Возможности саливадиагностики COVID-19

Размещено на http://www.allbest.ru/

Возможности саливадиагностики COVID-19

Курзанов А.Н.¹, Быков И.М.¹, Ледванов М.Ю.

¹ ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России, Краснодар;

²ООО «Оргметодотдел АЕ»

В обзоре представлена существующая информация о клинических и научных основах потенциального использования ротовой жидкости / слюны для диагностики COVID-19 и мониторинга этого заболевания. Приведены данные о применении различных биохимических и иммунологических методов, используемых для выявления в образцах ротовой жидкости / слюны самого вируса SARS-CoV-2 по результатам исследования его РНК или антигенов, которые применяют с целью верификации диагноза COVID-19, а также для количественного определения антител против вируса SARS-CoV-2, позволяющего оценивать наличие или отсутствие иммунитета в результате продолжающегося или перенесенного заболевания. Кроме того, обсуждаются представленные в современных публикациях сведения о преимуществах и недостатках, спорных моментах и перспективах исследования слюны, которые обещают быть полезными для лучшего понимания COVID-19 и, возможно, для идентификации пациентов с различной степенью тяжести, включая бессимптомных носителей. Приведены мнения различных авторов о том, что слюна становится многообещающей альтернативой мазкам из носоглотки / ротоглотки для диагностики и мониторинга COVID-19, которые основаны на сравнительных перекрестных анализах образцов слюны и мазков из носоглотки при обнаружении РНК SARS-CoV-2. Представлены аргументы, свидетельствующие о том, что саливадиагностика COVID-19 является перспективной для прямого тестирования в условиях “по требованию” в местах социальной агрегации людей для программ массового скрининга и для анализа образцов слюны непосредственно там, где требуется тест на наличие SARS-CoV-2. В обзоре обобщаются сведения о диагностической ценности исследования слюны для выявления РНК SARS-CoV-2, приводятся факты о возможности контактной передачи этого вируса через микрокапли слюны, что, как ожидается, будет способствовать контролю над эпидемией COVID-19.

Ключевые слова: саливадиагностика, коронавирус, COVID-19, SARS-CoV-2, ротовая жидкость, слюна, мазок из носоглотки

The survey covers existing clinical and scientific basics of potential use of oral fluid / saliva to diagnose COVID- 19 and monitor this disease. The survey includes facts about the application of various biochemical and immunological methods used to detect the virus SARS-CoV-2 in samples of oral fluid / saliva basing on the RNA test results, or its antigens, which are being used to verify diagnose COVID-19, as well as to quantitatively detect antibodies to virus SARS-CoV-2, which let assess the presence or absence of immunity as a result of current or earlier infection. Moreover, the authors discuss recently published works on advantages and disadvantages, controversial points and prospects of saliva research, that promise to be useful for a better understanding of COVID-19 and for possible identification of patients with different disease severity including asymptomatic carriers. The survey quotes opinions of different authors about saliva becoming a very promising alternative to nasal / throat swabs to diagnose and monitor COVID-19, which are based on comparative cross-referencing of saliva samples and throat swabs with detected SARS-CoV-2 RNA. The authors present arguments proving, that the salivary diagnostics of COVID-19 has future in the direct testing “on demand” in the areas of human social aggregation, mass screening and testing of saliva samples on the spot if a SARS-CoV-2 test is required immediately. The survey summarizes information on the diagnostic value of saliva testing to detect SARS-CoV-2 RNA, and refers to the facts about possible contact transmission of this virus via saliva microdroplets, which is expected to help control the epidemic of COVID-19.

При подготовке данной публикации в доступной ее авторам отечественной литературе не было найдено ни одной обзорной статьи, посвященной саливадиагностике

Прошло уже более года с тех пор, как органы здравоохранения Китая проинформировали Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) о вспышке новой пневмонии, связанной с коронавирусом, в провинции Хубэй и городе Ухань[4]. Этот новый штамм коронавируса, из рода бетакоронавирусов (Betacoronavirus) вскоре был назван коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) из-за его тесной связи с вирусом, ответственным за эпидемию SARS 2003 года (SARS-CoV). Распространение SARS-CoV-2 было признано третьим случаем внедрения высокопатогенного коронавируса в человеческую популяцию после коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV) и коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) в двадцать первом веке [5]. В феврале 2020 года Всемирная Организация Здравоохранения представила официальное название для болезни, которую вызывает SARS-CoV-2 - «COVID- 19» (COrona Virus Disease 2019). С тех пор высоко вирулентный респираторный патоген стал частью нашей действительности. Пандемия Covid-19 - самая большая проблема и причина глобального мирового кризиса здравоохранения со времен Второй мировой войны [6].

Несмотря на то, что последовательность SARS-CoV-2 на 80% идентична последовательности SARS-CoV, его заразность, по-видимому, намного выше, о чем свидетельствует распространение инфекции по всему миру. SARS-CoV-2, по-видимому, в основном распространяется через респираторные секреторные выделения, которые продуцируются слизистыми оболочками в форме микрокапель у инфицированных людей. Эти капли превращаются в аэрозоль при кашле, чихании или разговоре и могут распространяться по воздуху или через загрязненные ими поверхности. Прямая передача SARS-CoV-2 от человека к человеку происходит при вдыхании капель даже при разговоре, а также возможна передача, вызванная контактом со слизистыми оболочками носа, глаз и полости рта. Микрокапли из дыхательных путей особенно заразны, когда инфицированные люди находятся в закрытых помещениях или в тесном контакте с другими людьми [7]. Сегодня совершенно очевидно, что с возникшими проблемами невозможно справляться без использования лабораторной диагностики. Лабораторное тестирование на наличие в организме вируса стало принципиальным моментом в борьбе с пандемией COVID-19. Надежный тест на коронавирусную инфекцию должен выявлять пациентов с легкой или бессимптомной формой, достоверно отражать течение болезни и хорошо масштабироваться. Быстрое обнаружение SARS-CoV-2 имеет решающее значение для диагностики COVID-19 и предотвращения распространения вируса. Никакие другие инфекционные заболевания, даже пандемический грипп, не вызывали столь массовых лабораторно-диагностических акций, а регуляторные органы во всех странах оказались не готовы к проведению тестов на выявление SARS-CoV-2 в таких объемах и столь быстром темпе. Отсюда -- проблемы как с качеством, так и трактовкой результатов исследований.

Существует несколько диагностических стратегий для выявления или исключения текущей инфекции, выявления людей, нуждающихся в медицинской помощи, или для проверки на наличие инфекции в прошлом и формирования иммунного ответа. Европейская комиссия подготовила рабочий документ, в котором предлагается предварительное определение критериев качества средств для диагностики COVID-19 (European Commission, 2020). Как отмечено в документе, тесты, используемые при COVID-19, можно разделить на две группы: 1) направленные на выявление наличия самого вируса (РНК и антигенов), которые применяют с целью верификации диагноза COVID-19, для скрининга в критически важных целевых группах (медицинские работники) и проверки окончания выделения вируса излечившимися пациентами; 2) выявляющие антитела против вируса SARS-CoV-2, то есть наличие или отсутствие иммунитета в результате продолжающегося или перенесенного заболевания. Молекулярная диагностика позволяет выявлять SARS-CoV-2 путем идентификации его геномного материала, то есть вирусной РНК, в анализируемом образце. Эти процедуры представляют собой эталонный стандарт диагностики вирусных инфекций, требующий использования специального оборудования, дорогих реагентов, квалифицированного персонала и необходимой лабораторной инфраструктуры. Молекулярные тесты и выявление антигена в месте оказания медицинской помощи могут обеспечить более раннюю диагностику COVID-19 и изоляцию инфицированных лиц.

На основе опыта других респираторных инфекционных заболеваний, включая SARS в 2003 году, в начале пандемии COVID-19 ВОЗ рекомендовала диагностический протокол обнаружения вирусной РНК с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (рОТ-ПЛР) в респираторных образцах (мазки из ротоглотки (OPS), носоглотки (NPS), бронхоальвеолярный лаваж, трахеальный аспират), который был признан эталонным стандартом для диагностики инфекции, вызванной SARS- CoV- 2 [8, 9]. Среди различных респираторных образцов мазок из носоглотки (NPS) был рекомендован в качестве биоматериала первого выбора для тестирования с точки зрения чувствительности. Однако сбор мазков из носоглотки вызывает дискомфорт у пациентов из- за инвазивности процедуры, что может снизить вероятность согласия пациента на повторное тестирование. Кроме того, для сбора респираторных образцов требуется специализированный медицинский персонал, который подвержен очевидному риску контакта с содержащим вирус биоматериалом. Сама процедура может быть связана с раздражением глотки, чиханием и кашлем во время которых возможно массированное выделение вирусных частиц в зону нахождения медперсонала, что увеличивает риск инфицирования для медицинских работников, которые контактируют с пациентом во время сбора образцов биоматериала [10,11]. Получение мазков из носоглотки требует использования всех средств индивидуальной защиты, что увеличивает стоимость тестирования. Кроме того, сбор образцов из носоглотки или ротоглотки может вызвать кровотечение, особенно у пациентов с тромбоцитопенией [12]. Следовательно, мазки из носоглотки или ротоглотки нежелательны для серийного мониторинга вирусной нагрузки.

Во время пика эпидемии COVID-19 переполненность центров, предназначенных для анализа образцов мазков из носоглотки, вызвала прерывание многих других диагностических процедур, что оказало серьезное влияние на предоставление основных медицинских услуг при хронических заболеваниях. Наконец, чувствительность тестирования с использованием этого биоматериала может значительно варьировать в зависимости от интервала между воздействием инфицированного материала на обследуемого и процедурой отбора образцов [13].

Ротоглоточная секрет формируется при кашле или прочистке горла, и относится к респираторным секретам, образующимся как верхними (носоглотка), так и нижними (бронхи, легкие) дыхательными путями. Напротив, ротовая слюна вырабатывается слюнными железами и не принадлежит к группе респираторных биоматериалов. Однако четкое различие между этими двумя типами образцов невозможно и не входит в задачи лабораторной клинической диагностики COVID-19. Биоматериал, образующийся при кашле, содержит некоторое количество оральной слюны, а небольшое количество ротоглоточного секрета может присутствовать в ротовой слюне. Использование ротоглоточного секрета в качестве образца для обнаружения SARS-CoV-2 описано в исследованиях, в которых подчеркивается тот факт, что такие образцы могут содержать как бронхолегочные, так и носоглоточные выделения. Для тестов на обнаружение SARS-CoV-2 Японский национальный институт инфекционных заболеваний рекомендует собирать мокроту (первоочередная задача) [14]. Мокрота является неинвазивным образцом из нижних дыхательных путей, но только у 28% пациентов с COVID-19 в серии случаев оказалось возможным получить мокроту для диагностической оценки [15]. Поскольку сухой кашель, сопровождающийся уменьшением количества мокроты, является обычным явлением при COVID-19, образцы из носоглотки также собирают (вторичный приоритет). Однако сбор образцов из носоглотки, кроме указанных выше недостатков, связан с использованием персонала, обладающего необходимыми техническими навыками (поскольку несоответствующая процедура может привести к ложноотрицательным результатам теста). В этой связи в нескольких исследованиях было предложено обнаружение SARS-CoV-2 с использованием других биоматериалов, таких как моча, фекалии, слезы и слюна [16]. Среди этих биоматериалов слюна привлекает серьезное внимание ученых - клиницистов и специалистов в области лабораторной медицины прежде всего в ракурсе саливадагностики инфекций, включая заболевания, вызываемые коронавирусами.

Yoon J.G. et al. (2020) [17] проанализировали серийную вирусную нагрузку в носоглотке, ротоглотке, образцах слюны, мокроты и мочи у пациентов с COVID-19. На ранней стадии инфекции вирусная нагрузка SARS-CoV-2 была чрезвычайно высокой в носоглотке и слюне. Установлено, что слюна содержит живые вирусы, которые могут способствовать передаче инфекции [18]. SARS-CoV-2 может попасть в ротовую жидкость как минимум тремя разными путями. SARS-CoV-2 в нижних и верхних дыхательных путях достигает ротовой полости вместе с каплями жидкости; SARS-CoV-2 в крови может попасть в рот через десневую жидкость; в процессе формирования секрета слюнных желез в случае их инфицирования с последующим выбросом вирусных частиц в слюну через слюнные протоки [19]. саливадиагностика ротовая жидкость covid

Было показано, что SARS-CoV инфицирует эпителиальные клетки в протоках слюнных желез у макак-резусов [20]. Xu J. et al., (2020) [21] показали, что слюнные железы могут являться потенциальными резервуарами для SARS-CoV-2 и источником бессимптомной инфекции COVID-19. Возможность инфицирования слюнных желез предполагает наличие SARS-CoV-2 в слюне пациентов. Chen L. et al. (2020) [22] собрали слюну непосредственно из выводного протока слюнной железы и обнаружили РНК SARS- CoV-2, что доказывает инфицированность слюнных желез SARS-CoV-2. Тяжелая форма COVID-19 может индуцировать нарушение функции слюнных желез из-за заражения SARS- CoV-2. Предполагают, что SARS-CoV-2 может вызывать острый сиаладенит и связанные с ним симптомы, такие как боль, дискомфорт, воспаление и секреторную дисфункцию слюнных желез [23]. Ранее Xu H., et al., (2020) [24] показали роль слизистой оболочки полости рта в заражении COVID-19. Это требует учитывать потенциальную инфекционность ротовой жидкости в ракурсе новых проблем для стоматологии и оральной медицины [25].

Однако следует отметить, что образцы ротовой жидкости содержат не только слюну, секретируемую большими и малыми слюнными железами, включая лингвальные железы фон Эбнера, десневую жидкость, буккальные и десневые эпителиоциты, но также и секреты, поступающие из носоглотки или из дыхательных путей. Считается, что респираторные вирусы передаются от человека к человеку при прямом или косвенном контакте, а также через крупные или мелкие капли жидкости, выделяемые при кашле или чихании, а микрокапли, содержащие вирус гриппа, могут быть обнаружены в выдыхаемом воздухе, даже при нормальном дыхании [26]. Следовательно, SARS-CoV-2 может передаваться через слюну прямо или косвенно даже среди пациентов без кашля или других респираторных симптомов. Эти результаты подтверждают необходимость использования масок в качестве меры профилактики.

Использование слюны в качестве диагностического образца имеет ряд преимуществ, таких как возможность простого самостоятельного сбора биоматериала пациентом без каких- либо инвазивных процедур даже в домашних условиях и отсутствие необходимости в специализированном персонале для сбора образцов. Следовательно, использование образцов слюны может снизить риск передачи вируса медицинским работникам. Кроме того, забор слюны намного удобнее для пациента, чем процедура мазков из носоглотки / ротоглотки, практически не вызывая дискомфорта [27]. Использование образцов слюны снижает риск внутрибольничной передачи COVID-19 и идеально подходит для ситуаций, в которых сбор образцов из носоглотки может быть противопоказан. Это также экономит время и является менее дорогостоящим, поскольку не требует использования средств индивидуальной защиты или устройств для безопасной транспортировки содержащих вирусы биоматериалов. Использование слюны позволяет собирать образцы за пределами больниц или медицинских центров. В условиях, когда необходим скрининг большого количества людей, слюна представляет собой практичный и неинвазивный тип биоматериала [18]. В результате за последние месяцы несколько научных статей, средств массовой информации и компаний сообщили о разработке новых тестов с использованием слюны для выявления инфекции, вызываемой SARS-CoV-2. Диагностическая ценность образцов слюны для определения РНК SARS-CoV-2 по-прежнему ограничена, но это перспективный метод, к которому следует относиться с осторожным оптимизмом [2].

Целью этого обзора явился анализ существующей информации о возможности саливадиагностики COVID-19 и целесообразности использования ротовой жидкости (слюны) в качестве биологического образца для выявления SARS-CoV-2.

Данные об использовании слюны в диагностике более ранних респираторных синдромов и роли слюнных желез в передаче инфекции

Предыдущие исследования показали высокий уровень информативности слюны в качестве образцов для лабораторной диагностики респираторных синдромов, вызываемых вирусами. Идея о том, что капли слюны могут представлять собой важный компонент передачи инфекции и подходящий образец для диагностики, была подтверждена в 2003 году во время вспышки атипичной пневмонии, когда было доказано, что слюна является надежным образцом для выявления коронавируса SARS. Wang et al. (2004) [28]сообщили о высокой вирусной нагрузке SARS-CoV в образцах слюны по сравнению с промыванием горла. Аналогичные выводы были сделаны в отношении вспышки вызванного коронавирусом ближневосточного респираторного синдрома, MERS-CoV [29]. Ранее подтверждена роль слюны в диагностике респираторных инфекций, вызванных гриппом или другими коронавирусами [30]. Эти данные согласуются с выводом о том, что капли слюны представляют собой основной источник передачи инфекции SARS-CoV-2 от человека к человеку [31]. ВОЗ также заявила, что капли, выделяемые инфицированными людьми при кашле, чихании или разговоре при близком контакте, являются основным способом передачи SARS-CoV-2, помимо прикосновения к зараженным поверхностям без мытья рук (https://www.who.int/news-room / qa-detail / qa-coronaviruses #). Воздушно-капельная передача также может иметь место в том же внутреннем пространстве, где применяются процедуры, способствующие образованию аэрозолей (интубирование, бронхоскопия, стоматологические манипуляции, высокопоточная назальная оксигенотерапия, инвазивная искусственная вентиляция легких.

Использование различных диагностических протоколов для обнаружения SARS- CoV-2

Несмотря на увеличение возможностей диагностического тестирования на SARS- CoV-2 во многих странах имеющийся уровень тестирования по-прежнему недостаточен для замедления пандемии COVID-19. У многих тестируемых все еще возникают длительные задержки в получении результатов из-за дисбаланса между спросом и предложением в центрах тестирования. Спрос на тестирование только возрастает с открытием учебных заведений и рабочих мест. В идеале специализированное тестирование, ориентированное на эпиднадзор за населением, должно обеспечивать минимальное отвлечения ресурсов от клинического диагностического тестирования, быть доступным и масштабируемым, и быстро и надежно идентифицировать наличие вируса для при бессимптомных или субклинических вариантах инфекций. Таким образом, упрощение процесса сбора образцов и тестирования имеет решающее значение в борьбе с пандемией COVID-19. Исследование образцов ротовой жидкости / слюны для обнаружения SARS-CoV-2 - одно из простых и эффективных решений, необходимых для массового расширения тестирования поскольку показано, что этот биоматериал является чувствительным для детектирования возбудителя COVID-19 [3,32,33]. Поэтому необходимы недорогие методы тестирования на SARS-CoV-2 на основе образцов слюны, чтобы помочь достичь потенциала, необходимого для безопасного функционирования лечебных, учебных заведений и рабочих мест.

Многие протоколы сбора слюны требуют, чтобы пациенты откашливались перед тем, как собрать слюну [18, 34] и регламентируют использование реагентов для стабилизации РНК в составе устройства для сбора ротовой жидкости. Принудительный кашель, если он проводится в присутствии медицинского работника, требует использования средств индивидуальной защиты. Кроме того, стабилизаторы РНК увеличивают стоимость тестирования, дефицитны и могут быть потенциально токсичными при использовании. С целью определения возможной деградации РНК в слюне в качестве потенциального причины ложноотрицательных результатов, Hanson K.E. et al., 2020 [32] провели исследования стабильности биоматериала при температуре окружающей среды и при охлаждении в течение до 5 дней и не обнаружили снижения результата выявления РНК SARS-CoV-2. Это исследование представляет собой одно из крупнейших проспективных сравнений типов образцов на сегодняшний день и демонстрирует отличное согласие результатов тестирования между NPS, собранными врачом, и слюной, собранной самостоятельно пациентом. У большинства (91,9%) пациентов с положительными результатами РНК SARS-CoV-2 была обнаружена как минимум в двух типах образцов одновременно. Образцы NPS и слюны в целом показали наибольшую положительную реакцию. Учитывая, что у всех участников было сильное клиническое подозрение на COVID-19, а молекулярное тестирование в целом имеет очень высокую специфичность, вполне вероятно, что результаты NPS или образцов слюны, которые были единственными положительными образцами, являются истинно положительными, но отсутствие принятого внешнего эталонного стандарта не позволяет рассчитать клиническую чувствительность и специфичность.

Некоторые авторы рекомендуют использовать образцы ротовой жидкости, собранные сразу после пробуждения, до приема пищи или чистки зубов [11;35]. Другие исследователи собирали слюну в любое время у пациентов, у которых производили тест по запросу врача[36]. В некоторых исследованиях слюну получали с помощью специальных устройств для сбора, улучшающих качество и количество получаемой слюны [37]. Однако эти устройства для сбора обычно недоступны в медицинских центрах общего профиля, особенно в странах с низким уровнем доходов. Кроме того, для сбора слюны с помощью таких устройств требуется помощь медицинских работников.

Чтобы изучить возможность широкого внедрения доступных подходов к эпиднадзору на основе тестирования образцов слюны, [38] исследовали стабильность РНК SARS-CoV-2 и вирулентность вируса в образцах слюны, хранящихся в широко доступных стерильных лабораторных пластиковых (полипропиленовых) пробирках, не содержащих нуклеазы. Показано стабильное обнаружение РНК SARS-CoV-2 в образцах слюны, хранившихся при различной температуре и в течение продолжительных периодов времени, что подтверждает возможность недорогого и простого сбора слюны. Слюна, собранная у пациентов с COVID- 19 в стационаре и медицинских работников с использованием стерильных пробирок для сбора использовалась для оценки временной стабильности РНК SARS-CoV-2 при различных температурах хранения (-80 ° C, 4 ° C, ~ 19 ° C, 30 ° C). C) без использования консервантов нуклеиновых кислот. Установлено, что РНК SARS-CoV-2 из слюны неизменно обнаруживалась на одинаковых уровнях независимо от времени и температуры хранения. Более того, РНК SARS-CoV-2 оставалась относительно стабильной в образцах слюны, оставленных на срок до 25 дней при комнатной температуре. Этот вывод согласуется с недавним исследованием, в котором также сообщается о стабильности РНК SARS-CoV-2 в слюне, хранившейся при комнатной температуре 7 дней. Стабильность обнаружения РНК SARS-CoV-2 в течение продолжительных периодов времени и в различных условиях хранения указывает на то, что слюну можно собирать без необходимости использования дорогостоящих буферных добавок для стабилизации РНК [39].

Более того, предыдущие исследования продемонстрировали простую возможность сбора слюны в простые стерильные, свободные от нуклеаз пластиковые контейнеры с широким горлышком[3]. Стабильность SARS-CoV-2, как при комнатной температуре, так и при 30 ° C, позволяет использовать более доступные способы сбора и транспортировки биоматериала без необходимости использования дорогостоящих стратегий охлаждения, что также облегчает проведение массового тестирования слюны в регионах с ограниченными ресурсами. В других исследованиях обследуемые производили сбор ротовой жидкости используя метод сплевывания в стерильные контейнеры, обычно используемые во многих клиниках для сбора мочи, Поскольку никаких специальных устройств обычно не требуется, использование слюны может быть реализовано в клинической практике в качестве рутинной процедуры без ущерба для качества образца, как сообщалось ранее [40].

Метод пассивного слюнотечения позволяет получить более однородный образец и избежать влияния ингибирующих веществ [41]. Показано, что слюна, собранная методом пассивного слюноотделения, может быть лучше мазков из носоглотки для получения стабильных результатов анализа [42]. Тем не менее, для определения наиболее подходящего метода сбора слюны необходима дополнительная оценка. Самостоятельно собранные образцы ротовой жидкости и мазков из носа демонстрируют сопоставимую чувствительность с образцам мазков из носоглотки, собранным клиницистом, для выявления SARS-CoV-2 [43]. Вышесказанное позволяет констатировать, что использование самостоятельно собранных образцов слюны является простой, удобной и недорогой альтернативой обычным молекулярным тестам на основе мазков из носоглотки. Эти результаты могут позволить более широко использовать молекулярные тесты для управления пандемией COVID19, особенно в условиях ограниченных ресурсов. Даже если диагностика по слюне неинвазивна и менее опасна по сравнению с мазками из зева, комплексный диагноз должен подкрепляться полной информацией о симптомах, эпидемиологической историей и анализом нескольких клинических обследований. Поскольку присутствие живого вируса в слюне определяет ее как потенциальный источник передачи инфекции, с любыми собранными образцами слюны необходимо обращаться с осторожностью, чтобы избежать распространения этого патогена.

Выявление SARS-CoV-2 в ротовой жидкости (слюне) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени (рОТ-ПЦР)

Обнаружение SARS-CoV-2 в слюне с помощью рОТ-ПЦР было первоначально (февраль 2020 г.) описано To KK. et al., (2020) [18]. В своем исследовании авторы проанализировали 23 образца слюны пациентов с разной степенью тяжести заболевания COVID-19 и сообщили, что у 87% из них обнаруживалась вирусная РНК в слюне.

Исследование диагностической достоверности выявления SARS-CoV-2 с помощью анализа на основе ПЦР мазков из OPS, NPS и образцов слюны или мокроты с последующим сравнительным анализом количественной ОТ-ПЦР и вирусной нагрузки [44] показало, что частота обнаружения вируса в мокроте (95,65%) и слюне (88,09%) была значительно выше, чем в мазках из OPS (41,54%) и NPS (72,31%) (P <0,001). Кроме того, значение Ct для мазков из NPS, образцов мокроты и слюны было значительно выше, чем для мазков из OPS, тогда как между образцами мокроты и слюны не наблюдалось значительной разницы. Авторы исследования констатировали, что уровень обнаружения SARS-CoV-2 в слюне выше, чем в респираторных образцах. Эти результаты показали, что слюна и мокрота являются надежными типами биоматериалов, которые можно использовать для обнаружения SARS- CoV-2. Высокий уровень соответствия между двумя типами биоматериала демонстрирует, что использование слюны для обнаружения SARS-CoV-2 методом рОТ-ПИР так же надежно, как и использование мазков NPS / OPS, но с меньшими затратами и рисками.

На 25.08.2020 в Российской Федерации зарегистрировано 34 диагностических наборов реагентов для выявления РНК SARS-CoV-2.

Недавно разработаны новые методы диагностического тестирования, такие как более быстрый анализ ПИР, который позволяет выявить инфекцию в учреждениях, предназначенных для диагностики COVID-19 [45]. Эти методы позволяют более быструю диагностику с помощью прямой рОТ-ПИР без выделения РНК. Применение этой более быстрой процедуры с использованием образцов слюны позволило зафиксировать чувствительность, которая была лишь немного ниже, чем чувствительность, показанная стандартным протоколом с экстракцией РНК [46]. Новая тест - система nCoV-DK (Shimadzu Corporation, Киото, Япония) для обнаружения SARS-CoV-2, исключает этапы выделения и очистки РНК с помощью технологии Ampdirect ™, что значительно сокращение времени, необходимого для подготовки образца и детекции с помощью ПЦР[47]. Однако nCoV-DK был первоначально разработан для использования образцов мазков из носоглотки, и было необходимо выяснить, можно ли исследовать образцы слюны с использованием системы nCoV-DK, поскольку слюна имеет высокий уровень РНКазы [48]. Результаты показали, что присутствие РНКаз в слюне не нарушает такой альтернативный протокол, который позволяет обойти классическое выделение и очистку РНК, чтобы снизить риск человеческой ошибки на этом этапе. Fukumoto T., et al., (2020) [49] провели сравнительное тестирование группы пациентов больных COVID-19 с помощью прямой ПЦР и nCoV-DK. Общая степень соответствия обнаружения вируса между двумя методами составила 94,4%. Показатели соответствия составляли 95,2%, 95,5% и 85,7% в образцах мазка из носоглотки, слюны и мокроты соответственно. Между двумя методами была сильная корреляция (r = 0,837, 95% ДИ = 0,736-0,902, P <0,01). Это исследование продемонстрировало, что слюна является надежным инструментом для обнаружения вируса с помощью системы nCoV-KD даже без процесса экстракции и очистки РНК. Наконец, время, необходимое для выполнения этой процедуры, составляло от 30 до 60 минут, что обеспечивало более быструю диагностику [34]. Таким образом, можно сделать вывод, что rRT-PCR слюны предоставляет релевантные, надежные данные, которые можно использовать в дополнение к эталонному стандарту (например, NPS) для выявления ложноотрицательных случаев с помощью анализа респираторных мазков, тем самым повышая общую чувствительность на основе тестирования стандартных молекулярных образцов [32]. Несколько групп в мире изучают возможность применения технологии одностадийной изотермической амплификации нуклеиновых кислот, опосредованной обратной транскрипцией (RT-LAMP - Loop-Mediated Isothermal Amplification), которая используется для диагностики инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями или вирусами. RT-LAMP очень эффективный метод обнаружения вирусов с геномом РНК, использование которого в сочетании с колориметрическим качественным анализом в местах оказания медицинской помощи, было протестировано на образцах слюны, взятых у пациентов с COVID-19 без этапа выделения РНК. Результаты были доступны через 30 минут и оценивались на основе изменения цвета образца при наличии вирусной РНК [50]. Применение метода RT-LAMP с использованием слюны имеет несколько преимуществ при диагностике в месте оказания медицинской помощи. Во-первых, пациент самостоятельно собирает образец слюны и процедура анализа не требует выделения РНК. Во-вторых, этот метод обеспечивает легко интерпретируемые результаты в течение 1 часа и не требует каких-либо сложных лабораторных устройств или технологий [51,52]. Например, EasyCOV (SkiCell и Sys2Diag / CNRS) - это колориметрический анализ RT-LAMP, разработанный для анализа слюны. Результаты можно прочитать, наблюдая за цветом образца внутри пробирки. Изменение цвета с оранжевого на желтый указывает на то, что образец положительный и присутствует SARS-CoV-2 [53].

Диагностическая точность рОТ-ПЦР слюны Автоматизированные молекулярные анализы в местах оказания медицинской помощи значительно сократили время выполнения теста на SARS-CoV-2. Одно из основных препятствий сейчас находится на этапе сбора образцов, особенно в загруженных клинических условиях. Слюна - это удобный тип образцов, который могут легко получить взрослые пациенты. В последнее время образцы слюны были исследованы для обнаружения РНК SARS-COV-2 с переменным успехом. Чтобы сделать значимый вывод в этом отношении, наиболее важным дизайном исследования должен быть сравнительный перекрестный анализ образцов слюны и мазков из носоглотки при обнаружении РНК SARS- CoV-2 с пороговым значением цикла [54]. Поэтому здесь приведены результаты критического анализа опубликованных статей с таким дизайном исследования. В этих исследованиях слюна рассматривалась потенциальным биоматериалом для обнаружения и диагностики РНК SARS-CoV-2 с использованием ОТ-ПЦР. В группе исследований обнаружение вирусной РНК в слюне сравнивали с обнаружением мазков из носоглотки и / или ротоглотки (OPS), выполненных в тот же день сбора слюны. В некоторых из этих исследований сравнивалась чувствительность образцов слюны и дыхательных путей при обнаружении инфекции SARS-CoV-2 у анализируемых пациентов. Результаты были неоднородными.

Iwasaki S., et al., (2020) [41] сообщили о 97% -ной согласованности между образцами мазка из носоглотки и слюной при обнаружении SARS-CoV-2 .В нескольких публикациях представлены данные о молекулярной диагностике SARS-CoV-2 путем идентификации его геномного материала, то есть вирусной РНК, по результатам исследования слюны в сопоставлении с тестированием других биоматериалов методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени. Опубликованные данные, сравнивающие слюну и мазок из носоглотки для обнаружения SARS-CoV-2, показали противоречивые результаты. У пациентов с подтверждённым диагнозом COVID-19, поступивших в Йельскую больницу Нью-Хейвен с тяжелой формой заболевания, Wyllie et al.[3] обнаружили, что титр вируса в пробах слюны выше, чем в мазках из носоглотки. В ходе отдельного анализа 38 пар образцов слюна-мазок в 21% проб коронавирус обнаруживался в слюне, но не в мазке, и только для 8% проб ситуация была обратной. Авторы показали, что точность выявления SARS-CoV-2 в слюне если не превосходит, то как минимум сравнима с точностью результатов мазка из носоглотки при ранней госпитализации и даже более рациональна при продолжительной госпитализации и восстановлении. Этот факт позволил предположить, что анализ слюны для выявления коронавируса SARSCoV-2 является эффективной и оптимальной альтернативой мазкам из носоглотки и особенно для выявления легких или бессимптомных форм инфекции. Результаты других исследований подтверждают потенциал слюны для выявления SARS-CoV-2 как у пациентов без симптомов, так и у амбулаторных больных [43,55].

Точно так же у 25 пациентов с тяжелой формой заболевания в Италии был выявлен SARS-CoV-2 в слюне. Это позволило авторам констатировать, что слюна надежный инструмент для обнаружения SARS-CoV-2 [56]. Yokota I., et al., (2020) [57] сообщили, что образцы слюны более информативны, чем мазки из носоглотки (NPS) в условиях больниц, пунктов неотложной помощи и при скрининговом тестировании на SARS-CoV-2 с помощью ПИР с обратной транскрипцией в реальном времени. Результаты исследования [36] показали, что анализ слюны в качестве альтернативы мазкам из NPS является чувствительным и достаточно специфичным, чтобы использовать его в повседневной практике. Соответствие результатов ОТ-ПЦР для обнаружения SARS-CoV-2 в слюне и мазках NPS составило 96,1%. To et al. (2020) [55,35] сообщили о высокой согласованности результатов исследования между слюной и носоглоточным аспиратом для обнаружения респираторных вирусов и мониторинга вирусной нагрузки SARS-CoV-2.

Rao, M., et al., (2020) [58] провели проспективное одноцентровое сравнительное исследование утренних образцов слюны, собранных пациентами, с образцами NPS, полученными медицинским работником, в котором приняли участие 217 бессимптомных взрослых мужчин-участников карантинного центра COVID-19, у которых был получен положительный результат на SARS-CoV-2 за 8-10 дней до изоляции. Парные образцы NPS и слюны были собраны и обработаны в течение 5 часов после сбора образцов с использованием рОТ-ПЦР. Частота выявления SARS-CoV-2 была выше в слюне по сравнению с тестом NPS (93,1%, против 52,5%, p <0,001). Авторы заключили, что слюна - лучший альтернативный образец для выявления SARS-CoV-2, а с учетом простоты самостоятельного сбора образцов, дефицита средств индивидуальной защиты и трансмиссивности вируса, исследование слюны может обеспечить возможность для точного эпиднадзора за SARS-CoV-2.

Однако в амбулаторных условиях в Мельбурне, (Австралия), из 662 обследованных пациентов только у 33 из 39 (84,6%) пациентов с подтвержденными случаями COVID-19 был обнаружен SARS-CoV-2 в слюне [27]. Barat, B., et al., (2020)[59] оценили образцы слюны для тестирования SARS-CoV-2 рОТ-ПЦР путем сравнения 459 проспективно собранных парных мазков NPS или средней носовой раковины от 449 человек с целью определения возможности использования слюны для скрининга среди лиц с отсутствием симптомов COVID-19. Процент положительного и отрицательного совпадения результатов анализа слюны по сравнению с мазком из носоглотки составил 81,1% и 99,8% соответственно. Чувствительность увеличилась до 90,0% (95% ДИ: 74,4-96,5%) при рассмотрении только образцов с умеренной и высокой вирусной нагрузкой. Авторы пришли к выводу, что анализа слюны достаточно для выявления лиц с высокой вирусной нагрузкой в программе скрининга лиц с отсутствием симптомов COVID-19 не требующей сбора мазков и это может помочь улучшить добровольный скрининг для тех людей, которые не приемлют различные формы интраназальных манипуляций.

Чтобы лучше оценить клиническую ценность и характер выделения вирусной РНК в образцах слюны, Zhu J. et al., (2020) [60] дополнительно исследовали клинические характеристики слюны по сравнению с парными образцами из дыхательных путей в большей группе пациентов с COVID- 19 и проанализировали временное изменение вирусной нагрузки и ее корреляцию с тяжестью заболевания по слюне. По сравнению с образцами из дыхательных путей чувствительность и специфичность исследования слюны на присутствие SARS-CoV-2 составляли 86,4% и 97,0% соответственно. Анализ соответствия выявил 92,1% наблюдаемой точности обнаружения вируса и твердое согласие диагноза между респираторным трактом и образцом слюны (коэффициент Каппа Коэна 0,840, 95% ДИ 0,8050,874). Представленные авторами данные показали, что уровни РНК- SARS-CoV-2 в слюне достигли своего пика в течение одной недели после появления симптомов заболевания, а затем неуклонно снижались. 40% пациентов имели период выделения вируса в слюне более 14 дней. Это согласуется с предыдущими результатами анализа мазков из горла и мокроты [61], а также образцов слюны [35]. Продолжительное присутствие вирусной РНК SARS-CoV- 2 в образцах слюны не было связано с тяжестью заболевания (p = 0,535). Средняя вирусная нагрузка тяжелых случаев COVID- 19 не показала значимых отличий от легких случаев за весь указанный период. Паттерны клиренса вирусной РНК в образцах слюны также наблюдались аналогичным образом у пациентов с легкой и тяжелой формой COVID-19. Динамика выделения вирусной РНК в слюне, которая наблюдалась у пациентов с COVID-19 легкой и тяжелой степени тяжести, отличалась от той, которая была представлена в мазках из носоглотки NPS. Пациенты с более тяжелой формой заболевания имели более высокую вирусную нагрузку. Это свидетельствует о клинической значимости показателей вирусной РНК SARS-CoV-2 слюны у стационарных пациентов [62]. Это могло быть связано с длительным присутствием вирусной РНК SARS-CoV-2 в образцах слюны, тогда как мазки из носоглотки со временем стали отрицательными [63,64]. В исследовании, проведенном с участием 891 подозреваемого на COVID-19, поступивших последовательно в больницы АльСабах, Джабер и Альрази (Кувейт) было проанализировано восемьсот девяносто одна пара проб NPS и образцов слюны [65]. Результаты показали, что тест ОТ-ПЦР слюны продемонстрировал высокую чувствительность (83,43%) и специфичность (96,71%) и сопоставимые характеристики с текущим стандартом мазка из носоглотки. Эти данные согласуются с предыдущим исследованием (чувствительность и специфичность ОТ-ПЦР образца слюны составляют 84,2% и 98,9% соответственно) [66]. Кроме того, в недавнем метаанализе чувствительность к SARS-CoV-2 составляла 91% (95% ДИ, 80-99%) и 98% (95% ДИ, 89-100%) для слюны и образцов NPS, соответственно. [67]. Интересно, что не выявлено существенной разницы в чувствительности и специфичности тестов на основе слюны и NPS для 11 различных вирусных респираторных инфекций, включая коронавирусы [68].

Большинство исследований по обнаружению вирусной РНК в слюне проводилось с привлечением пациентов с COVID-19 или лиц с подозрительными симптомами, в то время как только несколько исследований включали когорты бессимптомных пациентов. Результаты, относящиеся к этой группе, были противоречивыми. Хотя в некоторых исследованиях сообщалось о более низкой чувствительности слюны в группе бессимптомных лиц [69,46], другие исследователи, напротив, подчеркивали клиническую полезность ротовой жидкости для выявления SARS -CoV-2 в этой группе населения [70,71]. В недавнем исследовании по данным тестирования слюны выявлены бессимптомные носители SARS-CoV-2 среди медицинских работников, имевших отрицательный результат аналогичного тестирования NPS [3]. Однако не все диагностические тесты подходят для саливадиагностики COVID-19 в любых условиях. Хотя рОТ-ПЦР представляет собой эталонный стандарт для молекулярной диагностики образцов слюны, время, необходимое для анализа, ограничивает его применение в программе массового скрининга. Таким образом, этот метод следует рассматривать в качестве предпочтительного теста в больницах для стационарных пациентов с COVID-19 или для подтверждения положительного диагноза, установленного тестами с использованием других образцов, особенно в случаях, дающих подозрение на ложноотрицательные результаты при анализе мазков из носоглотки. Прямая рОТ-ПИР без выделения РНК может использоваться в качестве предварительного анализа для скрининга пациентов с подозрением на COVID-19 при поступлении в отделение неотложной помощи, где необходимо быстрое получение определенных результатов, что снижает риск заражения персонала. Саливадиагностика COVID-19 представляет собой также действенный и полезный инструмент в местах оказания медицинской помощи для врачей, которые лечат пациентов вне больницы, например, в кабинете терапевта. В этом контексте технология прямой рОТ-ПЦР должна обеспечивать результаты в течение 30-60 минут и выполняться неспециализированным медицинским персоналом, а устройства должны быть простыми в использовании и портативными.

В нескольких исследованиях сообщалось, что в период выздоровления образцы мазков из носоглотки показали более высокую чувствительность для SARS-CoV-2, выявляемого методом рОТ-ПЦР, чем слюна [41,27]. Skolimowska K., et al., (2020) [72] сравнили результаты полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, полученные при исследовании образцов мазков из ротоглотки / носоглотки со слюной. Авторы обнаружили, что слюна имела чувствительность 83,3% и специфичность 99,1% и заключили, что исследование слюны характеризуется отрицательной прогностической ценностью. Во временном профиле пик вирусной нагрузки слюны выявлен в течение первой недели появления симптомов, а затем этот показатель снизился. Эта группа также обнаружила РНК SARS-CoV-2 в слюне после лечения. Даже при использовании антител против SARS-CoV-2 вирусная РНК все еще может быть обнаружена в течение 20 дней или даже дольше в образцах слюны из глубокого горла у трети включенных пациентов, что позволяет предположить, что вирусная РНК может оставаться в течение длительного периода времени вместо того, чтобы исчезнуть после применение антител. Это позволяет предположить, что низкие уровни РНК SARS-CoV-2 могут выделяться со слюной даже после клинического выздоровления [35].

В других исследованиях сообщалось о положительных на SARS-CoV-2 пробах слюны одновременно с отрицательными результатами такого же тестирования образцов NPS. Причины, лежащие в основе этого расхождения результатов, остаются неясными и могут быть связаны с несколькими факторами, включая неправильное выполнение процедуры забора NPS или различные варианты вирусного и клинического течения инфекции. Опубликованные данные предполагают, что комбинация образцов слюны и респираторных проб в условиях больницы может повысить общую чувствительность и снизить количество ложноотрицательных результатов. Следует учитывать то, что некоторые пациенты с COVID- 19 могут иметь отрицательный результат на SARS-CoV-2 по анализу NPS, в то время как образец их слюны является и остается положительным при тестировании с помощью рОТ- ПЦР [63]. Этот факт поднимает вопрос о том, действительно ли все пациенты, показавшие 2 последовательных отрицательных теста на SARS-CoV-2 по анализу NPS не заразны.

Выявление в ротовой жидкости (слюне) антигенов SARS-CoV-2

Экспресс-тест на антиген - это метод, который обнаруживает присутствие антигена т. е. вирусного белка на его поверхности. Это отличает его от других медицинских тестов, которые обнаруживают антитела (тесты на антитела) или нуклеиновые кислоты (молекулярные тесты). В отличие от серологических тестов, тест на антиген не может выдать предполагаемый иммунный паспорт, так как он не определяет наличие специфических антител IgG и / или IgM против SARS-CoV-2. Он просто определяет наличие вируса прямо в момент анализа. Эта особенность объясняет его пригодность в программе массового скрининга. Для достижения этой цели любой тест на антиген должен иметь возможность широко использоваться на целевой территории, а также быть легко применяемым, как медицинским, так и немедицинским персоналом и иметь приемлемую цену. В Российской Федерации зарегистрирован один из лучших в классе быстрых тестов на наличие антигена к новому коронавирусу - One Step SARS-CoV-2 Antigen Rapid Test Biocredit (RapiGEN, Южная Корея). Это исследование выявляет непосредственно белковые антигенные структуры вируса в биологическом материале методами иммунохроматографии, показывая в течение 5-10 минут с высокой вероятностью, инфицирован ли человек в данное время и является ли он источником инфицирования для других людей. Необходимо понимать, что исследование антигенов SARS-CoV-2 не может полностью заменить методы молекулярной диагностики (ПЦР), однако является важной скрининговой опцией, особенно при использовании в комбинации с тестом на ранние антитела (IgM).