Гемостаз. Методы исследования. Геморрагические диатезы. Тромбоцитопении. Тромбоцитопатии

§ при введении гепарина AT III снижается, так как соединяется с ним. Низкое содержание AT ІІI ведет к неэффективности терапии гепарином. Наклонность к рецидивирующим тромбозам, особенно плохо поддающимся терапии гепарином, должна наводить на мысль о снижении AT III. При терапии гепарином желательно проводить контроль над уровнем содержания AT III;

§ при приеме пероральных контрацептивов и эстрогенов;

§ наиболее частая причина снижения уровня AT III -- шоковые состояния, при которых резко падает продукция AT III печенью, и активируются его ингибиторы в крови.

Повышение уровня AT III расценивается как фактор геморрагического риска и отмечается в следующих случаях:

§ при вирусном гепатите, холестазе, тяжелом остром панкреатите, раке поджелудочной железы;

§ при дефиците витамина К;

§ при приеме антикоагулянтов непрямого действия;

§ во время менструации.

Гепарин в плазме

Активность гепарина в плазме в норме - 0,24-0,6 кЕД/л.

Гепарин является сульфатированным полисахаридом, синтезируется в тучных клетках, не проникает через плаценту. В большом количестве содержится в печени и легких. Превращает AT III в антикоагулянт немедленного действия. С фибриногеном, плазмином и адреналином образует комплексы, обладающие противосвертывающим и фибринолитическим действием. В малых концентрациях ингибирует реакцию между факторами IХа, VIII, аутокаталитическую активацию тромбина и действие фактора Ха. В высоких концентрациях ингибирует коагуляцию во всех фазах, в том числе и тромбин-фибриногеновую. Тормозит некоторые функции тромбоцитов. Экзогенный гепарин инактивируется главным образом в печени, но 20 % его выделяется с мочой. Гепарин оказывает свое действие только при наличии полноценного AT III в крови.

1. Определение гепарина необходимо как для мониторинга гепаринотерапии, так и для выявления резистентности больных к гепарину.

Повышение количества гепарина наблюдается при диффузных болезнях соединительной ткани, лейкозах, лучевой болезни, при анафилактическом и посттрансфузионном шоке.

Активированное время свертывания крови (ABC)

ABC в норме - 80-120 с.

Метод определения активированного времени свертывания крови (ABC) позволяет контролировать и регулировать уровень гепаринизации больного во время работы искусственных органов (аппарат искусственного кровообращения, искусственная почка, печень, гемосорбция), рассчитывать нейтрализующую дозу протамина сульфата и оценивать полноту нейтрализации гепарина. Большим достоинством метода является возможность выявлять больных с той или иной степенью резистентности к гепарину, когда для достижения оптимальной степени гепаринизации приходится вводить больному гепарин в дозе до 13 мг/кг, в то время как обычно применяется 2--4 мг/кг.

Протеин С в плазме

Содержание протеина С в плазме в норме -- 70-130%.

Протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеид плазмы. Синтезируется печенью в виде неактивного профермента, который под влиянием комплекса тромбин - тромбомодулин превращается в активную форму. Активированный протеин С - антикоагулянтный энзим, который селективно инактивирует факторы Va и VІІІa путем их гидролиза в присутствии ионизированного кальция, фосфолипидов и его кофактора - протеина S, тем самым препятствуя переходу протромбина в тромбин.

Определение протеина С - дополнительный тест для оценки состояния антикоагулянтной системы у больного. Специфичностью теста является то, что дефицит протеина С связан с высоким риском развития тромбоза, особенно венозного тромбоза и тромбоэмболии легочной артерии у молодых людей.

Дефицит протеина С - частая причина тромбоэмболических заболеваний у пожилых людей, поэтому определение его показано у больных в возрасте старше 50 лет, страдающих тромбозами, у которых его недостаточность составляет 25-40%. Недостаточность протеина С может быть двух типов: количественная (тип І) -- низкая концентрация протеина и качественная (тип II) -- протеин имеется, но он неактивен или малоактивен. При врожденной недостаточности протеина С - гетерозиготной - его активность составляет 30-60 %, при гомозиготной - 25% и ниже. Дальнейшие исследования показали, что резистентность к протеину С (неактивный протеин С) объясняется генетически обусловленным дефектом фактора V (и фактора VIII в других случаях) свертывающей системы крови.

Протеин С не является белком острой фазы. Снижение протеина С отмечается при заболеваниях печени, витамин-К-авитаминозе, ДВС-синдроме. При нефротическом синдроме протеин С может теряться с мочой. Непрямые антикоагулянты, контрацептивы снижают концентрацию протеина С.

3.2 Исследование микроциркуляторно-тромбоцитарного гемостаза

Наиболее общими тестами, отражающими состояние сосудистотромбоцитарного гемостаза, являются определение длительности кровотечения по Дуке и ретракция кровяного сгустка.

Уколочная проба Дуке. При уколе кончика пальца или мочки уха иглой на глубину 3--4 мм выступающую самостоятельно из ранки кровь снимают фильтровальной бумагой каждые 30 с. Продолжительность кровотечения в норме не превышает 4 мин, при тромбоцитопениях удлиняется до 20 - 30 мин и больше.

Определение ретракции кровяного сгустка (метод Макферлейна). В градуированную центрифужную пробирку помещают 5 мл венозной крови. В нее погружают стеклянную палочку с шероховатой поверхностью, укрепленную вертикально при помощи пробки, закрывающей пробирку. Пробирку устанавливают в водяную баню при 37°С. Через час, после свертывания, стеклянную палочку удаляют вместе со сгустком. Определяют объем оставшейся сыворотки и выражают его в процентах. У здорового человека ретракция кровяного сгустка составляет 44-46%, индекс ретракции (отношение объема отделившейся сыворотки к общему объему крови) - 0,3-0,5. Ретракция кровяного сгустка недостаточна или отсутствует при тромбоцитопениях и тромбоцитопатиях.

Из проб на резистентность капилляров при тромбоцитопениях и тромбоцитопатиях пользуются чаще «симптомом щипка» (на месте щипка через несколько минут появляется кровоизлияние, которое увеличивается неадекватно нанесенной травме капилляров) или «симптомом жгута» (симптом считается положительным, если при наложении на плечо жгута или манжетки тонометра на 3 мин при давлении 50 мм рт. ст. возникают петехии в количестве не менее одной на 1 см²).

В последние годы при диагностике тромбоцитопатий (качественных изменений тромбоцитов) стали применять методы, позволяющие изучить адгезию, агрегацию, реакцию освобождения тромбоцитов.

Из способов изучения адгезии тромбоцитов наиболее информативными являются закрытые методы, при которых кровь прямо из вены пропускается через колонку со стеклянными бусами (диаметр 0,5 мм) с соблюдением времени контакта. По разнице количества тромбоцитов в крови до и после прохождения через колонку судят о количестве тромбоцитов, подвергшихся адгезии к стеклу.

Агрегацию тромбоцитов исследуют в обогащенной тромбоцитами плазме крови с помощью ФЭКа или специальных фотометров (агрегометров), либо микроскопически - путем подсчета тромбоцитарных агрегатов и свободно лежащих тромбоцитов.

Агрегационную функцию тромбоцитов определяют при воздействии различных физиологических агрегирующих агентов: оптимальных и малых доз АДФ, коллагена (в эмульсии), адреналина, малых доз тромбина. При использовании малых доз АДФ и адреналина выявляется вторая волна агрегации, обусловленная «реакцией освобождения» из тромбоцитов собственных агрегирующих агентов (АДФ, адреналина, тромбоксана и др.). Отсутствие второй волны агрегации - важный признак некоторых тромбоцитопатий. Дополнительное представление о реакции освобождения дает изучение тромбоцитарных факторов - 4 пластиночного фактора, серотонина и др. в плазме крови. Исследование тромбоцитарных компонентов после разрушения тромбоцитов (ультразвуком или повторными замораживанием и оттаиванием) способствует разграничению нарушений реакции освобождения от недостаточности пула накопления в клетках этих компонентов. Исследование агрегации тромбоцитов под влиянием ряда нефизиологических агентов, например ристоцетина и бычьего фибриногена, используют в основном при диагностике болезни Виллебранда и синдрома Бернара - Сулье.

Агрегация тромбоцитов с АДФ в плазме

Процессы агрегации изучают с помощью агрегометра, отражающего ход агрегации графически в виде кривой; в качестве стимулятора агрегации служит АДФ.

До добавления проагреганта (АДФ) возможны случайные осцилляции кривой оптической плотности. После добавления агреганта на кривой появляются осцилляции за счет изменения формы тромбоцитов. Осцилляции уменьшаются по амплитуде, уменьшается и оптическая плотность. Тромбоциты соединяются в агрегаты, и кривая идет вверх (первичная волна). Когда подъем переходит в «плато», происходит реакция высвобождения, и кривая еще больше поднимается вверх (вторичная волна).

При воздействии малых доз АДФ на агрегатограмме регистрируется двойная волна агрегации. Первая фаза (первичная волна) зависит от добавленного экзогенного АДФ, вторая фаза (вторичная волна агрегации) - за счет реакции высвобождения собственных агонистов, содержащихся в гранулах тромбоцитов. Вводимые извне большие дозы АДФ, обычно 1·10-⁵М (1мкМ - 1·10-⁶М), приводят к слиянию первой и второй волн агрегации. Для достижения двухволновой агрегации обычно используется АДФ в концентрации 1·10-⁷М.

При анализе агрегатограмм обращают внимание на общий характер агрегации (одновол-новая, двухволновая; полная, неполная; обратимая, необратимая), разницу между оптической плотностью плазмы до начала агрегации и после достижения максимальной агрегации (характеризует интенсивность агрегации), а также уменьшение оптической плотности плазмы за первую минуту агрегации или угол наклона кривой на этапе бурной агрегации (характеризует скорость агрегации). Важно отметить, что появление двухволновой агрегации при стимуляции АДФ и адреналином в концентрациях, вызывающих в норме обратимую агрегацию (обычно 1-5 мкМ), указывает на повышение чувствительности тромбоцитов к этим индукторам, а развитие одноволновой неполной (а часто и обратимой) агрегации при стимуляции ими в концентрациях 10 мкМ и больше -- на нарушение реакции высвобождения тромбоцитов. В клинических исследованиях общепринятым считается использование АДФ в концентрациях 1·10-⁵М (для достижения одноволновой агрегации) и 1·10-⁷М (для достижения двухволновой агрегации).

Результаты исследования агрегационной способности тромбоцитов могут выражаться в процентах (табл. 3).

Определение агрегации тромбоцитов с различными индукторами агрегации играет важнейшую роль в дифференциальной диагностике тромбоцитопатий (табл. 4).

Таблица 3. Агрегация по Вайсу для АДФ в норме

Таблица 4. Нарушения агрегации тромбоцитов при различных заболеваниях

Примечание; (+,-) - диагностического значения не имеет

В зависимости от функционально-морфологических характеристик тромбоцитов тромбоцитопатии делят на следующие группы.

§ Наследственные дизагрегационные тромбоцитопатии без нарушения реакции высвобождения (вторичная волна). В эту группу входят:

§ - тромбастения Гланцманна, для которой характерно падение АДФ-зависимой агрегации, при нормальной ристоцетинагрегации;

§ Парциальные дизагрегационные тромбоцитопатии. В эту группу входят заболевания с врожденным дефектом агрегации с тем или иным агрегантом или упадком реакции высвобождения;

§ Нарушение реакции высвобождения. Для этой группы заболеваний характерно отсутствие второй волны агрегации при стимуляции малым количеством АДФ и адреналина. В тяжелых случаях отсутствуют АДФ и адреналинагрегация;

§ Болезни и синдромы с недостаточным пулом накопления и хранения медиаторов агрегации. К этой группе относятся заболевания, характеризующиеся неспособностью тромбоцитов накапливать и выделять серотонин, адреналин, АДФ и другие факторы кровяных пластинок. Лабораторно для этой группы характерны снижение всех видов агрегации и отсутствие второй волны агрегации.

При приобретенных тромбоцитопатиях отмечают снижение агрегации в ответ на введение АДФ при пернициозной анемии, остром и хроническом лейкозе, миеломной болезни. У больных уремией при стимуляции коллагеном, адреналином АДФ-агрегация снижена. Для гипотиреоза характерно снижение агрегации при стимуляции АДФ. Ацетилсалициловая кислота, пенициллин, индометацин, делагил, диуретики (в частности фуросемид при применении в высоких дозах) способствуют снижению агрегации тромбоцитов, что нужно учитывать при лечении этими препаратами.

При хирургических операциях, осложненных кровотечениями, нарушения в системе сосудисто-тромбоцитарного гемостаза в большинстве случаев обусловлены не нарушением агрегационных и других функциональных свойств тромбоцитов, а наличием тромбоцитопении той или иной степени.

Агрегация тромбоцитов с коллагеном в плазме

Коллагениндуцированная агрегация тромбоцитов имеет достаточно выраженную латентную фазу, во время которой происходит активация фосфолипазы С. В зависимости от используемого реагента продолжительность этой фазы может составить 5-7 мин.

В лабораторно-клинической практике коллаген (например, фирмы «Stago», Франция) чаще всего используют в конечной концентрации 50 мкг/мл. Однако коллагены других фирм могут обладать иной активностью, что необходимо учитывать при их применении. Результаты исследования агрегационной способности тромбоцитов могут выражаться в процентах (табл. 5.).

Таблица 5. Агрегация тромбоцитов по Вайсу для коллагена в норме

Агрегация тромбоцитов с адреналином в плазме

Кривая, регистрируемая при записи адреналининдуцированной агрегации, имеет две волны. Адреналин при контакте с тромбоцитами взаимодействует с б_2а-адренорецепторами, что вызывает ингибирование аденилатциклазы. Вторичная агрегация при индукции процесса адреналином является итогом развития реакции высвобождения и продукции тромбоксана А₂.

Результаты исследования агрегационной способности тромбоцитов могут выражаться в процентах (табл. 6).

Таблица 27. Агрегация тромбоцитов по Вайсу для адреналина в норме

Отдельно исследование не назначается, а проводится в комплексе с определением агрегации тромбоцитов с АДФ и коллагеном.

Агрегация тромбоцитов с арахидоновой кислотой в плазме

Арахидоновая кислота является природным агонистом, причем ее действие опосредовано эффектами простагландинов G₂ и Н₂ и тромбоксана А₂ и включает активацию как фосфо-липазы С с последующим образованием вторичных посредников, мобилизацией внутриклеточного кальция и расширением процесса активации клеток, так и фосфолипазы А₂, что непосредственно приводит к либерации эндогенной арахидоновой кислоты.

Активация тромбоцитов под действием арахидоновой кислоты происходит достаточно быстро, поэтому кривая, характеризующая этот процесс, чаще носит одноволновый характер.

Для индукции агрегации тромбоцитов арахидоновая кислота используется в концентрациях 1·10-³ - 1·10-⁴ М. При работе с арахидоновой кислотой следует учитывать, что на воздухе это вещество очень быстро окисляется.

Рекомендуется выполнение агрегации с арахидоновой кислотой в случаях использования лекарств, влияющих на реакцию агрегации (например, ацетилсалициловая кислота, пенициллин, индометацин, делагил, диуретики), что нужно учитывать при оценке результатов исследований.

Агрегация тромбоцитов с ристоцетином в плазме

Активность фактора Виллебранда в норме - 58-166 %.

Фактор VIII свертывания плазмы - антигемофильный глобулин А - циркулирует в крови в виде комплекса из трех субъединиц, обозначаемых VIII-к (коагулирующая единица), VIII-АГ (основной антигенный маркер) и VIII-ФВ (фактор Виллебранда, связанный с VIII-АГ). Считают, что VIII-ФВ регулирует синтез коагуляционной части антигемофильного глобулина (VIII-к) и участвует в сосудисто-тромбоцитарном гемостазе.

При болезни Виллебранда снижается активность как VIII-ФВ, участвующего в сосудисто-тромбоцитарном гемостазе и являющегося основным маркером комплекса фактора VIII (фактор Виллебранда), так и VIII-к. При этом заболевании нарушается ристоцетинагрегация тромбоцитов.

Определение агрегации тромбоцитов с ристоцетином в плазме применяется для количественной оценки фактора Виллебранда. При болезни Виллебранда отмечается нарушение ристоцетинагрегации при нормальном ответе на воздействие АДФ, коллагена и адреналина. Нарушение ристоцетинагрегации выявляется и при макроцитарной тромбодистрофии Бернара-Сулье (см. далее).

Исследование может использоваться в дифференциальной диагностике между врожденной гемофилией А (недостаток фактора VIII) и болезнью Виллебранда. При гемофилии резко снижено содержание VIII-к, а содержание VIII-ФВ находится в пределах нормы. Эта разница приводит к различию клинических форм геморрагического диатеза: гематомная форма возникает при гемофилии, а петехиально-гематомная - при болезни Виллебранда.

Кроме этих методов, применяют электронно-микроскопические (изучение ультраструктуры тромбоцитов), радиоизотопные (определение продолжительности жизни тромбоцитов), гистологические (исследование мегакариоцитов в срезах костного мозга), иммунологические (определение антитромбоцитарных антител) методы исследования.

Литература

1. Влияние лекарственных средств на результаты лабораторных методов исследования / Под ред. Проф. А.А. Спасова. - М.: Фармединфо, 1995. - 82 с.

2. Клиническая оценка биохимических показателей при заболеваниях внутренних органов / В.Г. Передерий, Ю.Г. Хмелевский, Л.Ф. Коноплева и др. - Киев: Здоров'я, 1993. 192 с.

3. Козинец Г.И. Интерпретация анализов крови и мочи. - СПб., 1997. - 128 с.

4. Козловская Л.В., Мартынова М.А. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования (с элементами программирования0 / Под ред. Акад. Е.М. Тареева, проф. А.В. Сумарокова. - М.: Медицина, 1975. - 352 с.

5. Колб В.Г., Камышников В.С. Лабораторная диагностика хирургических заболеваний. - Минск: Высшейш. шк., 1993. - 185 с.

6. Лабораторные методы исследования в клинике: Спрв. / В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотницкая и др.; Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

7. Норма в медицинской практике: Спрв. пособие. - М.: ООО «МЕДпресс», 1998. - 144 с.

8. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов: Т. 4. Диагностика болезней системы крови. - М.: мед. лит., 2003. - 512 с.

9. Окороков А.Н. Диагностика болезней внутренних органов: Т. 5. Диагностика болезней системы крови. Диагностика болезней почек. - М.: мед. лит., 2002. - 512 с.

10. Патологическая физиология / В.А. Фролов, Г.А. Дроздова, Т.А. Казанская и др. - М., 1997. - 568 с.

11. Предтеченский В.Е. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / Под. ред. Л.Г. Смирновой и Е.А. Кост. - М.: Медгиз, 1960.

12. Руководство по клинической лабораторной диагностике: Учеб. пособие. Ч 1-2. / М.А. Базарнова, А.И. Воробьев, З.С. Баркаган и др.: под. ред. М.А. Базарновой, А.И. Воробьева. - Киев: Вища шк., 1991. - 615 с.

13. Руководство по медицине. Диагностика и терапия: Пер. с англ. В 2 т. / Под ред. Р. Беркоу, Э. Флетчера. - М.: Мир, 1997. - Т. 1. - 1045 с.; Т 2. - 872 с.

14. Справочник практического врача / Под ред. А.И. Воробьева. - М.: Баян, 1992. - 608 с.

15. Станковская И.М., Шифрина Р.С. Побочное действие лекарственных средств: Обзор. информ. ВНИИМИ. - М.: Медицина, 1985. - Вып. 15, № 6. - 38 с.

16. Тодоров Й. Клинические лабораторные исследования в педиатрии. - София: Медицина и физкультура, 1961. - 784 с.

17. Чекман И.С. Биохимическая фармакодинамика. - Киев:: Здоров'я, 1991. - 200 с.

18. Чиркин А.А., Окороков А.Н., Гончарик И.И. Диагностический справочник терапевта, - 2-е изд. - Минск: Беларусь, 1992. - 668 с.

19. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови. Пер. с англ. - М. - СПб.: «Издательство БИНОМ» - «Невский диалект», 2000. - 448.

20. Юрковский О.И., Грицюк А.М. Общеклинические анализы в практике врача. - М., 1997. - 123 с.

21. Henry J.B. Clinical diagnosis and management by Laboratory Methods. - Philadelphia, PA: Saunders, 1991.

22. Ravel R. Clinical Laboratory Medicine. - Chicago, 1989. - 692 p.

23. Winter ME et al. Basic Clinical Pharmacokinetics. Applied Therapeutics. - Vancouver, 1994. - 93 p.

24. Yong L.Y., Holland E.G. Interpretation of clinical Laboratory tests. In “Applied Therapeutics”/ Edited by Lloid Yee Young. - Vancouver, 1996. -136 p.

Размещено на Allbest.ru