Оценка степени проявления фенилкетонурии, обусловленной гомозиготной мутацией p.R155H, при помощи масс- спектрометрического анализа метаболитов крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оценка степени проявления фенилкетонурии, обусловленной гомозиготной мутацией p.R155H, при помощи масс- спектрометрического анализа метаболитов крови

фенилкетонурия мутация кровь метаболит

О. А. Батурина1, А.А. Черноносов1,

В. В. Коваль1,2, И. В. Морозов1,2*

1Институт химической биологии и

фундаментальной медицины СО РАН

2Новосибирский государственный университет

РЕФЕРАТ

Мы сравнили проявления фенилкетонурии (ФКУ) у двух гомозиготных носителей редкой мутации p.R155H - брата и сестры, детей одних и тех же родителей, получавших различное лечение. Такие пациенты представляют собой уникальную модель, позволяющую оценить как степень фенотипического проявления мутации, так и эффективность терапии. ФКУ, обусловленная мутациями с достаточной остаточной активностью фенилаланингидроксилазы, зачастую не выявляется, если диагноз основан исключительно на концентрации фенилаланина в крови. Подобная ошибка была допущена в случае одного из наших пациентов. Для уменьшения вероятности ошибок мы предлагаем использовать для диагностики более точные методы, например, масс-спектрометрический анализ метаболитов крови, эффективность которого показана в данной работе.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА p.R155H, гиперфенилаланинемия, карнитин в крови, масс-спектрометрия, мутация, фенилаланин в крови, фенилкетонурия.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФКУ - фенилкетонурия;

ФАГ - фенилаланингидроксилаза;

ЦНС - центральная нервная система;

C0 - свободный карнитин;

C2-C18 - ацилкарнитины.

ВВЕДЕНИЕ

Фенилкетонурия типа I (классическая) (ФКУ; MIM 261600) - аутосомное рецессивно наследуемое заболевание, обусловленное недостаточной активностью фенилаланингидроксилазы (ФАГ; [КФ 1.14.16.1]) [1, 2]. Недостаток ферментативной активности обычно обусловлен мутациями в гене фенилаланингидроксилазы [1]. Неполное превращение фенилаланина в тирозин из-за недостаточной активности ФАГ приводит к накоплению в тканях и биологических жидкостях фенилаланина и токсичных продуктов альтернативных путей его метаболизма, таких, как фенилпируват, винилацетат, фениллактат и фенилацетилглутамин, что приводит к развитию симптомов заболевания, в частности слабоумия.

Распространенными признаками фенилкетонурии также являются уменьшение концентрации тирозина и изменение баланса аминокислот в биологических жидкостях. Повсеместно используемая классификация степени проявления ФКУ, основанная на концентрации фенилаланина в крови, была предложена C.R. Scriver и S. Kaufman [3]. Согласно N. Blau и соавт. [4] ФКУ рассматривается как классическая (тяжелая) при концентрации фенилаланина в крови до лечения более 1200 мкМ; как ФКУ средней тяжести - при концентрации фенилаланина в пределах 900-1200 мкМ; как легкая форма - при концентрации 600-900 мкМ; концентрации менее 600 мкМ до лечения рассматриваются как гиперфенилаланинемия.

Неонатальный биохимический анализ является наиболее широко используемым в настоящее время методом ранней диагностики генетических заболеваний и предотвращения их последствий. Всемирная организация здравоохранения определила социальные и экономические предпосылки для включения заболевания в национальные программы неонатальной диагностики [5]. В настоящее время неонатальная диагностика ФКУ, как одного из наиболее распространенных генетических заболеваний (частота от 1 : 10000 до 1 : 25000 среди европеоидов, проводится в большинстве стран. В Российской Федерации такая диагностика предусматривает несколько измерений уровня фенилаланина в плазме крови, первое из которых проводится на 4 или 5 день после рождения. Если обнаруживается повышенный уровень, то измерение проводится повторно. Однако диагностика, основанная только на уровне фенилаланина в крови, может быть недостоверной, особенно при пограничных уровнях. Для точной диагностики требуются более совершенные методы, особенно в случае мутаций с относительно высокой остаточной активностью ФАГ, при которых уровень фенилаланина в крови повышается незначительно, оставаясь менее 500 мкМ, что недостаточно для однозначной диагностики. Масс-спектрометрический анализ метаболитов крови может обеспечить постановку более точного диагноза, основанного на оценке концентрации не только фенилаланина, но также тирозина и других аминокислот, что, в частности, позволяет определить соотношение фенилаланина и тирозина. Основанный на уровне метаболитов диагноз должен подтверждаться генетическим анализом с идентификацией мутаций гена ФАГ и характера их наследования при помощи определения нуклеотидных последовательностей соответствующих локусов.

В настоящее время основным и наиболее широко используемым методом коррекции ФКУ является диетотерапия [7, 8], направленная прежде всего на предотвращение повреждений центральной нервной системы (ЦНС), ведущих к деградации умственных способностей. Для достижения этой цели диетотерапия должна начинаться не позднее нескольких недель после рождения. Будучи в целом достаточно эффективной, такая диета ограничивает потребление белков животного происхождения, что может привести к уменьшению концентраций свободного карнитина (C0) и ацилкарнитинов (C2- C18), и, как следствие, к нарушениям метаболизма и функционирования митохондрий у некоторых пациентов [9].

В данной работе мы определяли уровни метаболитов в крови при наличии и отсутствии диетотерапии у двух родственных гомозиготных носителей ассоциированной с ФКУ мутации p.R155H гена ФАГ с использованием масс-спектрометрического анализа высушенных образцов крови. Близкородственных гомозиготных пациентов с различными историями использования диетотерапии можно рассматривать как уникальную модель для исследования как фенотипического проявления мутации, так и эффективности терапии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Оба пациента являются детьми одних и тех же родителей. У девочки (1), рожденной в июне 2009 года в России, ФКУ выявлена в процессе неонатальной биохимической диагностики, и она получала диету с ограниченным содержанием фенилаланина со второго месяца жизни. У мальчика (2), рожденного в июле 2001 года в Узбекистане, неонатальная диагностика не выявила ФКУ, и к нему не применяли диетотерапию. Образцы крови для масс- спектрометрического анализа были взяты в 2010 году, примерно через год после начала диетотерапии у пациента 1. В это же время проведена оценка физического развития и статуса ЦНС пациентов, которая не выявила каких-либо существенных отклонений. Исследование проводили в соответствии с требованиями комитета по медицинской этике ИХБФМ СО РАН.

В процессе неонатальной диагностики образцы крови собирали, используя бумажные фильтры (Perkin Elmer, Финляндия), концентрацию фенилаланина в крови определяли с использованием анализатора Delfia/Victor и набора реактивов производителя (Wallac Oy, Финляндия). Геномную ДНК выделяли из крови как описано ранее [10]. Мутации в гене ФАГ идентифицировали, определяя методом Сэнгера по двум цепям ДНК нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР-амплификации областей всех экзонов и прилежащих районов ин- тронов гена ФАГ с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.1 и генного анализатора ABI 3130xl (Applied Biosystems, США) в ЦКП «Геномика» ИХБФМ СО РАН. Нуклеотидные последовательности ДНК обоих пациентов были идентичными и соответствовали известным последовательностям гена ФАГ за исключением мутации p.R155H. Нуклеотидные последовательности родителей пациентов позволили подтвердить наследование мутации p.R155H. Масс-спектрометрический анализ содержания фенилаланина, тирозина и ацилкарни- тинов проводили в ЦКП масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН с использованием стандартной процедуры [11]. Использовали реактивы для подготовки образцов и внутренние стандарты из набора для диагностики новорожденных Amino acids and acylcarnitines kit # 55000 (Chromsystems Instruments & Chemicals, Германия), образцы готовили согласно протоколу производителя набора. Анализ проводили с использованием системы тандемного масс-спектрометра Agilent 6410 QQQ с системой ионизации ESI, объединенного с системой жидкостной хроматографии Agilent 1200 (Agilent Technologies, США). Количественный анализ проводили в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) с общим временем анализа 2.5 мин. Сигнал регистрировали и анализировали с использованием программы MassHunter v.1.3.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Точечная мутация p.R155H является заменой G на A в структуре экзона 5 гена ФАГ, приводящей к замене аргинина в каталитическом домене ФАГ на гистидин. Остаточная активность фермента, содержащего мутацию, остается достаточно высокой, примерно 44% от исходной, согласно данным http://www.biopku.org [12]. Поэтому мутация p.R155H считается ассоциированной с гиперфенилаланинемией с относительным коэффициентом корреляции генотипа и фенотипа 8 по шкале, предложенной Guldberg и соавт. [1]. Эта редкая мутация ранее была описана лишь в одном случае в сочетании с мутацией p.D143G у пациента с диагнозом гиперфенилаланинемия [13]. Нами изучены два рожденных от одних родителей гомозиготных носителя мутации p.R155H, один из которых подвергался диетотерапии, в то время как другой -нет. Будучи гомозиготными носителями мутации, такие пациенты дают уникальную возможность непосредственно изучить степень проявления мутации на уровне фенотипа, в то время как существенные различия в применявшейся терапии позволяют оценить ее сравнительную эффективность.

Первоначальное фенотипическое проявление мутации p.R155H у пациентов 1 и 2 несколько различалось, несмотря на одинаковый генотип по локусу ФАГ и общую родословную. Концентрация фенилаланина в крови в момент неонатальной диагностики у пациента 1 составила 1100 мкМ, на основании чего был поставлен диагноз ФКУ средней тяжести и предписана диетотерапия. У пациента 2 ФКУ не была диагностирована в процессе неонатальной диагностики, проводившейся в Республике Узбекистан, возможно, в силу разных сроков и стандартов диагностики. В 2010 году уровень фенилаланина в крови этого пациента составил 497 ± 13 мкМ (таблица), что соответствует максимум гиперфенилаланине- мии. Таким образом, при использовании в качестве критерия только уровня фенилаланина крови можно заключить, что генотип p.R155H/p.R155H может проявляться достаточно широким спектром симптомов - от слабо выраженной гиперфенилаланинемии до ФКУ средней тяжести, в зависимости от других биохимических особенностей пациента, ассоциированных, например, с полом, составом питания в неонатальный период и т.п. При этом неонатальная диагностика, основанная на концентрации фенилаланина в крови, может не выявить заболевание, что и произошло с пациентом 2.

Эффективное использование масс-спектрометрии для точной диагностики ФКУ, особенно при промежуточных концентрациях фенилаланина в крови, описано в работах Chace и соавт. [15, 16]. В качестве более точного и селективного критерия диагностики вместо концентрации фенилаланина они предложили использовать отношение концентрации фенилаланина и тирозина, поскольку при этом корректируются изменения общего уровня аминокислот. Отношение концентраций фенилаланина и тирозина в крови в норме находится в диапазоне от 0.49 до 0.93, повышаясь до значений от 1.3 до 14.3 у больных ФКУ [15, 16]. Мы зарегистрировали высокие значения этого параметра, явно и однозначно соответствующие ФКУ как у пациента 1 (6.9 ± 0.3), так и у пациента 2 (5.8 ± 0.1) (таблица). В то же время родители пациентов - гетерозиготные носители мутации, имели отношения, характерные для здоровых людей: 0.9 ± 0.1 (мать) и 0.7 ± 0.02 (отец).

Мы также определили уровни карнитинов в крови пациентов (таблица) и сравнили их с данными 20 здоровых детей [17]. Ранее было показано, что уровни карнитинов могут быть полезным критерием при идентификации врожденных сбоев метаболизма, и они существенно меняются при различных метаболических нарушениях [18]. Также отмечено, что концентрации карнитинов значительно понижаются в крови пациентов с ФКУ после диетотерапии с пониженным содержанием фенилаланина, если она не дополняется карнитинами [19]. У наших пациентов выявлено незначительное снижение общего уровня карнитинов (44.9 мкМ у пациента 1 и 55.2 мкМ у пациента 2) относительно нормальных уровней, которые составляют 60-100 мкМ [20]. Общие уровни ацилкарнитинов (13.2 мкМ у пациента 1 и 13.9 мкМ у пациента 2) полностью соответствовали норме. Возможный дефицит карнитинов мы определяли по отношению концентраций ацилкарнитинов и свободных карнитинов. Значения (0.42 у пациента 1 и 0.33 у пациента 2) были значительно ниже верхнего предела нормы (0.6), что свидетельствует о достаточных уровнях свободного карнитина, а также о соответствующей норме доле связанных форм карнитина. Таким образом, концентрации ацилкарнитинов у наших гомозиготных носителей p.R155H были в пределах нормы, несмотря на то, что ряд исследований [21, 22] свидетельствуют о значительных отличиях концентраций ацилкарнитинов у пациентов с классической ФКУ от нормы.

Концентрации метаболитов крови по данным масс-спектрометрии

Примечание. Представлены средние значения ± стандартная ошибка среднего пяти или шести измерений.

ВЫВОДЫ

Мы обследовали двух близкородственных гомозиготных носителей мутации p.R155H, ассоциированной с ФКУ, с различными историями терапии: один подвергался диетотерапии, а другой лечения не получал. В случае использования концентрации фенилаланина в крови в качестве единственного диагностического критерия ФКУ состояние одного пациента следует классифицировать как гиперфенилаланинемию, а другого - как ФКУ средней тяжести. В то же время использование отношения концентраций фенилаланина и тирозина в качестве критерия позволяет достоверно диагностировать ФКУ у обоих пациентов. Таким образом, уровень фенилаланина в крови сам по себе не может служить достоверным критерием диагностики ФКУ во всех случаях и не должен использоваться в качестве единственного диагностического критерия. Наши данные подтверждают возможность использования соотношения концентраций фенилаланина и тирозина в качестве более точного и достоверного критерия при неонатальной диагностике. Мы также показали возможность использования масс-спектрометрического анализа в качестве основного метода неонатальной диагностики ФКУ.

Определенные нами концентрации свободной и связанных форм карнитинов в крови свидетельствуют о том, что гомозиготные носители мутации p.R155H, вероятно, не испытывают существенных ограничений энергетического обмена в клетках, в отличие от пациентов с классической ФКУ или ФКУ средней тяжести.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Guldberg P, Rey F., Zschocke J., Romano V., Francois B., Michiels L., Ullrich K., Hoffmann G.F., Burgard P, Schmidt H., et al. // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 63. P 71-79.

2. DiLella A.G., Kwok S.C., Ledley F.D., Marvit J., Woo S.L. // Biochemistry. 1986. V. 25. P 743-749.

3. Scriver C.R., Kaufman S., Woo S.L. // Annu. Rev. Genet. 1988. V. 22. P 301-321.

4. Blau N., van Spronsen F.J., Levy H.L. // Lancet. 2010. V. 376. P. 1417-1427.

5. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 22.03.2006 № 185 «О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания».

6. Williams R.A., Mamotte C.D., Burnett J.R. // Clin. Biochem. Rev. 2008. V. 29. P 31-41.

7. Ahring K., Bйlanger-Quintana A., Dokoupil K., Gokmen Ozel H., Lammardo A.M., MacDonald A. // Clin. Nutr. 2009. V. 28. P. 231-237.

8. Bushueva T.V. // Questions of Modern Pediatrics. 2010. V. 9. P. 157-162.

9. Mutze U., Beblo S., Kortz L., Matthies C., Koletzko B., Bruegel M., Rohde C., Thiery J., Kiess W., Ceglarek U. // PLoS One. 2012. V. 7. P. 1-9.

10. Baturina O.A., Tupikin A.E., Lukjanova T.V., Sosnitskaya S.V., Morozov I.V. // J. Med. Biochem. 2014. V. 33. P. 333-340.

11. Chace D.H., Kalas T., Naylor E.W. // Clin. Chem. 2003. V. 49. P. 1797-1817.

12. Databases of Pediatric Neurotransmitter Disorders (PND), including the locus-specific database of PAH variants and BIOPKU genotypes database [Internet]. Division of Metabolism University Children's Hospital Steinwiesstrasse 75 CH- 8032 Zьrich Switzerland [cited 2018 Sep 10]. Available from: http:www.biopku.org

13. Dobrowolski S.F., Pey A.L., Koch R., Levy H., Ellingson C.C., Naylor E.W., Martinez A. // J. Inherit. Metab. Dis. 2009. V. 32. P. 10-21.

14. Liu Q., Wu J., Shen W., Wei R., Jiang.J, Liang J., Chen M., Zhong M., Yin A. // J. Matern. Fetal Neonatal. Med. 2017. V. 30 (22). P. 2697-2704.

15. Chace D.H., Mlllington D.S., Terada N., Kahier S.G., Roe C.R., Hofman L.F. // Clin. Chem. 1993. V. 39. P. 66-71.

16. Chace D.H., Sherwin J.E., Hillman S.L., Lorey F., Cunningham G.C. // Clin. Chem. 1998. V. 44. P. 2405-2409.

17. Leontieva I.V., Nikolaeva E.A., Alimina E.G., Zolkina I.V. // Practice Pediatrician. 2012. V. 10. P. 74-79.

18. Jones L.L., McDonald D.A., Borum P.R. // Prog. Lipid Res. 2010. V. 49 (1). P. 61-75.

19. Vilaseca M.A., Briones P., Ferrer I., Campistol J., Riverola A., Castillo P., Ramon F. // J. Inherit. Metab. Dis. 1993. V. 16 (1). P. 101-104.

20. Weigel C., Kiener C., Meier N., Schmid P., Rauh M., Rascher W., Knerr I. // Ann. Nutr. Metab. 2008. V. 53. P. 91-95.

21. Fischer G.M., Nemeti B., Farkas V., Debreceni B., Laszlo A., Schaffer Z., Somogyi C., Sandor A. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 150. P. 200-210.

22. Engel A.G., Rebouche C.J. // J. Inherit. Metab. Dis. 1984. V. 7 (Suppl. 1). P. 38-43.

Размещено на Allbest.ru