Диагностические возможности гематологических анализаторов

Среди бета-талассемий выделяют две основные формы: тяжелую средиземноморскую форму, при которой синтезируется около 10% нормальной цепи и более легкую форму, когда сохраняется около 50% синтеза нормальной бета-цепи.

Большая талассемия (анемия Кули, thalassemia major). Считается гомозиготной формой талассемии, хотя во многих случаях заболевание является двойным гетерозиготным состоянием по различным формам бета-талассемии. В костном мозге наблюдается гиперплазия красного ростка, выявляется значительное количество сидеробластов. В крови - гипохромная микроцитарная анемия (снижены MCV, МСН, МСНС), резкий анизоцитоз, пойкилоцитоз, мишеневидные эритроциты, шизоциты, встречаются эритроциты с базофильной пунктацией, эритрокариоциты. Даже при тяжелой анемии ретикулоцитоз не бывает высоким, так как в костном мозге выражен неэффективный эритропоэз. Отмечается повышение осмотической резистентности эритроцитов. Характерна лейкопения с относительным лимфоцитозом, в период гемолитического криза - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево. В период криза может наблюдаться левый сдвиг.

В сыворотке крови имеет место гипербилирубинемия за счет неконъюгированного билирубина, повышено содержание сывороточного железа. Избыточное отложение железа приводит к сидерозу органов.

Характерным признаком большой талассемии является выраженное увеличение концентрации фетального гемоглобина. Количество HbA варьирует в зависимости от типа талассемии.

Малая талассемия (thalassemia minor) является гетерозиготной формой бета-талассемии. В костном мозге - гиперплазия эритроидного ростка, количество сидеробластов повышено или нормальное. В крови наблюдается умеренная гипохромная микроцитарная анемия: умеренное снижение гемоглобина при нормальном, а чаще повышенном количестве эритроцитов, снижение индексов MCV, МСН, МСНС, которое может быть более выраженным, чем при ЖДА, эритроцитарная гистограмма смещается в левую сторону.

В мазках крови отмечается анизоцитоз, поэтому показатель RDW выше нормальных значений, пойкилоцитоз, мишеневидность эритроцитов, может быть базофильная пунктация эритроцитов, выявляется ретикулоцитоз. При малой форме талассемии встречается ложный тромбоцитоз. Это явление обусловлено микроцитарной фракцией эритроцитов, которая счетчиками оценивается, как тромбоциты. В сыворотке крови имеет место умеренная неконъюгированная билирубинемия, содержание железа обычно нормальное или повышенное. Диагноз устанавливается на основании результатов определения малых фракций гемоглобина HbA и HbF2.

Рис. 72. Алгоритм дифференциальной диагностики гипохромных, микроцитарных анемий

2.5 Макроцитарные гиперхромные анемии

По этиологии и патогенезу макроцитарные анемии могут быть разделены на две группы - мегалобластные и немегалобластные анемии (рис. 73). Мегалобластные анемии

Анемии, связанные с нарушением синтеза ДНК, могут быть как наследственными, так и приобретенными. Общим признаком этих анемий является наличие в костном мозге мегалобластического типа кроветворения. Чаще наблюдается изолированный дефицит витамина В12, реже - фолиевой кислоты.



Рис. 73. Классификация макроцитарных анемий по этиологии и патогенезу

Таблица 11

Наиболее частые причины мегалобластных анемий
Дефицит витамина В12	Дефицит фолиевой кислоты	Комбинированный дефицит витамина В12 и фолиевой кислоты	Токсические нарушения синтеза ДНК
-Нарушение всасывания -Недостаточное поступление с пищей -Конкурентное потребление -Повышенная утилизация витамина В12 -Наследственный дефицит транско- баламина II	-Снижение содержания в пище -Нарушение всасывания -Повышение потребности -Уменьшение запасов в печени -Прием антагонистов фолиевой кислоты	- Спру	-Прием алкилирующих агентов, триметоприма, противосудорожных препаратов, пуринов и пиримидина

Таблица 12

Причины развития немегалобластных макроцитарных анемий
Повышенный эритропоэз	Увеличение площади мембраны эритроцитов	Рефрактерные анемии	Прочие
-Постгеморраги- ческая анемия -Гемолитическая анемия	-Заболевания печени -Обструктивная желтуха -Состояние после спленэктомии	Миелодиспластические синдромы Апластическая анемия	Гипотиреоз Хронические обструктивные заболевания легких

Лабораторные показатели

- Анемия (макроцитарная гиперхромная).

- Ретикулоцитопения.

- Эритроциты с остатками ядер (тельца Жолли, кольца Кебота).

- Лейкопения (нейтропения).

- Гиперсегментация ядер нейтрофилов.

- Тромбоцитопения.

- Мегалобластическое кроветворение в костном мозге.

2.6 Аутоиммунные гемолитические анемии (АИГА)

Аутоиммунные гемолитические анемии возникают в результате сенсибилизации организма и появления в крови антител, обладающих способностью разрушать клеточные элементы крови в РЭС или сосудистом русле. В патогенезе гемолиза играет роль комплекс факторов: класс, подкласс и титр антиэритроцитарных антител, температурный оптимум их действия, антигенные особенности эритроцитарной мембраны и направленность иммуноглобулинов к тем или иным антигенам, система комплемента и активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Аутоиммунные гемолитические анемии диагностируют по наличию аутоантител, фиксированных на эритроцитах, с помощью пробы Кумбса, при которой антиглобулиновые антитела вступают во взаимодействие с иммуноглобулинами эритроцитов (прямая реакция Кумбса) и вызывают агглютинацию эритроцитов. Можно выявлять циркулирующие антитела в сыворотке крови непрямой пробой Кумбса, смешивая сыворотку с эритроцитами донора. Как правило, выраженность прямой реакции Кумбса тесно коррелирует с количеством IgG, фиксированных на эритроцитах. Отрицательная проба Кумбса не исключает АИГА. Она может иметь место при интенсивном гемолизе, массивной гормональной терапии, низком титре антител.

Выделяют несколько форм АИГИ в зависимости от типа AT:

- Аутоиммунная гемолитическая анемия, обусловленная неполными тепловыми агглютининами;

- Аутоиммунная гемолитическая анемия, обусловленная полными холодовыми агглютининами (холодовая гемагглютининовая болезнь);

- Аутоиммунные гемолитические анемии, обусловленные тепловыми гемолизинами;

- Пароксизмальная холодовая гемоглобинурия с двухфазными гемолизинами.

Симптоматические или вторичные АИГА развиваются на фоне лимфопролиферативных заболеваний и злокачественных опухолей, болезней соединительной ткани, инфекций, аутоиммунных заболеваний (тиреоидит, неспецифический язвенный колит, сахарный диабет I типа, саркоидоз и др.). Тепловые агглютинины могут появляться при лечении большими дозами пенициллина или цефалоспоринов, при этом они направлены против комплекса антибиотика с антигенами мембраны эритроцита. Отмена антибиотика ведет к прекращению гемолиза.

Неполные тепловые агглютинины относятся к классам IgG, IgA. В большинстве случаев антитела направлены к системе антигенов резус. Течение болезни может быть острое, хроническое и подострое. Обычно гемолиз развивается постепенно, редко остро. Разрушение эритроцитов происходит в селезенке (внутриклеточный гемолиз). Потому в клинике наблюдаются признаки, характерные для анемии (бледность слизистых, сердцебиение, головокружение) и внутриклеточного гемолиза (желтуха различной интенсивности, спленомегалия).

В костном мозге отмечается гиперплазия эритроидного ростка, встречаются клетки с мегалобластоидной структурой ядерного хроматина. Анемия, как правило, носит макроцитарный, нормо- или гиперхромный характер и сопровождается умеренным, реже высоким ретикулоцитозом. В мазках крови отмечается анизоцитоз, полихроматофилия, могут присутствовать сфероциты, макроциты, эритрокариоциты. В гемограмме выявляются повышение MCV, MCH, RDW, эритроцитарная гистограмма уплощается и смещается вправо.

Количество лейкоцитов зависит от активности костного мозга и основного заболевания, которое лежит в основе гемолиза: может быть нормальным, при острой форме - лейкоцитоз со сдвигом влево, иногда лейкопения.

Содержание тромбоцитов в большинстве случаев нормальное, реже сниженное.

Решающим диагностическим признаком этого вида АИГА является положительная прямая проба Кумбса. По мнению ряда исследователей, параллелизма между выраженностью прямой пробы Кумбса и интенсивностью гемолиза нет.

Использование иммуноферментного анализа позволяет количественно оценить содержание иммуноглобулинов на поверхности одного эритроцита, а также определить их класс и тип. Значение этих исследований обусловлено тем, что различные классы и типы иммуноглобулинов обладают неодинаковой физиологической активностью in vivo. Показано усиление остроты гемолиза при участии в процессе одновременно нескольких классов иммуноглобулинов. Аутоиммунная гемолитическая анемия, обусловленная полными холодовыми агглютининами, наиболее часто является вторичным процессом. В молодом возрасте холодовая гемагглютининовая болезнь (ХГАБ) обычно осложняет течение острой микоплазменной инфекции и разрешается по мере купирования последней. У пожилых больных холодовой гемолиз сопутствует хроническим лимфопролиферативным заболеваниям, протекающим с секрецией парапротеина IgM, который играет ведущую роль в гемолитическом процессе. Наиболее часто ХГАБ сопровождает макроглобулинемию Вальденстрема и хронический лимфолейкоз с секрецией IgM, а также системные заболевания соединительной ткани. Для этого вида анемии характерен преимущественно внутриклеточный гемолиз.

Макроглобулин, обладающий свойствами холодовых агглютининов, благодаря высокой молекулярной массе, вызывает гипервискозный синдром. Заболевание проявляется синдромом Рейно, развитием акроцианоза, тромбофлебита, тромбозов, трофических изменений, вплоть до акрогангрены. IgM функционирует при низких температурах, оптимальной для действия макроглобулина является температура +4 °С. Поэтому весь симптомокомплекс заболевания разыгрывается на холоде, при переохлаждении открытых частей тела. При переходе в теплое помещение гемолиз прекращается.

Агглютинация часто приводит к увеличению среднего объема эритроцитов и ложно низким значениям гемоглобина при исследовании крови на гематологических анализаторах. Количество лейкоцитов и тромбоцитов - в пределах нормальных величин, ускоренная СОЭ. В сыворотке крови - незначительное увеличение неконъюгированного билирубина.

Наличие холодовых агглютининов затрудняет проведение общего анализа крови. Поэтому исследование проводят после подогрева образца в термостате при температуре 37 °С (кровь берут в пробирку, предварительно опущенную в горячую воду). В сыворотке крови таких больных обнаруживают диагностически значимое повышение титра холодовых антител, на поверхности эритроцитов - IgM. При использовании поливалентной антиглобулиновой сыворотки прямая проба Кумбса оказывается в ряде случаев положительной. Полные холодовые агглютинины имеют специфичность к системе антигенов Ii (Рр) на поверхности эритроцитов.

Таким образом, используя эритроцитарные и ретикулоцитарные показатели, стали возможными:

- проведение быстрого скрининга на наличие анемического синдрома;

- определение характера анемии;

- оценка интенсивности эритропоэза в костном мозге;

- мониторирование динамики лечения по этим показателям.

Эритроцитозы

Повышение количества эритроцитов в крови - эритроцитоз - может наблюдаться при различных состояниях (таблица 13).

Таблица 13

Эритроцитозы (Г.И. Козинец и В.А. Макаров, 1997)
Основные патогенетические группы	Клинические формы (ситуации)
Абсолютные эритроцитозы (обусловлены повышенной продукцией) - первичный эритроцитоз - симптоматические эритроцитозы: - вызванные гипоксией - вызванные повышенной продукцией эритропоэтина - связанные с избытком адренокортикостероидов или андрогенов	Эритремия - заболевания легких - врожденные "синие" пороки сердца - наличие аномальных Hb -пребывание на больших высотах синдром Пиквика (ожирение) - гипернефроидный рак, рак надпочечников - рак печени - гидронефроз и поликистоз почек - стеноз почечной артерии - рак яичников - ангиобластома мозжечка - синдром Кушинга - феохромоцитома - гиперальдостеронизм
Относительные эритроцитозы(следствие гемоконцентрации)	-Потеря жидкости организмом (потоотделение, рвота, понос, ожоги, прием диуретиков) - Стресс
Смешанный эритроцитоз (вследствие сгущения крови и плацентарной трансфузии)	Физиологический эритроцитоз новорожденных

2.7 Нейтрофильный лейкоцитоз

Нейтрофильный лейкоцитоз (нейтрофилез) может быть следствием:

- усиленной продукции клеток в костном мозге;

- повышенной миграции нейтрофилов из костного мозга в кровь;

- перераспределения нейтрофилов из маргинального в циркулирующий пул;

- задержки миграции нейтрофилов из крови в ткани;

- сочетанного действия вышеперечисленных причин.

Нейтрофилез может быть реактивной и опухолевой природы (таблица 14).

Таблица 14

Причины развития нейтрофильного лейкоцитоза
Реактивный	Опухолевый
- Инфекции (бактериальные, грибковые, паразитарные) - злокачественные новообразования - гемолитические анемии - острая кровопотеря - лекарственные препараты - воспалительные и некротические процессы - ацидоз, эклампсия, уремия, подагра - лимфогранулематоз - физические и эмоциональные нагрузки - беременность	- Миелопролиферативные заболевания

Выраженный нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево свидетельствует о максимальной активности гемопоэза, что прогностически благоприятно. Относительный нейтрофилез со сдвигом влево при наличии лейкопении свидетельствует об истощении гранулоцитарного костномозгового резерва и является крайне неблагоприятным признаком.

Лейкопения с нейтропенией

Лейкопения может быть функциональной и органической (таблица 15).



Таблица 15

Причины развития нейтропении
Функциональная	Органическая
- Инфекции (бактериальные, грибковые, вирусные, вызванные простейшими, риккетсиями) - Алиментарная дистрофия, голодание - Лекарственные препараты - Анафилактический шок - Аутоиммунные заболевания	- Острые лейкозы - Лимфопролиферативные заболевания - Миелодиспластический синдром - Мегалобластные анемии - Наследственная доброкачественная нейтропения, циклическая нейтропения, синдром Чедиака-Хигаши - Лучевая болезнь - Агранулоцитоз - Апластическая анемия

Агранулоцитоз

Агранулоцитоз - резкое уменьшение числа гранулоцитов в периферической крови вплоть до их исчезновения.

Эозинофилия

Эозинофилия - увеличение количества эозинофилов в крови более

Таблица 16

Причины развития эозинофилии
Реактивная	Опухолевая
- Паразитарные инфекции - Аллергические заболевания - Аутоиммунные заболевания - Лекарственные препараты - Гранулематозные процессы - Лимфогранулематоз - Злокачественные новообразования	- Острый лейкоз с эозинофилией (М4эоз) - Эозинофильный лейкоз

Эозинопения

Эозинопения - снижение количества эозинофилов в крови менее или анэозинофилия - отсутствие эозинофилов в крови - встречается на первом этапе воспалительного процесса, при тяжелых гнойных инфекциях, шоке, стрессе, эклампсии и в родах, интоксикациях различными химическими соединениями, тяжелыми металлами.

Базофилия

Базофилия может наблюдаться при аллергических заболеваниях, в ранней фазе ревматизма, при хроническом миелоидном лейкозе, миелофиброзе, эритремии. Тучноклеточный лейкоз сопровождается увеличением тучных клеток в костном мозге и крови.

Лимфоцитоз

Лимфоцитоз - относительное или абсолютное увеличение количества лимфоцитов.

Таблица 17

Причины развития лимфоцитоза
Реактивный (поликлональный)	Опухолевый (моноклональный)
- Вирусные и паразитарные инфекции - Гранулематозные процессы - Аутоиммунные заболевания - Злокачественные новообразования	- Лимфопролиферативные заболевания

Лимфоцитопения

Лимфоцитопения - содержание лимфоцитов, наблюдается при острых инфекционных заболеваниях, милиарном туберкулезе (висцеральная форма), системной красной волчанке, почечной недостаточности, в терминальной стадии злокачественных новообразований, лимфогранулематозе, как ранний признак острой лучевой болезни.

Моноцитопения

Моноцитопения - снижение содержания моноцитов. Уменьшение числа моноцитов наблюдается при гипоплазии и аплазии костного мозга, острых лейкозах, волосатоклеточном лейкозе, острых инфекциях при применении некоторых лекарственных препаратов.



3. Возможности высокотехнологичных гематологических анализаторов

Эволюция созревания клетки отражается на ее морфологии. В современных гематологических анализаторах стало возможным распознавать функциональную трансформацию клетки, исходя из концепции "морфология отражает функцию". Различные этапы созревания клеток оцениваются по синхронности созревания ядра и цитоплазмы и могут быть оценены по стандартным критериям. Разработка новых технологий, исследовательских программ автоматизированного анализа крови основана на знании событий, происходящих в процессе клеточного цикла, функций и морфологии клеток, их изменений при воздействии различных факторов, вызывающих диспластические процессы, апоптоз.

3.1 Использование тромбоцитарных параметров крови

Одним из важных параметров общего анализа крови является количество тромбоцитов, определяющее зачастую вероятность развития тромбоза или геморрагического синдрома. В то же время количество тромбоцитов не отражает их функциональную активность. Поэтому для прогноза развития вышеперечисленных состояний необходимо использование дополнительных, более информативных показателей тромбоцитов, а также исследование системы гемостаза.

Среди тромбоцитарных показателей используются средний объем тромбоцитов (MPV), ширина распределения тромбоцитов по объему (PDW), тромбокрит (РСТ), а также новые показатели - фракция незрелых тромбоцитов (IPF), средний тромбоцитарный компонент (МРС).

Фракция незрелых тромбоцитов может быть использована в дифференциальной диагностике тромбоцитопений, которые наиболее часто могут быть вызваны либо нарушенной продукцией в костном мозге, либо повышенным их потреблением.

Нарушение продукции тромбоцитов наблюдается после химиотерапии, лучевой терапии, трансплантации костного мозга или стволовых гемопоэтических клеток, апластической анемии. Во всех этих наблюдениях содержание IPF находится в пределах нормы.

Параметр фракции незрелых тромбоцитов может быть использован при мониторинге регенерации костномозгового гемопоэза после химиотерапии, лучевой терапии, трансплантации костного мозга или стволовых клетокПосле трансплантации костного мозга или стволовых клеток имеется определенный промежуток времени, когда регенераторная способность костного мозга еще не восстановлена, поэтому больные нуждаются в трансфузии эритроцитарной и тромбоцитарной массы. Мониторинг за показателем IPF позволяет сократить число таких трансфузий, т.к. является более ранним предвестником восстановления тромбоцитопоэза в костном мозге по сравнению с общим количеством тромбоцитов.

IPF используется в мониторинге терапии идиопатической и аутоиммунной тромбоцитопенической пурпуры. На фоне эффективного лечения повышенные значения IPF возвращаются к норме параллельно с повышением общего количества тромбоцитов, т.е. этот параметр обратно коррелирует с числом PLT.

Снижение количества PLT в крови - тромбоцитопения - может развиваться в результате:

- снижения продукции тромбоцитов (наследственные и приобретенные заболевания - онкогематологические заболевания, метастазы злокачественных новообразований в костный мозг, апластическая анемия, заболевания соединительной ткани, мегалобластные анемии, заболевания печени, воздействие ионизирующей радиации, цитостатической терапии, вирусные инфекции и др.);

- повышенной деструкции тромбоцитов - инфекции, эклампсия беременных, гемолитико-уремический синдром (ГУС), идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, хронический лимфолейкоз, хронический активный гепатит, посттрансфузионная тромбоцитопения, гемодиализ, кровотечения, спленомегалии (болезни накопления, лимфомы, волосатоклеточный лейкоз, миелопролиферативные заболевания), иммунные тромбоцитопении;

- в результате потребления PLT - ДВС-синдром.

Повышение количества тромбоцитов в крови - тромбоцитоз - наблюдается при различных заболеваниях (таблица 19).

Таблица 19

Причины развития тромбоцитозов
Тромбоцитоз	Заболевания и синдромы
Реактивный	Спленэктомия, острая кровопотеря, острый гемолиз состояние после операции, злокачественные новообразования, ревматоидный артрит, туберкулез, язвенный колит, остеомиелит
Опухолевый	Миелопролиферативные заболевания

В настоящее время трансплантация гемопоэтических стволовых клеток широко используется при гематологических, онкологических заболеваниях, некоторых аутоиммунных заболеваниях. В ряде случаев она является единственным излечивающим методом (хронический миелолейкоз, апластические анемии, острые лейкозы). Для пересадки стволовых клеток необходимо иметь трансплантат, состоящий либо из аутологичных, либо из аллогенных клеток. Основными его источниками являются клетки костного мозга, периферической и пуповинной крови. В качестве источника стволовых клеток все чаще выступает периферическая кровь, в связи с чем существует серьезная потребность в быстром, надежном методе оценки содержания стволовых клеток в периферической крови. Эта информация жизненно необходима для определения оптимального времени сбора (афереза) стволовых клеток и мониторирования приживления трансплантата.

Для достижения оптимального клинического результата трансплантации стволовых клеток необходима достаточная концентрацию этих клеток. В настоящее время с целью характеристики содержания в трансплантатах клеток-предшественников существует три метода. Это метод проточной цитофлюориметрии для количественной оценки CD34+ клеток, который используется наиболее часто, требует квалифицированных специалистов, четкой стандартизации, занимает достаточно длительное время и дорогостоящий. Метод определения колониеобразующей способности (CFU-GM) не является практическим методом для стандартного клинического мониторинга, так как требует 14 дней для полного завершения. Третий метод - это подсчет стволовых клеток периферической крови на основании относительно нового потенциального маркера - Гемопоэтическая Клетка-Предшественник (НРС), определяемого некоторыми гематологическими анализаторами.

Истинные стволовые клетки и ранние гемопоэтические клетки-предшественники имеют меньший размер по сравнению с линейно коммитированными клетками-предшественниками, и по мере их созревания они постепенно сначала увеличиваются в размерах, а затем прогрессивно уменьшаются. Эти процессы сопровождаются выраженными изменениями в цитоплазме, характеризуемыми преимущественно потерей диффузного голубого цитоплазматического окрашивания, которое представляет собой активно синтезирующий белки эндоплазматический ретикулум. Затем клетки фокусируют свою метаболическую активность в сторону образования внутриклеточных гранул, в результате цитозоль подвергается ряду характерных изменений, преимущественно вследствие аккумуляции в клетках большого количества гранул. К концу последовательного процесса созревания клетки цитоплазма становится резко гранулярной. Кроме того, изменяется хроматиновая структура ядра. На ранних этапах развития хроматиновая сеть имеет крупные открытые ячейки, легко различимые ядрышки. В процессе созревания ядерный хроматин становится более плотным и в случае нейтрофилов дольчатым.

Поверхностная мембрана ранних клеток-предшественников специфически адаптирована для адгезии к стромальным клеткам костного мозга, что необходимо для поддержания важных свойств этих клеток - самообновления и направленной дифференцировки. Такие адгезированные клетки нечасто покидают костный мозг. В большинстве случаев они так плотно приклеены к строме, что им приходится изменять свою мембрану для мобилизации из костного мозга и выхода в циркуляцию. Эти процессы сопровождаются изменениями в содержании поверхностных мембранных белков и в способе взаимодействия этих белков с цитоскелетом, что делает клетки более деформируемыми. Это позволяет им продвигаться через сосудистый эндотелий и, в конечном итоге, в межтканевое пространство. Мембранные изменения также значительно изменяют чувствительность клеток к лизису неионными детергентами.

3.2 Контроль качества на гематологических анализаторах

Современные анализаторы, используемые в клинико-диагностических лабораториях, - это, как правило, "черные ящики", которые программируются на входе, результат получается на выходе. Уверенность в получаемых результатах может быть обеспечена только при использовании программ контроля качества.

Согласно 1.5.3 Приложения 1 к Приказу 45: "Регулярно проводимая внешняя оценка качества и повседневно проводимый внутрилабораторный контроль качества дополняют, но не заменяют друг друга. Внешняя оценка качества направлена, прежде всего, на выявление систематических ошибок лабораторных методов и обеспечение единства измерений на территории страны, а внутрилабораторный контроль качества предназначен для поддержания стабильности аналитической системы, выявления и устранения недопустимых случайных и систематических погрешностей".

Сущность контроля качества заключается в сопоставлении результатов исследования проб с результатами исследования контрольного материала и измерении величины отклонения.

Внешний контроль качества обеспечивается в России Федеральной системой внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК). В перечне услуг, предоставляемых ФСВОК, есть программы, предназначенные для оценки качества гематологических показателей, определяемых на анализаторах. Программы внешней оценки качества ФСВОК ежегодно адаптируются под конкретные задачи текущего момента. Однако подчеркиваем, что участие во внешней оценке качества при работе на гематологических анализаторах является обязательным, и будет учитываться как один из основных критериев при сертификации клинико-диагностических лабораторий любого подчинения.

3.3 Внутрилабораторный контроль качества

Внутрилабораторный контроль качества - объективная проверка результатов лаборатории, осуществляемая ежедневно непосредственно в лаборатории, преимущественно с целью оценить воспроизводимость. Внутрилабораторный контроль качества решает две основные задачи: контроль переменных внешних факторов (разные партии реагентов, калибровочных материалов и пр.) и контроль стабильности выполнения методики в лаборатории. Цель внутрилабораторного контроля качества - выявление и устранение отклонений от стабильного выполнения теста в лаборатории, т.е. выявление и устранение недопустимых аналитических ошибок.

Для того, чтобы контроль качества отвечал поставленным перед ним задачам, он должен быть:

1. Систематическим, повседневным, проводиться по единым правилам, т.е. анализ контрольных проб должен включаться в обычный ход работы лаборатории;

2. Охватывать все области измерений (норма, высокие и низкие патологические значения);

3. Производиться в реальных условиях работы лаборатории (так же, как обычные пробы пациентов, т.е. тем же персоналом и в тех же условиях);

4. Объективным (желательно "шифровать" контрольный материал, чтобы исполнитель не знал, где опыт, а где контроль).

3.4 Принцип проведения внутреннего контроля качества

Принцип проведения внутреннего контроля достаточно прост: периодически (в каждой серии) нужно проводить измерение одного и того же контрольного материала, а результаты этих измерений заносить на контрольную карту.

Хорошо организованная система внутреннего контроля качества позволяет достаточно эффективно выявлять ошибки, связанные с:

- внешними варьирующими факторами (реагенты, калибраторы, расходные материалы);

- внутренними варьирующими факторами (организация в лаборатории "домашних реактивов", обучение персонала, обслуживание приборов, ведение документации, реакция персонала на возникающие проблемы).

Для оценки качества исследований рассчитываются следующие статистические показатели:

1. Среднее арифметическое значение или средняя арифметическая

где:

X - значения конкретных измеренений;

n - число измерений.

2. Отклонение от правильного значения, то есть разница между истинной величиной (мю) и средней арифметической, отражает величину систематической ошибки (b) и, соответственно, точность определений (В, %):

b (абсолютная величина) = Х ср - мю или

3. Стандартное отклонение (сигма - "сигма", SD стандартная девиация, дисперсия):

Стандартное отклонение отражает величину случайной ошибки, то есть воспроизводимость конкретного измерения в абсолютной величине.

4. Коэффициент вариации (V или CV):

Коэффициент вариации отражает воспроизводимость в относительном значении (процентах). Его легко можно использовать для характеристики и сравнения различных лабораторных показателей. Чем меньше коэффициент вариации, тем выше воспроизводимость результатов.

Внутрилабораторный контроль качества с использованием аттестованной контрольной крови - контроль правильности и воспроизводимости

При проведении контроля качества с использованием аттестованного коммерческого контроля применяются фиксированные стабилизированные клетки крови. Измерение этих клеток по программе, аналогичной программе измерения проб, дает возможность оценить работу прибора. Применяются контроли с низким, нормальным и высоким содержанием исследуемых показателей. Используется этот контрольный материал для оценки правильности. В то же время фиксированные клетки коммерческого контроля нельзя использовать для оценки свойств реактивов (лизатов, изотонических и промывающих растворов), так как эти растворы предназначены для влияния на живые клетки крови, они их модифицируют, но не действуют на фиксированные неживые клетки. Фиксированные клетки в любом растворе будут давать одинаковый результат. В анализаторах заложена данная программа. Она имеет обширную память, автоматически строятся контрольные карты и рассчитываются статистические показатели по всем измеряемым и расчетным параметрам. Такая программа значительно упрощает работу по контролю качества и фактически не требует дополнительных усилий со стороны оператора, в то же время дает определенную уверенность в результатах.

При использовании коммерческой контрольной крови можно сразу оценивать результаты. В этом случае так называемое должное значение для используемой модификации метода, указанное в инструкции к контрольному материалу, следует принять за среднюю арифметическую (Х ср), доверительный предел - за предел Хср +/- 1 сигма и самостоятельно рассчитать два других предела (Х ср +/- 2 сигма и Х ср +/- 3 сигма), необходимых для построения контрольной карты. В инструкции к коммерческой аттестованной контрольной крови все эти пределы указаны.

В гематологических анализаторах заложена программа внутреннего контроля качества с автоматическим построением карты Шухарта. Однако строиться такая карта будет только в том случае, если при измерении контрольной крови оператор будет выходить на программу контроля качества, а не измерять контрольную кровь в программе измерения проб пациентов.

Оценка контрольных карт

Если воспроизводимость и правильность проводимых измерений сохраняются на неизменном уровне, то все следующие результаты измерения контрольного материала должны подчиняться правилам, которые являются следствиями закона нормального распределения. Получаемые результаты должны приблизительно поровну располагаться по обе стороны от среднего значения, не должны непрерывно возрастать или убывать и не должны сильно отклоняться от среднего значения. Ошибки, возникающие при измерении контрольного материала, будут сопровождаться отклонением от характеристик нормального распределения. Это положено в основу принципов оценки контрольных карт.

Таблица 20

Правила Вестгарда для оценки результатов внутреннего контроля качества с использованием контрольных карт
Критерий и его описание <*>	Тип ошибки
1 2SD	- один результат в серии вышел за предел Хср+/- 2 сигма	Сигнал для применения других критериев!
L 3SD	- один результат в серии вышел за предел Хср +/- 3 сигма	случайная
R 4SD	- разница между двумя измерениями в серии превышает 4 сигма	случайная
2 2SD	- два последовательных измерения в серии вышли за предел Хср + 2 сигма или Хср - 2 сигма	систематическая
4 LSD	- четыре последовательных измерения в серии вышли за предел Хср + 1 сигма или Хср - 1 сигма	систематическая
10 х	- десять последовательных измерений лежат по одну сторону от средней линии (Хср). Может применяться самостоятельно!	систематическая

<*> Для удобства использования контрольные правила обозначаются символами типа А , где А - это аббревиатура числа L контрольных результатов, учитываемых данным правилом, L -контрольный предел (например 4LSD).

Существует несколько принципов оценки контрольных карт, однако общепринятыми являются правила Вестгарда (Westgard), которые используются и при анализе ошибок, возникающих на гематологических анализаторах при работе на программе контроля качества с коммерческой контрольной кровью (таблица 20).

Приведенные правила Вестгарда достаточно эффективны для выявления минимальной систематической ошибки.

Действия, которые нужно предпринимать при выходе метода из-под контроля.

При появлении результатов, соответствующих предупредительным критериям, необходимо тщательно проанализировать все этапы работы. Такие результаты можно выдать врачу, но необходимо проверить весь процесс работы на гематологическом анализаторе.

При появлении результатов, соответствующих контрольным критериям, анализы задерживаются и принимаются меры для выявления и исключения ошибок. Когда условия выполнения анализа будут исправлены, необходимо заново измерить контрольную кровь и пробы пациентов, которые были проанализированы в неправильных условиях.

Предупредительные действия:

- периодический просмотр/обслуживание оборудования, документация этих действий;

- закупка контрольных материалов заранее так, чтобы существовала возможность их сравнения с материалами, употребляемыми в настоящее время;

- создание соответствующих условий для хранения реактивов, контрольной крови и проб пациентов;

- точная маркировка всех реагентов и проб;

- нанесение на контрольную карту всех пометок, связанных с заменой реагентов, калибраторов и прочее.

Методы, использующие контрольные материалы, наиболее широко применяются для контроля качества в КДЛ. Однако эти методы не выявляют ошибку в целом. В таблице приведены некоторые недостатки методов с использованием коммерческих контрольных материалов.

Таблица 20

Некоторые недостатки методов, использующих для контроля качества коммерческие контрольные материалы: Требуют значительных материальных затрат Контрольные материалы имеют ограниченный срок действия (нестабильны) Контрольные материалы могут быть неадекватными по своим характеристикам образцам пациентов Контролируется только этап анализа, игнорируются преаналитическая и постаналитическая стадии

Для России существенными недостатками контрольной крови для контроля качества являются:

- дороговизна контрольной крови;

- сложность регулярных поставок импортных материалов;

- ограниченность срока действия;

- невозможность по этому контрольному материалу оценить качество отечественных реагентов, предлагаемых взамен "родных реактивов" к импортным гематологическим анализаторам.

Ниже приводятся некоторые способы проведения внутреннего контроля без использования контрольных материалов. Эти способы не упоминаются в последних рекомендациях ведущих европейских экспертов. Создание адекватной системы внутреннего контроля качества без приобретения хороших контрольных материалов невозможно, описанные ниже способы можно рекомендовать только как дополнительные.

3.5 Внутрилабораторный контроль качества без контрольной крови

Карта по ежедневным средним (контроль правильности)

Для многих исследований в качестве дополнительного можно рекомендовать контроль по ежедневным средним, в котором используются образцы или результаты исследования образцов пациентов. Преимуществами этого метода является то, что он, с одной стороны, не требует специального контрольного материала, с другой стороны, позволяет выявлять ошибки не только на аналитическом этапе, но и некоторые ошибки, возникающие на преаналитическом этапе (например, связанные с взятием или предварительной обработкой проб пациентов).

Данный метод имеет ряд ограничений. Прежде чем начинать ведение карты по ежедневным средним, нужно принять во внимание следующее:

- Обследуемый изо дня в день контингент должен быть достаточно однородным (т.е. не должно быть сильных изменений количественных и качественных изменений обследуемых лиц).

- Если в лаборатории в определенные дни происходит смена обследуемого контингента (например, в один из дней обследуются только новорожденные или только больные диабетом), то средние значения по этим дням в расчет принимать не следует.

- Если усреднять все полученные значения, то даже один сильно патологический результат может существенно изменить среднее значение. Поэтому в расчет должны приниматься только те значения, которые укладываются в определенные пределы (диапазон усреднения).

- Пределы усреднения могут быть установлены достаточно произвольно. Как правило, рекомендуется использовать нормальный диапазон или брать шире его в 1,2 - 2,0 раза.

- Диапазон усреднения не должен быть слишком узким, так как это снижает чувствительность данного метода контроля к выявлению ошибок, но и не должен быть слишком широким, так как при этом будет большой разброс средних изо дня в день.

- Минимальное количество усредняемых ежедневно результатов должно быть не менее 15, лучше 50 - 70, это зависит от теста и от нагрузки в лаборатории.

- Большая часть пациентов должна иметь результаты в области усреднения. Не имеет смысл вести контроль качества по ежедневным средним, если результаты данного теста сильно патологические (например, результаты исследования лейкоцитов в гематологическом отделении).

- Необходимо обрабатывать достаточно большие массивы данных. Ручной расчет очень трудоемок, желательно проводить автоматизированный контроль.

Карты по ежедневным средним анализируются по тем же правилам, что и карты по контрольным материалам. Для построения карт по ежедневным средним необходимо выполнить следующие действия:

1. В течение 20 дней ежедневно рассчитывать среднее по результатам пациентов, попавших в диапазон усреднения;

2. По этим значениям рассчитать среднюю, дисперсию и коэффициент вариации;

3. Если коэффициент вариации (CV) будет существенно больше, чем CV, получаемый изо дня в день по контрольным материалам, значит, количество усредняемых в день результатов пациентов недостаточно (при условии однородности контингента обследуемых). В этом случае будет очень большой разброс точек на карте, и интерпретировать ее будет затруднительно. Надо увеличивать количество усредняемых результатов, иначе ведение карты по ежедневным средним теряет смысл. При ведении такого контроля следует иметь в виду, что этот метод позволяет вести контроль правильности только на уровне среднего значения по пациентам. Контроль на более высоком и более низком уровнях значений нужно вести другими методами.

3.6 Программа контроля качества по накопленному среднему

Эта программа основана на законах распределения больших выборок, согласно которым суммарный результат генеральной совокупности имеет тенденцию быть стабильным при отсутствии систематических влияний. Систематические ошибки неизбежно приведут к отклонению от генеральной средней средних выборочных совокупностей. Во многих гематологических анализаторах устанавливают программу контроля качества по накопленному среднему.

Эта программа функционирует без непосредственного участия оператора. При наборе, допустим, из 20 анализов, в которых не было флагирования по оцениваемым параметрам, прибор вычисляет текущую среднюю для таких комплексных показателей, как MCV, МСН, МСНС. Текущее среднее сравнивается со значением генерального среднего, вычисленного, допустим, из 500 анализов. Программа запоминает средние из последовательных 20-ти анализов, строит графики, аналогичные графикам на картах Шухарта. Отображаемые на графиках предельные линии ошибок соответствуют отклонениям показателей, допустим, в +/- 3%. Если новое среднее значение вышло за предельные линии ошибок по любому из оцениваемых параметров, то будет сделано соответствующее сообщение оператору и распечатаны результаты отдельных анализов, приведшие к значительному отклонению комплексных показателей. Если наблюдается последовательность из 3 средних, отклонившихся от генерального среднего более чем на предельную допустимую величину, то прибор фиксирует ненормальное поведение системы.

Сочетание этих подходов, основанных на контроле правильности, контроле воспроизводимости и выявлении систематических ошибок, позволяет достаточно уверенно использовать результаты анализов пациентов на гематологических анализаторах. В настоящее время все гематологические анализаторы снабжены встроенными программами контроля качества.

Ошибки аналитического периода

Приступая к работе на гематологическом анализаторе, внимательно прочитайте руководства по эксплуатации и обратите внимание на границы линейности измерения анализируемых параметров. Оценка проб со значениями анализируемых параметров, превышающих границу линейности измерения, чревата получением ошибочных результатов. В большинстве случаев при анализе проб с гиперцитозами анализатор вместо значения измеряемого параметра выдает значок "--D", что указывает на необходимость разведения пробы и повторного измерения. Разведение необходимо проводить до тех пор, пока не будут получены схожие итоговые результаты при двух ближайших разведениях.

Концентрация гемоглобина в большинстве гематологических анализаторов определяется фотометрически. Различное влияние липидемии на определение гемоглобина в приборах связано с техническими особенностями, а не с методологией. Величина результирующей ошибки сильно зависит от оптической геометрии прибора: размера выходного отверстия из кюветы для образцов и расстояния до фотодиода.

Контролем за правильностью измерения концентрации гемоглобина может служить величина МСНС, которая рассчитывается приборами путем деления концентрации гемоглобина в г/100 мл на гематокрит и умножения на 100. Чаще всего увеличение МСНС свидетельствует об ошибках, допущенных при измерении пробы (погрешности определения гемоглобина или MCV). Таким образом, данный параметр может быть использован и как индикатор ошибок, допущенных на аналитическом или преаналитическом этапах работы.



Основные рекомендации по обеспечению качества гематологических исследований на анализаторах

1. Внимательно изучите инструкцию к гематологическому анализатору и работайте на анализаторе согласно этому документу.

2. Используйте для анализа кровь, стабилизированную К-ЭДТА в рекомендованной пропорции для конкретной соли. Лучшие результаты достигаются при использовании одноразовых коммерческих пробирок для гематологических исследований (красная крышечка).

3. Запускайте прибор, соблюдая все стадии промывки, добейтесь нулевых (фоновых) значений показателей по всем каналам.

4. Выполните процедуру контроля качества по соответствующей программе. Оцените полученный результат.

5. В качестве реактивов используйте рекомендованные фирмой - поставщиком прибора. При смене реагентов на другого производителя будьте предельно внимательны на всем протяжении работы на этих реактивах, нарушения работы прибора могут возникнуть не сразу.

6. Перед анализом осторожно, но тщательно перемешайте пробирку с кровью. Лучше для этой цели использовать ротомикс.

7. Работайте осмысленно, сопоставляя получаемые результаты с клинической характеристикой проб пациента.

8. Обращайте внимание на сообщения прибора о вероятных систематических ошибках. Помните, что увеличение МСНС выше нормальных значений, - как правило, результат ошибки измерения.

9. При выявлении ошибки обязательно устраните причину, не работайте на неисправном приборе.

10. После окончания измерений тщательно промойте анализатор, не перекладывайте эту работу на других.

11. При остановке прибора на длительный срок обязательно выполните все процедуры консервации. Лучше эту работу выполнить вместе с сервис-инженером.

12. При возникновении технических проблем дождитесь сервис-инженера, авторизованного фирмой - поставщиком. Не доверяйте работать на приборе и копаться в нем необученному персоналу.

13. Добейтесь от администрации заключения с фирмой-поставщиком контракта на постоянное сервисное обслуживание. Следите, чтобы фирма-поставщик вовремя проводила профилактическое обслуживание прибора.

14. Все получится, если будете соблюдать инструкцию по работе на приборе и будете уверены в своих знаниях. Авторы желают Вам удачи.

Основная литература

1. Долгов В.В., Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е. // Лабораторная диагностика анемий. Тверь, Губернская медицина, 2001.

2. Козинец Г.И., Макаров В.А. (Ред.) // Исследование системы крови в клинической практике. М., Триада-Х, 1997.

3. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др. // Клетки крови - современные технологии их анализа. М, "Триада-Фарм", 2002, с. 4 - 27.

4. Г.И. Козинец, В.М. Погорелов, О.А. Дягилева, И.Н. Наумова. // Кровь. Клинический анализ. Диагностика анемий и лейкозов. Интерпретация результатов. М., Медицина XXI, 2006.

5. Меньшиков В.В. (Ред.) Клиническая лабораторная аналитика. // М., т. 2, 1999.

6. Кузнецова Ю.В., Ковригина Е.С., Байдун Л.В. и др. // Использование эритроцитарных индексов и показателей обмена железа в дифференциальной диагностике микроцитарных анемий. Гематол. и трансфузиол., 2000, т. 45, N 6, с. 46 - 48.

7. Луговская С.А., Почтарь М.Е. // Гематологический атлас. М., "Триада", 2004.

8. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. // Лабораторная гематология. М., "Триада", 2006.

9. Луговская С.А., Почтарь М.Е. // Ретикулоциты. М., 2006.

10. Матер. XIX Международного симпозиума "Technological Innovations in Laboratory Hematology", April 25 - 28, 2006.

11. Новик А.А., Богданов А.Н.. Анемии. СПб, "Нева", 2004.

12. Погорелов В.М., Козинец Г.И., Ковалева Л.Г. // Лабораторно-клиническая диагностика анемий, МИА, 2004.

13. Шиффман Ф.Д. // Патофизиология крови. М. - СПб., 2000.

14. Briggs С., Rogers R., Thompson В., Machin S. // "New Red Cell Parameters as Potential Markers of Functional Iron Deficiency". Infusion Therapy and Transfusion Medicine, 2001, v. 28, N 5, p. 249 - 308.

15. Hillman R.S., Ault K.A., Rinder H.M. // Hematology in Clinical Practice, McGrawHill, 2005.

16. Hinsmann R. // "Iron Metabolism, Iron Deficiency and Anemia". Sysmex Journal International, 2003, v. 13, N 2, p. 65 - 74.

17. Pollard Y., Watts M.J., Grant D. et al. // Use of the haemopoietic progenitor cell count of the SYSMEX SE-9500 to refine apheresis timing of peripheral blood stem cells. Br. J. Haematol, 1999, v. 106, p. 538 - 544.

18. Peng L., Jang J. Jang H. et al. // Determination peripheral stem cells by the SYSMEX SE-9500. Clin Lab Haemat., 2001, v. 23, p. 231 - 236.

19. Thomas L., Franck S., Thomas C., Messinger M. // "Clinical Utility of RET-Y in Functional Iron Deficiency. Proceedings of the Sysmex European Symposium", 2003, p. 91 - 101.

19. Torres Gomez A., Casano J., Sanchez J. at al. // "Utility of reticulocyte maturation parameters in the differential diagnosis of macrocytic anemias". Clin. Lab. Haematology, 2003, v. 25, p. 283 - 288.

20. Yu J., Leisenring W., Fritschle W. et al. // Enumeration of HPC in mobilized peripheral blood with the SYSMEX SE-9500 predicts final CD34+ cell yield in the apheresis collection. Bone Marrow Transplantant, 2000, v. 25, p. 1157 - 1164.

21. Wintrobe M.M. // Clinical Hematology - 9-th-Ed. Lea and Febiger, 1993.



Список сокращений

АА	Апластическая анемия
АИГА	Аутоиммунная гемолитическая анемия
АХЗ	Анемия хронических заболеваний
ЖДА	Железодефицитная анемия
НТЖ	Насыщение трансферрина железом
ОЖСС	Общая железосвязывающая способность сыворотки
ОПГА	Острая постгеморрагическая анемия
ХПН	Хроническая почечная недостаточность
ЭПО	Эритропоэтин
эЭПО	Эндогенный эритропоэтин
рЭПО	Рекомбинантный эритропоэтин
CHr	Содержание Hb в ретикулоцитах
CRC	Скорректированный подсчет ретикулоцитов
FSC	Прямое светорассеяние
HGB	Концентрация гемоглобина в крови
HFR	Ретикулоциты с высокой флюоресценцией
HLR%	Процент незрелых ретикулоцитов
HLR#	Абсолютное количество незрелых ретикулоцитов
Ht, НСТ	Гематокрит
% Hypo	Процент гипохромных эритроцитов
IRF	Фракция незрелых ретикулоцитов
LFR	Ретикулоциты с низкой флюоресценцией
MCV	Средний объем эритроцитов
MCVr (MRV)	Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах
MCH	Средний объем ретикулоцитов
MCHC	Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах
MFR	Ретикулоциты со средней флюоресценцией
MSRV (MSCV)	Средний объем сферических ретикулоцитов
PLT	Количество тромбоцитов (10 /л)
SFL	Канал специфического флюоресцентного сигнала
SSC	Боковое светорассеяние
sTfR	Растворимые рецепторы к трансферрину
RBC	Количество эритроцитов (10 /л)
RDW-CV	Показатель анизоцитоза эритроцитов
Ret	Ретикулоциты
RET#	Количество ретикулоцитов (10 /л)
Ret-He	Содержание Hb в ретикулоцитах
RET%	Количество ретикулоцитов (%)
RPI	Индекс продукции ретикулоцитов
WBC	Количество лейкоцитов (10 /л)

Размещено на Allbest.ru

...