Механизмы дисфункции митохондрий и нарушений ионного гомеостаза при глутаматной нейротоксичности

3. Вклад эндогенных факторов, возникающих в результате индуцированной глутаматом активации поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1 и фосфолипаз А2, в развитие дисфункции митохондрий и ОКД.

3.1. Роль поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1 (ПАРП-1) в возникновении ОКД и гибели нейронов. При гиперстимуляции NMDA рецепторов происходит избыточная активация фермента ПАРП-1, который расщепляет NAD⁺, присоединяя АДФ-рибозильную часть динуклеотида к ядерным белкам и запуская, таким образом, процесс репарации повреждений ДНК (Cosi et al, 1994; Zhang et al., 1994; Duan et al., 2007; Wang et al., 2007). Недавно появились сообщения о том, что в культуре гиппокампальных нейронов причиной возникновения ОКД может быть исчерпание NAD⁺ в результате повышенной активности ПАРП-1 и, как последствие, дефицит NADH (Abramov & Duchen, 2008, 2010). Выполненный нами биохимического анализа содержания NAD⁺ и NADH в культуре гранулярных нейронов мозжечка показал, что при действии Glu NAD⁺ снижался на 25% относительно уровня в покоящихся клетках (2,2пикомоль/мг белка), тогда как NADH падал на 75% (в контроле 1,6 пикомоль/мг белка). Наиболее потентный из ингибиторов ПАРП-1 антибиотик миноциклин (Alano et al, 2006) удерживал NAD⁺ при действии Glu на контрольном уровне, но не предотвращал падения NADH. Миноциклин (0,2мкМ) удлинял время, за которое в 50% нейронов развивалась ОКД, на ~35% (n=198), не влияя на синхронность второй фазы роста [Ca²⁺]_i и падения ДШ_m.

Рис.9. Зависимость флуоресцентного сигнала NAD(P)H от времени, прошедшего от начала ОКД до момента добавки цианида (CN).

Сигнал NAD(P)H представлен как отношение прироста флуоресценции NAD(P)H, вызванного добавкой CN в присутствии глутамата (Glu), к приросту флуоресценции NAD(P)H, вызванного добавкой CN к покоящимся клеткам (Glu+CN/CN). Значения величин, отложенных по Х-У-осям, иллюстрированы на вставке, на которой показаны сигналы NAD(P)H и кальциевого индикатора Fluo-3FF, индуцированные CN и Glu в одном из нейронов. Точкам, лежащим на вертикальной пунктирной линии, присвоено нулевое время задержки роста флуоресценции NAD(P)H относительно ОКД. Это означает, что в соответствующих нейронах ОКД еще не успела начаться и в момент добавки CN эти клетки все пребывали в первой фазе подъема [Ca²⁺]_i .

Таким образом представление об исчерпании NAD⁺, ведущем к дефициту NADH и, соответственно, снижению эффективности работы дыхательной цепи, не получили подтверждения в наших исследованиях. Для дополнительной проверки было изучено влияние блокады дыхательной цепи на уровень NAD(P)H на разных стадиях [Ca²⁺]_i ответа нейронов на Glu (Рис. 9). Поскольку лаг-период ОКД находится в диапазоне десятков минут (см. Рис.1), то добавка CN застает соседние нейроны на разных стадиях изменений [Ca²⁺]_i и ДШ_m. Если ОКД была в фазе развития или только что достигла [Ca²⁺]_i плато, то добавка NaCN вызывала такой же подъем NAD(P)H, как и в нейронах, находившихся к моменту добавления CN в первой фазе [Ca²⁺]_i ответа на Glu (Рис. 9). Из этого следует, что, если бы к началу ОКД весь NAD⁺ был израсходован ПАРП-1 на реакцию поли(АДФ-рибозилирования), то подъем флуоресценции в момент добавления CN был бы невозможен. Другими словами, вторичное падение NAD(P)H, совпадающее с развитием ОКД (см. вставку на Рис.9 и Рис.8Б,Г) не является последствием исчерпания NAD⁺/

Продление графика линейной регрессии на рисунке 9 до пересечения с осью абсцисс показывает, что, спустя примерно 30-40 минут после начала ОКД, добавление CN уже не вызывает подъема флуоресценции NAD(P)H. Нейроны, находившиеся в стадии [Ca²⁺]_i плато такое длительное время, как правило, не способны восстановить низкий уровень [Ca²⁺]_i и вернуться к высокому ДШ_m после удаления Glu. По нашему мнению, такие последствия длительного пребывания нейронов в фазе высокого [Ca²⁺]_i плато, как необратимость этой фазы и отсутствие роста NAD(P)H в ответ на CN могут свидетельствовать о возникновении в митохондриях нейронов неспецифической поры высокой проводимости (мРТ). ОКД, возможно, является начальной стадией образования такой поры, но не «классическим» ее состоянием, при котором мРТ способна пропускать молекулы размером до 1500Да (Zoratti & Szabo, 2005; Bernardi et al, 2006; Zorov et al, 2009). Благодаря большому диаметру мРТ, митохондриальный NAD⁺ способен «вытекать» из матрикса в цитозоль, прекращая дыхание (Di Lisa et al, 2001). Судя по быстрому увеличению NAD(P)H при остановке дыхания цианидом, NAD⁺ остается в митохондриях культивируемых нейронов, по крайней мере, вплоть до выхода на высокое [Ca²⁺]_i плато (Рис.9).

3.2. ОКД и образование активных форм кислорода (АФК). Считается, что повреждения ядерной ДНК активными формами кислорода являются пусковым фактором ПАРП-1 (von Zglinicki et al., Beneke & Bьrkle, 2007). Поскольку проверка гипотезы об исчерпании NAD⁺ как основном факторе энергетического кризиса нейронов (Abramov & Duchen, 2008, 2010) привела к отрицательному результату, мы решили убедиться происходит ли образование АФК в условиях наших экспериментов. Мы проверили каково соотношение между возникновением ОКД и образованием АФК в культуре, используя флуоресцентный индикатор MitoSox, наиболее избирательный для обнаружения супероксиданион радикала в митохондриях (Robinson et al., 2006).

Мы обнаружили, что за время действия Glu флуоресцентный сигнал MitoSox возрастал только в тех нейронах, в которых возникла ОКД и оставался на постоянно низком уровне в нейронах, не имевшем ОКД. Добавление протонофора FCCP (1мкМ) в постглутаматный период вызывала коллапс ДШ_m , однако, роста флуоресценции MitoSox не происходило. Эти данные показывают, что при действии нейротоксических доз глутамата возникают АФК, а значит и условия для повреждения ДНК и гиперактивации PARP-1, но только в тех нейронах, в которых произошла ОКД.

3.3. Иммунофлуоресцентный анализ локалазации продукта активности PARP-1 при действии глутамата. Если ОКД возникает вследствие слишком сильного расхода NAD+, потраченного на образование избыточного количества поли(АДФ-рибозы) (ПАР), то естественно ожидать более высокий уровень ПАР в тех нейронах, в которых возникла ОКД, по сравнению с нейронами, сохранившими [Ca²⁺]_i на относительно низком уровне. Для проверки этого предположения на культуру гранулярных нейронов мозжечка воздействовали нейротоксической дозой глутамата (Glu) до тех пор, пока примерно в половине нейронов возникла ОКД. Затем методом иммунофлуоресцентного окрашивания определяли распределение ПАР в этих же самых клетках. Результаты представлены на рисунке 10. Видно, что большинство нейронов, в которых возникла ОКД, имели распределение PAR преимущественно по периметру ядра. Однако подобное окрашивание наблюдалось и в некоторых нейронах, в которых ОКД не возникла (например, клетка 26 и еще 3 нейрона в данном поле). Преимущественно ядерную локализацию PAR имели те нейроны, в которых ОКД наступила быстро (клетка 1). Остальные нейроны, не испытавшие ОКД, имели более слабую и диффузную иммунофлуоресценцию (например, клетки 24 и 25). Для сравнения на Рис.1 буквами «А» отмечены два астроцита, поскольку в этих клетках Glu вызывает лишь небольшой монофазный подъем [Ca²⁺]_i , либо осцилляции [Ca²⁺]_i малой амплитуды (см., например, Рис. 3Ж). Астроциты имели небольшое окрашивание цитоплазмы и еще более слабое окрашивание ядерной зоны.

Рис. 10. Распределение поли(АДФ-рибозы) и графики изменения [Ca²⁺]_i в нейронах, подвергнутых нейротоксическому воздействию глутамата.

Сопоставление изображения клеток, нагруженных Ca²⁺ индикатором Fura-FF и подвергнутых действию нейротоксической концентрации глутамата, с изображениями, полученными последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием тех же клеток моноклональными антителами против PAR, а затем вторичными поликлональными антителами (goat antimouse), содержащими флуоресцентную метку Alexa-568. Изображение клеток, окрашенных Fura-FF (левое изображение), является рэйшиометрическим (F340/F380), в котором более теплому цвету соответствует более [Ca²⁺]_i. Рэйшиометрическое изображение было получено непосредственно перед удалением Glu. Среднее изображение (красным цветом) показывает распределение поли(АДФ-рибозы) в клетках, после глутаматного воздействия. Цифры возле нейронов соответствуют графикам изменения [Ca²⁺]_i, приведенным в нижней части рисунка. Буквами «А» отмечены два из пяти астроцитов в поле наблюдения. Правое изображение получено после завершения иммунофлуоресцентного окрашивания и отмечает положение ядер клеток, окрашенных DAPI.

Сопоставление [Ca²⁺]_i ответов и иммунофлуоресцентного окрашивания показывает, что причиной гибели нейронов может быть не столько дефицит NAD⁺, сколько продукт ферментативной активности PARP-1 - поли(АДФ-рибоза), способствующая высвобождению из перимембранного пространства митохондрий фактора апоптоза, AIF (Andrabi et al., 2006, 2008). Исследование протекторного действия ингибиторов PARP-1 3-аминобензамида (АВА, 1мМ) и миноциклина (0,2мкМ) на гибель гранулярных нейронов мозжечка крысы, вызванную Glu (60мин, 100мкМ) показало, что оба ингибитора снижают долю погибших клеток примерно на 14%. Эти данные согласуются с результатами измерения [Ca²⁺]_i , продемонстрировавшими, что доля нейронов, имевших ОКД после 1часа экспонирования Glu, составляла 65%, тогда как в присутствии миноциклина Glu вызывал ОКД в 55% нейронов.

3.4. Исследование обратимости ОКД при прекращении поступления Са²⁺ из внеклеточной среды. Развитие ОКД, т.е. переход от относительно небольшого стационарного уровнях [Ca²⁺]_i к высокому плато, может отражать возникновение и развитие во внутренней мембране митохондрий обратимой поры низкой проводимости, способной закрыться при удалении Са²⁺ (Ichas & Mazat, 1998; Brustovetsky & Dubinsky 2000). Мы проверили, существует ли такая обратимость по отношению к субстратам дыхательной цепи. На рисунке 16 приведены изменения [Ca²⁺]_i и автофлуоресценции, обусловленной NAD(P)H и FAD, в двух представительных нейронах из гиппокампа крысы.

У флавинаденин динуклеотида, являющегося кофактором сукцинат-дегидрогеназы (комплекса II дыхательной цепи), в отличие от никотинамидаденин динуклеотида, флуоресцирует не восстановленная, а окисленная форма (FAD), поэтому при усилении дыхания и увеличении концентрации окисленных форм этих динуклеотидов изменения их сигналов имеют противоположную направленность (Chance et al, 1979). Сигнал NAD(P)H снижался сразу после добавления Glu (Рис. 11) тогда как флуоресценция FAD, отражающая активность сукцинат-дегидрогеназы изменялась слабо (Рис. 11А). Это может означать, что во время первой фазы Са²⁺ ответа на Glu восстановление убихинона происходит преимущественно в комплексе I, тогда как комплекс II находится в «резерве». Во время развития ОКД резко увеличивается нагрузка на протонные насосы по поддержанию электрохимического потенциала митохондрий и в этом случае в действие вступает комплекс II, что проявляется в резком увеличении сигнала FAD.

При развитии ОКД происходило вторичное снижение NAD(P)H и одновременно увеличение FAD (Рис. 11Б). Эти изменения показывают, что ни NAD(P)H, ни FADH2 не находились на минимальном уровне перед развитием ОКД и свидетельствуют о том, что дефицит субстратов дыхательной цепи не является причиной развития ОКД.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Удаление Са²⁺ из буфера при продолжающемся действии Glu вызывало снижение [Ca²⁺]_i, которое всегда происходили синхронно с ростом NAD(P)H и FAD (Рис. 11) и увеличением ДШ_m (не показано). Рост NAD(P)H и FAD и восстановление ДШ_m были бы невозможны в том случае, если ОКД вызвано образованием поры такого размера, через которую способен пройти NAD⁺ и тем более низкомолекулярые субстраты ЦТК, в частности сукцинат. Другими словами, если при ОКД образуется пора, то она, вероятно, относится к «низкопроводящей, не классической», способной пропускать неорганические ионы, но не молекулы размера субстратов ЦТК и выше.

Способность нейронов к немедленному восстановлению [Ca²⁺]_i и реполяризации митохондрий при удалении Са²⁺ из буфера вскоре после выхода на высокое [Ca²⁺]_i плато указывает на то, что повреждение Са²⁺-насосной функции Са²⁺-АТФазы (Schwab et al. 2002) или прямой моды Na⁺/Са²⁺-обменника (Bano et al, 2005), если и происходит, то не перед развитием ОКД, а уже после того, как клетки достаточно долго пребывали в стадии высокого [Ca²⁺]_i плато (Brustovetsky et al, 2010).

Возвращение Са²⁺ в буфер приводило к подъему [Ca²⁺]_i . В тех нейронах, в которых удаление Са²⁺ из буфера произошло до возникновения ОКД, этот подъем [Ca²⁺]_i имел двухфазный характер, напоминающий ОКД (Рис. 11А). Если до удаления Са²⁺ нейроны успели войти в фазу высокого [Ca²⁺]_i плато, то возвращение Са²⁺ в буфер вызывало быстрое увеличение [Ca²⁺]_i, напоминающее НКД (Рис. 11Б). В ~80% нейронов (n=6) подъем [Ca²⁺]_i начинался до того, как NAD(P)H и FADН₂ падали до минимального уровня, указывая на то, что развитие «повторной» Са²⁺ дисрегуляции вызвано в большинстве случаев не падением субстратов дыхания до минимального уровня, а другой причиной.

3.5. Влияние блокады F1Fo-АТФаза на NAD(P)H и ДШ_m. Сопоставление эффектов блокатора дыхания СN и ингибитора F1Fo-АТФазы олигомицина на ДШ_m и NAD(P)H (Рис.5) показало, что в покоящихся нейронах ~87% NAD(P)H. затрачивается на обеспечение синтеза АТФ. Используя тот же методический прием, мы исследовали как меняется это соотношение при действии нейротоксических концентраций Glu

Добавление олигомицина во время Glu воздействия вызывало увеличение ДШ_m и рост NAD(P)H в нейронах, имевших небольшую митохондриальную деполяризацию, и находившихся, следовательно, в первой фазе [Ca²⁺]_i ответа на Glu (Рис. 12А,В,Г). Эти данные свидетельствуют о том, что F1Fo-АТФаза работала в режиме синтеза АТФ (Nicholls & Budd, 2000). Рост NAD(P)H в ответ на Oligo составил 65,4±3,8% (n=15), указывая на повышение до 35% потребления NAD(P)H на процессы, не связанные непосредственно с синтезом АТФ, по сравнению с 13% в покоящихся нейронах (см. Рис.5).

В основной части нейронах к моменту добавления Oligo уже произошло вторичное падение ДШ_m и, следовательно, синхронно с деполяризацией развилась ОКД, т.е. добавление Oligo пришлось на фазу [Ca²⁺]_i плато. В этих нейронах ингибирование F1Fo-АТФазы также увеличивало ДШ_m (Рис. 12Б,В). Это говорит о том, что, несмотря на сильную митохондриальную деполяризацию, F1Fo-АТФаза продолжала синтезировать АТФ. Другими словами, синхронная с ОКД сильная МД не снижала ДШ_m настолько глубоко, чтобы прекратился синтез АТФ. Кроме того, снижение ДШ_m может быть компенсировано поддержанием ДрН на таком уровне, что электрохимический потенциала остается достаточно высоким для синтеза АТФ (ниже Рис. 17). Данные о продолжающемся синтезе АТФ согласуются с изложенными выше аргументами о том, что развитие ОКД не является результатом образования классической поры высокой проводимости.

Рис.12. В нейронах, подвергнутых токсическому действию глутамата (Glu), при достижении высокого [Ca²⁺]_i плато происходит разобщение окислительного фосфорилирования.

Изменения митохондриального трансмембранного потенциала (ДШ_m) и NAD(P)H в двух представительных гранулярных нейронах мозжечка, в одном из которых (А) добавление ингибитора F1Fo-АТФазы олигомицина (Oligo, 2,5мкг/мл) совпало с 1-ой фазой [Ca²⁺]_i ответа на Glu (100мкМ, 10мкМ глицина, 0 Mg²⁺), а во втором нейроне (Б) добавка Oligo пришлась на фазу высокого [Ca²⁺]_i плато. Данные экспериментов на трех культурах (45 нейронов), полученных в разные дни, суммированы на панелях (В,Г), показывающих относительное снижение сигналов Rh123 (В) и NAD(P)H (Г) при добавлении Oligo.

Ингибирование F1Fo-АТФазы в тех нейронах, в которых Oligo был добавлен во время [Ca²⁺]_i плато, не увеличивало NAD(P)H (Рис. 12Б,Г), что указывает на отсутствие сопряжения окисления NAD(P)H с синтезом АТФ. Таким образом, гиперполяризация митохондрий в ответ на Oligo указывает на продолжение синтеза АТФ во время ОКД, а отсутствие роста NAD(P)H на прекращение работы F1Fo-АТФазы в режиме АТФ синтетазы во время ОКД. Это противоречие между митохондриальным синтезом АТФ и отсутствием сопряжения окисления NAD(P)H с фосфорилированием можно разрешить, на наш взгляд, если учесть подключение сукцинатдегидрогеназы и усиление окисления FADH2 до FAD во время развития ОКД (см. Рис. 11Б). Кроме того, добавление Oligo и прекращение расходования энергии на поддержание Н⁺-тока через F1Fo-АТФазы высвобождает часть NAD(P)H, которая немедленно расходуется комплексом I на компенсацию «токов утечки». В результате Oligo не увеличивает автофлуоресценцию, если добавлен во время высокого [Ca²⁺]_i плато, зато увеличивает ДШ_m (Рис. 12Б,Г). Последующая блокада дыхания цанидом при продолжающемся присутствии Oligo вызывала быстрый рост NAD(P)H (Рис. 12Б). Этот рост NAD(P)H подтверждает то, что снижение автофлуоресценции до минимального уровня не связано с исчерпанием NAD⁺ , а также то, что сильная митохондриальная деполяризация во время [Ca²⁺]_i плато не равнозначна понятию «коллапс митохондриального потенциала».

3.6. Роль глутамат-индуцированной активации фосфолипазы А2 и арахидоновой кислоты (АА) в развитии ОКД. Выше было показано, что частичная блокада дыхательной цепи и глюкозная депривация приближают ОКД (см. Рис. 7 и 8). Воздействие Glu, особенно в отсутствие глюкозы, вызывает в культуре нейронов или срезах мозга Ca²⁺-зависимое высвобождение жирных кислот, среди которых значительная доля принадлежит АА (Lazarewicz et al, 1990; Williams et al, 1995). АА образуется в нейронах в результате индуцированной Glu активации различных подтипов фосфолипазы А2 (PLA2) (см., например, обзор Sun et al, 2004). Свободные жирные кислоты, особенно в сочетании с поступлением в клетку Ca²⁺, могут значительно влиять на функциональное состояние митохондрий, увеличивая ионную проводимость митохондриальной мембраны (Sultan & Sokolove, 2001; Mironova et al, 2004), блокируя комплекс I дыхательной цепи (Morii et al, 1991; Loskovich et al, 2005), индуцируя образование неспецифической поры высокой проводимости (Scorrano et al, 2001). Мы исследовали, способна ли экзогенная арахидоновая кислота (АА) увеличивать долю нейронов, которые в ответ на Glu имеют двухфазный подъем [Ca²⁺]_i и вторичное падение ДШ_m.

Рис. 13. Действие арахидоновой (АА) кислоты на изменения [Ca²⁺]_i (А, Б, В) и ДШ_m (Г, Д, Е), вызванные глутаматом (100 мкМ; - Mg²⁺ + 10 мкМ глицина) в гранулярных нейронах мозжечка крысы. Kонцентрация АА 10 мкМ.

Экзогенная АА (=< 10мкМ), не влияя на [Ca²⁺]_i , немного снижала ДШ_m. (Рис. 13Б,Д). Добавление АА при воздействии Glu приводило к тому, что индуцированные Glu подъем [Ca²⁺]_i и падение ДШ_m были значительно выше, чем при действии одной АА (Рис. 13В,Е). Независимо от способа добавления АА (до Glu или после начала действия Glu) высокое [Ca²⁺]_i плато и сильная МД сохранялись в пост-глутаматный период, напоминая эффекты блокатора дыхания и протонофора (Рис.3В,Г). Предотвращение метаболизма экзогенной АА с помощью ETYA, ингибитора цикло- и липоксигеназного окисления АА, увеличивало долю нейронов, в которых Glu вызывал двухфазное повышение [Ca²⁺]_i и падение ДШ_m., свидетельствуя, что АА, а не продукты ее метаболизма вызывают обнаруженные эффекты.

Полученные результаты показывают, что АА может вызывать изменения функционального состояния митохондрий, способствующие возникновению двухфазных [Ca²⁺]_i и ДШ_m ответов нейронов на Glu и напоминает совместное действие Glu с ингибитором дыхания или протонофором (см. Рис.3). Поэтому мы сопоставили влияние АА на ДШ_m , с эффектами протонофоров DNP и FCCP, и ингибитора дыхания цианида в покоящихся нейронах (Рис. 13).

Деполяризация, вызванная АА была сравнительно небольшой, сопоставимой с той, которую можно получить с помощью низкой концентрации DNP (8мкМ) (Рис. 14Б). Высокие дозы протонофоров DNP (200мкМ) или FCCP (1мкМ), вызывающие полную деполяризацию митохондрий, увеличивали флуоресценцию Rh123 в 3-4 раза сильнее, чем АА. Сочетанное действие АА и ингибитора F1Fo-ATФазы олигомицина приводило к резкой деполяризации, почти столь же сильной, как и МД, вызванная FCCP (Рис. 14А), тогда как сам Oligo вызывал гиперполяризацию митохондрий нейронов. В отличие от небольшой деполяризации, вызванной АА, равное по величине снижение ДШ_m, вызванное низкой концентрацией DNP, было нечувствительно к Oligo (Рис. 14Б). Совместное действие АА с Oligo (Рис. 14А), вызывало такую же полную деполяризацию, как цианид с Oligo (Рис. 14В). Из сравнения данных, представленных на рисунке 14, можно заключить, что действие АА на митохондриальный потенциал нейронов вызвано не только, или не столько протонофорными свойствами АА, сколько тем, что она каким-то образом блокирует дыхание.

Рис. 15. Ингибитор фосфолипазы А2 задерживал наступление ОКД.

Зависимость доли нейронов (%), в которых возникла ОКД, от длительности действия глутамата в контрольной опыте без ингибитора (сплошные квадратики, n=52) и в культуре, в которую за 5 мин до Glu и в течение действия Glu присутствовал ингибитор фосфолипаз А2 арахидоноил трифторметил кетон (AACOCF3, 50мкМ, полые квадратики, n=44). Вертикальные стрелки отмечают момент времени, когда в 50% нейронов наступила ОКД.

Характер изменений [Ca²⁺]_i и ДШ_m, индуцированных Glu в присутствии экзогенной АА (Рис. 13), а также сопоставление изменений ДШ_m под влиянием АА и митохондриальных ядов в покоящихся нейронах (Рис. 14) находятся в согласии с предположением о возможном участии АА развитии ОКД. Поэтому мы проверили, будет ли предотвращение образования АА за счет ингибирования гидролиза фосфолипидов клеточных мембран фосфолипазами А2 задерживать наступление ОКД. Для этого сопоставили изменения [Ca²⁺]_i , вызванные одним Glu и в присутствии арахидоноил-трифторметил кетона (AACOCF3, 50мкМ), который ингибирует преимущественно Са²⁺-зависимую цитозольную PLA2 (cPLA2, MW 61-114kDa) и, в меньшей степени, Са²⁺- независимую PLA2 (iPLA2, MW 84-88kDa) (Ackermann et al, 1995; Street et al,1995), причем AACOCF3 подавляет гидролиз преимущественно тех фосфолипидов, в состав которых входит АА. AACOCF3 удлинял лаг-период ОКД, сдвигая вправо кумулятивную кривую увеличения доли нейронов, имевших ОКД (Рис.15).

Измерения [АТР] методом люциферин-люциферазной люминесценции показали, что совместное применение АА и Glu приводит к падению [АТР], в 2-3 раза большему, чем вызванному АА и Glu по отдельности (не показано). Результаты исследования эффектов экзогенной арахидоновой кислоты и свободные жирные кислоты, блокады высвобождения АА (и, вероятно, других жирных кислот) из фосфолипазой A2 из фосфолипидов, позволяют предположить, что свободные жирные кислоты, обладая свойствами протонофоров (и ингибиторов дыхания в случае АА) могут быть одним из факторов развития сильной МД и ОКД.

4. Различия биоэнергетики культивируемых нейронов при действии глутамата и в нейронах, полученных из животных пре- и постнатального периода развития

4.1. Изменения [ATP]c, при нейротоксическом воздействии глутамата. В предыдущих параграфах изменения [Ca²⁺]_i и ДШ_m при действии Glu, митохондриальных ядов и протонофоров трактовали в тесной связи с изменениями [ATP]с, хотя прямых измерений [ATP]с в тех же самых нейронах, в которых отслеживали [Ca²⁺]_i и ДШ_m , не проводили. Возможность восполнить этот пробел появилась благодаря применению флуоресцентного белкового АТФ-сенсора. Установлено, что в культуре гиппокампальных нейронов Р1-Р2 крыс Glu (20мкМ, 10мкМ глицина, 0 Mg²⁺) вызывал быстрое снижение [ATP]с . Между скоростью снижения [ATP]с и латентным периодом развития ОКД существует примерно линейная зависимость (r²=0,56), при которой большей скорости падения [ATP]с соответствует более короткий лаг-период ОКД. В среднем (n=15) ОКД начиналась при снижении [ATP]с до 16% и далее опускалась в фазе высокого [Ca²⁺]_i плато до 10% относительно [ATP]с в покоящихся нейронах. Если Glu добавляли в присутствии ингибитора Na⁺/К⁺-АТФазы плазматической мембраны, оубаина (0,5мМ), то ОКД возникала при [ATP]с ~37% относительно уровня в покоящихся нейронах (n=5).

Скорость синтеза АТФ в митохондриях определяется (помимо концентраций АДФ и неорганического фосфата) протонным электрохимическим потенциалом, который включает два слагаемых -ДШ_m и разность рН между матриксом митохондрий и цитозолем (ДрН = рНм - рНс) (Mitchell, 1968). Конструктивная особенность АТФ-сенсора АТ1.03 позволяет использовать его для измерения рН в том же внутриклеточном компартменте, в котором одновременно производят измерения [ATP] (см. Методы и Материалы). Поэтому мы выполнили двойную трансфекцию нейронов, направив в цитозоль АТ1.03, а в митохондрии рН-чувствительный красный флуоресцентный белок mito-mKate-1 (Chudakov et al, 2010).

Размещено на http://www.allbest.ru/

На рисунке 16 представлены изменения [Ca²⁺]_i , [ATP]с , рНм и рНс , индуцированные Glu в одном из таких гиппокампальных нейронов. Видно, что [ATP]с может опускаться до минимального уровня прежде, чем начнется ОКД (Рис. 16А) и, соответственно, предшествует падению NAD(P)H до минимального уровня (см. Рис. 7,9,10). Это еще раз свидетельствует, что падение NAD(P)H до минимального уровня не является необходимым условием или причиной падения [ATP]с, поскольку наступает позже. Неожиданным оказалось то, что восстановление низкого [Ca²⁺]_i в постглутаматный период, а значит и рост ДШ_m (см. Рис. 1Г), могут происходить до начала увеличения [ATP]с (Рис. 16А). Вероятно, значительный расход АТФ на выкачивание из цитозоля Na⁺, при котором снижение [Na⁺] начинается после снижения [Ca²⁺]_i (Сторожевых и соавт, 2007), задерживает восстановление [ATP]с. Протонофор FCCP (1мкМ) в конце эксперимента индуцировал резкое падение [ATP]с и высвобождение Са²⁺ в цитозоль (Рис. 16А), очевидно, в результате коллапса ДШ_m и последовавшими за этим реверсией митохондриальной АТФсинтазы в АТФазу, и исчезновением электрофоретической силы, удерживавшей Са²⁺ в митохондриях.

Glu вызывал быстрое снижение рНс, которое сменялось ростом рНс примерно тогда же, когда начиналось развитие ОКД (Рис. 16Б). Изменения рНм имели более сложный вид (Рис. 16Б), причем профили этих изменений были более индивидуальны для каждого отдельного нейрона, чем графики изменений рНс. Этот феномен более четко виден на графике изменений ДрН (Рис. 16В). FCCP (1мкМ) в конце эксперимента ликвидировал различие между рНм и рН_с (Рис. 16Б), делая ДрН=0 (Рис. 16В).

Одновременные измерения рНм и рН_с показали, что даже во время [Ca²⁺]_i плато может не происходить коллапса ДрН. Аналогичный результат был получен при одновременной экспрессии двух белковых флуоресцентных рН-сенсоров - красного mKate в цитозоле и желто-зеленого YFP в матриксе митохондрий (не показано). Это наблюдение является еще одним аргументом против «классической» поры высокой проводимости, по крайней мере, в начальный период высокого [Ca²⁺]_i плато. Необходимо подчеркнуть, что изменения [Ca²⁺]_i на (Рис. 16А,В) синхронны с изменения ДШ_m (см. Рис.1В,Г и Рис.2) и поэтому в совокупности с графиками ДрН указывают на сложнй характер изменений протонного электрохимического потенциала митохондрий нейронов при действии на них Glu.

4.1. Изменения концентрации АТФ в цитозоле индивидуальных нейронов ([ATP]c), вызванные химической гипоксией и глюкозной депривацией в пре- и постнатальных нейронах. Считается, что в нейрональной культуре, так же как и в мозге, более 90% АТФ производится митохондриями. Тот факт, что Oligo вызывает лишь небольшое снижение [ATP], измеренное биохимическими методами в среднем по клеточной популяции в культуре (см., например, обзор Б.И. Ходорова, 2003), объясняют компенсаторным эффектом усиления гликолитического синтеза АТФ в цитозоле. Мы впервые исследовали изменения концентрации АТФ в цитозоле индивидуальных нейронов ([ATP]c), вызванные химической гипоксией (блокадой дыхательной цепи митохондрий цианидом) или/и удалением глюкозы (чаще с эквимолярной заменой ее на 2-дезоксиглюкозу). Для этого в цитозоле клеток нейрональных культур экспрессировали флуоресцентный белковый АТФ-сенсор, АТ1.03 (Imamura et al, 2009). Культуры, часть нейронов в которых экспрессировала АТ1.03, нагружали TMRM, что позволяло проводить одновременные измерения [ATP]с и ДШ_m .

Рис.17. В культивируемых нейронах из гиппокампа эмбрионов крысы (А,Б) АТФ производится в результате гликолиза, а в нейронах из гиппокампа новорожденных крыс (В,Г) преимущественно благодаря окислительному фосфорилированию.

Изменения [ATP]с (зеленые графики -o-o-, правые оси ординат) и ДШ_m (красные графики ----, левые оси ординат), индуцированные в нейронах последовательной заменой (А,В) буфера с глюкозой на безглюкозный с 5мМ 2-дезоксиглюкозы (-Gluc+2DG), добавлением митохондриального субстрата пирувата (Pyr, 10мМ), ингибитора F1Fo-АТФазы олигомицина (Oligo, 5мкг/мл) и цианида (CN, 3мМ), либо последовательным (Б,Г) добавлением Oligo, заменой глюкозы на 2DG и добавлением CN.

Было обнаружено, что в культурах, приготовленных из гиппокампов эмбрионов крысы (17-18 день беременности, Е17-Е18), удаление глюкозы (Gluc) вызывало падение [ATP]с до почти минимального уровня (Рис.17А). Последующая замена Gluc на 2-дезоксиглюкозу (2-DG) при одновременной блокаде дыхательной цепи цианидом вызвала дальнейшее понижение [ATP]с лишь на 2,5±1,0% (принимая исходный [ATP]с в покоящихся нейронах

за 100%). Блокада гликолиза вызывала небольшую деполяризацию (Рис.17А). Pyr не увеличивал [ATP]с в безглюкозном буфере в 84% нейронов (96/114; 43 эксперимента), хотя при этом Pyr увеличивал ДШ_m (Рис.17А) и закислял цитозоль (не показано), что свидетельствует о проникновении этого субстрата митохондрий в клетку и поступлении в митохондрии.

Oligo не уменьшал [ATP]с в этих нейронах, но при этом вызывал снижение ДШ_m (Рис.17Б), свидетельствуя, что F1Fo-АТФаза работала в реверсивном режиме, не синтезируя, а потребляя АТФ. Эта особенность Е17-Е18 нейронов оставалась неизменной на протяжении всего срока исследования культуры (от 5 до 15 дней).

Нейрональные культуры из гиппокампов постнатальных крысят (1-2 день после рождения, Р1-Р2) кардинально отличались от Е17-Е18 по реакции на митохондриальные яды и глюкозную депривацию. Удаление Gluc вызывало гораздо меньшее снижение [ATP]с (на 30,1±6,5%) по сравнению с нейронами из Е17-18 (на 97,5±1,0%), но при этом заметно деполяризовала митохондрии (Рис.17В). Pyr, добавленный во время глюкозного голодания, значительно увеличивал как [ATP]с (на 54±8%), так и ДШ_m (Рис.17В). Oligo резко уменьшал [ATP]с (на 66±11%, n=8) и гиперполяризовал митохондрии (Рис.17В,Г). Исходя из перечисленных характеристик, мы заключили, что Р1-Р2 нейроны синтезировали АТФ преимущественно благодаря ОксФос. В перинатальный период в нейронах мозга (по крайней мере, гиппокампа крыс), по-видимому, происходит переключение синтеза АТФ с преимущественно гликолитического. в цитозоле на ОксФос в митохондриях.

Заключение

Проведенные нами исследования на нейрональных культурах мозжечка и гиппокампа крысы показали, что индуцированное Glu поступление в нейроны Са²⁺ и Na⁺ запускает каскад событий, в которых митохондрии демонстрирую самые разные аспекты своих функциональных возможностей. Вход Са²⁺ в цитозоль по НМДА-каналам в первую же минуту увеличивает [Ca²⁺]_i до уровня, необходимого для активации кальциевого унипортера и захвата Са²⁺ митохондриями. Быстрая деполяризация плазматической мембраны (Czyz et al, 2002) и падение градиента концентрации Na⁺ между буфером и цитозолем (Czyz et al, 2002; Сторожевых и соавт, 2007) существенно снижают способность Na⁺/Са²⁺-обменников, наиболее производительных механизмов плазмалеммы, удалять избыток Са²⁺ из нейронов, вынуждая митохондрии поглощать значительную, если не основную, долю поступающего в цитозоль Са²⁺. Сильный ацидоз цитоплазмы, возникающий в результате активации Са²⁺-АТФаз плазматической мембраны сразу после добавления Glu, приводит к снижению рН митохондрий (Рис. 23Б), подавляя их способность удерживать Са²⁺ в форме комплексов с фосфатами (Chalmers & Nicholls, 2003). Быстрое падение [ATP]с во время первой фазы [Ca²⁺]_i ответа на Glu до уровня, лишь на ~16% превышающего минимальный [ATP]с, вызвано, судя по влиянию оубаина, интенсивной работой Na⁺/К⁺-АТФазы плазмалеммы. Одновременный мониторинг рН цитозоля и митохондрий позволил обнаружить, что во время низкого [Ca²⁺]_i плато, относительно небольшая митохондриальная деполяризация (снижение ДШ_m на 40-60мВ, см. Рис. 2В) компенсируется ростом ДрН на 0,8-1,2 (Рис. 23В). Таким образом, сильное падение [ATP]с во время первой фазы [Ca²⁺]_i ответа на Glu вызвано не столько значительным ослаблением электрохимического потенциала митохондрий, сколько многократным усилением его потребления в цитозоле. Нельзя, однако, исключить и такого фактора падения [ATP]с, как способность высоких концентраций Са²⁺ снижать эффективность работы АТФ/АДФ-транслокатора и F1Fo-АТФсинтазы (Moreno-Sanchez, 1985), хотя влияние Са²⁺ на функциональные и структурные элементы митохондрий зачастую неоднозначно (Hansford & Zorov, 1998; Brookes et al, 2004). Полученные результаты показывают, что любой способ снижения ДШ_m и [ATP]с будет способствовать развитию ОКД. Поэтому ингибирование гликолиза или химическая гипоксия, моделируемая применением ингибиторов дыхательной цепи, сокращали лаг-период ОКД. Поскольку доставка глюкозы сквозь плазматическую мембрану нейронов осуществляется в форме котранспорта с Na⁺ (Espinoza-Rojo et al, 2010), то снижение потенциала плазматической мембраны и трансмембранного градиента концентрации Na⁺, происходящее при действии Glu, также можно рассматривать как факторы, ухудшающие синтез АТФ и приближающие ОКД. Аноксия, имитируемая высокими концентрациями CN, оказалась опаснее блокады гликолиза, так как вызывала немедленную дисрегуляцию Са²⁺ гомеостаза, тогда как глюкозная депривация приближала наступление ОКД, но не превращала ее в НКД. В отсутствие гликолиза нейроны в состоянии на некоторое время (от единиц до ~30мин, в зависимости от типа нейронов и возраста культуры) (Рис. 9,12) компенсировать дефицит пирувата мобилизацией эндогенного субстрата для цикла трикарбоновых кислот. Таким субстратом, по нашим представлениям, может быть цитозольный глутамат, концентрация которого в соме культивируемых нейронов составляет около 10мМ (Nicholls, 2009).

Повышенный уровень [Ca²⁺]_i в совокупности с другими внутриклеточными сигнальными системами, запускаемыми Glu (Farooqui & Horrocks, 2004, 2006; Ferraguti et al, 2008), приводит к активации фосфолипаз А2 и высвобождению свободных жирных кислот (СЖК), которые (по крайней мере, арахидоновая кислота) способны усиливать митохондриальную деполяризацию, вызванную Glu или ингибированием дыхания (Рис. 13,14). Необходимо отметить, что СЖК не имеют быстрой системы удаления и накапливаются в клеточных мембранах, ухудшая их барьерные свойства тем сильнее, чем дольше действует Glu.

Совокупность перечисленных выше процессов, происходящих во время первой фазы [Ca²⁺]_i ответа на Glu, приводит к тому, что наступает момент, индивидуальный для каждого нейрона, когда удаление Са²⁺ из цитозоля во внеклеточное пространство и захват его митохондриями перестают уравновешивать поток Са²⁺ из внеклеточного пространства. Это событие быстро приобретает характер кооперативного процесса. На ключевую роль дисфункции митохондрий в возникновении ОКД указывает синхронность этого процесса с : 1) началом сильной деполяризации митохондрий, 2) появлением второй ступени снижения NAD(P)H и усилением окисления флавиновых нуклеотидов, 3) сильным снижением рНм и ДрН на восходящей фазе ОКД, 4) образованием АФК.

Начало ОКД не обусловлено исчерпанием NAD⁺ в результате гиперактивации ПАРП-1 и, соответственно, истощением митохондриального NADH, необходимого для питания комплекса I дыхательной цепи. Наши данные свидетельствуют в пользу развития неселективной поры, способной пропускать неорганические ионы, но слишком узкой для NAD⁺ и даже для молекул, меньшего, чем NAD⁺ размера, таких, как субстраты цикла трикарбоновых кислот.

Сопоставление Glu-индуцированных изменений [Ca²⁺]_i и распределения поли(АДФ-рибозы) (ПАР) в одних и тех же нейронах показало, что за время действия Glu ПАР успевает диффундировать в цитозоль. Взаимодействие ПАР с внешней митохондриальной мембраной способствует высвобождению фактора апоптоза AIF (Wang Y. et al, 2009). Вероятно, это является одной причин того, что в течение первых суток после действия Glu около половины нейронов, имевших ОКД, погибает от апотоза (Рис. 4 и 15).

Сопоставление изменений [Ca²⁺]_i при действии Glu и путей последующей гибели тех же самых нейронов показало, что развитие ОКД ведет к смерти ~97% клеток в течение первых суток после глутаматного стресса. Нейроны, имевшие более длительный лаг-период ОКД, имели более высокую вероятность гибели от апоптоза, чем от некроза. Необходимо отметить, что все нейроны, в которых за время действия Glu не возникла ОКД, выжили. Поэтому удлинение лаг-периода ОКД может служить полезным для практики критерием отбора химических агентов на пригодность в качестве нейропротекторных препаратов.

Выводы

1. Индуцированная глутаматом отсроченная кальциевая дизрегуляция (ОКД) и синхронная с ней сильная митохондриальная деполяризация (МД) являются результатом, изменений концентраций Са²⁺, Na⁺, Н⁺, АТФ, NAD(P)H, потенциалов митохондриальной и плазматической мембраны.

2. Нейроны, в которых возникла ОКД, гибнут в результате апоптоза и некроза. Увеличение или сокращение лаг-периода ОКД и МД может служить количественным критерием соответственно нейропротекторных или нейротоксических свойств биологически активных веществ.

3. ОКД возникает тогда, когда скорость поступления Са²⁺ в цитоплазму начинает превышать скорость удаления Са²⁺ из клетки. Важным фактором дисбаланса скоростей является реверсия Na⁺/Са²⁺ обмена через плазмалемму.

4. Анализ эффектов глюкозной депривации, экзогенных ингибиторов протонных насосов дыхательной цепи, протонофоров и усиление показывает, что причиной развития ОКД являются процессы, снижающие митохондриальный синтез АТФ и способность митохондрий захватывать и удерживать Са²⁺.

5. Эндогенными факторами ускорения ОКД являются: усиление потребления NADH и разобщение окислительного фосфорилирования; активация фосфолипаз А2 (PLA2), приводящая к высвобождению арахидоновой кислоты, способной снижать эффективность работы протонных насосов; активация фермента поли(АДФ-рибоза)полимеразы-1 (ПАРП-1), расходующего NAD⁺ на репарацию ДНК и вызывающего дефицит NADH. Ингибиторы PLA2 и ПАРП-1 задерживают наступление ОКД.

6. Во время первой фазы Ca²⁺ ответа на Glu в нейронах усиливаются процессы, препятствующие развитию ОКД: увеличивается градиент рН между митохондриями и цитозолем (ДрН), который компенсирует снижение митохондриального потенциала; активируются альтернативные пути окисления субстратов; повышается активность сукцинатдегирогеназы.

7. При развитии ОКД происходит падение ДШ_m и ДрН, что приводит к ослаблению захвата митохондриями избытка Са²⁺ из цитозоля и дополнительному снижению концентрации цитозольного АТФ, необходимого Са²⁺- и Nа⁺/К⁺-АТФазам для поддержания потенциала плазмалеммы и концентрации этих ионов в цитозоле.

8. В перинатальный период происходят кардинальные перестройки биоэнергетики нейронов - в культивируемых нейронах из гиппокампа эмбрионов крысы (Е17-Е18), доминирующим способом производства АТФ является гликолиз, тогда как, в нейронах, полученных из гиппокампа постнатальных крыс (Р1-Р2), АТФ синтезируется преимущественно за счет окислительного фосфорилирования.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. B. Khodorov, T. Storozhevykh, A. Surin, E. Sorokina, A. Yuravichus, A. Borodin, N. Vinskaya, L. Khaspekhov, and V. Pinelis. (2001). Mitochondrial depolarization play a dominant role in the mechanism of perturbation of calcium homeostasis caused by glutamate in cultured cerebellar granule cells. Biological Membranes (Rus), 18 : 421-432.

2. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин А.М., Ходоров Б.И. (2001) Ведущая роль митохондриальной деполляризации в механизме глутамат-вызванного нарушения Са²⁺ гомеостаза. Фиизол. Журнал им.И.М.Сеченова 87(4): 459-467.

3. Duchen M.R., Surin A.M. (2002). On the role of mitochondria and calcium in glutamate-induced neurotoxicity in hippocampal neurons in culture. Biological Membranes (Rus), 19 : 97-109.

4. Duchen M.R., Surin A.M., Jacobson J. (2003). Imaging mitochondrial function in intact cells. Methods in Enzymology 361: 353-389.

5. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин А.М., Ходоров Б.И. Ведущая роль Са²⁺-АТФазы плазматической мембраны в восстановлении Са²⁺ гомеостаза нейронов после глутаматного удара. (2003). Бюллетень Эксперим. Биол. и Медицины. 135(2): 162-165

6. Bolshakov A.P., Mikhailova M.M., Jurevicius A., Surin A.M., Pinelis V.G., Khodorov B.I. (2003). Contribution of Ca²⁺ and Na⁺ to glutamate-induced mitochondrial depolarization in cerebellar granule cells. Biological Membranes (Rus). 20: 443-445.

7. Михайлова М.М., Большаков А.П., Сурин А.М., Пинелис В.Г. Ходоров Б.И. (2003). Снижение устойчивости нейронов к токсическому воздействию глутамата в отсутствие глюкозы. Биологические Мембраны, 20: 446-448.

8. Surin A.M., Storozhevykh T.P., Vinskaya N.P., Pinelis V.G., Duchen M.R., Khodorov B.I. (2004) Does mitochondrial ATP synthаse reversal play a crucial role in glutamate-induced deterioration of Ca²⁺ homeostasis in cultured mature neurons? Biological Membranes (Rus). 21: 157-160

9. А.В.Вабниц, Я.Е.Сенилова, Е.В.Колесникова, А.М.Сурин, В.Г.Пинелис, Б.И.Ходоров. (2006) Отсроченная Са²⁺ дерегуляция в молодых нейронах мозжечка при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Роль NMDA-каналов. Биологические Мембраны, 23: 311-319

10. Surin AM, Bolshakov AP, Mikhailova MM, Sorokina EG, Senilova YE, Pinelis VG, Khodorov BI. (2006). Arachidonic acid enhances intracellular [Ca2+]i increase and mitochondrial depolarization induced by glutamate in cerebellar granule cells. Biochemistry (Rus). 71(8): 864-870.

11. Kolikova J, Afzalov R, Giniatullina A, Surin A, Giniatullin R, Khiroug L. (2006) Calcium-dependent trapping of mitochondria near plasma membrane in stimulated astrocytes. Brain Cell Biol. 35(1): 75-86.

12. A.M. Surin , S.N.Zobova, G.R.Tukhbatova, Y.E.Senilova, V.G.Pinelis, B.I.Khodorov (2010). Changes in mitochondrial NAD(P)H and calcium homeostasis deregulation in cultured rat cerebellar granule neurons. Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 4 : 32-37.

13. Kolikova J, Afzalov R, Surin A, Lehesjoki AE, Khiroug L. (2011) Deficient mitochondrial Ca(2+) buffering in the Cln8(mnd) mouse model of neuronal ceroid lipofuscinosis. Cell Calcium. 50(6): 491-501.

14. Г. Д. Миронова, К. Н. Белослудцев, А. М. Сурин, А. С. Трудовишников, Н. В. Белослудцева, В. Г. Пинелис, И. А. Красильникова, Б. И. Ходоров (2011) Митохондриальная липидная пора в механизме глутамат-индуцируемой кальциевой дисрегуляции нейронов мозга. Биологические Мембраны, 28(6): 483-494.

15. Khodorov, B.I., Mikhailova, M M., Bolshakov, A P., Surin, A.M., Sorokina, E.G., Rozhnev, S.A., and Pinelis, V.G. (2012). Dramatic effect of glycolysis inhibition on the cerebellar granule cells bioenergetics. Biochemistry (Mosc.) Suppl. Series A: Membrane Cell. Biol. 6: 186-197.

16. Surin А.М., S. Khiroug, L.R. Gorbacheva, B.I. Khodorov, V.G. Pinelis and L. Khiroug . Comparative analysis of cytosolic and mitochondrial ATP synthesis in embryonic and postnatal hippocampal neuronal cultures. Front. Mol. Neurosci. 5:102. doi: 10.3389/fnmol.2012.00102. Epub 2013 Jan 10.

17. Сурин А.М., Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е , Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Исследование роли изменений NAD(P)H в возникновении отсроченной кальциевой дисрегуляции в гранулярных нейронах мозжечка. Материалы конференции «Гипоксия - механизмы, адаптация, коррекция». Москва, 9-11 октября 2008 г

18. АA.M. Surin, Zobova S.N., V.G. Pinelis, B.I. Khodorov. Role of mitochondrial NADH in the glutamate-induced delayed Ca²⁺ deregulation in cerebellar granule neurons. Society for Neuroscience 38th Annual Meeting, Washington DC, November 15-18, 2008, Abstract 51.19

19. А.M. Surin, V. G. Pinelis*, Д. D. Vinogradov, B. I. Khodorov. Evidence for pore opening in mitochondrial membrane during glutamate-induced delayed calcium deregulation in brain neurons. Материалы научной конференции «Ионные каналы: Структура и функции», 17-18 марта 2009, С.-Петербург. Биол. Мембраны Т.26, № 4, С.330

20. Сурин А.М., Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Изменения митохондриального NAD(P)H и нарушения кальциевого гомеостаза в культивируемых нейронах мозжечка крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 4-6 июня 2009, стр.157-162

21. А.M. Surin, V. G. Pinelis*, Д. D. Vinogradov, B. I. Khodorov. Evidence for pore opening in mitochondrial membrane during glutamate-induced delayed calcium deregulation in brain neurons. Материалы научной конференции «Ионные каналы: Структура и функции», 17-18 марта 2009, С.-Петербург. Биол. Мембраны Т.26, № 4, С.330

22. Сурин А.М., Зобова С.Н., Тухбатова Г.Р., Сенилова Я.Е., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Изменения митохондриального NAD(P)H и нарушения кальциевого гомеостаза в культивируемых нейронах мозжечка крысы при гиперстимуляции глутаматных рецепторов. Материалы Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 4-6 июня 2009, стр.157-162

23. V. G. Pinelis, G. Tuhbatova, A. Surin, B. Khodorov, L. Khiroug; Disturbance of oxidative phosphorilation coupling during glutamate-induced delayed calcium deregulation in cultured brain neurons. Society for Neuroscience 38th Annual Meeting, Chicago, IL, October 17-21, 2009, Program 634.21, N13

24. Сурин А.М., Красильникова И.А., Персиянцева Н.А. , Ефремова А.С., Шрам С.И., Горбачева Л.Р., Савинкова И.Г., Зобова С.Н., Пинелис В.Г., Ходоров Б.И. Роль поли(АДФ-рибоза)-полимеразы-1 (PARP-1) в нарушении кальциевого гомеостаза нейронов мозжечка крысы. Международная конференция “Рецепторы и внутриклеточная сигнализация” Пущино, 24-26 мая 2011г. Сборник статей, Т.1 стр. 150-156

25. Миронова Г.Д., Белослудцев К.Н., Сурин А.М., Трудовишников А.С., Белослудцева Н.В., Пинелис В.Г., Красильникова И.А., Ходоров Б.И. Возможная роль митохондриальной Са²⁺-зависимой липидной поры в глутамат-индуцируемой кальциевой дерегуляции нейронов. международная конференция “рецепторы и внутриклеточная сигнализация” Пущино, 24-26 мая 2011г. Сборник статей, Т.2 стр. 680-687