Формирование воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни: роль сурфактантного белка D и репрограммирования макрофагов

Анализ морфологической характеристики АМ М1 и М2 фенотипов показал, что при культивировании АМ с 10 и 40% сывороткой, содержащей блокирующие SP-D антитела, процентное содержание клеток расплющенной формы (М2) у АМ мышей линий C57/BL6 и Balb/c достоверно снижалось по сравнению с аналогичными концентрациями стандартной сыворотки (таблица 8).

Таким образом, установлено влияние SP- D на процесс фенотипирования и репрограммирования макрофагов: отсутствие эндогенной продукции SP-D существенно изменяло секреторную функцию макрофагов и приводило к формированию изменений в цитокиновом профиле макрофагов М1 и М2 фенотипов, а также значимо влияло на клеточные ответы макрофагов разных фенотипов. Отсутствие SP-D в микроокружении макрофагов приводило к изменению фенотипирования макрофагов и их репрограммирования, что подтверждено существенным изменением секреторной способности макрофагов на примере продукции нитритов и выраженным изменением морфологических характеристик клеток в процессе репрограммирования.

Таблица 8

Морфологическая характеристика макрофагов при репрограммировании клеток различными концентрациями сыворотки FBS

Концентрация FBS в питательной среде, %	Клетки округлой формы, %	Клетки расплющенной формы, %
C57/BL6, n=80
0 vs 0+АТблок	90,70±1,11 vs 90,90±0,89	9,30±1,11 vs 9,10±0,89
10 vs 10+АТблок	83,25±3,69 vs 89,00±4,60	16,75±3,69 vs 11,00±4,60*
40 vs 40+АТблок	61,50±5,29 vs 83,00±3,29	38,50±5,29 vs 17,00±3,29**
Balb/c, n=80
0 vs 0+АТблок	89,60±1,02 vs 90,20±1,	10,40±1,02 vs 9,80±1,06
10 vs 10+АТблок	67,75±4,03 vs 78,77±3,92	32,25±4,03 vs 21,33±3,92**
40 vs 40+АТблок	49,00±7,0 vs 83,00±1,35	51,00±7,0 vs 17,00±1,35**

*р<0,05 относительно ФБС без добавления блокирующих антител, **р<0,001 относительно ФБС без добавления блокирующих антител

Разработка лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов мышей генетических линий C57/BL6 и Balb/c

В основу разработки лабораторного прототипа клеточной биотехнологии репрограммирования макрофагов положена способность макрофагов существенно модифицировать/репрограммировать свой фенотип в зависимости от микроокружения. Показано, что изменение концентрации сыворотки, добавляемой в питательную среду при культивировании альвеолярных макрофагов, способно вызывать направленное изменение фенотипа клеток в сторону М1 или М2 фенотипа, что подтверждено такими общепринятыми критериями фенотипа, как секреторная активность макрофагов по продукции нитритов и цитокинов и изменением морфологической характеристики клеток.

Выбранная продолжительность культивирования и точки тестирования были определены в ходе пилотных экспериментов. Выбор пониженных и повышенных концентраций FBS при культивировании макрофагов также проводился экспериментально.

Увеличение продукции нитритов АМ обеих линий животных при снижении концентрации сыворотки FBS в культуральной среде с 10% до 0%, что свойственно М1 фенотипу макрофагов. Повышение концентрации FBS с 10% до 40% приводило к достоверному снижению продукции нитритов у АМ обеих линий, что свидетельствует о репрограммировании фенотипа АМ в сторону М2 (таблица 9).

Таблица 9

Характеристика секреторной функции макрофагов М1 и М2 фенотипов при их репрограммировании различными концентрациями сыворотки

Альвеолярные макрофаги мышей линии С57/BL6, n=80
	0% FBS	5% FBS	10% FBS	20% FBS	30% FBS	40% FBS
Продукция нитритов, мкМ	68,00±15,60#	39,42±9,16	21,50±11,46*	25,39±12,46	7,66±0,64#	5,23±1,15#
Альвеолярные макрофаги мышей линии Balb/c, n=80
Продукция нитритов, мкМ	13,52±0,94#	8,62±2,84	7,57 ±1,23	5,86±1,76	4,13±0,34#	2,80±1,48#

*р<0,05 по сравнению с оценкой аналогичных параметров у линии Balb/c

#р<0,05 по сравнению с данными для 10% FBS для аналогичной линии животных

В процессе репрограммирования альвеолярных макрофагов их секреторная активность также оценивалась по продукции макрофагальных цитокинов в культуральной среде. Показано, что при снижении концентрации сыворотки в культуральной среде до 0% у макрофагов мышей обеих линий преобладает продукция цитокинов Th1 профиля при снижении уровня антивоспалительных Th2 цитокинов, что характерно для макрофагов М1 фенотипа. Повышение концентрации FBS в питательной среде до 40% приводило к достоверному увеличению продукции антивоспалительных цитокинов при снижении уровня провоспалительных цитокинов, что свойственно М2 макрофагам.

Установлено, что снижение концентрации сыворотки в питательной среде при культивировании макрофагов до 0% и повышение ее до 40% достоверно изменяло соотношение клеток округлой и расплющенной формы у обеих линий мышей.

При этом увеличение концентрации FBS до 40% в питательной среде при культивировании макрофагов максимально увеличивало процентное содержание клеток расплющенной формы и снижало количество круглых клеток у обеих линий экспериментальных животных, что позволяет рассматривать концентрацию FBS 40% как максимально эффективную для репрограммирования макрофагов в сторону М2 фенотипа. Снижение концентрации FBS до 0% являлось наиболее эффективной концентраций для репрограммирования макрофагов в сторону М1, поскольку именно на этой концентрации FBS были достигнуты максимальные показатели увеличения содержания клеток округлой формы у обеих генетических линий животных (таблица 10).

Эффективность процедуры репрограммирования макрофагов оценивалась по макрофагальному (морфологический) индексу, показано, что увеличение концентрации FBS в питательной среде с 10% до 40% вызывало прогрессивное достоверное увеличение величины макрофагального индекса в 4,7 раза у мышей линии C57/BL6 и в 2,8 раза у мышей линии Balb/c (р<0,001) (таблица 10), а снижение концентрации FBS в питательной среде до 0% достоверно снижало показатели макрофагального индекса по сравнению с 10% FBS в 1,7 раза у мышей линии C57/BL6 (р<0,05) и в 3,75 раза у мышей линии Balb/c (р<0,001) (таблица 10). Таким образом, проведенный анализ параметров фенотипа альвеолярных макрофагов продемонстрировал эффективность разработанного на основании изменения концентрации сыворотки и, соответственно, SP-D, в культуральной среде лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов in vitro.

Таблица 10

Морфологическая характеристика макрофагов при репрограммировании клеток различными концентрациями сыворотки FBS

Линия С57/BL6, n=80
Концентрация FBS в питательной среде, %	Клетки округлой формы, %	Клетки расплющенной формы, %	Макрофагальный (морфологический) индекс
0	90,80±1,11 ‡	9,20±1,11	0,10±0,01
5	91,60±1,36 ** ‡	8,40±1,36	0,09±0,02
10	81,43±2,41	13,57±2,41 **	0,17±0,03
20	67,23±0,86	32,77±0,86 ‡	0,49±0,02
30	57,41±1,20	42,59±1,20	0,74±0,03
40	55,0±0,55 #	45,0±0,55 #	0,81±0,02
Линия Balb/c, n=80
0	89,2±1,02 ‡	10,8±1,02	0,12±0,03
5	79,0±0,68 ‡	21,0±0,68	0,27±0,02
10	69,58±3,14	31,42±3,14	0,45±0,03
20	57,6±3,65	42,4±3,65 **‡	0,74±0,03
30	49,4±1,72	50,6±1,72	1,02±0,02
40	43,8±1,15 #	56,2±1,15 #	1,28±0,01

**р<0,001 по сравнению с равнозначной концентрацией FBS у линии Balb/c

‡ р<0,001 по сравнению с концентрацией FBS 10% для одноименной линии животных

#р<0,001 по сравнению с концентрацией FBS 20% для одноименной линии животных

Оценка фенотипической активности альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов и роли SP-D при формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе у больных с заболеваниями легких и ГЭРБ

Для решения клинических задач по рациональной терапии больных, особенно с учетом современных позиций развития клеточных технологий, несомненна значимость оценки фенотипа и фенотипической пластичности АМ при хронических заболеваниях с поражением бронхо-легочной системы. Способность АМ быстро изменять свой фенотип играет значимую роль в формировании иммунного ответа. Возможно, именно патологическое снижение пластичности АМ и утрата ими способности адекватно изменять свой фенотип вносит определенный вклад в развитие воспалительных заболеваний. Таким образом, оценка фенотипа макрофагов и их пластичности может обладать диагностическим и прогностическим значением.

Привлечение новых направлений протеиномики в клиническую медицину и определение роли важных белковых фракций в патогенезе заболеваний и их влиянии на течение воспалительных реакций, и, прежде всего, SP-D как фактора микроокружения альвеолярных макрофагов при поражении бронхо-легочной системы, несомненно, обеспечит развитие перспективных направлений в патогенетических подходах терапии еще на ранних стадиях развития заболеваний с воспалительными изменениями в бронхо-легочной системе.

Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при ХОБЛ

Изучение фенотипа и оценка изменений фенотипической пластичности АМ у больных ХОБЛ in vitro проводились по следующим критериям фенотипа: содержанию на поверхности клеток макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, продукции цитокинов (оценка секреторной функции), морфологической характеристике в условиях культуры клеток.

Анализ указанных критериев фенотипа выявил смещение баланса М1/М2 фенотипов АМ в сторону М1 с зависимостью от стадии заболевания. Полученные данные свидетельствовали о нарушении процесса фенотипирования альвеолярных макрофагов и прогрессировании дисбаланса Th1/Th2 ответов с утяжелением заболевания. Показано, что прогрессирование клинического течения заболевания и нарастание обструктивных изменений (ОФВ₁) у больных ХОБЛ по сравнению с клинически здоровыми некурящими лицами сопровождается увеличением содержания М1 маркеров CD25 (в 1,23 раза при I стадии ХОБЛ и в 1,62 раза при III стадии) и CD80 (в 3,11 раза при I стадии и в 4,85 раза при III стадии), снижением содержания М2 маркеров CD163 (в 1,21 раза при I стадии, в 1,45 раза при III стадии) и CD206 (в 1,54 раза при I стадии, в 1,63 раза при III стадии). Прогрессирование ХОБЛ и нарастание обструктивных изменений сопровождалось возрастанием в культуре клеток количества АМ округлой формы (М1 фенотип) по сравнению с клинически здоровыми лицами - на 6,4% при I стадии и на 5,17% при III стадии; отмечен дисбаланс Th1/Th2 цитокинов с выраженным преобладанием продукции Th1 цитокинов (IL-12p70, IL-1в) и снижением - Th2 цитокинов (IL-4).

Полученные данные свидетельствуют о выраженном изменении функциональных свойств АМ при ХОБЛ по сравнению с клинически здоровыми лицами, а также о зависимости нарушения функций АМ от стадии заболевания и выраженности обструктивных изменений (ОФВ₁). Наиболее значимые нарушения функциональных свойств АМ отмечены на III стадии ХОБЛ.

Анализ фенотипической пластичности АМ и ее изменений у больных с различными стадиями ХОБЛ проводился in vitro с помощью лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов, разработанного на экспериментальном этапе работы на основе изменения концентрации стандартной сыворотки и SP-D в культуральной среде по критериям, использованным для исходного определения фенотипа АМ при ХОБЛ.

При снижении концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% в питательной среде фенотип АМ направленно менялся в сторону М1, что подтверждено увеличением содержания маркеров М1 фенотипа: CD25 в 1,30 раза при I стадии, в 1,15 раза при II стадии, в 1,17 раза при III стадии (р<0,05), CD80 в 1,08 раза при I стадии, 1,32 раза при II стадии, в 1,31 раза при III стадии; и снижением содержания маркеров М2 фенотипа: CD163 в 1,19 раз при I стадии, в 1,24 раза при II стадии, в 1,81 раза при III стадии и CD206 в 1,69 раз при I стадии, 1,28 раз при II стадии, в 1,42 раза при III стадии; увеличением содержания в культуре клеток АМ округлой формы в 1,05 раз при I стадии, в 1,07 раз при II и III стадиях; преобладанием продукции Th1 цитокинов при снижении Th2.

Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% в питательной среде способствовало изменению фенотипа АМ больных ХОБЛ в сторону М2, о чем свидетельствует увеличение содержания поверхностных маркеров М2 фенотипа: CD163 в 1,24 раза при I стадии, в 1,46 раз при II стадии и в 1, 07 раза при III стадии и CD206 в 1,22 раза, в 1,33 раза и в 1, 42 раза при I, II и III стадии, соответственно, снижение содержания М1 маркеров: CD25 в 1,45, 1,22 и 1,28 раз при I, II и III стадии; и CD80 в 1,77, 1,47 и 1,21 раза при I, II и III стадии, соответственно; снижение содержания в культуре клеток АМ округлой формы в 1,15 раз при I стадии, в 1,14 раз при II стадии и в 1,12 раз при III стадии ХОБЛ; снижение уровня цитокинов Th1 профиля при увеличении продукции Th2 цитокинов.

Фенотипическая пластичность (ФП) АМ при ХОБЛ по содержанию поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и морфологической характеристике оценивалась количественно и представлена как фенотипическая пластичность в сторону М1 (ФП-М1) - при действии фактора репрограммирования макрофагов (0% сыворотки), фенотипическая пластичность в сторону М2 (ФП-М2) - при действии фактора репрограммирования макрофагов (40% сыворотки) и суммарная фенотипическая пластичность (ФПсум) (рисунок 7, 8).

Установлено, что АМ больных ХОБЛ обладают способностью к фенотипической пластичности при применении лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования, при этом способность к фенотипической пластичности зависит от стадии заболевания. Анализ показателей фенотипической пластичности АМ при ХОБЛ показал, что наиболее низкой ФП характеризуются АМ больных III стадией ХОБЛ, принимающих ИГКС.

Таким образом, коррекция дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ при ХОБЛ наиболее целесообразна при I и II стадиях заболевания. Полученные результаты могут явиться основой для персонализации патогенетического подхода терапии у больных при I и II стадиях заболевания ХОБЛ для достижения необходимой сбалансированности М1/М2 фенотипов АМ, что может быть использовано в разработке новых стратегий патогенетической терапии при ХОБЛ.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 7. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ и здоровых лиц в условиях культуры клеток по содержанию поверхностно-клеточных маркеров.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 8. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ (морфологическая характеристика клеток) и клинически здоровых лиц.

Роль сурфактантного белка D (SP-D) в формировании воспалительного компонента при ХОБЛ

Проведен анализ уровня и олигомерного состава SP-D в БАЛЖ больных ХОБЛ, а также уровня SP-D в сыворотке больных. Полученные данные сопоставлены с результатами клинически здоровых лиц. Показано, снижение уровня SP-D в БАЛЖ по мере прогрессирования ХОБЛ и нарастания обструктивных изменений в легких (ОФВ₁): с 390,86±69,49 нг/мл при I стадии ХОБЛ до 287,01±53,62 нг/мл при III стадии ХОБЛ. У больных ХОБЛ уровень SP-D в БАЛЖ был существенно ниже, чем у клинически здоровых некурящих лиц - в 1,4 раза при I стадии ХОБЛ и в 1,8 раза - при III стадии (р<0,05). Тогда как в сыворотке крови уровень SP-D возрастал с увеличением тяжести заболевания - в 1,4-2,6 раз при I-III стадии ХОБЛ, по сравнению с клинически здоровыми некурящими лицами (р>0,05).

Для анализа роли и значения SP-D в патогенезе ХОБЛ оценивался олигомерный состав SP-D в БАЛЖ на различных стадиях заболевания. У клинически здоровых лиц SP-D в БАЛЖ присутствовал в форме мономеров, тримеров и додекамеров (таблица 11).

альвеолярный макрофаг рефлюксный воспалительный

Таблица 11

Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ при ХОБЛ и у клинически здоровых лиц

Показатели	Отсутствие терапии ИГКС	Терапия ИГКС	Отсутствие терапии ИГКС
	Стадия ХОБЛ	Здоровые лица
	I (n=12)	II (n=15)	III (n=14)	Здоровые курящие (n=9)	Здоровые некурящие (n=10)
Возраст, лет	58,66±1,76	58,87±1,56	58,71±2,92	53,34±2,48	51,83±3,52
ОФВ1, %	90,75±1,93	58,37±2,70	38,62±2,51	86,44±2,96	97,63±1,14
SP-D в БАЛЖ, нг/мл	390,86±40,12*	336,74±17,67**	287,01±18,96**	394,00±27,67	533,20±21,12
SP-D в сыворотке, нг/мл	76,87±20,79	106,61±25,54**	144,52±18,46**	137,00±19,24	54,60±4,77
Мономеры SP-D, опт.ед.	4,19±0,56	2,86±0,14*	3,26±0,26	4,79±0,31	4,37±0,66
Тримеры SP-D, опт.ед.	3,02±0,24	-	-	3,94±0,26	3,65±0,29
Додекаме-ры SP-D, опт.ед.	2,36±0,18*	-	-	2,95±0,32	3,92±0,28

*р<0,05 относительно здоровых некурящих; **р<0,001 относительно здоровых некурящих

В зависимости от стадии ХОБЛ олигомерный состав SP-D в БАЛЖ изменялся: при I стадии отмечены все определяемые формы - мономеры, тримеры и додекамеры; при II и III стадии - только мономерные формы белка (таблица 11).

Полученные данные показали, что при прогрессировании ХОБЛ и нарастании обструктивных изменений (ОФВ₁) существенно изменяется не только уровень, но и олигомерный состав SP-D. Установленные изменения олигомерного состава позволяют судить о значимой роли сурфактантного белка D в фенотипировании альвеолярных макрофагов и тенденции к формированию М1 фенотипа АМ, что было подтверждено при изучении фенотипа АМ при разных стадиях ХОБЛ.

Таким образом, анализ количественного и качественного состава SP-D не только позволяют оценить роль данного белка в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при ХОБЛ, но и может быть использован при диагностике заболевания и его тяжести в качестве дополнительных критериев.

Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при БА

Оценка фенотипа и анализ изменений фенотипической пластичности АМ у больных БА in vitro проводились по критериям фенотипа: содержание на поверхности клеток макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, продукции цитокинов (оценка секреторной функции), морфологической характеристике в условиях культуры клеток.

Анализ указанных критериев фенотипа и сравнение с клинически здоровыми лицами выявили смещение М1/М2 фенотипов АМ при БА в сторону М2, наиболее выраженное при интермиттирующей БА без применения ИГКС. Наличие дисбаланса М1/М2 фенотипов и его выраженность подтверждены увеличением содержания М2 поверхностных маркеров по сравнению с клинически здоровыми лицами: CD163 в 2,18 раза при интермиттирующей БА без применения ИГКС и в 1,99 раз при персистирующей БА(ИГКС+), а CD206 в 1,38 раза у больных БА(ИГКС-) и в 1,32 раза у больных БА(ИГКС+), а так же снижением содержания М1 маркеров: CD25 в 1,37 раза у больных БА(ИГКС-) и в 1,19 раза у больных БА(ИГКС+), повышением CD80 в 1,07 раза в группе БА(ИГКС-) и снижением его в 1,13 раза у больных БА(ИГКС+). Кроме того, по сравнению с клинически здоровыми лицами количество АМ округлой формы снижалось в 1,05 раза при БА(ИГКС-) и в 1,21 раза - в группе БА(ИГКС+). Изменения Th1 и Th2 цитокинового профиля по сравнению с клинически здоровыми лицами в БАЛЖ при БА носили разнонаправленный характер, но изменения уровня цитокинов определялись степенью тяжести заболевания. Наиболее значимо по сравнению с клинически здоровыми был снижен уровень Th1 цитокина IL-12p70 в 2,4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 1,8 раза в группе БА (ИГКС+), при этом уровень некоторых других Th1 цитокинов был повышен: IL-2 в 9 раз в группе БА(ИГКС-) и в 5,5 раз в группе БА(ИГКС+), а TNF-б в 7 раз в группе БА(ИГКС-) и в 4,2 раза в группе БА(ИГКС+). Выявлены также разнонаправленные изменения уровня Th2 цитокинов при различной тяжести БА. По сравнению с клинически здоровыми лицами установлено повышение уровня IL-4 - в 4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 2,5 раза в группе БА(ИГКС+), но при этом уровень IL-10 снижался - в 4 раза в группе БА(ИГКС-) и в 2,14 раза в группе БА(ИГКС+).

Таким образом, выявлено наличие нарушений функциональной способности АМ у больных БА, наиболее выраженное у лиц с интермиттирующей БА, не принимавших ИГКС, что, вероятно, и объясняет дальнейшее прогрессирование заболевания и зачастую отсутствие контроля над течением БА.

Анализ ФП АМ и ее изменений у больных с БА проводился in vitro с помощью лабораторного прототипа клеточной биотехнологии направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов, разработанного на экспериментальном этапе работы на основе изменения концентрации стандартной сыворотки и SP-D в культуральной среде по критериям, использованным для исходного определения фенотипа АМ.

Снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% в питательной среде способствовало направленному изменению фенотипа АМ в группе БА(ИГКС-) в сторону М1, что подтверждено увеличением содержания маркеров CD25 и CD80 в 1,30 и 1,36 раз, соответственно, снижением содержания М1 маркеров CD25 и CD80 в 1,11 и 1,77 раз, соответственно; увеличением количества АМ округлой формы в культуре клеток в 1,2 раза, а также возрастанием продукции цитокинов Th1 профиля.

У больных БА(ИГКС+) снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% изменяло фенотип АМ в сторону М2, что подтверждено снижением содержания М1 маркеров: CD25 и CD80 в 1,44 и 1,29 раз, соответственно, увеличением М2 маркеров CD163 и CD206 в 1,32, 1,27 раз, соответственно; снижением количества АМ округлой формы в культуре клеток в 1,17 раза; возрастанием продукции Th2 цитокинов.

При оценке макрофагальных маркеров на поверхности АМ у больных БА с интермиттирующей формой без применения ИГКС увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% сопровождалось увеличением содержания маркеров М2 фенотипа: CD163 в 1,49 раз, CD206 в 1,40 раза, и снижением маркеров М1фенотипа: CD25 в 1,11 и CD80 в 1,77. Кроме того, снижение количества АМ округлой формы в культуре клеток в 1,15 раза и увеличение продукции цитокинов Th2 профиля также подтверждают направленность процесса репрограммирования в сторону М2 фенотипа.

При персистирующей БА с применением ИГКС повышение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% приводило к увеличению содержания М1 маркеров: CD25 в 1,32 раза, CD80 в 1,48 раза, а также снижению содержания М2 маркеров: CD163 в 1,37 раза и СD206 в 1,12 раза. Количество АМ округлой формы в культуре клеток возрастало в 1,27 раза, увеличивалась продукция Th1 цитокинов. Полученные данные подтверждают репрограммирование АМ при персистирующей БА с применением ИГКС в сторону М1 фенотипа.

Изменения фенотипической пластичности АМ при БА оценивались количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки (рисунок 9, 10).

В результате установлено, что независимо от проводимой терапии и тяжести течения БА АМ обладают способностью к ФП. Показатели суммарной ФП АМ больных интермиттирующей БА, не получавших ИГКС, были сопоставимы с показателями клинически здоровых лиц, за исключением маркера СD80.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 9. Фенотипическая пластичность по содержанию поверхностно-клеточных маркеров альвеолярных макрофагов больных БА и клинически здоровых лиц в условиях культуры клеток.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 10. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных БА и клинически здоровых лиц (морфологическая характеристика клеток).

При БА с применением ИГКС показатели ФП были инвертированы по сравнению с группой БА(ИГКС-) и здоровыми лицами, что свидетельствует о возможном влиянии ИГКС на ФП, однако при этом не выявлено значимого влияния применения ИГКС на исходные характеристики фенотипа. Выявленные нарушения функциональной способности АМ при БА, наиболее выраженные при интермиттирующей БА без приема ИГКС, а также показатели ФП данной категории лиц позволяют определить целесообразность персонализированного подхода к патогенетической терапии у данной категории больных БА и применение у них биотехнологии направленного репрограммирования АМ с целью направленной коррекции баланса М1/М2 фенотипов АМ.

Роль сурфактантного белка D (SP-D) в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе у больных БА

Проведен анализ уровня и олигомерного состава SP-D в БАЛЖ больных БА, а также уровня SP-D в сыворотке больных. Полученные данные сопоставлены с результатами клинически здоровых лиц. Показано, что уровень SP-D в БАЛЖ превышает показатели клинически здоровых лиц, при этом более высокие значения SP-D в БАЛЖ характерны для персистирующей БА с применением ИГКС (таблица 12). Содержание SP-D в системной циркуляции при БА любой степени тяжести и независимо от применения ИГКС было существенно повышено по сравнению со здоровыми лицами (таблица 12).

Выявлена зависимость изменения олигомерного состава SP-D в БАЛЖ при БА от тяжести течения и проводимой терапии ИГКС (таблица 12).Установлено, что при более тяжелом течении БА с применением ИГКС по сравнению со здоровыми лицами значимо повышается уровень SP-D, при этом его качественный состав характеризуется изменением соотношения олигомерных форм белка относительно здоровых. При более легком течении БА - интермиттирующем, без приема ИГКС, уровень SP-D в БАЛЖ также увеличен по сравнению с клинически здоровыми лицами, однако в БАЛЖ белок присутствует только в форме мономеров, что является значимым фактором, влияющим на взаимодействие SP-D с АМ на уровне рецепторов, поскольку предполагает нарушение процесса фенотипирования альвеолярных макрофагов и формирование более выраженного дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ у данной категории больных.

Таблица 12

Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ больных БА и здоровых лиц

Показатели	Интермиттирующая БА без ИГКС, n=15	Персистирующая БА с ИГКС, n=15	Здоровые некурящие, n=10
Возраст, лет	46,56±4,18	48,24±3,89	51,83±3,52
ОФВ1, % от должного	88,47±2,90	70,27±5,23	97,63±1,14
SP-D в БАЛЖ, нг/мл	671,1±52,05	748,32±69,25*	533,20±21,12
SP-D в сыворотке, нг/мл	68,56±7,07*	71,21±6,97**	54,60±4,77
Мономеры SP-D, опт.ед.	5,20+0,36	4,99+0,17	4,37±0,66
Тримеры SP-D, опт.ед.	-	4,92+0, 27*	3,65±0,29
Додекамеры SP-D, опт.ед.	-	4,38+0,22	3,92±0,28

*р<0,05 относительно здоровых некурящих, **р<0,001 относительно здоровых некурящих

Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА

Изучение фенотипа и оценка изменений фенотипической пластичности АМ у больных ГЭРБ и сочетанием ГЭРБ и БА in vitro проводилось по следующим критериям фенотипа: содержание на поверхности клеток макрофагальных маркеров М1 и М2 фенотипа, продукция цитокинов (оценка секреторной функции), морфологическая характеристика в условиях культуры клеток.

Выявлено смещение баланса М1/М2 фенотипов АМ в сторону М1 фенотипа при ГЭРБ. По сравнению с клинически здоровыми лицами на АМ при ГЭРБ существенно возрастало содержание маркеров М1 фенотипа CD25 (в 1,08 раз) и СD80 (в 3,25), снижалось содержание М2 маркера CD206 (в 1,21 раз); в БАЛЖ больных ГЭРБ по сравнению со здоровыми был преимущественно увеличен уровень Th1 цитокинов - наиболее значимо - IL-6 (в 28 раз) и IL-1в (в 14,4 раза). При этом выраженных различий по количеству АМ округлой формы в культуре клеток у больных ГЭРБ по сравнению со здоровыми не выявлено (79,00±3,61% vs 81,67±0,58%, соответственно), что может быть объяснено частичным «отмыванием» фенотипа АМ при культивировании.

Дисбаланс М1/М2 фенотипов АМ выявлен также при сочетании ГЭРБ и БА: по сравнению с клинически здоровыми лицами содержание АМ, имеющих маркеры М1 фенотипа, возрастало на 16%, маркеры М2 фенотипа - на 79%; в культуре клеток в 1,8 раза возрастал процент АМ расплющенной формы (М2 фенотип). При сочетании ГЭРБ и БА по сравнению с клинически здоровыми уровень Th1 цитокинов в БАЛЖ преимущественно снижался, за исключением IL-2 (был повышен в 1,71 раза) и IL-6 (повышен в 6,8 раз), а изменения Th2 цитокинов были разнонаправленными - возрастал уровень IL-5 (в 3,42 раза), но снижался IL-4 (в 1,4 раза) и IL-10 (в 2,23 раза). Сравнение основных критериев фенотипа АМ при сочетанной патологии с больными ГЭРБ и больными БА показал, что присоединение ГЭРБ достоверно смещает фенотип макрофагов у пациентов с БА в сторону М1 (содержание CD25 и CD80 на АМ возрастает в 1,08 и 1,93 раза, соответственно). Эти данные позволяют предположить, что более тяжёлое течение БА при её сочетании с ГЭРБ может быть обусловлено именно сдвигом фенотипа макрофагов в сторону провоспалительного М1 фенотипа, и, соответственно, усилением воспаления в бронхо-легочной системе.

Анализ ФП АМ и ее изменений у больных ГЭРБ и сочетанием ГЭРБ и БА проводился по критериям фенотипа АМ in vitro с помощью разработанного экспериментально лабораторного прототипа направленного репрограммирования альвеолярных макрофагов, на основе изменения концентрации стандартной сыворотки и SP-D в культуральной среде.

На АМ больных ГЭРБ при снижении концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% в питательной среде возрастало содержание маркеров М1 фенотипа (CD25 - в 1,19 раз, CD80 - в 1,46 раз), снижалось содержание маркеров М2 фенотипа (СD163 - в 1,63 раз, СD206 - в 1,32 раза); количество АМ округлой формы в культуре клеток возрастало на 8,86%; увеличивалась продукция цитокинов Th1 профиля, что характерно для приобретения клетками М1 фенотипа.

Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% в питательной среде способствовало направленному репрограммированию АМ больных ГЭРБ в сторону М2 фенотипа, что подтверждено увеличением содержания поверхностных макрофагальных маркеров М2 фенотипа (CD163 в 1,77 раз, CD206 в 1,63 раза), снижением - М1 фенотипа (CD25 в 1,29 раза, CD80 в 2,17 раза), преимущественным возрастанием продукции цитокинов Th2 профиля и увеличением количества АМ расплющенной формы в культуре клеток на 46,04%.

На АМ больных с сочетанием ГЭРБ и БА снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% приводило к значимому возрастанию содержания М2 маркеров (CD163 в 1,26 раза, CD206 в 1,23 раза), содержание М1 маркеров изменялось разнонаправленно - содержание маркера СD25 было снижено в 1,08 раза, CD80 - увеличено в 1,37 раза. Полученные данные характерны для приобретения АМ М2 фенотипа макрофагов. Также выявлено преимущественно увеличение продукции цитокинов Th2 профиля, однако количество АМ расплющенной формы в культуре клеток практически не изменялось (65,00+3,46% vs 65,66+2,72%).

Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% способствовало in vitro увеличению содержания на АМ при сочетании ГЭРБ и БА маркеров М1 фенотипа (CD25 в 1,13 раз, CD80 в 1,19 раз), снижению - М2 фенотипа (CD163 в 1,3 раза, CD206 в 1,14 раза), увеличивалось количество АМ округлой формы в культуре клеток (на 17,3%); возрастала продукция цитокинов Th1, т.е. АМ направленно приобретали М1 фенотип.

Изменения ФП АМ при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА оценивались количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки (рисунок 11,12).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 11. Фенотипическая пластичность по содержанию поверхностно-клеточных маркеров АМ при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА в условиях культуры клеток.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 12. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию клеток округлой формы при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА.

В сравнении с клинически здоровыми лицами и больными ГЭРБ при сочетанной патологии выявлена инверсия показателей ФП макрофагов, а также наиболее низкие показатели суммарной ФП. Совокупность полученных данных ограничивает возможность применения технологии направленного репрограммирования АМ при сочетанной патологии ГЭРБ и БА. При анализе поверхностных маркеров фенотипа установлено, что максимальной ФП в сторону М2 фенотипа обладали АМ при ГЭРБ, что, учитывая выраженность дисбаланса М1/М2 фенотипов при данной нозологии, позволяет использовать направленное репрограммирование АМ при ГЭРБ как один из вариантов персонифицированного подхода к патогенетической терапии для коррекции воспалительных изменений в бронхо-легочной системе.

Роль сурфактантного белка D (SP-D) в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при ГЭРБ и сочетании ГЭРБ и БА

Выполнена оценка уровня и олигомерного состава сурфактантного белка D в БАЛЖ и уровня SP-D в сыворотке больных ГЭРБ и сочетанной патологией ГЭРБ и БА. Проведено сопоставление полученных данных с показателями клинически здоровых лиц.

По сравнению со здоровыми лицами наиболее снижен уровень SP-D в БАЛЖ при ГЭРБ (в 3,4 раза), при сочетанной патологии уровень SP-D в БАЛЖ был ниже в 1,3 раза. Кроме того, уровень SP-D в БАЛЖ при сочетанной патологии был в 2,7 раза выше, чем при ГЭРБ, но в 1,8 раза ниже, чем при БА(ИГКС+). Полученные данные позволяют предположить, что присоединение ГЭРБ к БА приводит к снижению уровня SP-D в БАЛЖ. Значимых изменений уровня SP-D в системной циркуляции при ГЭРБ и сочетанной патологии по сравнению с клинически здоровыми лицами не выявлено (р>0,05) (таблица 13).

Таблица 13

Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ при ГЭРБ и сочетанной патологии

Показатели	ГЭРБ, n=15	Сочетание ГЭРБ и БА с применением ИГКС, n=16	Персистирующая БА с применением ИГКС, n=15	Здоровые некурящие, n=10
Возраст, лет	46,41±4,18	49,30±3,64	48,24±3,89	51,83±3,52
SP-D в БАЛЖ, нг/мл	155,83±18,13	414,72±50,22	748,32±69,25*	533,20±21,12
SP-D в сыворотке, нг/мл	49,05±6,00	57,92±7,79	71,21±6,97**	54,60±4,77
Мономеры SP-D, опт.ед.	5,93±0,12	5,41±0,06	4,99+0,17	4,37±0,66
Тримеры SP-D, опт.ед.	-	-	4,92+0,27*	3,65±0,29
Додекамеры SP-D, опт.ед.	-	-	4,38+0,22	3,92±0,28

*р<0,05, ** р<0,001 относительно здоровых некурящих

Выявлены существенные нарушения олигомерного состава SP-D в БАЛЖ при ГЭРБ и сочетанной патологии по сравнению со здоровыми лицами - в БАЛЖ при данных нозологиях отсутствуют тримерные и додекамерные формы белка. Анализ распределения олигомерных форм SP-D в БАЛЖ показал, что присоединение ГЭРБ к БА приводит к исчезновению в БАЛЖ тримерных и додекамерных форм SP-D по сравнению с БА (таблица 13). Выраженное изменение олигомерного состава SP-D и его уровня при ГЭРБ и сочетанной патологии предопределяют изменения взаимодействия белка с АМ на рецепторном уровне и провоспалительную направленность его действия, что было подтверждено при исходном определении фенотипов АМ и формировании дисбаланса М1/М2 фенотипов при ГЭРБ и сочетанной патологии.

Изменения фенотипа и фенотипической пластичности альвеолярных макрофагов при СОД

Фенотип и изменения ФП АМ больных СОД различного течения (впервые выявленный и рецидивирущий СОД) in vitro оценивались по критериям фенотипа: содержание на поверхности АМ макрофагальных маркеров, свойственных М1 или М2 фенотипу, секреторная способность АМ (продукция цитокинов), морфологическая характеристика.

Установлено, что выраженность дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ по сравнению с клинически здоровыми лицами определялась характером течения заболевания и проводимой терапией. Впервые выявленный СОД, нелеченый ГКС, характеризовался в 4 раза большим преобладанием альвеолярных макрофагов, имеющих маркеры М1 фенотипа (СD80 18,84±3,61% vs 4,68±0,96%), а рецидивирующий СОД с применением ГКС - в 3,5 раза (СD80 16,72±3,11% vs 4,68±0,96%) по сравнению с клинически здоровыми лицами. Содержание М2 маркеров СD163 и СD206 на АМ больных СОД по сравнению с клинически здоровыми лицами также было изменено, однако значимым было изменение только содержания CD206 и только в группе впервые выявленного СОД - снижение по сравнению со здоровыми лицами составило 1,7 раза (р<0,05), при этом содержание СD163 относительно группы контроля практически не изменялось (22,79±11,20% vs 23,12±3,87%). При рецидивирующем СОД содержание М2 маркеров по сравнению с клинически здоровыми лицами существенно не изменялось (р>0,05). Анализ морфологической характеристики АМ показал, что при впервые выявленном СОД 77,56±4,71% клеток имели округлую форму, при рецидивирующем СОД -72,57±7,76%, что однако значимо не отличалось от клинически здоровых лиц (81,67±0,58%). При этом независимо от течения заболевания в БАЛЖ больных выявлен выраженный дисбаланс Th1/Th2 цитокинов. При СОД по сравнению с клинически здоровыми лицами в БАЛЖ достоверно снижался уровень таких Th1 цитокинов, как INF-г и IL-8, но в то же время возрастал уровень других Th1 цитокинов - IL-6 и TNF-б. Независимо от течения СОД в БАЛЖ больных был снижен уровень Th2 цитокинов - IL-10, IL-4 и IL-5.

Анализ ФП АМ и ее изменений у больных СОД проводился по критериям фенотипа АМ in vitro с помощью экспериментально разработанного лабораторного прототипа биотехнологии направленного репрограммирования АМ, на основе изменения концентрации стандартной сыворотки и SP-D в культуральной среде.

Показано, что при впервые выявленном СОД снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% способствовало репрограммированию АМ в сторону М1 фенотипа, что подтверждает увеличение содержания М1 маркеров СD25 (в 1,47 раз) и СD80 (в 1,52 раза) и снижение М2 маркеров CD163 (в 1,22 раза) и CD206 (в 1,36 раза); увеличение продукции Th1 цитокинов АМ; достоверное увеличение в 1,15 раз количества АМ округлой формы в культуре клеток.

Увеличение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% при впервые выявленном СОД направленно репрограммировало АМ в сторону М2 фенотипа: на АМ снижалось содержание М1 маркеров CD25 (в 1,14 раз), CD80 (в 1,96 раз), возрастало - М2 маркеров СD163 (в 1,23 раза), CD206 (в 1,24 раза); увеличивалась продукция АМ Th2 цитокинов и количество АМ расплющенной формы в культуре клеток (в 1,73 раза).

При рецидивирующем СОД снижение концентрации сыворотки FBS с 10% до 0% способствовало репрограммированию АМ в сторону М2 фенотипа, что подтверждено снижением содержания М1 маркера CD80 (в 1,26 раз) и увеличением содержания М2 маркера CD206 (в 1,14 раз), однако при этом достоверно не изменялось содержание маркера CD25 (35,70±4,85% vs 35,81±4,50%) и снижалось содержание CD163 (в 1,21 раз); снижалась продукция АМ Th1 цитокинов и увеличивалось количество клеток расплющенной формы (в 1,58 раза).

Изменение концентрации сыворотки FBS с 10% до 40% при рецидивирующем СОД направленно репрограммировало АМ в сторону М1 фенотипа, о чем свидетельствует увеличение содержания М1 маркеров СD25 (в 1,59 раз) и СD80 (в 1,27 раз) и снижение М2 маркера CD206 (в 1,4 раза), при этом содержание М2 маркера CD163, наоборот, возрастало (в 1,19 раз); продукция Th1 цитокинов возрастала, при этом в культуре клеток на 7,3% увеличивалось количество АМ округлой формы.

Изменения ФП АМ при СОД оценивались количественно по изменению содержания поверхностно-клеточных маркеров фенотипа и формы клеток при действии различных концентраций сыворотки (рисунок 13, 14).

Установлено, что наибольшей ФП характеризуются АМ при впервые выявленном СОД, нелеченом ГКС. Анализ полученных данных обосновывает возможность применения направленного репрограммирования АМ лишь при впервые выявленном СОД, поскольку показатели суммарной ФП при рецидивирующем течении СОД были существенно ниже и преимущественно инвертированы по сравнению данными при впервые выявленном СОД. Таким образом, проведение анализа фенотипа и показателей ФП у АМ для персонализированного подхода к патогенетической терапии целесообразно у больных впервые выявленным СОД.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 13. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию поверхностно-клеточных маркеров при СОД в условиях культуры клеток.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 14. Фенотипическая пластичность АМ по содержанию клеток округлой формы при СОД.

Роль SP-D в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при СОД

Изучен уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ, уровень SP-D в сыворотке больных СОД. Выполнено сопоставление полученных данных с показателями клинически здоровых лиц. Уровень SP-D в БАЛЖ при рецидивирующем СОД был на 17% повышен относительно клинически здоровых лиц, при впервые выявленном - на 23% (таблица 14).

Таблица 14

Уровень и олигомерный состав SP-D в БАЛЖ при СОД

	Впервые выявленный СОД без применения ГКС, n=15	Рецидивирующий СОД с применением ГКС, n=15	Здоровые некурящие, n=10
Возраст, лет	44,72±3,89	45,10±3,06	51,83±3,52
Уровень SP-D в БАЛЖ, нг/мл	660,45±46,71	628,00±58,82*	533,20±21,12
Уровень SP-D в сыворотке, нг/мл	83,72±9,55*	72,25±11,44*	54,60±4,77
Мономеры SP-D в БАЛЖ, опт.ед.	5,40±0,31	5,06±0,21	4,37±0,66
Тримеры SP-D в БАЛЖ, опт.ед.	-	4,31±0,18*	3,65±0,29
Додекамеры SP-D в БАЛЖ, опт.ед.	5,29±0,45*	5,52±0,27*	3,92±0,28

*р<0,05 относительно здоровых некурящих

В системной циркуляции уровень SP-D при СОД также превышал значения здоровых лиц - на 32% при рецидивирующем СОД и на 53% - при впервые выявленном СОД (таблица 14).

В зависимости от течения СОД различался олигомерный состав SP-D в БАЛЖ. При впервые выявленном СОД в БАЛЖ отсутствовали тримеры SP-D, при рецидивирующем течении - присутствовали все олигомерные формы белка (мономеры, тримеры и додекамеры), однако их соотношение отличалось от показателей клинически здоровых лиц (таблица 14).

Изменение уровня SP-D в сочетании с измененным олигомерным составом белка в БАЛЖ влияет на изменение взаимодействия SP-D с АМ на уровне рецепторов, что отражено в нарушении процесса фенотипирования АМ при СОД и формировании дисбаланса М1/М2 фенотипов АМ. Увеличение уровня SP-D в БАЛЖ и системной циркуляции при СОД может быть использовано в качестве дополнительного диагностического маркера заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Альвеолярные макрофаги М1 фенотипа по сравнению с альвеолярными макрофагами М2 фенотипа in vitro характеризуются более выраженной фагоцитарной активностью в отношении бактериальных агентов (Staphylococcus аureus), более высоким (в 2 раза) уровнем продукции нитритов и повышенной продукцией цитокинов Th1 профиля (с достоверными различиями по IL-2 и TNF-б, р<0,05), но более низкой (в 1,25 раза) выраженностью клеточного стресс ответа, подтвержденной различием в продукции белков теплового шока HSP32 и HSP70. Миграционная активность альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов зависит от используемого хемоаттрактанта: способность к миграции макрофагов на «собственный» хемоаттрактант - БАЛЖ существенно выше, чем на «чужеродный»; миграционная активность М2 фенотипа существенно выше по сравнению с М1 фенотипом.

2. SP-D как фактор микроокружения альвеолярных макрофагов является эндогенным фактором репрограммирования. SP-D влияет на формирование фенотипа, а именно на функциональную активность и морфологическую характеристику альвеолярных макрофагов в процессе их репрограммирования. Повышение уровня SP-D с возрастанием количества мультимерных форм способствует направленному репрограммированию альвеолярных макрофагов в сторону М2 фенотипа, а снижение уровня SP-D с уменьшением количества мультимеров - в сторону М1 фенотипа.

3. Увеличение концентрации сыворотки в культуральной среде до 40% способствует изменению исходного фенотипа макрофагов в сторону М2, снижение концентрации сыворотки до 0% - в сторону М1 фенотипа. Разработанный лабораторный прототип клеточной биотехнологии с использованием различных концентраций сыворотки, содержащей SP-D, направленно репрограммирует альвеолярные макрофаги.

4. У больных ХОБЛ соотношение М1/М2 альвеолярных макрофагов смещено в сторону М1 фенотипа по сравнению с клинически здоровыми лицами. Выраженность дисбаланса сопряжена с утяжелением клинического статуса больных ХОБЛ. Фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов больных ХОБЛ снижается с увеличением тяжести ХОБЛ.

5. Локальный (в БАЛЖ) и системный (в сыворотке крови) уровни SP-D, а также олигомерный состав данного белка у больных ХОБЛ существенно отличаются от здоровых лиц. Прогрессирование ХОБЛ сопровождается снижением SP-D в БАЛЖ относительно уровня клинически здоровых лиц в 1,4-1,8 раз и повышением уровня SP-D сыворотке в 1,4-2,6 раз. Олигомерный состав SP-D в БАЛЖ на I стадии ХОБЛ характеризуется снижением количества додекамеров по сравнению с клинически здоровыми лицами и наличием лишь мономерных форм при II и III стадии.

6. У больных БА М1/М2 баланс альвеолярных макрофагов смещен в сторону М2 фенотипа по сравнению с клинически здоровыми лицами. Более выраженный дисбаланс М1/М2 фенотипов выявлен при легком течении БА, у пациентов, не применяющих ИГКС. Показатели суммарной фенотипической пластичности, определяемой по поверхностным маркерам и морфологической характеристике альвеолярных макрофагов, у пациентов с БА, не получавших ИГКС, были сопоставимы с показателями клинически здоровых лиц.

7. Уровень SP-D системный (в сыворотке крови) и локальный (в БАЛЖ) при БА повышен по сравнению с клинически здоровыми лицами в 1,3 и 1,2-1,4 раза, соответственно. Утяжеление течения БА с применением ИГКС повышает уровень SP-D в БАЛЖ на 15%. Олигомерный состав SP-D у больных БА изменяется при утяжелении БА и изменении проводимой терапии: у больных интермитирующей БА, не получающих ИГКС, преобладают мономерные формы, а на фоне приема ИГКС у больных персистирующей БА олигомерный состав SP-D аналогичен здоровым.

8. У больных ГЭРБ М1/М2 баланс альвеолярных макрофагов смещен в сторону М1 по сравнению со здоровыми лицами. При сочетании ГЭРБ и БА М1/М2 дисбаланс фенотипов альвеолярных макрофагов характеризуется увеличением количества клеток с маркерами М1 фенотипа на 16%, а с маркерами М2 фенотипа - на 79% по сравнению с клинически здоровыми лицами. При сочетании ГЭРБ и БА суммарная фенотипическая пластичность альвеолярных макрофагов снижена по сравнению с клинически здоровыми лицами и больными с БА и с ГЭРБ.

9. Как у больных ГЭРБ, так и при сочетании ГЭРБ и БА уровень SP-D в БАЛЖ снижен по сравнению с клинически здоровыми лицами в 3,4 раза и 1,3 раза, соответственно. В сыворотке крови у обеих категорий пациентов уровень SP-D значимо не изменен. Олигомерный состав SP-D при обеих клинических ситуациях характеризуется наличием лишь мономерных форм белка в отличие от клинически здоровых лиц, у которых в БАЛЖ присутствовали все олигомерные формы SP-D.

10. У больных с СОД выраженность М1/М2 дисбаланса альвеолярных макрофагов по сравнению с клинически здоровыми лицами определялась характером течения заболевания и проводимой терапией. Впервые выявленный СОД, не леченный ГКС, характеризовался четырехкратным преобладанием клеток с маркером М1 фенотипа (СD80), а рецидивирующий СОД с применением ГКС - его увеличением в 3,5 раза по сравнению с клинически здоровыми лицами. Альвеолярные макрофаги у больных с впервые выявленным СОД обладают большей суммарной фенотипической пластичностью по сравнению с клетками, выделенными от пациентов с рецидивирующим течением заболевания, но более низкой - по сравнению с клинически здоровыми лицами.

11. У больных СОД уровень SP-D в БАЛЖ повышен по сравнению с клинически здоровыми лицами на 23% при впервые выявленном заболевании и на 18% при рецидивирующем СОД, леченном ГКС. В сыворотке крови по сравнению со здоровыми лицами содержание SP-D возрастало при впервые выявленном СОД в 1,3 раза, при рецидивирующем СОД - в 1,5 раза. В олигомерном составе SP-D в БАЛЖ при впервые выявленном СОД преобладали мономерные формы белка, тогда как при рецидивирующем СОД с применением ГКС в БАЛЖ наряду с мономерами присутствовали тримеры и додекамеры с изменением соотношения олигомерных форм по сравнению с клинически здоровыми лицами.

12. Выявленные локальные и системные изменения уровня SP-D, а также его олигомерного состава в БАЛЖ при патологии, сопряженной с воспалительным поражением бронхо-легочной системы (подтвержденным данными ФБС и цитокиновым профилем), являются дополнительными маркерами дифференциальной диагностики заболеваний и оценки тяжести их течения. Изменения содержания и олигомерного состава SP-D в БАЛЖ влияют на процесс фенотипирования альвеолярных макрофагов, участвуя в формировании воспалительного компонента в бронхо-легочной системе при заболеваниях легких и ГЭРБ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вассерман Е. Н., Абрамова Е. В., Круглов С. В., Лямина С. В., Шимшелашвили Ш. Л., Малышев Ю. И., Беарс М. Ф., Гоу А. Д., Малышев И. Ю. Отсутствие гена SP-D приводит к усилению ЛПС-индуцированного синтеза HSP70 в М2, но не в М1 фенотипе перитонеальных макрофагов: возможная роль интерлейкина - 10 // Фундаментальные исследования. - 2010. - №6. - С. 19-27

2. Вассерман Е.Н., Лямина С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Абрамова Е.В., Назаров В.А., Круглов С.В., Малышева Е.В., Беарс М.Ф., Гоу А.Д., Малышев И.Ю. SP-D контролирует баланс Th1 и Th цитокинов и обладает признаками эндогенного фактора репрограммирования макрофагов // Фундаментальные исследования. - 2010. - №6. - С. 28-36

3. Лямина С.В., Круглов С.В., Веденикин Т.Ю., Малышев И.Ю. Новая стратегия управления иммунным ответом при заболеваниях легких ? роль сурфактантного белка D как бивалентного фактора репрограммирования макрофагов // Фундаментальные исследования. - 2011. - №1. - С. 90-98

4. Малышев И.Ю., Лямина С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Вассерман Е.Н. Функциональные ответа альвеолярных макрофагов, сурфактантный белок D и заболевания легких // Пульмонология. - 2011. - №3. - С.101-107

5. Лямина С.В., Маев И.В., Юренев Г.Л., Малышев И.Ю. Бронхиальная астма и гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь: взгляд клинициста и патофизиолога // Терапевтический архив. - 2011. - №6. - С. 73-78

6. Лямина С.В., Круглов С.В., Веденикин Т.Ю. Бородовицына О.А., Суворова И.А., Шимшелашвили Ш.Л., Малышев И.Ю. Альтернативное репрограммирование М1/М2 фенотипа перитонеальных макрофагов мышей in vitro с помощью интерферона гамма и интерлейкина 4 // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2011. - №4. - С.235-239

7. Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Малышев И.Ю. Современный подход к анализу иммунного ответа при заболеваниях легких: сурфактантный белок D и его роль // Современные проблемы науки и образования. - 2011. - №4.- http://www.science-education.ru/98-4717

8. Лямина С.В., Веденикин Т.Ю., Круглов С.В., Шимшелашвили Ш.Л., Буданова О.П., Малышев И.Ю. Особенности фагоцитарной и миграционной активности альвеолярных макрофагов М1 и М2 фенотипов // Фундаментальные исследования. - 2011. - №11(3). -С. 536-539

...