием. Приведенные данные клинического обследования, цитогенетического, молекулярно-цитогенетического и молекулярно-генетического исследования пациентов. Показано отсутствие различий в спектре хромосомных перестроек при одновременном цитогенетическом исследовании в незрелых миелоидных клетках-предшественниках периферической крови, стимулированных in vitro Г-КСФ, и в нестимулированном костном мозге. Выявлено, что самой частой среди всех аномалий кариотипа в крови и костном мозге больных с миелофиброзом является полиплоидия (в 10,5 %) в субклонах клеток. Среди аномалий отдельных хромосом при миелофиброзе чаще всего наблюдаются моносомии хромосомы 7 и трисомии хромосомы 8. Установлено, что хромосомные аномалии достоверно чаще встречались в сочетании с полиплоидными наборами хромосом, чем без полиплоидии. Подтверждено, что цитогенетические аномалии в крови или костном мозге больных с миелофиброзом связаны с коротким общим выживанием. Выявлено достоверно более высокую частоту прогностически неблагоприятных по DIPSS-Plus цитогенетических аномалий у больных с мутацией JAK2V617F. Доказана необходимость мониторинга в динамике кариотипа крови, стимулированной in vitro Г-КСФ, поскольку в течение 6-12 месяцев в 33,3 % больных появляются новые цитогенетические аномалии. Показана целесообразность проведения цитогенетического исследования крови, стимулированной in vitro Г-КСФ у больных с неинформативным пунктатом костного мозга и наличием не менее 12 % незрелых миелоидных клеток-предшественников в лейкоцитарной формуле, поскольку при использовании этого подхода выявлены хромосомные аномалии у 50 % таких больных, из них в 80 % - прогностически неблагоприятные по DIPSS-Plus.