Механизмы дисфункции митохондрий и нарушений ионного гомеостаза при глутаматной нейротоксичности

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Механизмы дисфункции митохондрий и нарушений ионного гомеостаза при глутаматной нейротоксичности

14.03.03 - Патологическая физиология

Сурин Александр

Москва - 2013

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «НИИ общей патологии и патофизиологии» Российской Академии медицинских наук

Работа выполнена в Лаборатории патологии ионного транспорта и внутриклеточной сигнализации ФГБУ «НИИ общей патологии и патофизиологии» РАМН и в Лаборатории клеточных и молекулярных технологий ФГБУ «Научный центр здоровья детей РАМН.

Научные консультанты

доктор медицинских наук, профессор Б.И. Ходоров

доктор медицинских наук, профессор В.Г. Пинелис

Официальные оппоненты:

Лукьянова Людмила Дмитриевна, доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАМН, ФГБУ НИИОПП РАМН, Зав. лаб.

Зинченко Валерий Петрович, доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Институт биофизики клетки» РАН, Зав. лаб.

Черняк Борис Викторович, доктор биологических наук, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Зав. лаб.

Ведущая организация: ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ (Информационный бюллетень №310, июнь 2011) в странах со средним и высоким уровнем дохода инсульт и другие цереброваскулярные заболевания прочно занимают второе место (9-13%) после сердечно-сосудистых по уровню смертности (14-16%). С учетом нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера и др.) и травм, полученных при несчастных случаях, повреждения мозга становятся на один уровень с сердечно-сосудистыми заболеваниями по доле летальных исходов. По потерям трудоспособности инсульт, цереброваскулярные и нейродегенеративные заболевания опережают все остальные причины инвалидности среди выживших.

При повреждениях мозга, вызванных кислороддефицитными состояниями, травмами или инсультами, вокруг участков поражения развиваются зоны энергозависимого нарушения метаболизма клеток, в первую очередь, нейронов (так называемая «ишемическая полутень» или «пенумбра» (penumbra) (Dirnagl et al, 1999). В синапсах нейронов, оказавшихся в этих зонах, происходит неконтролируемое высвобождение основного возбуждающего нейромедиатора центральной нервной системы глутамата (Glu). Избыточная стимуляция глутаматных рецепторов, прежде всего ионотропных рецепторов NMDA-типа, приводит к перегрузке нейронов ионами Са²⁺ и Na⁺, нарушению сигнальных, метаболических и энергетических процессов и, в итоге, к увеличению области поражения мозга в результате отсроченной гибели нейронов (Mattson & Mark, 1995; Nicotera & Orrenius, 1998; Sattler & Tymianski, 2000). Разработка методов, позволяющих ограничить область вторичного поражения мозга, требует учета многих параметров, влияющих на способность нейронов к выживанию. Первичные культуры нейронов, полученных из различных разделов мозга млекопитающих (в основном крысы и мыши), являются общепризнанной и часто незаменимой моделью исследования процессов, происходящих в мозге в норме и при патологии (Choi, 1987, 1992).

Предшествующие пионерские исследования (Tymianski et al, 1993; Adamec et al, 1998; Castilho et al, 1998), выполненные, в том числе, с участием нашего коллектива (Khodorov et al, 1996; см. также обзоры Ходоров, 2000; Khodorov, 2004), показали, что в нейрональных культурах длительное воздействие высоких доз Glu вызывает двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са²⁺ ([Ca²⁺]_i). Вторая фаза подъема [Ca²⁺]_i , т.н. отсроченная кальциевая дисрегуляция (ОКД), всегда происходит синхронно со значительным падением трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий (далее «митохондриального потенциала», ДШ_m) (Vergun, et al, 1999). Измерения на сестринских культурах показали, что доля нейронов, в которых возникла ОКД, почти линейно соотносится с долей нейронов, погибших через несколько часов после окончания Glu воздействия (Limbric et al, 1995). Этим обстоятельством, а также тем, что Са²⁺ является вторичным мессенджером во всех типах клеток и регулирует мириады внутриклеточных процессов (Авдонин и Ткачук, 1994; Berridge, 2000), и обусловлен незатухающий интерес к механизму возникновения ОКД и использованию этого феномена для тестирования нейротропных свойств различных агентов (см., например, Suwanjang et al, 2013; Vaarmann et al, 2013).

Исследования, выполненные за последние 20 лет, выявили ряд возможных причин развития ОКД и последующего сохранения высокого [Ca²⁺]_i плато. Эти исследования можно разделить на два направления в зависимости от того, какой из механизмов развития ОКД считается основным: (1) возникновение неспецифической поры высокой проводимости во внутренней мембране митохондрий (mitochondrial permeability transition, мРТ) или (2) развитие энергетического кризиса, приводящего к дисбалансу ионного гомеостаза, кульминацией которого является ОКД. Центральная роль митохондрий не подвергается сомнению в любой из гипотез развитии ОКД и последующей гибели нейронов. При этом остаются невыясненными следующие вопросы: 1) на какой стадии ОКД образуется мРТ в нейронах; 2) Является ли образование мРТ главной причиной ОКД и последующего энергетического кризиса, или наоборот, мРТ является следствием развития ОКД? 3) Предшествует ли критическое падение концентрации АТФ в цитозоле ([ATP]с) развитию ОКД или низкий уровень [ATP]с достигается только на стадиях высокого [Ca²⁺]_i плато? 4) Каковы механизмы вовлечения митохондрий в развитие ОКД и поддержание высокого [Ca²⁺]_i плато ?

Для решения этих вопросов необходимо не только расширение арсенала методов исследования, но и разработка методических приемов, позволяющих проводить многопараметрические прижизненные высокочувствительные измерения процессов, вовлекаемых в развитие ОКД. Значительный прогресс в изучении разнообразных аспектов внутриклеточной сигнализации в норме и патологии был достигнут благодаря применению белковых конструктов, состоящих из флуоресцентных и сенсорных белков, которые селективно реагируют на изменения внутриклеточных параметров, таких как рН, концентрации Са²⁺, пероксида водорода, циклического АМФ и др. (Shaner et al, 2006; Chudakov et al, 2010; Lukyanov et al, 2010; Orosco et al, 2013). В дифференцированных клетках экспрессия флуоресцентных белковых сенсоров затруднена и поэтому примеры применения этого метода при исследовании внутриклеточных процессов в нейронах пока немногочисленны (Rintoul et al, 2003; Shalbueva et al, 2006; Bolshakov et al, 2008; Kovac et al, 2012). Вирусная трансфекция позволяет достичь 80-90% экспрессии флуоресцентного сенсора в нейронах (Bano et al, 2005), однако требует особых мер предосторожности при проведении экспериментов и поэтому реже используется. Главными преимуществами флуоресцентных белковых сенсоров являются (1) возможность отслеживать такие внутриклеточные характеристики, для которых пока не удалось создать синтетические индикаторы и (2) адресная доставка в интересующие внутриклеточные компартменты с прецизионностью, недоступной для низкомолекулярных синтетических флуоресцентных зондов. Учитывая все это, при выполнении данной работы были разработаны способы одновременной экспрессии в культивируемых нейронах различных флуоресцентных белковых сенсоров и исследование с их помощью внутриклеточной сигнализации, ионного гомеостаза и биоэнергетики нейронов в норме и при нейротоксическом действии Glu.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось выяснение роли митохондрий в механизмах нарушения ионного гомеостаза нейронов при гиперстимуляции ионотропных глутаматных рецепторов, приводящей к развитию отсроченной Са²⁺ дисрегуляции (ОКД) и последующей гибели клеток.

Задачи исследования:

1. Разработать мультипараметрическую флуоресцентно-микроскопическую систему для измерений функционального состояния митохондрий и ионного гомеостаза в индивидуальных нейронах с комбинированным использованием синтетических флуоресцентных зондов и флуоресцентных белковых сенсоров с адресной доставкой в цитозоль и митохондрии.

2. Исследовать взаимосвязь между индуцированной глутаматом ОКД, митохондриальной деполяризацией и механизмом последующей гибели нейронов.

3. Исследовать влияние на развитие ОКД внешних факторов, модулирующих функциональное состояние митохондрий (инигбирования дыхания, разобщения окислительного фосфорилирования, глюкозной депривации, реверсии Na⁺/Са²⁺ обмена).

4. Изучить вклад в развитие дисфункции митохондрий и ОКД эндогенных факторов, возникающих в результате индуцированной глутаматом активации фосфолипаз А2 и поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1.

5. Исследовать процессы, в которых митохондрии играют активную роль в противодействии развитию ОКД.

6. Исследовать различия биоэнергетики культивируемых нейронов при действии глутамата и в нейронах, полученных из животных пре- и постнатального периода развития.

Научная новизна

1. Впервые показано, что более 90% культивируемых нейронов, в которых за время аппликации Glu успела развиться ОКД и сильная митохондриальная деполяризация, погибают спустя 14-20час от некроза и апоптоза.

2. Показано, что эндогенными факторами развития ОКД, снижающими митохондриальный синтез АТФ и Са-буферные свойства митохондрий, являются арахидоновая кислота, высвобождаемая в результате активации фосфолипаз А2, и падение NADH вследствие активации поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1.

3. Установлено, что в культивируемых нейронах наряду с Glu-индуцированными патогенными процессами, развиваются также процессы, противодействующие дисфункции митохондрий и глутаматной токсичности: 1) переключение на другой метаболический путь окисления субстратов, компенсирующий глюкозную депривацию и дефицит пирувата; 2) увеличение градиента рН между матриксом митохондрий и цитозолем (ДрН), компенсирующее снижение митохондриального потенциала (ДШ_m); 3) рост активности сукцинатдегидрогеназы.

4. Впервые показано, что в индивидуальных культивируемых нейронах развитию ОКД предшествует падение концентрации АТФ в цитозоле до 10-20% от уровня в покоящихся клетках.

5. Обнаружены кардинальные отличия в биоэнергетики нейронов пре- и постнатального периодов: в культивируемых нейронах, из гиппокампа эмбрионов крысы (Е17-Е18), основным способом производства АТФ является гликолиз, тогда как в нейронах из гиппокампа постнатальных крыс (Р1-Р2) АТФ синтезируется преимущественно за счет окислительного фосфорилирования.

Научно-практическое значение работы

Разработаны флуоресцентно-микроскопические методы регистрации в индивидуальных клетках изменений одновременно нескольких (от двух до четырех) внутриклеточных параметров, таких, как внутриклеточная концентрация свободного Са²⁺ и Nа⁺ , NAD(P)H и FAD автофлуоресценции, активных форм кислорода, потенциала митохондриальной и плазматической мембраны, рН в цитозоле и митохондриях.

Применены новые фармакологические подходы (ингибиторный анализ) и внедрен многопараметрический морфологический анализ выживаемости нейрональной культуры.

Впервые удалось достичь экспрессии в нейрональных культурах одновременно двух сенсорных флуоресцентных белков, имеющих разные спектральные параметры и локализованных в разных внутриклеточных компартментах.

Разработанные методы могут служить для тестирования механизмов действия биологически активные веществ. Вещества, задерживающие развитие ОКД, могут быть перспективными при разработке препаратов нейропротекторного действия. Увеличение лаг-периода ОКД под влиянием испытуемого вещества, является количественным критерием эффективности подобных веществ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Развитие ОКД происходит синхронно с развитием сильной митохондриальной деполяризации (МД). Нейроны, в которых ОКД достигла фазы высокого [Ca²⁺]_i плато, гибнут через 14-20час в результате некроза или апоптоза в пропорции ~1:1. Длительность лаг-периода ОКД и МД может служить количественной мерой для тестирования нейропротекторных или нейротоксических свойств биологически активных соединений.

2. Развитие ОКД вызвано действием нескольких факторов, в числе которых высвобождение из фосфолипидов арахидоновой кислоты, снижение NAD(P)H, увеличение ионной (протонной) проводимости внутренней мембраны митохондрий, разобщение окислительного фосфорилирования, падение [ATP]с , снижение Са²⁺-буферной емкости митохондрий. Восходящая фаза ОКД и начало высокого [Ca²⁺]_i плато не являются следствием образования «классической» неспецифической высокой проводимости (мРТ), поскольку являются обратимыми, происходит сильное падение, но не коллапс ДШ_m и ДрН, митохондрии удерживают в матриксе NAD⁺ и более низкомолекулярные субстраты цикла трикарбоновых кислот.

3. При действии нейротоксических доз Glu, одновременно с появлением факторов, ослабляющих функционирование митохондрий в качестве производителей АТФ и основных Са²⁺-буферных емкостей нейронов, происходит привлечение внутриклеточных ресурсов, препятствующих ОКД, а именно, мобилизация «резервного» субстрата взамен пирувату при блокаде гликолиза, рост ДрН, усиление работы FAD-зависимого комплекса II дыхательной цепи.

4. При переходе от эмбриональной (Е17-Е18) к постнатальной (Р1-Р2) стадии развития в нейронах мозга происходит перестройка биоэнергетики проявляющаяся в том, что в основной массе (~84%) культивируемых нейронов из мозга пренатальных животных основным способом производства АТФ служит гликолиз, тогда как в нейронах из гиппокампа новорожденных крыс доминирующим способом синтеза АТФ становится окислительное фосфорилирование.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на Международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2007, 2009, 2011, 2013), на 3-ем Съезде Биохимического общества России, Санкт-Петербург-2003, на Конференциях Физиологического общества Великобритании (Aberdeen-2000, London-2002), 3-ем Российском Конгрессе по патофизиологии (Москва-2004), на Конференциях Американского Общества нейронаук (Society for Neurosciences, Washington-2005, 2008, 2011; Chicago 2009; San-Diego, 2010), на Съезде Американского биофизического общества (Baltimore-2011), на 8-ом Всемирном конгрессе IBRO (Florence-2011), на 3-ем Съезде физиологических обществ стран СНГ (Ялта-2011).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 43 печатных работах, из которых 16 в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем работы

Диссертация написана на стр., состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который включает отечественных и иностранных источника.

Методы и материалы

Приготовление первичных нейрональных культур. Культуры приготавливали из мозжечка 6-7-дневных или из гиппокампа 1-2-дневных крыс Вистар. Эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. Животных анестезировали, декапитировали, извлекали мозг и затем гиппокампы. Суспензию клеток (10⁶ клеток/мл) получали, обрабатывая гиппокампы папаином (10ед/мл), диссоциируя 15-кратным пипептированием, и отмывали от разрушенных клеток 2-кратным осаждением в центрифуге (1000об/мин). Суспензию (200мкл) переносили на покровные стекла, прикрепленные к лункам 35мм пластиковых чашек Петри (MatTek, США). Стекла предварительно покрывали поли-этиленимином (10 мг/мл). Через час добавляли 1,5 мл нейробазальной среды, содержащей 2% Supplement B-27 и 0.5 мМ L-глутамина. Клетки содержали при 37^оС в атмосфере 5%СО2/95% воздуха при 100%влажности. На 3-4 день добавляли арабинозид (AraC, 10мкМ) для подавления роста глиальных клеток. Культуры использовали на 8-13 день после посадки (2-7 дней после трансфекции).

Содержание NAD+ и NADH в клеточных культурах измеряли в плашечных ридерах с помощью наборов, в которых NAD+ восстанавливается до NADH с последующим восстанавлением формазана до интенсивно окрашенного соединения. Среднюю [АТФ] в клеточной культуре измеряли методом люциферин/люциферазной хемилюминесценции. Для измерения активности ПАРП-1 применяли иммуноцитофлуоресцентное окрашивание продукта реакции поли(АДФ-рибозы) с последующим анализом флуоресцентно-микроскопических изображений.

Флуоресцентно-микроскопические измерения. Для измерения [Ca²⁺]_i клетки нагружали Са²⁺ индикаторами (Fura-2, Fluo-3, Rhod-2 или их низкоаффинными аналогами) в форме ацетоксиметиловых (АМ) эфиров (40-50мин, 37^оС, концентрации, в зависимости от индикатора, составляли 0,5-5мкМ). Изменения ДШ_m отслеживали, окрашивая клетки потенциал-чувствительным зондом Rh123 (2,5мкг/мл, 15мин, 37^оС) или TMRM (4-40нМ, 40мин, 37^оС).

Измерения выполнены при 27-29^оС в буфере, содержащем (мM): 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl2, 20 HEPES, 5 D-глюкозы; pH 7,4. В безнатриевом буфере NaCl заменяли на N-метил-D-глюкамин (130мМ); рН 7,4 устанавливали, добавляя 20мМ HEPES и дотитровывая 1М HCl. Номинально бескальциевые растворы вместо CaCl₂ содержали 0,1мМ EGTA и 2мМ MgCl₂. Смену растворов осуществляли 2х2мл заменой содержимого чашки с клетками за время не более 30с. Клетки термостатировали на предметном столике микроскопа при 28-29^оС.

Для измерения рН митохондрий и цитозоля, а также [ATP]с с помощью флуоресцентных белковых сенсоров плазмиды, несущие гены соответствующих белков, доставляли в клетки, используя Lipofectamin-2000 (LF-2000). ДНК (0,5-1мкг/50мкл OptiMem) смешивали с LF-2000 (1мкл/50мкл OptiMem) и после образования комплекса ДНК с LF-2000 вносили смесь в культуру с клетками (50мкл на 200мкл клеточной среды). Для одновременного измерения [ATP]с и рНс мы воспользовались тем, что в АТ1.03 реализован феномен флуоресцентного (фёрстеровского) резонансного переноса энергии (FRET). При регистрации сигнала АТ1.03 в условиях возбуждения флуоресценции только белка-акцептора энергии (возбуждение 485-500нм, испускание 525-535нм) практически исключена зависимость флуоресценции от уровня [ATP]с , что позволило отслеживать изменения только рНс. Калибровку рН-зависимости сигналов флуоресцентных белковых сеносоров в нейронах проводили как описано в (Bolshkov et al, 2008), используя растворы с ионофорами, обеспечивающими выравнивание рН между буфером и внутриклеточной средой. Калибровочные растворы имели состав (мМ): 0,005 нигерицина, 0,001 FCCP, 134 глюконата калия, 1 MgCl2, 20 HEPES. Для установки рН использовали 1М растворы HCl или КОН. Для предотвращения работы митохондриальной АТФсинтазы в прямом или реверсивном режиме в калибровочные растворы добавляли олигомицин (2,5мкг/мл).

В экспериментах по исследованию выживаемости культивируемых нейронов с помощью флуоресцентных красителей применяли Hoechst 33342 (10мкг/мл), Syto-13 (1мкМ) и этидиум гомодимер (EthD-1, 3мкМ). Концентрацию NAD+ и NADH определяли с помощью аналитического набора BioAssay Systems (США).

Флуоресцентно-микроскопические измерения выполнены на установках, включающих инвертированный микроскоп Olympus IX-71 или Zeiss Axiovert-200, систему освещения Sutter Labmda 10-2 со 175Вт ксеноновой лампой (Sutter Instruments) и CCD-камеру CoolSNAP HQ2 (Photometrics), управляемых через компьютерную программу MetaFluor 6.2 или 7.2 (Molecular Devices, США).

Все реагенты фирмы Sigma (США). Флуоресцентные реагенты, включая Са²⁺ индикаторы, потенциал-чувствительные зонды, МитоТрекеры, витальные красители, ред-окс-индикаторы приобретены у Invitrogen (США). Плазмиды, кодирующие флуоресцентные белковые сенсоры, были любезно предоставлены Dr. R.Rizzuto, Dr. H.Imamura, Д-ром Д.Чудаковым и Д-ром В.Белоусовым.

Для обсчета флуоресцентных сигналов и построения графиков, а также для статистической обработки данных использовали программы MetaFluor Analyst, Excel-2007, Prizm-4 и Origin 7.5.

Основные результаты и обсуждения

1. Исследование взаимосвязи между индуцированной глутаматом отсроченной Са²⁺ дисрегуляцией, митохондриальной деполяризацией и механизмом последующей гибели нейронов.

1.1. Синхронность изменений внутриклеточной концентрации

свободного Са²⁺ ([Ca²⁺]_i) и трансмембранного потенциала внутренней мембраны митохондрий (ДШ_m).

Типичные изменения [Ca²⁺]_i (Рис. 1А) и ДШ_m (Рис. 1Б), индуцированные Glu в культуре гранулярных нейронов мозжечка крысы и в двух представительных нейронах (Рис. 1В,Г) из этой группы клеток показаны на рисунке 1А,В. Видно, что токсическая доза Glu (100кМ, 10мкМ глицина, 0 Mg²⁺) вызвала вторичный подъем [Ca²⁺]_i (ОКД) и митохондриальную деполяризацию (падение ДШ_m) с лаг-периодами (DCD-Lag) индивидуальными для каждого нейрона. Совмещение графиков [Ca²⁺]_i и изменений сигнала потенциал-чувствительного зонда Rh123 (Рис. 1В,Г) демонстрирует, что при развитии ОКД рост [Ca²⁺]_i и падение ДШ_m происходят синхронно. Соотношение между началом ОКД и началом сильной митохондриальной деполяризации (МД) соответствует линейной функции во всем диапазоне измерений (r²=0,995) (Рис. 1Д). Отмывание Glu бескальциевым буфером, способствует восстановлению низкого [Ca²⁺]_i , причем задержка между моментом удаления Glu и началом снижения [Ca²⁺]_i (Recovery-Lag) также индивидуальна для каждого нейрона, как и задержка между моментом добавления Glu и началом ОКД (DCD-Lag) (Рис. 1Е). Такое соотношение объясняется, вероятно тем, что при более раннем наступлении ОКД (короткий DCD-Lag) в митохондриях накапливается больше Са²⁺ и, соответственно, требуется больше времени на его удаление в постглутаматный период (более длительный Recovery-Lag). Деполяризация митохондрий в бескальциевом буфере высвобождает из них Са²⁺ (Рис. 1А,В,Г), причем тем больше, чем короче период между удалением Glu и деполяризацией митохондрий что согласуется с опубликованными ранее данными (Kiedrowski et al., 1994; Brocard et al, 2001). Коэффициент линейной корреляции между DCD-Lag и Recovery-Lag не велик (на Рис. 1Д r²=0,45), что отражает различие механизмов, регулирующих поступление и удаление Са²⁺ во время ОКД и в постглутаматный период. На это же указывает различие в сигналах потенциал-чувствительного зонда в нейронах, имеющих разную кинетику снижения [Ca²⁺]_i в постглутаматный период (Рис. 1В,Г). В среднем, чем раньше возникала ОКД, тем продолжительнее была фаза высокого [Ca²⁺]_i плато (Рис. 1Е).

1.2.Математическое моделирование сигналов потенциал-чувствительныч флуоресцентных зондов Rh123 и TMRM. Важно отметить, что сигналы потенциал-чувствительных зондов сложным образом зависят от потенциала как митохондриальной (ДШ_m), так и плазматической мембраны (ДШ_p).

Анализ математической модели, связывающей изменения флуоресценции «одноволновых» потенциал-чувствительных зондов, таких как Rh123 и TMRM, показал, что наиболее критическими факторами, которые, помимо ДШ_m и ДШ_p , определяют изменения сигналов Rh123 и TMRM, являются проницаемость этих зондов через плазматическую мембрану, доля митохондриального матрикса в объеме клетки и концентрация самотушения (Ward et al., 2000; Nicholls & Ward, 2000). Мы выполнили расчеты изменений ДШ_m и ДШ_p на основании алгоритмов, предложенных в указанных работах. Имитация изменений флуоресценции TMRM и Rh123 во время 1-ой фазы Glu-индуцированных изменений [Ca²⁺]_i и при развитии ОКД показала следующее. Более гидрофобный и быстро проникающий через плазмалемму зонд TMRM вытекает из нейронов в ответ на Glu настолько быстро, что возникновение ОКД отражается на его сигнале лишь как небольшое ускорение снижения флуоресценции. В то же время проницаемость Rh123 сквозь плазмалемму почти в 20 раз меньше по сравнению с TMRM (соответственно 0,00045с-¹ и 0,007с-¹) и поэтому за время от момента добавления Glu и до развития высокого [Ca²⁺]_i плато Rh123 циркулирует

Рис. 1. Глутамат индуцируете двухфазные изменения внутриклеточной концентрации Са²⁺ ([Ca²⁺]_i ) и митохондриального потенциала (ДШ_m) в культивируемых нейронах.

Изменения [Ca²⁺]_i (А) и ДШ_m (Б) в группе клеток и в двух представительных нейронах (В и Г) из этой группы. (Д) Соотношение между началом ОКД (DCD-Lag, c) и началом второй фазы митохондриальной деполяризации (MD-Lag, c). (Е) Соотношение между лаг-периодом ОКД (DCD-Lag, c) и лаг-периодом восстановления [Ca²⁺]_i в постглутаматный период (Recovery-Lag, c); Представлены данные культур гранулярных нейронов мозжечка крысы (возраст культур 7 дней, 7DIV). На этом и последующих рисунках (если не отмечено особо) изменения [Ca²⁺]_i представлены, как изменения рэйшиометрического сигнала флуоресцентного Са²⁺ индикатора Fura-FF (F340/F380); на этом и последующих рисунках, если не указано специально, относительные изменения ДШ_m представлены, как изменения флуоресценции потенциал-чувствительного зонда Rh123 (F/Fo), где F - текущее значение сигнала, а Fo - исходное в покоящихся нейронах.

преимущественно между цитозолем и митохондриями, не вытекая наружу. Благодаря этому свойству, изменения сигнала Rh123 отражают изменения ДШ_m и слабо зависят от ДШ_p. Это упрощает интерпретацию данных и поэтому мы использовали в основном Rh123, за исключением случаев, когда перекрывание спектров Rh123 со спектрами других флуорофоров не допускало такого применения.

Анализ кинетики Rh123 показывает также, что снижение флуоресценции, наступающее во время высокого [Ca²⁺]_i плато и пост-глутаматного периода, может быть вызвано ускорением вытекания зонда из клетки за счет изменения барьерных свойств плазмалеммы. Важным фактором, облегчающим вытекание зонда из клетки, может быть появление в мембране гидрофобного аниона в качестве противоионов для липофильных катионов Rh123 и TMRM (Nicholls, 2006). В роли таких противоионов могут выступать свободные жирные кислоты (Severin et al, 2010), которые при Glu воздействии образуются в результате активации фосфолипаз А2 (см. далее).

1.3. Продолжительность ОКД и механизм гибели нейронов. На примере культивируемых нейронов гиппокампа крысы было показано, что нейроны, имевшие ОКД и не сумевшие восстановить низкую [Ca²⁺]_i после удаления Glu, погибают (Limbric et al, 1995). Необходимо отметить, что эти измерения были выполнены на сестринских культурах. Вывод о том, что гибли именно те нейроны, которые имели затруднения в восстановлении низкой [Ca²⁺]_i, был сделан на основании сопоставления статистических данных, а не прямого наблюдения за теми же самыми нейронами. Мы проверили, имеется ли корреляция между длительностью лаг-периода ОКД (продолжительностью высокого [Ca²⁺]_i плато во время действия Glu, см. Рис. 1Е) и последующей гибелью именно тех нейронов, которые имели ОКД. Для этого клетки, не нарушая стерильности культур, подвергали действию Glu, а затем возвращали в кондиционную среду и оставляли на 18-20час в СО₂-инкубаторе. Выживаемость определяли, анализируя изображения в проходящем свете и флуоресцентные изображения тех же самых нейронов, окрасив их

.

На рисунке 2 графики [Ca²⁺]_i ответов клеток на Glu разделены на две группы в зависимости от того, погибли клетки впоследствии от некроза (Рис. 2А) или апоптоза (Рис. 2Б). Видно, что кинетика развития ОКД одинакова, как в клетках погибших от некроза, так и от апоптоза, хотя в первых DCD-Lag в среднем короче и ОКД наступала раньше, чем в нейронах, погибших по апоптотическому пути (Рис. 2В). Из всех нейронов, имевших ОКД, удалось обнаружить среди живых только 3% клеток (2 из 76 нейронов в трех посадках культур). Среди погибших 60% находились в некрозе, остальные 37% в апоптоза. Все нейроны, которые перед удалением Glu сохранили относительно низкую [Ca²⁺]_i и не имели ОКД, остались живы. Возможно, при развитии ОКД происходит активация сразу нескольких внутриклеточных механизмов гибели, кульминацией которых (через 18-20час) является некроз либо апоптоз.

1.4. Исследование роли ингибирования протонных насосов и увеличения проводимости внутренней митохондриальной мембраны в возникновении Са²⁺ дисрегуляции. Учитывая тесную связь индуцированных нейротоксическими дозами Glu изменений [Ca²⁺]_i и ДШ_m (Рис.1), и последующей гибели нейронов (Рис.2), мы исследовали, как отражается на этих параметрах дисфункция митохондрий, вызванная митохондриальными ядами, и повышением протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны.

Кратковременная аппликация Glu не успевала, как правило, вызвать ОКД и сильную МД в молодой культуре нейронов (7DIV) (Рис.3А,Б). Протонофор FCCP (0,3мкM), добавленный перед Glu, быстро деполяризовал митохондрии, но не влиял на [Ca²⁺]_i (Рис.3В,Г), свидетельствуя о том, что в покоящихся нейронах концентрация Са²⁺ в матриксе митохондрий и цитозоле одинаково низкая. Аппликация Glu в присутствии FCCP вызывала скачок [Ca²⁺]_i , названный немедленной Са²⁺ дисрегуляцией, (НКД, Tymianski et al, 1993; Nicholls & Budd, 2000). Одна из двух причин НКД состоит в том, что деполяризованные митохондрии не способны на электрофоретический захват Са²⁺, поступающего в цитозоль по Glu-активированным каналами, указывая на важную роль митохондрий в нейронах как Са²⁺ буфера. Высокое [Ca²⁺]_i плато удерживалось даже после удаления Glu до тех пор, пока протонофор оставался в растворе (Рис.3В,Г), свидетельствуя о нарушении системы удаления избытка Са²⁺ из цитозоля. Очевидно, в результате вызванного протонофором коллапса ДШ_m , митохондриальная АТФсинтаза переходит в режим АТФазы и, становясь протонным насосом, поддерживает ДШ_m . Реверсия АТФсинтазы в АТФазу создает дефицит АТФ для Са²⁺ насосов плазматической мембраны, что и служит второй причиной НКД. Это предположение было подтверждено экспериментами, в которых протонофор добавляли вместе с ингибитором F1Fo-АТФазы олигомицином. В этом протоколе Glu также вызвал НКД, однако большинство нейронов восстанавливало исходную [Ca²⁺]_i сразу после удаления Glu, несмотря на сохраняющуюся сильную МД (Рис.3Д,Е). Оубаин, ингибитор Na⁺/K⁺-АТФазы плазматической мембраны, являющейся в нейронах одним из главных потребителей АТФ (Ames, 2000), подобно олигомицину, придавал нейронам способность восстанавливать низкую [Ca²⁺]_i после удаления Glu при продолжающейся МД (Рис.3Ж,З). Напротив, ингибирование Са²⁺-насосов плазматической мембраны эозином Ж (0,25мМ) затягивало восстановление низкого [Ca²⁺]_i. Такой же эффект вызывала замена Са²⁺ его суррогатом Ва²⁺, который может входить в клетку по Са²⁺-проницаемым каналам (Ascher et al, 1988), но плохо удаляется Са²⁺-АТФазой (Graf et al, 1982).

Рис. 3. Немедленная Са²⁺ дисрегуляция (НКД), вызванная Glu в условиях коллапс ДШ_m , может быть подавлена в постглутаматный период ингибиторами F1Fo-АТФазы митохондрий или Na⁺/K⁺-АТФазы плазмалеммы.

Изменения [Ca²⁺]_i (А,В,Д,Ж) и ДШ_m (Б,Г,Е,З) индуцированные Glu в контрольной культуре гиппокампальных нейронов (7DIV) (А,Б), в присутствии протонофора FCCP (0.3мкM) (В,Г) и в присутствии FCCP при одновременном ингибировании F1Fo-АТФазы олигомицином (Oligo, 2.5мкг/мл) или Na⁺/K⁺-АТФазы оубаином (Ouab, 0.5мМ). Для предотвращения действия эндогенного Glu в отмывающий раствор добавляли ингибитор NMDA-каналов МК-801 (10мкМ). (Ж,З) Пунктиром выделены сигналы астроцита.

НКД можно было получить, используя в аналогичных протоколах вместо протонофоров ингибиторы дыхательной цепи (ротенон, антимицин А, цианид). Добавление цианида (3мМ NaCN) к покоящимся нейронам вызывало небольшую МД за счет того, что F1Fo-АТФаза, расходуя поступающий из цитозоля АТФ, работала как протонный насос, генерируя ДШ_m. НКД и сильная МД возникала после добавления Glu в результате поступления в цитозоль Са²⁺ и Na⁺ по Glu-управляемым каналам. Расход АТФ, производимого гликолизом, многократно возрастал за счет потребления Na⁺/K⁺-АТФазами и при такой конкуренции за АТФ производительности F1Fo-АТФазы уже не хватало для генерации высокого ДШ_m при поступлении Са²⁺ в митохондрии по унипортеру. Удаление Са²⁺ из буфера значительно уменьшало МД, вызванную Glu в присутствии блокатора комплекса IV дыхательной цепи цианида. МД, вызванную Glu в присутствии CN, можно было уменьшить еще больше, отменив потребление АТФ Na⁺/К⁺-АТФазами предынкубацией клеток с оубаином.

НКД возникала также при добавлении протонофоров или ингибиторов протонных насосов дыхательной цепи, если эти агенты добавляли не заранее, а уже после начала действия Glu. Также, как в протоколе с предварительным добавлением этих агентов, восстановление низкого [Ca²⁺]_i в постглутаматный период становилось возможным только после отмывания митохондриальных ядов и восстановления ДШ_m. Блокада F1Fo-АТФазы олигомицином способствовала восстановлению [Ca²⁺]_i сразу после удаления Glu при продолжающемся присутствии митохондриальных ядов

Поскольку отключение Na⁺/К⁺-АТФазы от потребления АТФ с помощью оубаина облегчало восстановление [Ca²⁺]_i в постглутаматный период, был применен другой способ блокирования Na⁺/К⁺-АТФазы, а именно, замена Na⁺ в буфере на непроникающий органический катион N-метил-D-глюкамин (NMG⁺). Замена Na⁺ на NMG⁺ не повлияла на базальный уровень [Ca²⁺]_i и ДШ_m покоящихся нейронов (Рис. 4Г,Д,Е). Glu вызвал в безнатриевом буфере (NMG-

Рис. 4. Замена Nа⁺ на непроникающий органический катион NMG⁺ усиливает индуцированный глутаматом рост внутриклеточной концентрации свободного Са²⁺ ([Ca²⁺]_i) и вызывает глубокую митохондриальную деполяризацию.

глутамат митохондриальный деполяризация

Изменения [Ca²⁺]_i (А и Г) и митохондриального потенциала (ДШ_m) (Б и Д) в буфере с обычным содержанием Na⁺ (А, Б, В) и в безнатриевом растворе (Г, Д, Е) в первичной культуре нейронов из гиппокампа крысы. (В и Е) Изменения [Ca²⁺]_i (сплошные линии) и ДШ_m (пунктирные линии) в двух представительных нейронах совмещены попарно для демонстрации синхронности изменений [Ca²⁺]_i (левые оси ординат) и ДШ_m (правые оси ординат). В безнатриевом буфере Na⁺ полностью заменен на N-метил-D-глюкамин (NMG, 130мМ). Концентрация Glu 20мкМ (10мкМ глицина, 0Mg²⁺). Олигомицин (2,5мкг/мл) добавляли за 5мин до Glu и в течение всего времени действия Glu буфере) настолько сильный рост [Ca²⁺]_i и быстрое падение ДШ_m, что практически отсутствовала стабилизация [Ca²⁺]_i и ДШ_m на промежуточном относительно низком уровне и изменение этих параметров было таким же, как при НКД. Вызвано это тем, что в отсутствие трансмембранного Na⁺ тока (1) ДШ_p почти не снижается и поэтому увеличен электрофоретический захват Са²⁺ нейронами (Kiedrowski, 1999; Czyz et al., 2002) и (2) Na⁺/Са²⁺-обмен через плазматическую мембрану осуществляется только в реверсивном режиме, превращая Na⁺/Са²⁺-обмен из механизма поддержания Са²⁺ гомеостаза в дополнительный путь поступления Са²⁺ в нейроны (Kiedrowski, 1999; Czyz et al., 2002; Storozhevikh et al., 2007)

Синхронность изменений [ATP] и ДШ_m в NMG-буфере сохранилась, что более ясно видно на совмещенных графиках [Ca²⁺]_i и ДШ_m одного из нейронов (Рис. 4Е), входящих в группу клеток на рисунках 4Г,Д. На кумулятивной кривой (Рис. 4Ж) видно, что в NMG-буфере 50% клеток вступило в фазу высокого [Ca²⁺]_i плато быстрее, чем в обычном Na⁺-содержащем буфере. Сходство с НКД подкрепляется тем, что олигомицин отдалял наступление ОКД и сильной МД (Рис. 1Ж), указывая на реверсию F1Fo-АТФсинтазы.

Данные, представленные на рисунке 6 показывают, что экономия АТФ за счет уменьшения его расхода Na⁺/К⁺-АТФазой не гарантирует удаления Са²⁺ из нейронов Са²⁺-АТФазой плазмалеммы. В случае одновременного поступления Са²⁺ по NMDA-каналам и реверсированным Na⁺/Са²⁺-обменникам Са²⁺ дисрегуляция и дисфункция митохондрий могут наступить также быстро, как при НКД, индуцированной Glu в присутствии митохондриальных ядов.

2. Исследовать влияние на развитие ОКД внешних факторов, модулирующих функциональное состояние митохондрий

2.1. Изменения митохондриального NAD(P)H и ДШ_m при химической гипоксии, разобщении окислительного фосфорилирования и глюкозной депривации. Протонные насосы дыхательной цепи черпают энергию для перекачивания протонов из матрикса в цитозоль (межмембранное пространство митохондрий) и создания трансмембранного электрохимического потенциала за счет окисления NADH комплексом I, убихинола комплексом III и цитохрома С комплексом IV. NADH образуется в результате восстановления NAD⁺ пируватдегидрогеназой и тремя ферментами цикла трикарбоновых кислот.

Изменения концентрации митохондриального NADH являются важным показателем окислительно-восстановительных процессов в митохондриях и поэтому были исследованы нами в нейронах в условиях, нарушающих фукционирование митохондрий и при токсическом воздействии Glu. Для этого измеряли собственную флуоресценции клеток, обусловленную суммой сигналов NADH и NADPH (NAD(P)H-автофлуоресценцию). Доминирующим компонентом является NADH-флуоресценция (Chance et al, 1979). Сопоставление NAD(P)H автофлуоресцентных изображений нейронов с флуоресцентными изображениями Rh123 тех же самых клеток (не показано), согласуются с данными двух-фотонной микроскопия высокого разрешения, что при регистрации флуоресценции NAD(P)H всей клетки около 70% сигнала принадлежит митохондриальному NADH (Li et al, 2008).

В покоящихся нейронах ингибирование комплекса IV дыхательной цепи цианидом (CN, 3мМ) прекращает окисление субстратов всеми протонными насосами, в том числе NADH комплексом I, и вызывает максимально возможный подъем флуоресценции этого динуклеотида (Рис. 5А). Возникающая при этом небольшая деполяризация митохондрий (Рис. 5В), обусловлена тем, что инверсия митохондриальной АТФсинтазы в АТФазу и гидролиза поступающего из цитозоля АТФ позволяет поддерживать ДШ_m+ на уровне близком к тому, который создают насосы дыхательной цепи (Nicholls & Budd, 2000). Отмывание CN восстанавливало сигналы как Rh123 и, так и NADH. Последующая блокада F1FoАТФазы олигомицином вызывала рост флуоресценции NAD(P)H до 87.1+1.9% (n=24) от подъема, вызванного цианидом (Рис. 5А). Оставшиеся 13% NADH дыхательная цепь затрачивает, очевидно, на компенсацию «токов утечки» сквозь внутреннюю митохондриальную мембрану.

Добавка CN в присутствии Oligo вызывала полную деполяризацию, как и применение высокой концентрации протонофора (FCCP, 1мкМ) в конце эксперимента (Рис. 5В). Изменения флуоресценции NAD(P)H в ответ на CN и FCCP имели противоположную направленность - протонофор снижал сигнал NAD(P)H до минимального уровня, что отражает максимальную скорость дыхания и, соответственно, потребления NADH дыхательной цепью. (Jackobson & Nicholls, 2004). В дальнейшем остановка дыхания цианидом, являющаяся химической имитацией аноксии, и максимальное потреблении NADH в присутствии высокой концентрации протонофора служили процедурами калибровки максимального и минимального сигналов NAD(P)H.

Пируват (Pyr), окисление которого служит первым из четырех процессов восстановления NAD⁺ до NADH митохондриальными дегидрогеназами, образуется в результате окисления глюкозы в цитозоле. Поэтому мы проверили как будут изменяться важнейшие энергетические показатели митохондрий, NAD(P)H и ДШ_m , при глюкозном голодании нейронов. Замена глюкозы на неметаболизируемый аналог 2-дезоксиглюкозу (DG) вызывала медленную деполяризацию митохондрий и постепенное снижение NAD(P)H автофлуоресценции (Рис.6). Плавное падение ДШ_m и NAD(P)H является отражением того, что в условиях ингибирования гликолиза снижается соотношение АТФ/АДФ в цитозоле, увеличивается нагрузка на F1FoАТФазу по синтезу АТФ и, соответственно, растет протонный ток через F1FoАТФазу, деполяризующий митохондрии. Ингибирование F1FoАТФазы олигомицином увеличивало ДШ_m , резко снижая сигнал Rh123, подобно представленному на Рис.5Б, но с большей амплитудой (не показано).

Добавление Pyr в безглюкозный буфер быстро восстанавливало NAD(P)H и ДШ_m до исходного уровня в покоящихся нейронах (Рис. 6), в соответствии с тем, что Pyr служит основным субстратом митохондрий, а NADH, в свою очередь, является основным источником автофлуоресценции нейронов. После отмывания Pyr добавление цианида в безглюкозный буфер вызвало сильный рост сигнала Rh123, такой же как FCCP в конце измерений (Рис. 6Б). Вызвано это тем, что в условиях ингибирования гликолиза F1FoАТФаза не может поддерживать потенциал за счет гидролиза цитозольного АТФ и поэтому остановка дыхательной цепи цианидом в безглюкозном буфере вызвала коллапс ДШ_m. Неожиданным оказалось то, что, несмотря на отсутствие глюкозы (и Pyr), цианид вызвал сильный подъем NAD(P)H, составлявший 74±5% (n=47) от максимального, вызванного CN в обычном буфере с глюкозой (Рис. 6А,В). Этот эффект указывает на то, что нейроны имеют для митохондрий «запасной» субстрат, который окисляется в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), обеспечивая относительно небольшое снижение ДШ_m в отсутствии гликолиза. Наиболее вероятным, на наш взгляд, субстратом может быть Glu, поскольку концентрация этой аминокислоты в цитозоле может достигать 10мМ (Nicholl, 2009) и имеется механизм ее транспорта в митохондрии (Frigerio et al, 2008), где Glu окисляется до одного из субстратов ЦТК, б-кетоглутарата.

Размещено на http://www.allbest.ru/

2.2. Изменения [Ca²⁺]_i и ДШ_m индуцированные Glu в отсутствии глюкозы. Молодые нейрональные культуры (6-8DIV), особенно приготовленные из гранулярных клеток мозжечка крысы, довольно устойчивы к действию Glu и в течение первых 10-20мин ОКД и вторичное падение ДШ_m развивается в небольшой доле нейронов (Рис. 7А,В,Е; см. также, Рис. 3А,Б), по сравнению с

Fig. 7. Блокада гликолиза приближает наступление Са²⁺ дисрегуляции и вторичного падения ДШ_m, а митохондриальный субстрат пируват отдаляет ОКД и сильную МД. Изменения [Ca²⁺]_i (А,В) и ДШ_m (Б,Г) в группе нейронов в глюкозу-содержащем буфере (А,Б) и в буфере, в котором глюкоза заменена на 2-дезоксиглюкозу (DG, 10мМ) (В,Г). (Д) Изменения [Ca²⁺]_i и ДШ_m в представительном нейроне в условиях блокады гликолиза. (Е) Доля нейронов (%) имевших ОКД при действии одного Glu (Control), а также при действии Glu в безглюкозном буфере (DG) и в этом буфере в присутствии пирувата (DG+Pyr) или лактата (DG+Lac). Концентрации Glu (100мкМ), Pyr и Lac по 10мМ.

более зрелыми культурами (12-14DIV и более; Vergun et al, 1999). Блокада гликолиза заменой глюкозы на DG резко ускоряло наступление ОКД и сильной МД (Рис. 7Б,Г,Е). Синхронность ОКД и вторичного падения ДШ_m при этом не нарушалась (Рис. 7Д). Любопытно, что Glu вызывал в безглюкозном буфере кратковременную гиперполяризацию митохондрий, проявившуюся в опускании сигнала Rh123 ниже уровня, предшествующего добавлению Glu (Рис. 7Д). Возможно, вход Са²⁺ в цитозоль и захват его митохондриями активирует работу ЦТК (McCormac & Denton, 1990; Denton, 2009). Не исключено также, что Glu индуцирует Са²⁺-зависимое ингибирование F1FoАТФазы (Mareno-Sanches, 1985), вызывая подобно олигомицину, рост ДШ_m .

Введение в безглюкозный буфер Pyr или лактата (Lac) восстанавливало лаг-период ОКД (снижало долю клеток, имевших ОКД за время наблюдения) до контрольного уровня в обычном буфере с глюкозой (Рис. 7Е). Lac оказывал даже несколько больший положительный эффект, чем Pyr. Вероятно, Lac, окисляясь цитозольной лактатдегидрогеназой до Pyr и восстанавливая NAD⁺ до NADH, предоставлял митохондриям через посредство челноков дикарбоновых кислот дополнительный источник восстановительных эквивалентов для Ред-Окс процессов дыхательной цепи.

2.3. Изменения NAD(P)H при глутаматном воздействии. При действии на нейроны Glu на митохондрии ложится дополнительная нагрузка по увеличению производства АТФ для ионных насосов, удаляющих Са²⁺ и Nа⁺ из цитозоля наружу, а также по поглощению избытка Са²⁺ из цитозоля, благодаря его электрофоретическому транспорту по кальциевому унипортеру (Kirichok et al, 2004) и, возможно, другими Са²⁺ каналами внутренней мембраны митохондрий (Michels et al, 2009). Поэтому мы проверили, как изменяется соотношение между затратами NADH на производство АТФ и компенсацию других ионных потоков через внутреннюю мембрану во время первой фазы действия Glu и во время ОКД. В 57% нейронов (113/206) из мозжечка крысы во время первой фазы Glu-индуцированных изменений [Ca²⁺]_i происходило снижение NAD(P)H до уровня, промежуточного между исходным в покоящихся клетках и минимальным, наблюдаемым при добавлении высокой концентрации протонофора в конце эксперимента. Развитие сильной МД (и, следовательно, ОКД, см. Рис. 1Д) происходило одновременно со вторичным падением NAD(P)H. Пример изменений ДШ_m и NAD(P)H в группе гранулярных нейронов мозжечка и в одном из представительных нейронов показан на Рис. 8А,Б. Низкие концентрации протонофоров (10-50нМ FCCP или 5-8мкМ

Рис. 8. Частичное ингибирование дыхательной цепи ускоряет наступление ОКД.

Изменения ДШ_m и NAD(P)H в нейронах из мозжечка крысы (16DIV) под действием одного глутамата (Glu) (А,Б) и Glu в присутствии низких концентраций ингибитора дыхания (0,2мМ NaCN) (В,Г). Для калибровки максимального и минимального сигнала NAD(P)H в начале и конце эксперимента добавлены, соответственно, 1мМ NaCN и 1 мкМ FCCP. (Д) Увеличение доли клеток (%), в которых Glu и Glu+CN индуцировали сильную митохондриальную деполяризацию. (Б,Г) Изменения сигналов потенциал-чувствительного зонда Rh123 и NAD(P)H автофлуоресценции в двух представительных нейронах. Сигналы Rh123 (возб.485нм; исп.525нм) и NAD(P)H (возб.360нм; исп.460нм) нормированы относительно исходных значений в покоящихся нейронах (F/Fo).

динитрофенола), не вызывавшие коллапса ДШ_m , снижали NAD(P)H и ускоряли наступление ОКД (не показано). На этом основании можно заключить, что ОКД начинается тогда, когда [NADH] в митохондриях опускается ниже величины, необходимой для поддержания ДШ_m на уровне, достаточном для синтеза АТФ и поглощения избытка Са²⁺ из цитозоля. Однако частичная блокада дыхания с помощью небольшой концентрации ингибитора комплекса IV дыхательной цепи (0,1-0,2мМ NaCN) снижала ДШ_m примерно настолько же, насколько низкая концентрация FCCP, и тоже значительно ускоряла наступление сильной митохондриальной деполяризации (Рис. 8В,Д). Принципиальным отличием действия цианида от протонофора является то, что первый не уменьшал, а увеличивал NAD(P)H (сравните Рис. 8Б и 8Г) за счет понижения окисления NADH комплексом I дыхательной цепи. На примере нейрона на рисунке 8Г видно, что сильная МД (и, следовательно, ОКД) могут развиваться при уровне NAD(P)H, даже превышающем исходный в покоящихся нейронах. Из этого следует, что причиной наступления ОКД является не снижение NADH, как таковое, а неспособность протонных насосов дыхательной цепи поддерживать электрохимический потенциал на уровне, необходимом для поглощения избытка Са²⁺ из цитозоля и осуществления ОксФос. Такая ситуация может возникнуть даже при достаточном уровнеNAD(P)H, если в при патологическом состоянии (токсической концентрации Glu) в нейронах появляются эндогенные ингибиторы дыхательной цепи, например, оксид азота (Moncada & Bolaсos, 2006) и другие низкомолекулярные соединения (Brown, 2010). Пример такого эндогенного ингибитора рассмотрен далее в параграфе, посвященном влиянию арахидоновой кислоты на Glu-индуцированные изменения [Ca²⁺]_i и ДШ_m. Более высокий уровень NADH является, очевидно, показателем способности протонных насосов дыхательной цепи поддерживать достаточно высокий ДШ_m , но не гарантией предотвращения ОКД.