Оптимизация комплексного лечения распространенного гнойного перитонита (экспериментально-клиническое исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

Оптимизация комплексного лечения распространенного гнойного перитонита (экспериментально-клиническое исследование)

Косинец Владимир Александрович

Москва - 2013



Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

· академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Гостищев Виктор Кузьмич

Официальные оппоненты:

· Ефименко Николай Алексеевич - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, генерал-майор медицинской службы, главный врач-хирург, заведующий кафедрой хирургии усовершенствования врачей ФГКУ МО РФ «Медицинский учебно-научный клинический центр имени П.В. Мандрыка»;

· Липницкий Евгений Михайлович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой хирургии медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова;

· Луцевич Олег Эммануилович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии № 1 ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова».

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «13» мая 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.03 при Первом Московском государственном медицинском университете имени И.М. Сеченова (119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (117418, Москва, Нахимовский проспект, д. 49).

Автореферат разослан ____________ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Шулутко Александр Михайлович

Актуальность проблемы

За последние десятилетия достигнуты определенные успехи в решении одной из наиболее сложных проблем абдоминальной хирургии - лечении распространенного гнойного перитонита. Многочисленные экспериментальные и клинические исследования способствовали разработке фундаментальных принципов лечения данного заболевания, которые позволили перестать считать исход перитонита неизбежно летальным. Тем не менее, согласно современных литературных данных, летальность при распространенном гнойном перитоните колеблется в широких пределах от 9,79 до 84% и в среднем составляет 38,6-45%, что, по-прежнему, свидетельствует об отсутствии единого эффективного комплексного подхода при его лечении (Савельев B.C., 2007; Ефименко Н.А., 2006; Брискин Б.С., Демидов Д.А., 2005; Стручков Ю.В., 2004; Гостищев В.К., 2002).

Не теряет свою актуальность проблема рациональной антибактериальной терапии. Основные сложности связаны с формированием резистентной микрофлоры в связи с назначением антибактериальных препаратов без учета результатов бактериологических исследований (Шестопалов А.Е., 2004). Важное значение имеет своевременное выделение, достоверная идентификация микроорганизмов, определение их чувствительности к антибактериальным препаратам и назначение рациональной антибактериальной терапии. В настоящее время с этой целью, как правило, используются тест-системы зарубежного производства. Основным их недостатком является высокая себестоимость применения. В связи с этим назрела необходимость создания отечественных тест-систем.

Перитонит характеризуется выраженными негативными изменениями иммунного гомеостаза, которые усугубляются операционной травмой и наркозом, оказывающими мощное депрессивное воздействие на иммунитет (Гаин Ю.М. и соавт., 2001; Жестков К.Г. и соавт., 1993).

В настоящее время медицина располагает широким набором препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием. Тем не менее, в их применении при лечении распространенного гнойного перитонита нередко отсутствует системный и целенаправленный характер, в частности, на клеточно-опосредованный иммунитет с целью регуляции миграционных свойств нейтрофильных гранулоцитов.

Исследования последних лет указывают на прямое негативное влияние бактериальных токсинов на функцию митохондриального аппарата (Porta F. et al., 2009; Fedotcheva N.I. et al., 2008; Vanasco V. et al., 2008;), выполняющего целый ряд функций, важнейшей из которых является синтез макроэргических соединений и энергообеспечение организма (Афанасьев В.В., 2005).

Следовательно, необходимым компонентом в комплексном лечении распространенного гнойного перитонита должно быть средство, действие которого было бы направлено на нормализацию процессов биологического окисления и восстановление энергообеспечения организма.

В настоящее время большой интерес представляет изучение при распространенном гнойном перитоните состояния липид-транспортной системы организма и возможности его коррекции.

Современные методы исследования на клеточно-молекулярном уровне дают возможность получить новые данные о механизмах патогенеза распространенного гнойного перитонита. В связи с этим назрела необходимость уточнения и дополнения существующих схем комплексного лечения распространенного гнойного перитонита с целью повышения его эффективности и снижения летальности.

Цель работы: разработка комплексного лечения распространенного гнойного перитонита с учетом новых данных его этиопатогенеза.

Задачи исследования:

1. Провести анализ результатов применяемого в настоящее время комплексного лечения распространенного гнойного перитонита.

2. Разработать тест-системы для идентификации аэробных и неклостридиальных анаэробных микроорганизмов и определения их чувствительности к антибактериальным препаратам.

3. Разработать эффективные схемы антибактериальной терапии для лечения распространенного гнойного перитонита.

4. Изучить состояние клеточно-опосредованного иммунитета и неспецифической резистентности организма при распространенном гнойном перитоните и возможности их коррекции.

5. Изучить состояние биоэнергетических процессов, происходящих в организме при распространенном гнойном перитоните.

6. Определить роль липид-транспортной системы в патогенезе распространенного гнойного перитонита.

7. На основании проведенных исследований разработать и оценить эффективность предложенной новой патогенетически обоснованной тактики комплексного лечения распространенного гнойного перитонита.

Научная новизна

Впервые созданы тест-системы, позволяющие визуально или автоматически с помощью многоканального спектрофотометра АИФ М/340 и компьютера с разработанным программным обеспечением «Microbi» идентифицировать и определять чувствительность к антибактериальным препаратам основных возбудителей распространенного гнойного перитонита.

Предложена рациональная, эффективная схема антибактериальной терапии в комплексном лечении распространенного гнойного перитонита.

Впервые применен с целью иммунокоррекции при распространенном гнойном перитоните внутрикожный способ введения препарата рекомбинантного интерлейкина-2 «Ронколейкин», обеспечивший более выраженное иммунотропное действие, по сравнению с подкожным его введением, и сопоставимое с внутривенным, что позволило достичь в комплексе с другими средствами эффективное выздоровление пациентов.

Впервые системно изучены морфофункциональные изменения митохондриального аппарата тонкой кишки, печени и сердца при экспериментальном распространенном гнойном перитоните.

Впервые с целью коррекции морфофункциональных изменений митохондрий в организме, устранения энергетического дефицита, эндогенной интоксикации и полиорганной недостаточности при распространенном гнойном перитоните применен препарат, содержащий янтарную кислоту, «Цитофлавин», значительно превосходящий по своей активности препарат креатинфосфата «Неотон».

Впервые при экспериментальном распространенном гнойном перитоните изучено состояние липид-транспортной системы и структуры митохондрий печени, а также возможность их коррекции.

Впервые с целью нормализации морфофункциональных изменений в организме, происходящих в результате нарушений в липид-транспортной системе, применен препарат, содержащий омега-3-жирные кислоты, «Омегавен». аэробный антибактериальный гнойный перитонит

Впервые в эксперименте изучено влияние «Омегавена» на морфометрические параметры надпочечников, свидетельствующие о его способности препятствовать развитию в них патологических структурных изменений и гипофункционального состояния. Применение «Омегавена» в комплексном лечении распространенного гнойного перитонита положительно влияло на клиническое течение послеоперационного периода и исход заболевания.

Впервые показано, что сочетанное применение препарата рекомбинантного интерлейкина-2 «Ронколейкин» с внутрикожным способом введения, метаболического средства, содержащего янтарную кислоту, «Цитофлавин» и препарата для парентерального питания на основе омега-3-жирных кислот «Омегавен» обладает выраженным противовоспалительным действием в комплексном лечении распространенного гнойного перитонита.

На основании полученных новых данных об этиопатогенезе распространенного гнойного перитонита разработаны новые подходы в комплексном лечении, позволившие снизить летальность с 32,3% до 13,46%, а частоту послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений - с 17,14% до 13,46%.

Теоретическая и практическая значимость

· Результаты исследования в значительной степени расширяют представления о патогенезе распространенного гнойного перитонита и путях улучшения лечения пациентов с данным заболеванием. Установлены системные изменения миграционной активности иммунокомпетентных клеток, биоэнергетических процессов, состояния липид-транспортной системы при распространенном гнойном перитоните, предложены и обоснованы методы и способы их устранения.

· Для идентификации грамотрицательных микроорганизмов и определения их чувствительности к антибактериальным препаратам разработаны тест-системы «ИД-ЭНТ» и «АБ-ГРАМ(-)», для облигатно-анаэробных микроорганизмов - «ИД-АНА» и «АБ-АН», соответственно. Созданные тест-системы характеризуются большим разнообразием антибиотиков, относительной дешевизной, простотой в изготовлении, эксплуатации, быстротой идентификации и определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам и могут найти широкое использование в бактериологических лабораториях различного профиля с целью рационального применения антибактериальной терапии.

· Сочетанное применение в комплексном лечении распространенного гнойного перитонита препарата рекомбинантного интерлейкина-2 «Ронколейкин» с внутрикожным способом его введения, метаболического средства, содержащего янтарную кислоту, «Цитофлавин», препарата, содержащего омега-3 жирные кислоты, «Омегавен» способствует эффективному снижению активности воспалительного процесса, более благоприятному течению послеоперационного периода.

· Оптимизация комплексного лечения распространенного гнойного перитонита с учетом новых данных этиопатогенеза заболевания позволила снизить летальность с 32,38% до 13,46%, сократить число послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений с 17,41% до 13,46%.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Разработанные тест-системы для идентификации аэробной и неклостридиальной анаэробной микрофлоры, определения ее чувствительности к антибактериальным препаратам позволяют обеспечить диагностику основных возбудителей распространенного гнойного перитонита и назначить эффективную комбинированную антибактериальную терапию.

2. Внутрикожное введение препарата рекомбинантного интерлейкина-2 «Ронколейкин» оказывает выраженное влияние на миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов, по сравнению с традиционными методами его применения.

3. Пациентам с распространенным гнойным перитонитом необходимо включать в комплексное лечение средства, воздействующие на биоэнергетические процессы организма.

4. При распространенном гнойном перитоните в липид-транспортной системе организма наблюдаются изменения, характерные для генерализованного воспаления, оказывающие существенное влияние на течение заболевания и требующие корригирующей терапии.

5. Сочетанное применение лекарственных средств, обладающих иммунотропным действием (препарат рекомбинантного интерлейкина-2 «Ронколейкин»), влияющих на биоэнергетические процессы (метаболическое средство, содержащее янтарную кислоту, «Цитофлавин») и липид-транспортную систему (препарат, содержащий омега-3-жирные кислоты, «Омегавен»), оказывает выраженное противовоспалительное действие при распространенном гнойном перитоните.

Внедрение результатов исследования в практику

Основные результаты диссертационной работы внедрены и используются в клинической практике хирургических отделений и отделений реанимации ГУЗ ГКБ № 23 им. «Медсантруд» (Москва), УЗ «Витебская больница скорой медицинской помощи» (Республика Беларусь), УЗ «Витебская областная клиническая больница» (Республика Беларусь).

Разработаны, прошли клинические испытания и регистрацию в Республике Беларусь тест-системы «ИД-ЭНТ», «АБ-ГРАМ(-)», «ИД-АНА» и «АБ-АН» для идентификации грамотрицательных и облигатно-анаэробных микроорганизмов, определения их чувствительности к антибактериальным препаратам. Материалы диссертации использованы для учебника «Инфекция в хирургии» (Минск, 2012). Материалы работы используются при проведении теоретических и практических занятий на кафедре общей хирургии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, кафедрах факультетской, госпитальной хирургии, хирургии повышения квалификации УО «Витебский государственный медицинский университет».

Апробация результатов диссертации

Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на: научных сессиях Витебского государственного медицинского университета (г. Витебск 2010, 2011, 2012 гг.); XXVII съезде хирургов Республики Беларусь (2010 г.); Всероссийской конференции хирургов с международным участием, посвященной 65-летию Научного хирургического общества и 20-летию Ассоциации врачей хирургического профиля на Кавказских Минеральных Водах (Пятигорск, 2011); VII Всероссийской конференции общих хирургов с международным участием (г. Красноярск, 2011 г.); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии» (г. Геленджик, 2011 г.); IV съезде хирургов Сибири и Дальнего Востока (г. Якутск, 2012 г.); XXVI Пленуме Правления хирургов Республики Беларусь (Бобруйск, 2012); II съезде общероссийской общественной организации «Российское общество хирургов гастроэнтерологов» «Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии» (Геленджик, 2012).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции кафедры общей хирургии лечебного факультета Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова.

Личный вклад соискателя

Личное участие автора состоит в организации исследования в соответствии с его целями и задачами, непосредственное участие в обследовании и лечении пациентов. Автором самостоятельно проведены все клинические, биохимические и инструментальные исследования у пациентов, экспериментальные исследования на лабораторных животных, выполнены статистическая обработка, анализ и интерпретация полученных данных, написание публикаций и всех разделов диссертации.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 34 научные работы, из них 1 учебник, 1 монография, 16 статей в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК», получено 1 авторское свидетельство и 3 приоритетные справки на изобретения.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, клинической характеристики обследованных пациентов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 316 страницах машинописного текста, иллюстрированы 42 таблицами и 84 рисунками. Список литературы включает 190 отечественных и 151 зарубежных источников.

Содержание работы

Материал и методы исследования

Работа основана на результатах обследования и лечения 157 пациентов с распространенным гнойным перитонитом, оперированных в больнице № 23 им. Медсантруд г. Москва и больнице скорой медицинской помощи г. Витебска в 2008-2012 гг.

Для определения распространенности и стадии перитонита использовались шкала и классификация В.К. Гостищева.

В зависимости от проводимых лечебных мероприятий все обследованные пациенты были разделены на две группы: контрольную (105 пациентов) и основную (52 пациента). Формирование контрольной и основной групп проводилось методом слепой рандомизации. Каждому пациенту присваивался рандомизированный номер, который оставался неизменным до конца лечения.

Критерии включения пациентов в исследование: возраст 17-85 лет, верифицированный интраоперационно распространенный гнойный перитонит, занимающий более двух анатомических областей брюшной полости с Мангеймским перитонеальным индексом не менее 10 баллов, наличие мутного выпота в брюшной полости. В исследование не включались пациенты с распространенным перитонитом панкреатогенной этиологии.

C целью определения интегральной количественной оценки тяжести состояния больных при поступлении использовали шкалу APACHE II. Оценка тяжести течения заболевания у пациентов определялась по Мангеймскому перитонеальному индексу (МПИ). В контрольной группе процент пациентов с I-ой степенью тяжести составил 46,67%, II-ой степенью - 39,05%, III-ей степенью - 14,28%. Средний балл МПИ при I-ой степени тяжести составил 12,41±2,10, II-ой степени - 23,73±2,65, при III-ей степени - 35,2±2,51. В основной группе процент пациентов с I-ой степенью тяжести составил 46,15%, II-ой степенью - 40,38%, III-ей степенью - 13,47%. Средний балл МПИ при I-ой степени тяжести составил 13,5±2,78, II-ой степени - 24,94±2,82, III-ей степени - 32,33±2,08.

В контрольной группе оперативное вмешательство было завершено лапаростомией в 31,43% случаев, в основной группе - в 32,69%.

У 105 пациентов контрольной группы с распространенным гнойным перитонитом изучены результаты применяемого в настоящее время комплексного лечения. У 52 пациентов с распространенным гнойным перитонитом (основная группа) были включены в комплексное лечение разработанные нами схемы, способы и методы на основании полученных новых данных об этиопатогенезе заболевания.

У 85 пациентов изучена роль аэробной и неклостридиальной анаэробной микрофлоры в возникновении распространенного гнойного перитонита, ее видовой состав, чувствительность к антибактериальным препаратам.

У 26 пациентов основной и контрольной групп в динамике послеоперационного периода исследованы показатели иммунной системы и неспецифической резистентности организма, проведены биохимические исследования и изучено состояние липид-транспортной системы, а также определены белки острой фазы крови и ряд маркеров воспаления. За норму были приняты соответствующие показатели 15 доноров.

У 35 пациентов основной и контрольной групп изучена электрическая активность отделов желудочно-кишечного тракта и состояние системы свободнорадикального окисления. За норму были приняты показатели 20 доноров.

Эксперименты на животных. С целью разработки новых методов лечения распространенного гнойного перитонита нами были проведены экспериментальные исследования на кроликах-самцах породы шиншилла, массой 2600-3000 грамм.

Животные (170 кроликов) были разделены на следующие группы: интактные (n=10); с распространенным гнойным перитонитом без хирургического лечения (n=10); контрольная группа - хирургическое лечение перитонита без применения в послеоперационном периоде лекарственных средств (n=30); основная группа, хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде в течение 5-и суток препаратов: «Ронколейкин» (два раза в сутки внутривенно капельно из расчета 10 000 МЕ/кг (n=15), подкожно из расчета 10 000 МЕ/кг (n=15) и внутрикожно из расчета 3 000 МЕ/кг (n=15)); «Цитофлавин» внутривенно из расчета 28,5 мг янтарной кислоты на 1 кг массы животного (n=30); «Неотон» внутривенно из расчета 0,05 г на 1 кг массы животного (n=30); «Омегавен» внутривенно из расчета 2 мл на 1 кг массы животного (n=15).

Животные содержались в виварии в соответствии с международными правилами GLP. Карантинный режим животных составлял не менее 14 дней. Для моделирования перитонита использовали микробную смесь, состоящую из равных количеств аэробов (E.coli, штамм 0111 К58 НИ С 130-53) и анаэробов (B.Fragilis, штамм 323). Микробную смесь вводили в брюшную полость животных стерильным шприцем из расчета 6 млрд. микробных тел на 1 кг массы кролика. Количество микробных тел рассчитывали по стандарту мутности McFarland.

Через 6 часов после введения микроорганизмов у всех животных развивались симптомы перитонита: вялость, заторможенность, отказ от пищи, учащенное дыхание, вздутие живота. В крови определялся лейкоцитоз.

В основной и контрольной группах животных через 6 часов после заражения под внутривенным нембуталовым наркозом (30 мг/кг) плюс местная анестезия 50 мл 0,25%-ого раствора новокаина выполняли оперативное вмешательство: срединная лапаротомия, удаление гнойно-геморрагического выпота, промывание брюшной полости 0,02%-ым раствором хлоргексидина биглюконата; интубация тонкой кишки перфорированной полихлорвиниловой трубкой; декомпрессия и промывание тонкой кишки физиологическим раствором до светлых вод; наложение подвесной цекостомы.

Непосредственно после операции и через каждые 8 часов в течение первых 2-3-х суток проводили промывание тонкой кишки физиологическим раствором в объеме 40-60 мл на одну процедуру. Дренажную трубку удаляли из просвета тонкой кишки на 3-и сутки после операции.

Животных с распространенным гнойным перитонитом выводили из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 часов после заражения (10 животных), основной и контрольной групп - на 1-е, 3-и и 5-е сутки после операции (по 5 животных в исследуемые сроки). За норму были приняты результаты исследований, проведенных у 10 интактных (здоровых) кроликов.

У всех выведенных из эксперимента животных выполнялись иммунологические, биохимические, биофизические, гистологические исследования и электронная микроскопия.

Разработанная нами модель по клиническому течению и лабораторно-морфологическим показателям приближалась к перитониту у человека.

Микробиологические методы исследования. Идентификацию энтеробактерий и других грамотрицательных аэробных микроорганизмов, облигатно-анаэробных микроорганизмов проводили с помощью разработанных нами тест-систем «ИД-ЭНТ», «ИД-АНА», определение их чувствительности к антибактериальным препаратам - с помощью разработанных нами тест-систем «АБ-ГРАМ (-)», «АБ-АН». Учет осуществляли как визуально, так и с помощью многоканального спектрофотометра АИФ М/340 и компьютера с программным обеспечением «Microbi» - комплекса антибактериального (КАН), разработанного нами совместно с производственным объединением «Витязь» (Республика Беларусь). Идентификацию аэробных, факультативно-анаэробных и анаэробных микроорганизмов проводили также и с помощью тест-систем на автоматизированном биохимическом анализаторе АТВ Expression фирмы «BioMerieux» (Франция). Для обнаружения различных видов стрептококков использовали 5% кровяной Колумбия-агар, стафилококки выделяли на высокоселективном желточно-солевом агаре с азидом натрия, для кишечной группы бактерий использовали среду Эндо с генциан-фиолетовым, псевдомонады выделяли на среде ЦПХ с N-цетилпиридиния хлоридом, посев на микробы группы протея производили дополнительно по методу Шукевича. Для оценки чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам использовали стандартные бумажные диски Becton Dickinson (США), содержащие определенное количество антибиотиков и стандартные питательные среды, необходимые для роста данного вида микроорганизма.

Иммунологические методы исследования. Определяли реакцию торможения миграции лейкоцитов (Г.П. Адаменко и соавт., 1994). Иммуноферментное определение концентрации IgG, IgM, IgA общего, IgA секреторного, количественное определение человеческого фактора некроза опухоли (б-ФНО), количественное определение человеческих интерлейкинов-1в, -2, -4, -6, -8, -10 (ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10) в сыворотке крови проводили с использованием наборов «Вектор-Бест», г. Новосибирск, Россия.

Биохимические методы исследования. Определения состояния процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности проводили методом индуцированной биохемилюминесценции (Е.И. Кузьмина и соавт., 1983). Определение диеновых коньюгатов в мышечной оболочке тонкой кишки выполняли по методу В.Б. Гаврилова и соавт. (1983). Определение малонового диальдегида в мышечной оболочке тонкой кишки проводили по методу Я.И. Андреевой и соавт. (1988). Определение содержания липопротеинов в сыворотке крови осуществлялось с использованием наборов фирмы «Cormay-Diana» (Польша-Республика Беларусь). Определение содержания фосфолипидов в мембранах митохондрий печени проводили по методу М. Кейтса (1975). Содержание в сыворотке крови С-реактивного белка, высокочувствительного С-реактивного белка и б1-антитрипсина определяли с использованием турбидиметрических наборов фирмы «SPINREACT» (Испания). Определение содержания нитратов и нитритов в сыворотке крови проводили с помощью реакции Грисса. Определение среднемолекулярных пептидов в сыворотке крови проводилось по методу Н.И. Габриэлян (1984). Определение концентрации аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) в мышечной оболочке тонкой кишки проводилось с использованием наборов «Микролюм» фирмы «Люмтек» (Россия).

Выделение митохондрий печени выполняли по методу Johnson-Lardy (1967). Выделение митохондрий мышечной оболочки тонкой кишки проводили с помощью разработанного нами метода (патент 13689 C2, Национальный центр интеллектуальной собственности Республики Беларусь). Определение функциональной активности митохондрий мышечной оболочки тонкой кишки проводили с помощью полярографического метода.

Периферическая электроэнтерография. Двигательную активность отделов тонкой кишки исследовали методом периферической компьютерной электроэнтерографии с помощью гастроэнтеромонитора «Гастроскан-ГЭМ» (ЗАО НПО "Исток-Система", Россия). Данные обрабатывали прилагаемым пакетом программ с использованием алгоритмов быстрого преобразования Фурье и оценкой следующих показателей: абсолютная электрическая активность (Pi), коэффициент ритмичности (Kritm).

Гистологические методы исследования. Материалом для морфологического исследования служили участки стенки тонкой кишки, печени, сердца и надпочечников экспериментальных животных. Для световой микроскопии материал фиксировали в 10%-ом растворе нейтрального формалина. После стандартной проводки готовили парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином-эозином и по методу Ван-Гизон (О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий, 1982). Оценка морфологических изменений проводилась на световом оптическом уровне при увеличении х100, х200.

Электронная микроскопия. Для трансмиссионной электронной микроскопии участки тонкой кишки, печени и сердца экспериментальных животных фиксировали в 2,5%-ом растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,2) и в 2%-ом растворе четырехокиси осмия, после дегидратации и пропитки заливали эпон-аралдитной смесью (В.Я. Карупу, 1984). Ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме «LКВ» (Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу, исследовали в электронном микроскопе «JEM-100СХ» (Япония).

Статистическая обработка полученных результатов. Статистическая обработка данных проведена в соответствии с требованиями, предъявляемыми к исследованиям в области медицины с использованием электронных пакетов анализа «STATISTICA 6.0», «MedCalc 10.2.0.0» и «MS Excel». Использованы методы описательной статистики. На основании нормального распределения показателей в выборках экспериментальных данных для сравнения 2-х групп использовали t-критерий Стьюдента (уровень достоверности отличий средних значений р<0,05). Для оценки клинических данных применены методы непараметрической (расчет медианы (Ме), доверительного интервала для медианы с вероятностью 95%, размаха минимальных и максимальных значений (размах min-max), межквартильного интервала (25-75 процентиль), критериев Wilcoxon, Mann-Whitney (уровень достоверности р<0,05)) статистики.

Результаты исследования и их обсуждение

У 105 пациентов контрольной группы с распространенным гнойным перитонитом изучены результаты применяемого в настоящее время комплексного лечения. Лечение в контрольной группе пациентов с распространенным гнойным перитонитом проводилось по традиционной общепринятой схеме стандарта, утвержденного Министерством здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 25.10.2007 № 669 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с перитонитом (при оказании специализированной помощи)»: экстренная операция по устранению источника перитонита; промывание брюшной полости антисептиками; декомпрессия желудочно-кишечного тракта через концевую, петлевую илеостому или назогастральный зонд; дренирование брюшной полости; послеоперационная антибактериальная терапия; инфузионно-трансфузионная терапия.

Среди наблюдавшихся нами 105 пациентов было 67 (63,81%) мужчин и 38 (36,19%) женщин. Средний возраст составил Me=49,0 (min-max 19-85) лет. Распределение пациентов по возрасту показало, что контрольную группу составляют пациенты старше 40 лет. В подавляющем большинстве случаев причинами перитонита были острые хирургические заболевания органов брюшной полости. Летальность у пациентов с распространенным гнойным перитонитом в контрольной группе составила 32,38%. В послеоперационном периоде у 18 пациентов (17,14%) с распространенным гнойным перитонитом контрольной группы развились гнойно-воспалительные осложнения, что в значительной степени ухудшило течение и исход заболевания. Структура послеоперационных гнойно-воспалительных осложнений распределилась следующим образом: нагноение ран было у 3 пациентов, пневмония развилась у 14, флегмона передней брюшной стенки - у 1 пациента.

У 52 пациентов с распространенным гнойным перитонитом (основная группа) были включены в существующее комплексное лечение разработанные нами новые схемы, способы и методы: 1) антибактериальной терапии; 2) иммунокорригирующей терапии; 3) коррекции биоэнергетических процессов в организме и устранения эндогенной интоксикации; 4) коррекции липид-транспортной системы; 5) противовоспалительной терапии.

В основной группе пациентов с распространенным гнойным перитонитом было 29 (55,77%) мужчин и 23 (44,23%) женщины. Средний возраст составил Me=54,5 (min-max 18-85) лет. Летальность в основной группе составила 13,46%. В послеоперационном периоде у 7 пациентов (13,46%) основной группы возникли гнойно-воспалительные осложнения: флегмона передней брюшной стенки - у 1 пациента, пневмония - у 6 пациентов.

По возрастному составу, полу, нозологическим формам заболевания и сопутствующим заболеваниям, стадиям перитонита, степени эндогенной интоксикации контрольная и основная группы пациентов статистически значимо не отличались (р<0,05).

Антибактериальная терапия. Для идентификации грамотрицательных микроорганизмов и определения их чувствительности к антибактериальным препаратам нами разработаны тест- системы «ИД-ЭНТ» и «АБ-ГРАМ(-)», для облигатно-анаэробных микроорганизмов - «ИД-АНА» и «АБ-АН» соответственно.

В качестве планшетов использовали 96-луночные планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА), которые содержат 8 рядов по 12 лунок. Всего на одном планшете можно одновременно идентифицировать четыре штамма микроорганизмов, определить чувствительность грамотрицательных микроорганизмов к 23 антибиотикам, облигатно-анаэробных - к 12 антибиотикам.

Тест-система «ИД-ЭНТ» для идентификации грамотрицательных микроорганизмов однократного использования служит для определения видовой принадлежности грамотрицательных микроорганизмов в полужидкой среде после 18-24 ч инкубации. Учет идентификации возможен визуально или инструментально. В состав тест-системы включили 24 теста определения ферментативной активности микроорганизмов. При взаимодействии микробной культуры с субстратом происходит изменение цвета среды.

Для идентификации облигатно-анаэробных микроорганизмов использовалась разработанная нами тест-система «ИД-АНА».

Стандартные количества бактериальной взвеси вносятся в лунки планшета, содержащего дегидрированные субстраты с индикатором или хромогенные субстраты. После 4-6 часов инкубации производили визуальный или инструментальный учет. Штаммы, имеющие ферментативную способность, расщепляют соответствующие субстраты с изменением цвета содержимого лунок планшета. При отсутствии ферментативной способности изменения цвета содержимого лунок не происходит.

Разработанная нами тест-система «АБ-ГРАМ(-)» позволяет определить чувствительность сразу четырех микроорганизмов к 23 антибактериальным препаратам, после инкубации (18-24 ч) в термостате при 35-37оС.

После инкубации производили визуальный или инструментальный учет. При визуальном учете, при наличии роста в лунке, штамм считали резистентным, а при отсутствии роста - чувствительным к определенному антибиотику.

Тест-система «АБ-АН» для определения чувствительности облигатно-анаэробных бактерий к антибиотикам однократного использования служит для определения чувствительности облигатно-анаэробных микроорганизмов к антибиотикам в полужидкой среде после 18-48 ч инкубации.

В культуральную среду добавлялась бактериальная взвесь, которая затем вносилась в лунки планшета, содержащего лиофильно высушенные антибиотики. После инкубации производился визуальный или инструментальный учет. Резистентные штаммы растут в лунке, делая среду непрозрачной, а если штамм чувствителен к антибиотику, среда остается прозрачной.

Инструментальный учет производился с помощью многоканального спектрофотометра АИФ М/340 и компьютера с программным обеспечением «Microbi», разработанных нами совместно с производственным объединением «Витязь»: комплекс антибактериальный (КАН) (рис. 1).

Разработанные нами тест-системы обладают следующими преимуществами: одно исследование обходится примерно в 1 доллар США, временные затраты на исследование чувствительности к антибиотикам занимают до 17 минут для 4 штаммов микроорганизмов вместо 3-4 часов, учет результатов - до 5 минут.



Рисунок 1. Комплекс антибактериальный (КАН)

Тест-системы прошли санитарно-гигиенические и клинические испытания, которые показали, что они соответствуют заявленным требованиям: по параметру оценки качества и воспроизводимости в серии определений чувствительности контрольного образца к антибактериальным препаратам с расчетом различий по точному критерию Фишера и по параметру диагностической специфичности, по сравнению с методом бумажных дисков и с тест-системами фирмы «BioMerieux» (Франция). Получены регистрационные документы, утвержденные Белорусским государственным научно- исследовательским институтом стандартизации и сертификации и Министерством здравоохранения Республики Беларусь («ИД-ЭНТ», ТУ РБ 300002704.020-2011 г; «АБ-ГРАМ(-)»,ТУ РБ 300002704.011-2009 г; «ИД-АНА», ТУ РБ 300002704.016-2011 г; «АБ-АН»,ТУ РБ 300002704.019-2011 г; патент на полезную модель № 7596 «Тест-система для определения чувствительности облигатно-анаэробных бактерий к антибиотикам», 2011 г.).

Предложенный стандартизованный подход к комплектации тест-систем, наличие в них дегидрированных субстратов позволяют увеличить их срок годности до года с момента выпуска и создают возможности по организации промышленного производства.

Таким образом, созданные нами тест-системы позволяют быстро идентифицировать основных возбудителей хирургической инфекции и определить их чувствительность ко многим антибактериальным препаратам.

При микробиологическом исследовании перитонеального экссудата пациентов с распространенным гнойным перитонитом установлено, что в 76,25% случаев воспаление брюшины было вызвано смешанной аэробно-анаэробной микрофлорой, в 15% - только анаэробами, в 8,75% - только аэробами.

Рис. 2. Чувствительность E. Coli к антибактериальным препаратам

Среди выделенных штаммов анаэробов представителей рода Bacteroides было 63,4%, Bifidobacterium - 4,32%, Peptostreptocoсcus - 5,38%, Peptococcus - 4,3%, Eubacterium - 7,53%, Clostridium - 3,23%, Fusobacterium - 6,45%, недифференцированные грамм (-) палочки - 3,22%, недифференцированные грамм (+) и грам (-) кокки - 3,22%. Среди выделенных штаммов аэробов доминировали энтеробактерии: E.coli - 54,93%. В коллекции также определялись: Streptococcus - 9,85%, Pseudomonas aeruginosa - 4,23%, Klebsiella spp. - 9,86%, Proteus spp. - 5,63%, Staphilococсus - 4,23%, Enterococcus - 11,27%.

При изучении чувствительности основных возбудителей распространенного гнойного перитонита к антибактериальным препаратам было установлено, что большинство штаммов обладало множественной лекарственной устойчивостью (рис. 2, 3).

Рис. 3. Чувствительность Bacteroides spp. к антибактериальным препаратам

На основании данных об этиологической структуре и чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам нами предложены следующие эффективные схемы рациональной эмпирической антибактериальной терапии распространенного гнойного перитонита:

· препараты выбора 1-го ряда (чувствительность 53,84-93,1%)

· цефалоспорины III поколения + метронизадол;

· цефалоспорины III поколения + аминогликозиды + метронизадол;

· препараты выбора 2-го ряда (чувствительность 76,72-93,1%)

· фторхинолоны + метронизадол;

· цефалоспорины IV поколения + метронизадол;

· препараты резерва (чувствительность 89,74-100%) карбапенемы.

Иммунокорригирующая терапия. Нами изучено функциональное состояние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток крови, иммуноглобулиновый и интерлейкиновый профили сыворотки крови пациентов с распространенным гнойным перитонитом.

С 1-х суток послеоперационного периода у пациентов контрольной группы с распространенным гнойным перитонитом, получавших традиционное лечение, наблюдалось наличие способности иммунокомпетентных клеток (ИКК) регулировать миграционные свойства нейтрофильных гранулоцитов. Моноциты, активированные фитогемагглютинином (ФГА), утрачивали способность подавлять миграционные свойства нейтрофилов, в то время как липополисахарид (ЛПС) активированные моноциты еще в большей степени усиливали их миграцию. Лимфоциты после активации митогенами по-разному изменяли миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов. В отличие от ФГА, их стимуляция ЛПС E.coli оказывала меньшее влияние на миграцию тест-клеток. В контрольной группе это сопровождалось достоверным увеличением индекса миграции (ИМ) нейтрофильных гранулоцитов, по сравнению с нормальными значениями, с Ме=0,78 до Ме=0,98 (р<0,0001) (ФГА-стимулированные мононуклеарные клетки), с Ме=1,35 до Ме=1,59 (р<0,0001) (ЛПС-индуцированные моноциты) и с Ме=0,99 до Ме=1,08 (р=0,0001) (ФГА-индуцированные лимфоциты), что, по-видимому, приводит к значительному накоплению нейтрофильных лейкоцитов в брюшной полости и участию этих клеток в развитии экссудативно-деструктивного воспаления в ней.

На 7-10-е сутки послеоперационного периода в контрольной группе ИМ под действием ФГА-активированных мононуклеаров и лимфоцитов, а также ЛПС-активированных моноцитов, по-прежнему, превышал показатели нормы и составил Ме=0,89 (р<0,0001), Ме=1,03 (р=0,002) и Ме=1,46 (р=0,0005) соответственно.

У пациентов с распространенным гнойным перитонитом в послеоперационном периоде наблюдаются выраженные изменения со стороны иммунной системы, которые характеризуются явлением дисиммуноглобулинемии - снижением уровня IgM, IgG и общего IgA на фоне роста содержания секреторного IgA в сыворотке крови. Возможно, при распространенном гнойном перитоните под влиянием протеолитической системы усиливаются метаболические процессы катаболизма IgM и IgG, в то время как IgA, и особенно его секреторный компонент, защищены от такого воздействия углеводным компонентом.

При изучении сывороточного профиля цитокинов пациентов с распространенным гнойным перитонитом установлено с 1-х суток послеоперационного периода на фоне снижения уровня регуляторных медиаторов (ИЛ-2, ИЛ-4) однонаправленное повышение содержания как провоспалительных (ИЛ-1в, ИЛ-6,ИЛ-8), так и противовоспалительных интерлейкинов (ИЛ-10).

На фоне традиционного лечения на 7-10-е сутки послеоперационного периода сохранялись патологические изменения со стороны иммунной системы, что свидетельствовало о продолжающемся воспалительном процессе. Важным звеном в патогенезе иммунной дисфункции является дефицит эндогенного ИЛ-2.

Нами изучено иммунокорригирующее действие рекомбинантного интерлейкина-2 «Ронколейкина» на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток иммунных органов при различных способах введения препарата в условиях экспериментального распространенного гнойного перитонита.

В настоящее время применяются внутривенный и подкожный способы введения «Ронколейкина» при перитоните, а также использование с данной целью метода экстракорпоральной иммунофармакотерапии. Внутрикожное введение, а также сравнительная оценка эффективности различных способов введения «Ронколейкина» при перитоните, в доступной литературе отсутствуют.

Эксперимент выполнен на 70 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы: норма (n=5); I - 6-часовой распространенный гнойный перитонит (n=5); III - контрольная (хирургическое лечение распространенного гнойного перитонита), (n=15); IV - хирургическое лечение распространенного гнойного перитонита с внутривенным введением в послеоперационном периоде в течение 5-и суток препарата «Ронколейкин» из расчета 10000 МЕ/кг (n=15); V - хирургическое лечение распространенного гнойного перитонита с подкожным введением в послеоперационном периоде в течение 5-и суток препарата «Ронколейкин» из расчета 10000 МЕ/кг (n=15); VI - хирургическое лечение распространенного гнойного перитонита с внутрикожным введением в послеоперационном периоде в течение 5-и суток препарата «Ронколейкин» из расчета 3000 МЕ/кг (n=15). Для иммунологических исследований выполнялся забор венозной крови, селезенки, Пейеровых бляшек и подкожных лимфатических узлов.

При экспериментальном распространенном гнойном перитоните происходили изменения цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток различных иммунных органов при их активации митогенами ЛПС и ФГА. Эти изменения характеризовались снижением продукции фактора ингибирования миграции нейтрофильных лейкоцитов ФГА-активированными мононуклеарными клетками, ростом стимуляции миграции нейтрофильных лейкоцитов моноцитами, активированными ЛПС E.coli. Полученные данные позволяют полагать, что при экспериментальном распространенном гнойном перитоните наблюдаются изменения цитокинпродуцирующей активности иммунокомпетентных клеток (ИКК), приводящие к значительному накоплению нейтрофильных лейкоцитов в брюшной полости.

Оценка влияния «Ронколейкина» на функциональное состояние митоген-индуцированных иммунокомпетентных клеток венозной крови, Пейеровых бляшек, селезенки и периферических лимфатических узлов в условиях экспериментального распространенного гнойного перитонита при внутривенном, подкожном и внутрикожном способах введения показала, что препарат оказывал выраженное иммунотропное действие при внутрикожном введении. Эффект характеризовался повышением функциональной активности ИКК мононуклеаров при их стимуляции ФГА. В крови наблюдалось достоверное, по сравнению с внутривенным и подкожным способами введения (р=0,0003, р<0,0001 соответственно), восстановление регуляции миграционных свойств нейтрофильных лейкоцитов под влиянием ФГА-активированных мононуклеарных клеток до значений, полученных у здоровых животных. Данный эффект был наиболее характерен для ИКК крови, Пейеровых бляшек и периферических лимфоузлов, но не селезенки. Кроме этого, следует отметить, что такой иммунотропный эффект отмечался уже на 3-и сутки внутрикожного введения «Ронколейкина» и достигал максимальных значений на 5-е сутки его применения. Индекс миграции нейтрофильных лейкоцитов при этом снижался с 0,97±0,01 до 0,70±0,03 в крови и с 0,99±0,02 до 0,73±0,01 в Пейеровых бляшках.

Таким образом, результаты исследования указывают на наличие у «Ронколейкина» существенного иммунотропного потенциала, реализация которого зависит от способа его введения. Отличительной особенностью предложенной иммунотерапии перитонита является методика внутрикожного введения «Ронколейкина», позволяющая корригировать влияние иммунокомпетентных клеток различных органов на миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов. Теоретическим обоснованием целесообразности данной методики является присутствие в коже как значительного количества регуляторных иммунокомпетентных клеток, осуществляющих трансдукцию модуляционных сигналов, так и множества лимфатических микрососудов.

Иммунокорригирующая терапия путем внутрикожного введения рекомбинантного интерлейкина-2 «Ронколейкин» в дозировке 0,15 мг 1 раз в сутки применена у 52 пациентов с распространенным гнойным перитонитом.

Установлено, что внутрикожный способ введения препарата «Ронколейкин» способствует оптимизации регуляторного потенциала иммунокомпетентных клеток крови по отношению к миграционным свойствам нейтрофильных гранулоцитов. Применение препарата «Ронколейкин» внутрикожно в комплексном лечении распространенного гнойного перитонита позволяет эффективно корригировать миграционные свойства нейтрофильных лейкоцитов под действием митоген-активированных клеток крови (мононуклеары, моноциты и лимфоциты), по сравнению с контрольной группой, обеспечивая восстановление их регуляторных свойств на 7-10-е сутки послеоперационного периода.

Полученные данные указывают на позитивное воздействие предложенной схемы иммунокорригирующей терапии на иммуноглобулиновый и интерлейкиновый профили крови в комплексном лечении пациентов с распространенным гнойным перитонитом, что можно расценивать как результативный иммунотропный эффект, сопровождавшийся положительным клиническим течением и исходом заболевания.

Выявленные иммунотропные свойства «Ронколейкина» при внутрикожном введении позволяют в клинической практике лечения перитонита максимально локализовать воспалительную реакцию в брюшной полости, посредством регуляции миграционных свойств нейтрофильных гранулоцитов на ранних этапах воспаления до развития развернутой картины абдоминального сепсиса.

Коррекция биоэнергетических процессов и устранение эндогенной интоксикации. Ведущую роль в прогрессировании распространенного гнойного перитонита и возникновении его осложнений играет синдром энтеральной недостаточности, основным патогенетическим звеном которого является парез кишечника.

Исследование двигательной функции желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) у пациентов контрольной группы с распространенным гнойным перитонитом показало значительное снижение электрической активности всех его отделов на 1-е сутки послеоперационного периода, по сравнению с нормой.

На 3-и и 5-е сутки после операции в данной группе прослеживалась тенденция к восстановлению электрической активности ЖКТ. Однако, и на 5-е сутки послеоперационного периода в контрольной группе эти показатели были далеки от нормы. Абсолютная электрическая активность (Pi) желудка была равна 1,31 (Me, р<0,0001), двенадцатиперстной кишки - 0,14 (Me, р<0,0001), тощей и подвздошной кишок - 0,42 (Me, р<0,0001) и 0,51 (Me, р<0,0001) соответственно, толстой кишки - 1,74 (Me, р=0,008). Коэффициент ритмичности (Kritm) аналогичных отделов желудочно-кишечного тракта составил 2,98 (Me, р<0,0001), 0,67 (Me, р<0,0001), 1,31 (Me, р=0,0001), 1,52 (Me, р<0,0001) и 4,93 (Me, р=0,008) соответственно.

Развитие распространенного гнойного перитонита приводило к выраженной эндогенной интоксикации, энергетическому «голоду», нарушению процессов свободнорадикального окисления, что отражалось в системном накоплении токсичных продуктов перекисного окисления липидов, снижении активности антиоксидантов.

Нами проведена сравнительная оценка влияния метаболических средств «Цитофлавин» и «Неотон» на функциональную активность митохондрий мышечной оболочки тонкой кишки, состояние антиоксидантной и дезинтоксикационной активности организма, структурные изменения внутренних органов при экспериментальном распространенном гнойном перитоните.

«Цитофлавин» - раствор для инфузий, содержащий янтарную кислоту, никотинамид, рибоксин и рибофлавин. Янтарная кислота - один из промежуточных метаболитов, образующихся при биохимических превращениях углеводов, белков и жиров. Ее превращение в цикле Кребса в митохондриях связано с продукцией АТФ. Возрастание функциональных нагрузок в организме энергетически обеспечивается преимущественно за счет окисления янтарной кислоты, которая обладает регуляторными свойствами. Другие компоненты препарата также относятся к метаболически активным соединениям. Инозин является предшественником АТФ, активирует ряд ферментов цикла Кребса и стимулирует синтез нуклеотидов. Рибофлавин входит в состав флавиновых коферментов, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях дыхательной цепи митохондрий. Никотинамид играет важную роль в регуляции работы цикла Кребса, влияя на соотношение НАДН/НАД+. Активным веществом препарата «Неотон» является фосфокреатин - буферное соединение, поставляющее фосфатную группу АДФ с целью повторного синтеза универсального источника энергии АТФ.

Эксперимент выполнен на 55 кроликах-самцах породы шиншилла массой 2600-3000 г. Животные были разделены на следующие группы: I - интактные (n=5); II - 6-часовой распространенный гнойный перитонит без хирургического лечения (n=5); III - контрольная, хирургическое лечение перитонита (n=15); IV - хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде в течение 5-и суток препарата «Цитофлавин» ежедневно внутривенно капельно (28,6 мг янтарной кислоты на 1 кг массы) (n=15); V - хирургическое лечение перитонита с применением в послеоперационном периоде в течение 5-и суток препарата «Неотон» ежедневно внутривенно капельно (0,05 г на 1 кг массы) (n=15).

Животным III-ей группы вводился внутривенно капельно эквивалентный объем 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Животных с распространенным гнойным перитонитом выводили из эксперимента (летальная доза нембутала) через 6 часов после заражения, III-й, IV-й и V-й групп - на 1-е, 3-и и 5-е сутки после операции.

...