Формирование воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: роль сурфактантного белка D и репрограммирования макрофагов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Формирование воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: роль сурфактантного белка D и репрограммирования макрофагов

14.01.04 - внутренние болезни

Лямина Светлана Владимировна

Москва - 2013

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Малышев Игорь Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Маев Игорь Вениаминович

Официальные оппоненты:

Решетняк Виталий Кузьмич доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН; федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» Российской Академии Медицинских Наук, отдел клинической патофизиологии, заведующий отделом

Балякин Юрий Викторович доктор медицинских наук, профессор; государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей патологии медико-биологического факультета, заведующий кафедрой

Трухманов Александр Сергеевич доктор медицинских наук; государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета, профессор кафедры

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Продолжающийся рост заболеваемости населения болезнями органов дыхания, увеличение инвалидизации и преждевременной смертности у данной категории больных (Министерство здравоохранения и социального развития России, 2009), по-прежнему, определяет важность проблем патогенеза заболеваний легких и поиска новых подходов в их лечении. Наиболее распространенными среди заболеваний легких в настоящее время являются хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), бронхиальная астма (БА), а также отмечается неуклонный рост заболеваемости саркоидозом органов дыхания (СОД) (Министерство здравоохранения и социального развития России, 2009).

Нередкой клинической ситуацией в последние годы является сочетание бронхиальной астмы (БА) и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) (Корабельников Д.И., Чучалин А.Г., 2002; Маев И.В. и соавт., 2006), что определяет высокую распространенность симптомов ГЭРБ среди больных БА, взаимное влияние этих патологических состояний друг на друга (Корабельников Д.И., Чучалин А.Г., 2002) и рост числа их тяжелых форм. Известно, что ГЭРБ может проявляться не только симптомами поражения пищевода, но также служить причиной различных внепищеводных проявлений (Маев И.В. и соавт., 2006). БА и ГЭРБ имеют разную этиологию, однако формирование воспаления в бронхо-легочной системе при данных состояниях (Чучалин А.Г., 2005; Хаитов Р.М,, 2006) обусловлено общим патогенетическим компонентом - нарушением иммунного ответа в форме дисбаланса между клеточным Th1 и гуморальным Th2 звеньями иммунитета (P. Kidd, 2003). Поэтому дальнейшее изучение клеточных патогенетических механизмов развития данных заболеваний имеет высокую научную и практическую значимость.

Исключительно важную роль в патогенезе заболеваний с воспалительным компонентом в бронхо-легочной системе играют альвеолярные макрофаги М1 и М2 фенотипов, а одним из ключевых регуляторов функций альвеолярных макрофагов является сурфактантный белок D (SP-D) (Gardai S.J., 2003; Gow A.J., 2011). Макрофаги М1 и М2 фенотипов в зависимости от факторов микроокружения способны изменять свой фенотип (Martinez F.O., 2008), т.е. обладают фенотипической пластичностью. Мультифункциональная структура белка позволяет SP-D выступать в качестве бивалентного фактора контроля фенотипа макрофагов и определять двойственность иммунного ответа, обеспечивая возможность активации иммунного ответа провоспалительной или противовоспалительной направленности. Уровень SP-D и его олигомерный состав изменяются при различных заболеваниях легких, в связи с чем белок может быть использован не только как маркер повреждения легких, но и как агент воздействия на патогенетические звенья воспалительной реакции.

Несмотря на существующие методы терапии заболеваний бронхо-легочной системы, не всегда достигается необходимый эффект от проводимой терапии и улучшение прогноза пациентов, страдающих заболеваниями с воспалительным компонентом, хотя методы терапии и основываются на общепринятых принципах комплексности и преемственности лечения больных. В настоящее время чрезвычайно актуальным и приоритетным направлением представляется проблема по разработке и внедрению новых персонализированных подходов терапии с учетом фенотипической пластичности макрофагов, позволяющих достичь определенного баланса М1/М2 фенотипов макрофагов через факторы микроокружения и, прежде всего, SP-D, воздействующие на патогенетические звенья воспалительной реакции уже на начальных этапах формирования воспалительной реакции.

Цель исследования. Оценка фенотипа альвеолярных макрофагов и изменений их фенотипической пластичности, анализ роли SP-D при формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни, и разработка на этой основе прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов.

Задачи исследования

1. Изучение фенотипа альвеолярных макрофагов у мышей различных генетических линий - C57/BL6 и Вalb/c по функциональной (фагоцитарная способность, миграционная активность), секреторной (продукция нитритов, цитокинов) и морфологической (оценка формы клеток) характеристикам, клеточному ответу (стресс-ответ)

2. Определение роли SP-D с учетом его количественных и олигомерных характеристик в формировании фенотипа макрофагов и в процессе его репрограммирования у экспериментальных животных.

3. Разработка лабораторного прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов у экспериментальных животных: мышей различных генетических линий C57/BL6 и Balb/c

4. Определение фенотипа и изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных ХОБЛ. Изучение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных ХОБЛ

5. Оценка фенотипа, изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных БА. Определение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных БА.

6. Определение фенотипа и изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных ГЭРБ и при сочетанной патологии ГЭРБ и БА. Изучение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов у больных с сочетанной патологией ГЭРБ и БА с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования.

7. Изучение фенотипа и изменений фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов и роли SP-D в бронхо-легочной системе у больных саркоидозом органов дыхания. Определение возможности коррекции изменённого фенотипа альвеолярных макрофагов с помощью клеточной биотехнологии репрограммирования у больных СОД.

Научная новизна

Установлены различия функциональных свойств альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов по показателям клеточного ответа с учетом фагоцитарной, миграционной, секреторной активности клеток и морфологических характеристик, позволяющие конкретно охарактеризовать особенности развития иммунного ответа при дисбалансе М1/М2 фенотипов альвеолярных макрофагов.

Определена роль белка SP-D в формировании фенотипа макрофагов и в процессе их репрограммирования при заболеваниях легких и ГЭРБ.

Впервые разработан лабораторный прототип новой клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов - как новой стратегии управления иммунным ответом при заболеваниях легких, позволяющий использовать ключевую значимость эндогенных факторов микроокружения макрофагов для направленного репрограммирования макрофагов, с целью формирования необходимого «терапевтического» фенотипа макрофагов при заболеваниях с воспалительным компонентом, поражающих бронхо-легочную систему.

Определены функциональные фенотипы альвеолярных макрофагов при наличии воспалительного компонента в бронхо-легочной системе у больных ХОБЛ, СОД, БА, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ. Впервые оценены изменения фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов у больных при заболеваниях легких с воспалительным компонентом в бронхо-легочной системе и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни с анализом критериев фенотипа макрофагов: содержания поверхностно-клеточных макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, секреторной активности по продукции цитокинов и морфологической характеристики.

Впервые установлена целесообразность применения разработанного лабораторного прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования альвеолярных макрофагов, у больных ХОБЛ на I-II стадиях заболевания, при впервые выявленном саркоидозе органов дыхания, у пациентов с БА, не получающих базисной терапии ИГКС, при ГЭРБ с целью формирования необходимого «терапевтического» фенотипа макрофагов. Установлено, что фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов у больных при сочетанной патологии ГЭРБ и БА снижена по сравнению с пациентами, страдающими только одним из указанных заболеваний и клинически здоровыми лицами, что значительно затрудняет процесс репрограммирования макрофагов.

Впервые наряду с количественной оценкой содержания SP-D в биологических жидкостях - БАЛЖ и сыворотке крови - пациентов с заболеваниями легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью проведен анализ изменения олигомерного состава сурфактантного белка D в бронхо-альвеолярной жидкости пациентов (БАЛЖ). Показана роль белка SP-D как эндогенного фактора репрограммирования в фенотипировании и изменении фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при заболеваниях ХОБЛ, БА, СОД и ГЭРБ, что позволяет конкретизировать важные клеточные и молекулярные звенья в концепции воспалительного ответа в бронхо-легочной системе и иммунного ответа в целом при данной патологии.

Теоретическая значимость

Установлено влияние белка SP-D на процесс фенотипирования и репрограммирования макрофагов: отсутствие эндогенной продукции SP-D значимо влияет на клеточные ответы макрофагов разных фенотипов, а также существенно изменяет секреторную функцию макрофагов и приводит к формированию изменений в цитокиновом профиле макрофагов М1 и М2 фенотипов.

Смоделирован процесс репрограммирования макрофагов на основе изменения их микроокружения - концентрации сыворотки в культуральной среде, который может явиться основой для разработки экспериментального прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования макрофагов с целью задания им нужного «терапевтического» фенотипа М1 или М2, что позволит воздействовать на самые начальные звенья формирования воспалительной реакции и достичь необходимой сбалансированности всех звеньев иммунного ответа уже на ранних стадиях патологического процесса.

Разработан лабораторный прототип клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов in vitro на основании изменения концентрации сыворотки и, соответственно, SP-D в культуральной среде.

Практическая значимость

Выявленные различия фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов в зависимости от стадии заболеваний и характера проводимого лечения позволяют персонифицировать патогенетический подход к терапии у больных ХОБЛ, БА, СОД, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ.

Локальные и системные изменения качественного и количественного состава SP-D при заболеваниях с воспалительным поражением бронхо-легочной системы могут быть использованы в качестве дополнительных критериев диагностики заболеваний и при оценке тяжести клинического течения заболеваний у больных с поражением бронхо-легочной системы.

Использование эндогенного фактора - сурфактантного белка D для направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов дает новые возможности воздействия на патогенетические звенья воспалительной реакции и достижения необходимой сбалансированности М1/М2 фенотипов альвеолярных макрофагов, что может быть использовано в разработке новых схем патогенетической терапии при воспалительных изменениях бронхо-легочной системы.

Прогрессивное снижение уровня SP-D в БАЛЖ при различных стадиях ХОБЛ, при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА, а также его повышение при БА и СОД по сравнению со здоровыми лицами позволяет рассматривать данный критерий как дополнительный диагностический маркер.

Увеличение уровня SP-D в системной циркуляции при ХОБЛ, БА и СОД и зависимость его уровня от тяжести течения заболевания и проводимой терапии также может служить дополнительным диагностическим критерием при верификации диагноза.

Установленные изменения олигомерного состава SP-D в БАЛЖ в зависимости от тяжести заболевания и проводимой терапии также могут быть использованы как в диагностике, так и в контроле над эффективностью проводимой терапии заболеваний с воспалительным поражением бронхо-легочной системы.

Полученные данные являются основой для разработки и возможности применения в клинической практике клеточной биотехнологии управления иммунным ответом при лечении пациентов с поражением бронхо-легочной системы, имеющим воспалительный компонент, на начальных стадиях заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

1. Альвеолярные макрофаги М1 и М2 фенотипов обладают специфичностью функциональных ответов по секреторной способности, морфологическим характеристиками, фагоцитозу, миграции и клеточным стресс-ответам. Макрофаги М1 фенотипа характеризуются более выраженной фагоцитарной активностью в отношении микроорганизмов (Staphylococcus аureus) по сравнению с М2 фенотипом. Миграционная активность макрофагов М2 фенотипа в условиях аутологичной бронхо-альвеолярной лаважной жидкости выше по сравнению с показателями М1 фенотипа. Макрофаги М2 фенотипа характеризуются большим базальным уровнем белков HSP32 и HSP70 по сравнению с М1 фенотипом.

2. Сурфактантный белок D является эндогенным бивалентным фактором репрограммирования макрофагов. Мономерные формы белка формируют М1 фенотип макрофагов, олигомерные формы (додекамеры) - формируют М2 фенотип. Изменение концентрации сурфактантного белка D в микроокружении макрофагов направленно меняет фенотип макрофагов.

3. Прототип клеточной биотехнологии репрограммирования макрофагов, разработанный на основе использования эндогенных факторов репрограмирования - изменения концентрации SP-D в культуральной среде, обеспечивает возможности воздействия на звенья формирования воспалительной реакции при поражении бронхо-легочной системы.

4. Изменение фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов является патогенетическим звеном в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при ХОБЛ, БА, СОД, ГЭРБ и сочетании БА и ГЭРБ.

5. Изменение олигомерного состава сурфактантного белка D является патогенетическим фактором нарушения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при ХОБЛ, БА, СОД и сочетании БА и ГЭРБ.

Апробация работы

Материал диссертации доложен и обсужден на V, VI, VII Национальных конгрессах терапевтов (Москва, 2010, 2011, 2012), на XXI и XXII конгрессах Европейского респираторного общества (Амстердам, 2011; Вена, 2012), на ежегодной научной сессии Американского общества по экспериментальной медицине и биологии (Сан Диего, США, 2012); на ежегодной научной конференции ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России (Москва, 2011), на конференции молодых ученых федерального государственного бюджетного учреждения «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» Российской академии медицинских наук «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2012), на ежегодном конгрессе ассоциации по изучению структуры и физиологии артерий «Artery 12» (Вена, 2012г.), на межкафедральной конференции лаборатории клеточных биотехнологий НИМСИ ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, кафедр патологической физиологии лечебного факультета, факультетской терапии и профессиональных болезней, пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии, терапии и семейной медицины ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России (Москва, 2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, в том числе 15 статей в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, пяти глав результатов собственных исследований, включающих экспериментальную и клиническую часть исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, состоящего из 42 отечественных и 164 иностранных источников. Работа содержит 46 таблиц и 24 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа включала два этапа: экспериментальный и клинический (рисунок 1).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 1. Дизайн клинико-экспериментального исследования.

Общая характеристика экспериментальных животных

Экспериментальная часть исследования выполнена на культурах альвеолярных макрофагов, выделенных из бронхо-альвеолярной лаважной жидкости 200 мышей различных генетических линий - C57/BL6 и Balb/c, из которых 20 мышей линии C57/BL6 не имели гена сурфактантного белка D (SP-D).

Исследования экспериментального этапа работы выполнялись на базе ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России и Пенсильванского университета, Филадельфия, США. Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с положениями приказа №755 МЗ СССР от 12.08.1977, а также с соблюдением правил Надлежащей лабораторной практики (GLP, Good Laboratory Practice).

В соответствии с задачами исследования все животные были разделены на 2 группы: первая группа включала 160 животных - 80 мышей линий C57/BL6 и 80 Balb/c, во вторую группу были включены 40 животных - 20 мышей генетической линии C57/BL6, имеющие ген SP-D, и 20 мышей C57/BL6, лишенных гена SP-D.

Альвеолярные макрофаги мышей первой группы были использованы для изучения фенотипа макрофагов по функциональной (фагоцитарная способность, миграционная активность), секреторной (продукция нитритов, цитокинов), морфологической (оценка формы клеток) характеристикам и клеточному ответу (стресс-ответ), для разработки модели репрограммирования макрофагов.

Альвеолярные макрофаги мышей второй группы - С57/BL6, с геном и без гена SP-D, были использованы для определения роли сурфактантного белка D (SP-D) в формировании фенотипа макрофагов и его репрограммирования.

Первая и вторая группы животных были сопоставимы по возрасту, весу, полу (таблица 1).

Таблица 1

Характеристика групп экспериментальных животных

Группа исследования	Генетическая линия мышей	Цвет	Возраст, нед.	Вес, г	Пол
I	С57/BL6, n=80	Черный	8,75±0,09	23,99±0,22	Самцы
	Balb/c, n=80	Белый	9,09±0,07	23,90±0,24	Самцы
II	C57/BL6 без гена SP-D, n=20	Черный	8,95±0,17	23,55±0,43	Самцы
	C57/BL6 с геном SP-D, n=20	Черный	9,00±0,16	23,80±0,47	Самцы

Животные содержались в условиях аккредитованного вивария ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России и вивария Пенсильванского университета (Филадельфия, США), в стандартных условиях, не допускающих попадания патогенных микроорганизмов при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище (Приказ № 63 МЗ СССР от 10.03.1966; «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» за № 1045-73, утвержденные Главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973; протокол Комиссии по содержанию животных (Пенсильванский университет, США)). Перед началом экспериментов все животные в течение 2 часов находились в условиях лаборатории.

Характеристика клинического материала

Исследования клинического этапа работы выполнялись на базе ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова Минздрава России, ГКБ №70 Департамента здравоохранения (ДЗ) г. Москвы, ГКБ №11 ДЗ г. Москвы, ФКУЗ «ГКГ МВД России» (г. Москва) и ФБГУ «ЦНИИТ» РАМН (г. Москва). В клиническом этапе исследования были использованы бронхо-альвеолярная лаважная жидкость (БАЛЖ) и сыворотка крови пациентов с ХОБЛ, СОД, БА, ГЭРБ и сочетанной патологией ГЭРБ и БА, а также клинически здоровых лиц.

Использован биологический материал 151 человек, из которых у 132 человек по результатам проведения фибробронхоскопии (ФБС) выявлен воспалительный компонент в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и ГЭРБ, и 19 практически здоровых обследуемых - контрольная группа. В группы исследования вошли 41 пациент с ХОБЛ I, II и III стадии (по 12, 15 и 14 человек, соответственно), 30 пациентов с СОД (СОД впервые выявленный без приема глюкокортикостероидов (ГКС) - 15 человек, СОД рецидивирующий с приемом ГКС - 15 человек), 30 больных БА (интермиттирующая БА без применения ингаляционных ГКС (ИГКС) - 15 человек, персистирующая БА с применением ИГКС - 15 человек), 15 больных ГЭРБ (эрозивная форма) и 16 больных сочетанной патологией ГЭРБ и БА (с базисной терапией ИГКС по поводу БА).

Диагнозы были установлены на основании клинических, инструментальных и лабораторных методов исследования в соответствии с принятыми диагностическими критериями.

Контрольную группу составили 19 клинически здоровых лиц, из которых 9 человек были курящими, 10 - некурящими.

Все обследуемые перед проведением инвазивных процедур ФБС и эзофагогастродуоденоскопии (ЭГДС) подписывали форму информированного согласия.

Группы исследования были сопоставимы по полу и возрасту.

Критерии включения в исследование:

В исследование включались лица мужского и женского пола, в возрасте 18-70 лет, с установленными диагнозами: ХОБЛ I-III стадии (в соответствии с рекомендациями «Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктивной болезни легких», GOLD, 2007) в стадии ремиссии для I-III стадии и без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения в исследование для больных с I и II стадией; впервые выявленным или рецидивирующим СОД (наличие диагностических критериев СОД) без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения в исследование при впервые выявленном СОД), некурящие; интермиттирующей и персистирующей БА (в соответствии с рекомендациями Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы, GINA, 2007) в стадии ремиссии на момент включения в исследование и без применения гормональной терапии в течение 6 месяцев до включения в исследование для больных интермиттирующей БА, некурящие; эрозивной ГЭРБ (диагностические критерии в соответствии с клиническими рекомендациями Российской гастроэнтерологической ассоциации (РГА)) в стадии ремиссии на момент включения в исследование, некурящие; сочетанной патологией ГЭРБ и БА (диагностические критерии персистирующей БА (Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы, GINA, 2007) и эрозивной ГЭРБ (клинические рекомендации РГА) в стадии ремиссии на момент включения в исследование и применением ИГКС по поводу БА, некурящие; с подтвержденными при ФБС воспалительными изменениями бронхо-легочной системы.

Группу контроля составили клинически здоровые добровольцы в возрасте 18 - 70 лет, мужского и женского пола без патологии органов дыхания, ЖКТ и наличия других критериев исключения; не применявшие гормональные препараты в течение 6 месяцев до включения в исследование.

Критерии исключения из участия в исследовании:

острый инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, недостаточность кровообращения IIБ - III стадии, пароксизмальные нарушения ритма сердца, гипертонические кризы, острое нарушение мозгового кровообращения; дыхательная недостаточность III ст.; онкологические заболевания; туберкулез; острые инфекционные заболевания; заболевания соединительной ткани с изменениями функции дыхательной системы; нарушения свертывающей системы крови; сахарный диабет; беременность или кормление грудью, возраст моложе 18 или старше 70 лет.

Терапия пациентов группы исследования соответствовала клиническим статусам и симптоматике.

· Пациенты группы ХОБЛ с I и II стадиями заболевания получали ингаляционные холинолитики и в₂-агонисты короткого и пролонгированного действия, пациенты с III стадией ХОБЛ дополнительно принимали ИГКС (средние дозы 1600-2000 мкг/сут в пересчете на беклометазона дипропионат) и в₂-агонисты пролонгированного действия.

· В группе СОД пациенты с впервые выявленным саркоидозом включались в исследование сразу после верификации диагноза до назначения какой-либо терапии. В группе рецидивирующего саркоидоза органов дыхания пациенты получали системные глюкокортикостероиды - средние дозы в пересчете на преднизолон составляли 5-15 мг/сутки.

· В группе БА объем терапии у пациентов основывался на клиническом течении заболевания и существующих стандартах терапии в зависимости от тяжести течения БА. Пациенты с интермиттирующей астмой получали в₂-агонисты короткого и пролонгированного действия, пациенты с бронхиальной астмой персистирующего течения - ингаляционные глюкокортикостероиды в средних дозах 800-1500 мкг в пересчете на беклометазона дипропионат и в₂-агонисты пролонгированного действия.

Таблица 2

Характеристика больных ХОБЛ, СОД, БА, ГЭРБ и БА, ГЭРБ и клинически здоровых лиц

Показатели Группа	Клинический диагноз	Возраст, лет (М±m)	Количество обследованных	Значения ОФВ1 (% от должного)
			Всего	Муж-чин	Жен-щин
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)
I стадия	ХОБЛ, легкое течение	48,66±3,03	12	7	5	90,75±1,93
II стадия	ХОБЛ, средне-тяжелое течение	58,0±1,27	15	11	4	58,37±2,70
III стадия	ХОБЛ, тяжелое течение	58,6±2,02	14	12	2	38,62±2,51
Саркоидоз органов дыхания (СОД)
СОД ГКС (-)	СОД впервые выявленный	44,72±3,89	15	8	7	97,1 ± 4,6
СОД ГКС (+)	СОД рецидивирующий	45,10±3,06	15	10	5	108,1 ± 4,8
Бронхиальная астма (БА)
БА ИГКС (-)	Интермиттирующая БА без приема ИГКС	46,56±4,18	15	9	6	88,47±2,90
БА ИГКС(+)	Персистирующая БА с приемом ИГКС	48,24±3,27	15	8	7	70,27±5,23
Гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ)
ГЭРБ	ГЭРБ	46,41±4,18	15	10	5	101,6±4,81
Сочетанная патология: ГЭРБ + БА
ГЭРБ + БА(ИГКС+)	Сочетанная патология ГЭРБ и БА	49,30±3,64	16	12	4	75,6±4,27
Клинически здоровые лица
Здоровые	Здоровые курящие	53,34±2,48	9	6	3	101,4±3,06
	Здоровые некурящие	51,83±3,52	10	7	3	102,7±4,18

· Больным ГЭРБ проводилась терапия антисекреторными средствами - блокаторами протонной помпы (омепразол, 20-40 мг в сутки).

· При сочетанной патологии БА и ГЭРБ больные получали ИГКС в средних дозах 800-1500 мкг в пересчете на беклометазона дипропионат, в₂-агонисты пролонгированного действия (базисная терапия БА), блокаторы протонной помпы (20-40 мг омепразола в сутки) для поддерживающей терапии ГЭРБ.

Методики, использованные при проведении экспериментов

Выделение АМ

АМ были выделены из бронхо-альвеолярной лаважной жидкости мышей, больных и клинически здоровых лиц. Для получения БАЛЖ у мышей в легкие через внутритрахеальный катетер 4 раза вводилось по 1 мл стерильного фосфатного буфера с температурой +37°С (Lasbury, M.E., et al., 2003). АМ больных и клинически здоровых лиц были выделены из БАЛЖ, полученной в результате проводимой фибробронхоскопии (T. Thum и соавт., 2006). Полученный БАЛЖ центрифугировался (Heraeus-biofuge primo R, Германия) 4 минуты при 1000 об/мин. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл среды RPMI 1640 с доведением концентрации клеток в питательной среде RPMI 1640 до 1•10⁶/мл (Orosi et al., 1993). Одновременно с подсчетом количества клеток в камере Горяева производилось определение жизнеспособности АМ методом исключения красителя трипанового синего.

Культивирование АМ

АМ в стерильных условиях помещались в лунки стерильных культуральных планшетов из расчета 0,5 млн макрофагов на 1 лунку 48-луночного планшета. Планшеты с АМ для культивирования помещались в СО₂ инкубатор (Sanyo, Япония) при 37єС и 5% СО₂. Через час культивирования во всех лунках с АМ производилась замена среды на следующую комбинацию: 0,5 мл RPMI 1640 + сыворотка (FBS, 10%) + антибиотик (пенициллин / стрептомицин, 100 ед/мл / 100 мкг/мл). Планшеты вновь помещались в инкубатор при +37єС и 5% СО₂.

Определение фагоцитарной способности АМ

Фагоцитарная функция макрофагов (концентрация клеток 1 х 10⁶/мл) оценивалась прямым визуальным подсчетом поглощенных микроорганизмов (инактивированный нагреванием штамм Staphylococcus aureus 9198 с концентрацией клеток 1 х 10⁹/мл) при соотношении макрофаги:стафилококк - 1:400; 1:600; 1:800; 1:1000 (оптический микроскоп MICROS МС50, Австрия) через 3 часа после начала культивирования (+37+0,5^оС, 5% СО₂). Рассчитывался процент фагоцитирующих клеток от общего числа АМ и среднее количество микробов, захваченных одной клеткой (для фагоцитирующих клеток).

Определение миграционной активности АМ

Определение миграционной активности АМ основано на принципе метода Бойдена - прохождении лейкоцитов из одной половины камеры с взвесью клеток в другую половину камеры, содержащую хемоатрактант, и разделенных между собой мембранным фильтром. Анализ хемотаксиса проводился непосредственно по методике Neuro Probe Protocol (http://www.neuroprobe.com/protocols/BY312-Boyden.html). В качестве хемоаттрактанта была использована БАЛЖ мышей линий С57/BL6 и Balb/c. Подсчет количества мигрировавших клеток проводился в каждой ячейке под оптическим микроскопом (MICROS МС50, Австрия). Миграционная активность оценивалась по индексу миграции - отношение количества мигрировавших клеток к количеству немигрировавших в одной лунке.

Определение морфологической характеристики АМ

Морфологическая характеристика (форма клеток) АМ оценивалась методом световой микроскопии (MICROS МС50, Австрия). Подсчет клеток округлой и фибробластоподобной расплющенной формы проводился при помощи модифицированного метода Шиллинга в 100 клетках в 5 полях зрения (Шиллинг В., 1926).

Определение уровня продукции нитритов в культуральной среде

Продукция нитритов АМ оценивалась спектрофотометрически по содержанию нитритов в культуральной среде с помощью реакции Грисса (Redente E.F., et al., 2009).

У больных с поражением бронхо-легочной системы и здоровых лиц секреторная активность альвеолярных макрофагов по продукции нитритов не оценивалась, поскольку данный критерий не является достоверным у людей (Schneemann M., 2007; Fang F.C., 2007; Murray P.J., 2011).

Определение уровня цитокинов

Уровень цитокинов в БАЛЖ и в культуральной среде после репрограммирования АМ экспериментальных животных, больных и клинически здоровых лиц оценивался методом проточной цитофлуорометрии (Вeckman Coulter FC500, США) набором для мультиплексного определения 10 цитокинов (BMS820FF) мыши и набором для мультиплексного определения 11 цитокинов (BMS810FF) человека в соответствии с инструкциями производителя. Анализ полученных данных проводился лицензированной программой разработчика FlowCytomix Pro ver. 3.0.

Оценка содержания стресс-белков HSP32 и HSP70

Содержание стресс-белков HSP32 и HSP70 оценивали методом вестерн-блот анализа. Просмотр результатов осуществляли хемилюминесцентно (ECL+, Amersham Inc., Pittsburgh, PA). Количественное определение проводилось путем денситометрического сканирования экспонированных пленок или направленным просмотром на устройстве Kodak 440 Imaging System (New Haven, CT).

Определение содержания поверхностных макрофагальных маркеров человека

Определение поверхностных макрофагальных маркеров проводилось на проточном цитофлуориметре (Beckman Coulter FC500, США) после исходного выделения АМ, а также после процедуры репрограммирования клеток. Использованы моноклональные антитела к CD80, CD25, CD163, CD206 (Beckman Coulter; BD Pharmingen для CD163) (Martinez F.O., et al., 2008). Подготовка проб макрофагов для анализа проводилась по инструкциям производителя. Оценивали процентное содержание маркеров М1 и М2 фенотипов среди всех выделенных макрофагов у конкретного пациента.

Методика репрограммирования макрофагов (Zhang Х., Morrison С., 1993г.)

Методика использована для получения М1 и М2 фенотипов макрофагов у мышей C57/BL6 с геном и без гена SP-D. Первичная культура наивных макрофагов разделялась на три пула. В первый пул (формирование М1) на 6 часов добавлялся 0,5 нг/мл ЛПС (E. coli O111:B4, List Biologic Laboratories, Campbell, CA); во второй пул (формирование М2) - 5 нг/мл ЛПС. Третий пул являлся контролем (М0 фенотип). Для индукции воспалительного ответа использовали ЛПС в концентрации 500 нг/мл. Активация производилась через 6 часов после добавления программирующих концентраций ЛПС или через 7 часов после посадки на планшеты. Через 24 часа после индукции, среда отбиралась из лунок для анализа.

Лабораторный прототип направленного репрограммирования АМ при изменении концентрации сыворотки в питательной среде

Репрограммирование в М1 фенотип:

АМ в среде RPMI 1640 в стерильных условиях помещались в лунки стерильных культуральных планшетов (0,5 млн АМ на 1 лунку 48-луночного планшета) и находились в течение 1 часа в инкубаторе (Sanyo) (+37єС, 5% СО₂). Затем питательная среда во всех лунках заменялась на следующую комбинацию: RPMI 1640, FBS (0%), пенициллин / стрептомицин, 100ед/мл / 100 мкг/мл. Планшеты помещались в инкубатор (Sanyo) (+37єС, 5% СО₂). Через 12 часов культивирования в лунки добавлялся ЛПС (500 нг/мл), после чего АМ культивировались еще в течение 24 часов. Таким образом, общее время культивирования АМ составляет 37 часов. Результаты изменения маркеров фенотипа, функциональных и клеточных ответов оценивались через 24 часа после стимуляции ЛПC.

Репрограммирование в М2 фенотип:

АМ в среде RPMI 1640 в стерильных условиях помещались в лунки стерильных культуральных планшетов (0,5 млн АМ на 1 лунку 48-луночного планшета) и находились в течение 1 часа в инкубаторе (Sanyo) (+37єС, 5% СО₂). Затем питательная среда во всех лунках заменялась на следующую комбинацию: RPMI 1640, FBS (40%), пенициллин / стрептомицин, 100ед/мл / 100 мкг/мл. Планшеты помещались в инкубатор (Sanyo) (+37єС, 5% СО₂). Через 12 часов культивирования в лунки добавлялся ЛПС (500 нг/мл), после чего АМ культивировались еще в течение 24 часов. Таким образом, общее время культивирования АМ составляет 37 часов. Результаты изменения маркеров фенотипа, функциональных и клеточных ответов оценивались через 24 часа после стимуляции ЛПС.

Репрограммирование АМ с использованием сыворотки, не содержащей SP-D

За 48 часов до проведения эксперимента сыворотка FBS подвергалась предварительной обработке: на 1 мл FBS было добавлено по 20 мкл 100мМ CaCl₂ и по 30 мкл гранул мальтозы (M5895 Sigma, США). Полученная смесь инкубировалась при 4⁰С в течение 48 часов. Через 48 часов подготовленная смесь центрифугировалась в течение 5 минут при 400g. Полученный супернатант FBS не содержал SP-D и был использован для процедуры репрограммирования наряду с обычной FBS. Процедура репрограммирования АМ при использовании FBS, содержащей SP-D, и без SP-D проводилась в соответствии с методикой, представленной выше.

Получение сыворотки крови пациентов и здоровых лиц

Венозная кровь пациентов и здоровых лиц забиралась в пробирки VACUETTE® с активатором образования сгустка для получения сыворотки. После забора крови пробирка осторожно однократно переворачивалась и выдерживалась в течение 60 минут в вертикальном положении при комнатной температуре (не ниже +20^оС), затем центрифугировалась при 3000 об./мин в течение 15 минут (центрифуга Eppendorf 5415 R, Германия) c последующим отделением сыворотки крови.

Количественное определение уровня SP-D в БАЛЖ и сыворотке человека

Уровень SP-D в БАЛЖ и сыворотке больных и здоровых лиц определялся методом иммуноферментного анализа ELISA (BioVendor). Результаты уровня SP-D в БАЛЖ представлены с учетом фактора разведения, т.е. содержания уровня общего белка в БАЛЖ. Определение уровня общего белка в БАЛЖ проводилось методом Брэдфорда (Beirne P, et al., 2009).

Определение олигомерных форм SP-D

Определение олигомерного состояния белка SP-D в БАЛЖ и сыворотке крови проводили методом вестерн-блот анализа с использованием трис-ацетатных гелей (Invitrogen NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Gel, cat # EA03752BOX) и антител против SP-D. Антитела против SP-D были предоставлены Пенсильванским университетом (США).

Методы статистической обработки

Статистическую обработку полученных числовых результатов выполняли на персональном компьютере с использованием программы Statistica 8.0 for Windows (StatSoft Inc, США). Все выборки проверялись на нормальность распределения. Для определения значимости различий между исследуемыми признаками в выборке с нормальным распределением были использованы параметрические методы статистики (t-критерий Стьюдента). Сравнение средних осуществлялось в несвязанных массивах посредством расчета критерия Стьюдента (t-теста) методом непрямых разностей (вероятность ошибки р<0,05 оценивалась как значимая, р<0,01 - очень значимая и р<0,001 - максимально значимая). В случаях, когда распределение данных не соответствовало нормальному и в случае анализа малых выборок, для определения статистической значимости различий использовался непараметрический U-тест по методу Манна и Уитни для независимых выборок. Различия считали статистически достоверными при значениях p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Фенотипическая активность альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов мышей различных генетических линий - C57/BL6 и BALB/с

В результате проведенных экспериментальных исследований выявлены существенные различия функциональных (фагоцитоз, миграционная активность, секреторная способность), клеточных ответов (стресс-ответ) альвеолярных макрофагов мышей М1 и М2 фенотипов.

Более выраженной фагоцитарной активностью в отношении микроорганизмов (на примере Staphylococcus аureus) обладали макрофаги М1 фенотипа по сравнению с М2 фенотипом. При максимальном соотношении 1 АМ: 1000 Staphylococcus аureus фагоцитарная активность М1 макрофагов превышала показатели М2 макрофагов более чем в 2 раза. Установлена более выраженная зависимость фагоцитарной активности М1 фенотипа от концентрации Staphylococcus аureus, чем у М2 фенотипа (рисунок 2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 2. Фагоцитарная активность альвеолярных макрофагов М1 фенотипа (мыши С57/BL6), и макрофагов М2 фенотипа (мыши BABL/c)

Миграционная способность альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов (мыши С57/BL6 и Balb/c) изучалась в отношении наиболее «свойственного» альвеолярным макрофагам хемоаттрактанта - бронхо-альвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ). Выявлено, что способность макрофагов мигрировать в направлении «собственной» БАЛЖ была существенно выше по сравнению с хемоаттракцией «чужеродной» БАЛЖ (таблица 3).

Таблица 3

Оценка миграционной активности альвеолярных макрофагов М1 фенотипа (мыши С57/BL6) и М2 фенотипа (мыши BALВ/c)

Индекс миграции, абс.	Линия мышей C57/BL6 (М1 макрофаги)	Линия мышей Balb/c (М2 макрофаги)
	Хемоаттрактант «собственная» БАЛЖ
	1,50±0,11‡	1,88±0,13*#§
	Хемоаттрактант «чужеродная» БАЛЖ
	1,12±0,12	0,93±0,12

*р<0,05 относительно использования хемоаттрактанта «собственной» БАЛЖ у М1 макрофагов (линия мышей C57/BL6), #p<0,001 относительно использования хемоаттрактанта «чужеродной» БАЛЖ у М2 макрофагов (линия мышей Balb/c), ‡р<0,05 относительно использования хемоаттрактанта «чужеродной» БАЛЖ у М1 макрофагов (линия мышей C57/BL6), §р<0,001 активность макрофагов М2 (линия Balb/c) относительно активности М1 (линия C57/BL6) при использовании хемоаттрактанта БАЛЖ BALB/c

Показатели миграционной активности макрофагов М2 фенотипа, полученных от мышей BALB/c, в ответ на собственную БАЛЖ BALB/c были в 2 раза выше, чем при применении чужеродной БАЛЖ С57/BL6 (1,88+0,13 vs 0,93+0,12, р<0,001), а миграционная активность макрофагов М1 фенотипа мышей С57 в ответ на БАЛЖ С57/BL6 была почти в 1,5 раза выше по сравнению с хемоаттракцией чужеродной БАЛЖ BALB/c (1,50+0,11 vs 1,12+0,12, р<0,05). В случае применения в качестве хемоаттрактанта БАЛЖ BALB/c, активность макрофагов М2 (линия Balb/c) была существенно выше, по сравнению с М1 (линия C57/BL6) (1,88+0,13 vs 1,12+0,12, р<0,001). В том же случае, когда в качестве хемоаттрактанта использовался БАЛЖ С57/BL6, активность макрофагов М1 существенно превышала показатели М2 фенотипа (1,50+0,11 vs 0,93+0,12, р<0,001).

Секреторная активность АМ М1 и М2 фенотипов анализировалась по продукции нитритов и цитокинов. Продукция нитритов оценивалась в условиях культуры клеток по показателям культуральной среды с активированными клетками, т.е. среды с макрофагами после добавления ЛПС. Показано, что продукция нитритов АМ мышей C57/BL6 была почти в 2 раза выше по сравнению с АМ мышей линии Balb/c (8,4 мкМ и 4,3 мкМ, соответственно (рисунок 3).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

*р<0,05 относительно продукции нитритов макрофагами мышей линии Balb/c

Рисунок 3. Продукция нитритов альвеолярными макрофагами М1 фенотипа (мыши С57/BL6) и М2 фенотипа (мыши BABL/c).

Анализ продукции цитокинов в БАЛЖ мышей линий C57/BL6 и Balb/c выявил преобладание цитокинов Th1 профиля у C57/BL6 и Th2 профиля - у Balb/c (таблица 4). Учитывая, что у животных линии C57/BL6 преобладают макрофаги М1 фенотипа, а у линии Balb/c - М2 фенотипа, установлено, что макрофаги М1 фенотипа преимущественно секретируют провоспалительные Th1 цитокины, а макрофаги М2 фенотипа - Th2 противовоспалительные (таблица 4).

Таблица 4

Уровень цитокинов в БАЛЖ мышей C57/BL6 и BALB/c

Цитокины	Уровень цитокинов в БАЛЖ, пг/мл
	Линия мышей C57/BL6 (n=80)	Линия мышей Balb/c (n=80)
IL-2 (Th1)	35,17±3,22	21,74±2,01**
IL-5 (Th2)	36,55±5,3	41,81±5,81 *
IL-6 (Th1)	197,18±25,90	173,14±17,34
INFг (Th1)	69,47±9,23	63,50±8,35
IL-4 (Th2)	74,97±7,25	81,64±6,54 *
TNF-б (Th1)	14,76±1,84	7,93±2,15 **
IL-17 (Th1)	18,70±3,55	11,60±8,31
GM-CSF (Th1)	86,64±6,84	87,37±6,54

*р<0,05 относительно линии мышей С57/BL6,

**р<0,001 относительно линии мышей С57/BL6

Проведенный анализ морфологической характеристики АМ показал, что при стандартных условиях культивирования клеток (10% FBS, +37⁰С, 5% СО₂) через 36 часов от момента посадки макрофагов на плашку у C57/BL6 преобладали АМ округлой формы (87,43±2,41%), что соответствует преобладанию М1 фенотипа макрофагов (рисунок 4). У линии Balb/c - клетки расплющенной фибробластоподобной формы, характерной для М2 фенотипа, составляли 31,42±3,14% (рисунок 4).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 4. Форма АМ мышей C57/BL6 и Balb/c через 36 часов от начала культивирования в стандартных условиях (10% FBS, 5% CO₂).

Клеточные ответы АМ М1 и М2 фенотипов анализировались по показателям стресс-ответа - продукции белков теплового шока HSP32 и HSP70. Установлено значимое превышение показателей базальной продукции HSP32 и HSP70 у макрофагов М2 фенотипа по сравнению с М1 макрофагами (таблица 5).

Таблица 5

Продукция HSP32 альвеолярными макрофагами М1 и М2 фенотипа

Фенотип макрофагов	Продукция HSP32, опт.ед. М+m
М1 макрофаги, исходно (мыши С57/BL6, n=80)	5,41+0,08
М2 макрофаги, исходно (мыши Balb/c, n=80)	6,74+0,41*
М1 макрофаги, стимулированные ЛПС (мыши С57/BL6, n=80)	9,57+2,46
М2 макрофаги, стимулированные ЛПС (мыши Balb/c, n=80)	8,48+1,85

*р<0,001 относительно линии мышей С57/BL6

Полученные данные определяют специфичность функциональных и клеточных ответов макрофагов разных фенотипов, что позволяет выделить дополнительные признаки, характеризующие особенности развития иммунного ответа в бронхо-легочной системе при воспалительных изменениях.

Определение роли SP-D в формировании фенотипа макрофагов и в процессе его репрограммирования

Показано, что фактор микроокружения альвеолярных макрофагов SP-D является эндогенным фактором репрограммирования. В ходе экспериментов на АМ мышей второй группы - C57/BL6 без гена SP-D и с геном SP-D, проводился анализ роли SP-D в формировании фенотипа и его репрограммировании по критериям фенотипа макрофагов: секреторной активности макрофагов (продукция цитокинов), показателям клеточного ответа АМ (продукция стресс-белка HSP70).

Анализ продукции цитокинов макрофагами М1 и М2 фенотипа (фенотип АМ задан по методике X. Zhang, D.C. Morrison, 1993) у мышей второй группы показал, что SP-D существенным образом влиял на фенотипическую активность АМ. Отсутствие гена SP-D не влияло на продукцию Th1 цитокинов IL-12 и TNF-б в М2 фенотипе макрофагов, но приводило к увеличению секреции IL-12 и к снижению продукции TNF-б в М1 фенотипе. Отсутствие гена SP-D приводило к увеличению продукции IL-6 в М1 и М2 фенотипе. Выявлена зависимость эффектов SP-D от фенотипа макрофагов и на примере IL-10, и наиболее ярко она проявилась на примере IL-13 - отсутствие SP-D не влияло на продукцию указанных цитокинов АМ М1 фенотипа и повышало ее у АМ М2 фенотипа. Исключение составил лишь один из исследуемых цитокинов - IFN-г: удаление гена SP-D не приводило к изменению продукции этого цитокина ни в одном из фенотипов макрофагов (таблица 6). Данные о зависимости влияния SP-D на продукцию разных Th1 и Th2 цитокинов от фенотипа макрофагов предопределяет и изменение баланса Th1 / Th2 цитокинов. В М1 фенотипе отсутствие SP-D оказывает разнонаправленный эффект на различные Th1 и Th2 цитокины, а в М2 фенотипе за счет увеличения продукции Th2 цитокинов баланс Th1/Th2 сдвигается в сторону Th2 цитокинов (таблица 6).

Таблица 6

Продукция цитокинов Th1 и Th2 профиля АМ мышей C57/BL6 с геном и без гена SP-D

Цитокины Линия мышей, фенотип АМ	TNF-б, пг/мл	IL-12, пг/мл	INF-г, пг/мл	IL-6, пг/мл	IL-10, пг/мл	IL-13, пг/мл
C57/BL6 с геном SP-D, n=20	М1	8714±865**‡	51,0±3,0‡	798±84	31000±2000**‡	329±40	6,0±2,0
	М2	4412±468	11,0±2,0**	533±44**	21500±2000‡	780±35**‡	5,0±1,5‡
C57/BL6 без гена SP-D, n=20	М1	6142±432##	70,0±8,0##	901±66##	43000±2000##	218±44	4,0±2,3
	М2	3655±275	10,0±2,5	622±77	28000±1000	526±54##	12,0±2,5##

**р<0,001 относительно М0 макрофагов линии C57/BL6 с геном SP-D; ## р<0,001 относительно М0 макрофагов линии C57/BL6, лишенных гена SP-D; ‡ р<0,001 относительно макрофагов линии C57/BL6 без гена SP-D

Клеточный ответ АМ мышей второй группы оценивался по продукции стресс-белка HSP70. У мышей с геном SP-D после стимуляции макрофагов 500 нг/мл ЛПС (по методике X. Zhang, D.C. Morrison, 1993) и в М1, и в М2 фенотипах макрофагов отмечалось увеличение синтеза HSP70 (рисунок 5). Содержание HSP70 увеличивалось более, чем в 100 раз.

Рисунок 5. Увеличение содержания HSP70 в макрофагах мышей линии C57/BL6, имеющих ген SP-D (контроль), и лишенных гена SP-D, М0, М1 и М2 фенотипов в ответ на действие 500 нг/мл ЛПС в течение 24 часов.

При этом было установлено, что предварительное репрограммирование макрофагов на М1 и М2 фенотипы практически не повлияло на способность нормальных макрофагов индуцировать синтез защитных стресс-белков. Наблюдалась лишь тенденция к снижению ЛПС-индуцированного синтеза HSP70 в М1 фенотипе по сравнению с М2 фенотипом. В макрофагах мышей, лишенных гена SP-D, в ответ на стимуляцию ЛПС (500 нг/мл) синтез HSP70 в М1 фенотипе практически не изменялся (р>0,05), а в М2 фенотипе был более чем в 2 раза увеличен (р<0,001) по сравнению с соответствующим фенотипом макрофагов мышей, генотип которых содержал ген SP-D. Полученные данные указывают, что SP-D существенным образом влияет на синтез HSP70 в зависимости от фенотипа макрофагов (рисунок 5).

Показана значимая роль SP-D в процессах фенотипирования и репрограммирования АМ и как фактора микроокружения. Установлено, что в сыворотке, добавляемой в питательную среду при культивировании клеток, содержится SP-D (рисунок 6).

Рисунок 6. Олигомерный состав SP-D в сыворотке различных концентраций (0%, 10%, 40%) и в сыворотке при добавлении антител, блокирующих SP-D.

При этом подтверждена гипотеза об изменении количества SP-D в сыворотке соответственно изменению концентрации самой сыворотки. Проведенный анализ качественного состава SP-D (олигомеры) при изменении концентрации сыворотки показал, что в бессывороточной среде (0% FBS) SP-D отсутствует. При увеличении концентрации ФБС до 10% и 40% в питательной среде общее количество SP-D пропорционально возрастало. При увеличении содержания SP-D его олигомерный состав изменялся пропорционально изменению концентрации белка в питательной среде (рисунок 6, таблица 7). Установлено, что при добавлении к сыворотке антител, блокирующих SP-D, белок в сыворотке не определялся (рисунок 6, таблица 7). Полученные данные об изменении содержания и олигомерного состава SP-D в зависимости от концентрации сыворотки позволяют предположить, что увеличение концентрации сыворотки в питательной среде с возросшим количеством мультимерных форм SP-D способствуют направленному репрограммированию альвеолярных макрофагов в сторону М2 фенотипа, а снижение концентрации сыворотки и уменьшение уровня SP-D со снижением количества мультимеров - в сторону М1 фенотипа.

Таблица 7

Олигомерный состав SP-D при различных концентрациях FBS в питательной среде

Олигомерная форма SP-D, опт. ед.	Концентрация сыворотки FBS в питательной среде
	100%	40%	10%	0%
Мономеры	18,53±0,06	6,49±0,06	4,69±0,13	-
Додекамеры	9,69±0,08	5,03±0,06	4,20±0,01	-
Мультимеры	6,62	-	-	-

При оценке роли SP-D как фактора микроокружения в процессе фенотипирования и репрограммирования макрофагов анализировались общепринятые критерии фенотипа макрофагов: секреторная способность (продукция нитритов), морфологическая характеристика АМ.

Продукция нитритов АМ мышей генетических линий C57/BL6 и Balb/c значимо различалась при культивировании клеток с добавлением стандартной сыворотки и сыворотки, содержащей антитела, блокирующие SP-D. При культивировании АМ с сывороткой, содержащей блокирующие SP-D антитела, продукция нитритов была существенно выше, чем при использовании стандартной сыворотки и составляла 63,13±26,10 мкМ vs 21,32±0,39 мкМ для 10% концентрации и 27,38±3,28 мкМ vs 4,96±0,06 для 40% концентрации, соответственно. Аналогичная динамика наблюдалась и у АМ мышей линии Balb/c: 9,90±0,14 мкМ vs 7,12±0,23 мкМ для 10% концентрации и 5,19±0,96 мкМ vs 1,93±0,45 мкМ для 40% концентрации, соответственно. Полученные данные указывают на то, что в отсутствие SP-D как фактора микроокружения отмечается тенденция к репрограммированию АМ в сторону М1 фенотипа.

...