Влияние многократной гипотермии 30°с на свободно-радикальные процессы в крови крыс

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Дагестанский государственный университет»

Биологический факультет

Магистерская диссертация

по направлению магистратура 020400.68 - «Биология»

студента 2 года обучения

Влияние многократной гипотермии 30°с на свободно-радикальные процессы в крови крыс

Абдулжалилова Джамиля Ахмедхановна

Махачкала - 2013

Содержание

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Свободно-радикальные процессы в живых организмах

1.2 Влияние многократной гипотермии на повышение устойчивости к холодовому стрессу

2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

2.2 Постановка экспериментов

2.2.1 Искусственное охлаждение животных

2.2.2 Многократная гипотермия

2.3 Препаративные методы исследования

2.3.1 Получение плазмы крови и эритроцитов

2.4 Биохимические методы исследования

2.4.1 Определение содержания ТБК-активных продуктов в плазме крови

2.4.2 Определение содержания ТБК-активных продуктов в эритроцитах крови

2.4.3 Определение окислительной модификации белков плазмы крови

2.4.4 Определение содержания белка в плазме крови

2.4.5 Определение содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах

2.5 Статистическая обработка результатов

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в плазме крови и эритроцитах крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности

3.2 Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности

3.3 Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс при многократной гипотермии

Заключение

Выводы

Литература

Список сокращений

радикальный гипотермия крыса липид

АДФ - аденозиндифосфат

АОА - антиокислительная активность

АОЗ - антиоксидантная защита

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНФГ - 2,4 - динитрофенилгидразин

ДТНБ - 5,5' - дитио-бис (2 нитробензойная кислота)

МДА - малоновый диальдегид

МКО - металлкатализируемое окисление

НЭЖК - неэстерифицированные жирные кислоты

ОМБ - окислительная модификация белков

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СРП - свободно-радикальные процессы

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат натрия

Введение

Актуальность проблемы. Температура тела является важным фактором, определяющим постоянство скорости физиологических процессов - одно из важнейших условий жизнедеятельности организма. Проблема адаптации к холоду является одной из важнейших проблем современной биологической науки (Барбараш, 1996; Гасангаджиева, 1999; Ахалая и др., 2006).

Гипотермия широко используется в различных областях медицины и экспериментальной биологии, поскольку способствует снижению потребления кислорода тканями и устраняет влияние гипоксии и ишемии (Эмирбеков, Львова, 1985; Lei et al., 1994; Ooboshi, et al., 2000; Polderman, 2009). Кроме того, для развития повышенной сопротивляемости организма в медицине используется метод холодового закаливания, который применяется для лечения, реабилитации и укрепления здоровья (Меерсон, 1993; Барбараш, 1996). Следовательно, изучение молекулярных механизмов влияние низкой температуры на теплокровный организм является одной из важных медико-биологических проблем.

Однако гипотермия, особенно начальные ее периоды, сопровождаются увеличением скорости свободно-радикальных процессов (Дорохина, Зинчук, 2000; Erecinska et al., 2003). Об этом свидетельствуют данные по активации процессов ПОЛ различных тканей при умеренной гипотермии (Василькова, Кухта, 1988; Львова и др., 1993). Эти исследователи отметили важную роль активации процессов ПОЛ в развитии патологии при гипотермии. Вместе с тем существуют данные, свидетельствующие о том, что под действием АФК окисляются в первую очередь не липиды, а аминокислотные остатки белков, приводящие к их окислительной модификации (Дубинина, Шугалей, 1993; Davies, 1987). Проявлению повреждающего действия свободных радикалов препятствует антиоксидантная система, которая связывает и модифицирует активные кислородные метаболиты.

В литературе имеются экспериментальные данные по адаптации к сильному постоянному холодовому стрессу на некоторые компоненты анти-оксидантной системы в отдельных органах (Бородин и др., 1992; Дорошенко, 1995). Однако отсутствуют данные по интенсивности свободно-радикальных процессов при адаптации к прерывистому холодовому воздействию в динамике гипотермии разной глубины и длительности.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование интенсивности свободно-радикальных процессов в крови крыс при многократной умеренной гипотермии 30°С.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. изучить интенсивность перекисного окисления липидов в крови крыс по содержанию МДА в плазме крови и эритроцитах;

2. изучить интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови крыс по анализу карбонильных групп;

3. исследовать содержание глутатиона в эритроцитах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Однократная умеренная (30°С) гипотермия активируют процессы перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в крови крыс. Однократная глубокая (20°С) гипотермия, напротив, снижает окислительную модификацию липидов и белков.

2. При однократной умеренной гипотермии содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс снижается относительно контроля. При углублении гипотермии содержание глутатиона увеличивается.

3. Умеренная (30°С) гипотермия после многократной умеренной гипотермии приводит к снижению содержания МДА в плазме и эритроцитах. Глубокая (20°С) гипотермия после многократной умеренной гипотермии существенно не влияет на уровень МДА относительно однократной глубокой гипотермии.

4. Умеренная (30°С) и глубокая (20°С) гипотермия после многократной умеренной гипотермии приводят к снижению как исходного уровня карбонильных групп белков плазмы крови, так и прироста карбонильных групп в белках за 15 минут инкубации в среде Фентона.

5. Гипотермия 30°С после многократной умеренной гипотермии приводит к увеличению содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс. При глубокой гипотермии после многократной умеренной гипотермии содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс имеет тенденцию к снижению.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведен анализ интенсивности процессов перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и содержания глутатиона в крови крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности.

Установлено, что интенсивность процессов свободно-радикального окисления липидов и белков зависит от уровня гипотермии. Многократная умеренная гипотермия снижает окислительные повреждения макромолекул относительно однократной гипотермии.

Выявлено, что содержание восстановленного глутатиона коррелирует с интенсивностью свободно-радикальных процессов на разных этапах гипотермии.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярных механизмов действия низких температур на теплокровный организм и формирования адаптационных механизмов к периодическому действию холода. Результаты работы указывают на возможность применения адаптации к холоду в системе лечебных и профилактических мероприятий. Практическая значимость данной работы определяется перспективностью использования ряда изученных показателей для оценки состояния организма, адаптированного к холоду, перенесшего гипотермию.

Публикации. По материалам диссертации опубликована одна работа.

Результаты работы были доложены на Студенческой научно-теоретической конференции по приоритетным направлениям науки и техники, проходившей 25 апреля 2013 г. в г. Махачкала.

1. Обзор литературы

1.1 Свободно-радикальные процессы в живых организмах

Для высших форм жизни очень важно наличие в среде обитания молекул кислорода, реакция восстановления которого до Н₂О составляет основу биоэнергетики человека и животных (Ленинджер, 1985; Баблоянц, 1990).

Однако повышение концентрации О₂ в среде выше уровня, характерного для атмосферного воздуха, является для них токсическим. Степень токсичности зависит от вида организмов, а также от многих других факторов. Токсические эффекты кислорода определяются не им самим, а разнообразными кислородными радикалами, которые образуются в тканях. Эти радикалы образуются в клетках, как в результате нормальных метаболических реакций, так и вследствие нарушения их снабжения кислородом (Скулачёв, 1998).

Реакционноспособные формы молекулярного кислорода включают соединения нерадикальной природы: синглетный кислород и перекись водорода (Н₂О₂), озон (О₃) а также суперокисные (О₂), пергидроксильные (·О₂Н) и гидроксильные (НО·), алкоксильные (RO·), нитрорадикальные (NO·), гипохлоритные (·ОСl) радикалы (Арчаков, Мохосоев, 1989; Меньщикова, Зенков, 1997; Fridovich, 1998; Bomzon, Ljubuncic, 2001; Kowaltowski et al., 2001; Dalle-Donne et al., 2003).

Основным источником этих радикалов является утечка электронов из дыхательной цепи митохондрий на участке коэнзим Q - цитохром b, особенно при низкой концентрации АДФ (Turrens, 2003), хлоропластов и эндоплазматического ретикулума (Кулинский, 1999; Dean et al., 1997); а также катаболизм катехоламинов (Babior, 1997), детоксикация ксенобиотиков за счёт цитохрома Р-450, различные метаболические пути арахидоновой кислоты (Владимиров, 1989; Hermes-Lima et al., 1998; Zwart et al., 1999).

Экзогенные факторы также могут делать вклад в генерацию активных форм кислорода - УФ-свет, радиация или температура (Merker et al., 2001). УФ-свет может приводить к образованию синглетного кислорода и других АФК в коже. Атмосферные поллютанты, такие как NO₂, приводят к образованию радикалов и истощению антиоксидантов в бронхоальвеолярной жидкости, что приводит к респираторным заболеваниям. Различные ксенобиотики (параквот, парацетамол, блеомицин и антрациклин) также являются причиной повреждения тканей, как следствия генерации свободных радикалов (Журавлев, 2007; Fiskum et al., 2004).

АФК различаются по продолжительности их существования и активности. Наиболее короткоживущими (t = 7•10^-10c) и соответственно реакционноспособными являются гидроксильные радикалы, которые могут оказывать своё окислительное действие только в месте их образования. Гидроксильный радикал очень токсичен для биологических систем: он может разрывать любую С-Н- и С-С-связь, вызывать повреждение ДНК и других клеточных структур, индуцировать образование органических радикалов (Дубинина, Шугалей, 1993; Зенков, Меньщикова, 1993).

Гидроксилрадикалы образуются в реакции Фентона - реакции распада Н₂О₂ под действием металлов переменной валентности в восстановленном состоянии (Dean et al., 1997; Lloyd et al., 1997; Meneghini, 1997; Hermes-Lima et al., 1998):

Н₂О₂ + Fe²⁺ Fe³⁺ + яOH + ^-OH

Ещё одним путём формирования гидроксильных радикалов является реакция Габера-Вейса, катализируемая ионами переходных металлов в окисленном состоянии:

О₂ + Fe³⁺ Fe²⁺ + O₂

Fe²⁺ + H₂O₂ Fe³⁺ + яOH + ^-OH

О₂ + H₂O₂ яOH + ^-OH + O₂

Образование яOH в организме происходит в присутствии комплексных солей Fe и Cu, О₂ и H₂O₂ (Fridovich, 1998; Hermes-Lima et al., 1998; Merker et al., 2001; Young, Woodside, 2001). Однако интенсивность этого процесса незначительна. При патологии вероятность образования яОН резко возрастает (Дубинина, 1989).

ОН - высокоэнергетический оксидант, который атакует большинство органических компонентов в условиях, ограниченных диффузией (Fridovich, 1998). Константа скорости окисления липидов для яОН составляет 10^-9М^-1с^-1, что в 106 раз выше, чем для супероксид анион-радикала (Чеснокова и др., 2007).

Синглетный кислород (О₂^№) менее активен. Концентрация О₂^№ в клетках невелика, не превышает 10^-6 М, что объясняется низким выходом кислорода в синглетном состоянии и малым временем его жизни в биологических субстратах (t = 2-5•10^-6c). Тем не менее, синглетный кислород тоже характеризуется высокой реакционной способностью, легко вступает в окислительные реакции с органическими соединениями (Арчаков, Мохосоев, 1989; Зенков, Меньщикова, 1993).

В качестве основного продукта синглетный кислород ^/О₂ может образовываться лишь в фотохимических реакциях, связанных с возбуждением пигментов, таких как хлорофилл, ретиналь, флавины, порфирины (Арчаков, Мохосоев, 1989). В качестве побочного продукта синглетный кислород был обнаружен в ряде реакций (реакция разложения Н₂О₂, перекисного окисления липидов в микросомах, биосинтез простагландинов) (Fridovich, 1998).

Супероксидный анион-радикал (О₂) является первичным интермедиатом ионно-радикального окисления, сопряженного с образованием активных свободных радикалов ОНя, ROOя, Rя. O₂ образуется в ходе одноэлектронного восстановления кислорода ферментами в процессе транспорта электронов по дыхательной цепи и редокс-системе эндоплазматического ретикулума, а также при аутоокислении различных внутриклеточных компонентов - оксигемоглобина (NADPH), глутатиона, флавинов, цитохрома c, аскорбиновой кислоты, адреналина и др.:

O₂ + з O₂

В живых системах О₂ представляет собой промежуточный продукт многих биохимических реакций, таких как окисление тиолов, флавинов, хинонов, катехоламинов, птеринов, а также метаболизма ксенобиотиков (Соколовский, 1988; Меньщикова, Зенков, 1997).

В тканях О₂ генерируется: при неферментативном спонтанном самоокислении ряда химических соединений, особенно при наличии в их составе металлов переменной валентности; как основной или побочный продукт при ферментативных окислительно-восстановительных реакциях, протекающих в присутствии О₂; при так называемом «дыхательном взрыве» в процессе фагоцитоза (Дубинина, 1989; Зенков, Меньщикова, 1993).

В клетке содержится незначительное количество О₂ (10^-12 -10^-11 М). В митохондриях же печени крысы содержится 0,83·10^-10 М О₂, а в митохондрии сердца - 1,51·10^-10 М О₂ (Cadenas, Davies, 2000). Таким образом, генерация О₂ митохондриями - важный внутриклеточный источник радикалов кислорода.

Сам по себе О₂ мало активен по сравнению с другими радикалами, является скорее восстанавливающим, чем окисляющим агентом (Логинов, Матюшин, 1996), но в биологических системах он может превращаться в другие, более активные, виды, такие как пероксил (ROO·), алкоксил (RO·) и гидроксил (НО·) радикалы (Dean et al., 1997; Fiskum et al., 2004). В водной среде О₂ может нейтрализоваться спонтанно, этот процесс сопровождается появлением синглетного кислорода.

Перекись водорода (Н₂О₂) относится к окислителям средней силы. В отсутствии ферментов, разрушающих её, она относительно стабильна и может мигрировать в клетки и ткани. В живых организмах основным источником Н₂О₂ являются ферментативные реакции с оксидазами: ксантиноксида-зой, оксидазой L-аминокислот и другими. Вторично Н₂О₂ образуется в результате реакции дисмутации, катализируемой супероксиддисмутазой.

2 О₂+ 2Н⁺ Н₂О₂ + О₂

Около 80% Н₂О₂, генерируемой фагоцитами в очаге воспаления, образуется в результате дисмутации супероксидного анион-радикала супероксиддисмутазой (Меньшикова, Зенков, 1997).

Н₂О₂ как более гидрофобное (по сравнению с О₂) соединение легко покидает клетку. В противном случае она атакуется каталазой или пероксидазой, в результате чего превращается в воду (Young, Woodside, 2001).

Н₂О₂ сама по себе является очень слабым окислителем, который может повреждать белки и ферменты, содержащие активные тиоловые группы (Young, Woodside, 2001) и проявляет своё окислительное действие только в присутствии катализаторов (Дубинина, 1989). Перекись водорода оказывает ограниченное повреждающее действие, вызывая, в частности, нарушение гомеостаза Ca²⁺ в клетке (Чеснокова и др., 2007). Однако токсичность Н₂О₂ резко возрастает в присутствии металлов переменной валентности, что объясняется ускорением образования яОН.

Н₂О₂ и О₂ служат непосредственными предшественниками радикала яОН, наиболее опасного из продуктов реакций (Young, Woodside, 2001; Fiskum et al., 2004).

Важная роль в образовании реакционноспособных радикалов принадлежит NOя-радикалам. Образование NO-радикала эндотелиальными клетками является важным компонентом физиологической регуляции сосудов и предупреждения тромбообразования (Меньщикова и др., 1997). Другим эффективным источником NOя является NO-синтаза, содержащаяся в фагоцитах, нейронах, фибробластах гладкомышечных клеток, гепатоцитах, кардиомиоцитах, хондроцитах, в-клетках поджелудочной железы (Patel et al., 1999; Lee et al., 2000).

Физиологическая концентрация NO-радикала в тканях составляет 1-10 нМ (Murphy, 1999). NO-радикал относительно стабилен (время жизни составляет несколько секунд) и способен проникать через клеточные мембраны (Болдырев, 2001; Radi et al., 2002). Цитотоксическое действие NO обусловлено его реакцией с супероксидом:

NOя + О₂+ Н⁺ ONOOH

Реакция протекает очень быстро и ограничивается уровнем диффузии (2·10⁹ м^-1s^-1) (Lee et al., 2000). Среднее время жизни ONOOЇ составляет 1-2 с, поэтому он может мигрировать в тканях (Меньщикова и др., 2000). Пероксинитрит - потенциальный оксидант, который может атаковать множество различных биологических молекул (Lee et al., 2000; Valdez et al., 2000).

Пероксинитрит - сильный окислитель, способный окислять NH- и SH-группы белков, гидроксилировать и нитрировать ароматические кольца (в частности тирозина). ONOO? способен индуцировать процессы ПОЛ в мембранах, вызывать однонитевые разрывы в ДНК. Существенный вклад в цитогенетическое действие пероксинитрита вносит образующийся из него в результате нефентоновской реакции, при пониженном pH OHя-радикал. Так как данная реакция не требует участия металлов переменной валентности, содержание которых в клетках в свободном виде ограничено, а скорость взаимодействия О₂ с NOя выше, чем с СОД, то считают, что это одна из основных клеточных реакций, приводящих к образованию гидроксильного радикала (Меньщиков, Зенков, 1997):

ONOO? +H⁺> ONOOH>HOя + NO₂ (выход 20-30%).

Таким образом, свободные радикалы являются высокореакционными, быстро превращающимися друг в друга веществами. Кроме того, АФК участвуют в регуляции различных процессов в тканях, включая рост клеток, апоптоз, клеточную адгезию. Оксиданты, выступая в качестве вторичных мессенджеров, стимулируют фосфорилирование белков. АФК стимулируют накопление в клетке вторичных посредников - циклонуклеотидов (цАМФ и цГМФ), при этом последний образуется в результате активации NОя (но не другими АФК) гиалоплазматической гуанилциклазы. АФК вызывают накопление ионов Са²⁺ в цитозоле и стимуляцию фосфорилирования белков в результате активации протеинкиназ (особенно протеинкиназы С) и протеинтирозинкиназ и ингибирования протеинфосфатаз; активируют белок Ras, играющий важную роль в передаче сигналов в ядро клетки (Турпаев, 2002; Droge, 2002).

Клетки организма постоянно поддерживают такой баланс процессов образования и дезактивации АФК, при которых их концентрация находится на низком, но всегда отличном от нуля уровне.

Реакционная способность АФК может меняться в зависимости от места их генерации. Так, активность супероксид анион-радикала возрастает в гидрофобном окружении. Биологическая активность АФК связана с синтезом простагландинов, лейкотриенов, тромбоксанов, а также с окислительной модификацией белков, нуклеиновых кислот, липидов (Дубинина, Шугалей, 1993; Ляхович и др., 2005).

Несмотря на короткий срок жизни (от ~8•10^-9 до ~1•10^-6с) АФК успевают запустить цепные реакции окисления субстратов, среди которых наиболее известными являются липиды. Эти реакции приводят к образованию органических (Rя), алкоксильных (ROя) и перекисных (ROOя) радикалов (Zwart et al., 1999). Процессы ПОЛ протекают во всех клетках живых организмов (Zwart et al., 1999).

Радикальные реакции ПОЛ протекают, главным образом, в липидных структурах мембран. Основным субстратом ПОЛ являются ненасыщенные жирные кислоты. Чем больше ненасыщенность кислот, тем больше скорость их окисления. Особенно хорошо перекисному окислению подвергаются арахидоновая и линоленовая кислоты, важнейшие компоненты фосфолипидов биологических мембран, что сопровождается образованием группы радикальных продуктов - Rя, ROя, ROOя, цитотоксических альдегидов типа 4-гидрокси - 2,3 - транс-ноненаль или менее токсичных, как малоновый диальдегид (МДА) (Dean et al., 1997; Zwart et al., 1999; Dalle-Donne et al., 2003), изменение содержания которого служит основным показателем интенсивности ПОЛ (Kikugawa, Kosugi, 1993).

Следует отметить, что гидроперекиси липидов (ROOH) теряют свою стабильность в присутствии Fe²⁺, распадаясь с образованием радикалов RO· и OH·. При дальнейшей окислительной дегенерации RO· в клетке образуются высокотоксичные продукты ПОЛ - альдегиды, кетоны, спирты, накопление которых приводит к повреждению и гибели клеток (Чеснокова и др., 2007).

Образующиеся в результате активации ПОЛ перекисные соединения органической и неорганической природы способствуют возникновению последовательных изменений физико-химических свойств мембран, которые начинаются с перестройки липид-липидных и липид-белковых взаимодействий в бислое (Белоус, Бондаренко, 1982; Соколовский, 1988) и завершаются биохимической патологией клетки, нарушением процессов активного и пассивного транспорта, активацией лизосомальных гидролаз, снижением активности мембранных ферментов, появлением дефектов мембран и пр. (Эмирбеков, Львова, 1985; Эмирбеков и др., 1991).

Процессы ПОЛ протекают во всех клетках, однако, наиболее мощными генераторами свободных радикалов являются лейкоциты, тромбоциты, гепатоциты (Голиков и др., 2003).

В организме ПОЛ имеет большое значение для обновления липидов мембран клеток и для поддержания структурного гомеостаза. Накопление активных радикалов кислорода в органах и тканях приводит к нарушению структурной и функциональной организации клеточных мембран, их проницаемости, ионному дисбалансу, повреждению ДНК, мутациям и нарушению биосинтеза белка, разобщению окислительного фосфорилирования и окислению SH-групп белков, образованию стабильных реактивных комплексов с витаминами, гормонами, лекарствами (Дубинина, 1989; Болдырев, 1995; Пескин, 1996; Коган и др., 1997).

При окислительном стрессе радикальной атаке активными формами кислорода подвергаются в первую очередь клеточные белки (Вьюшина и др., 2002; Чечет и др., 2010; Griffiths, 2000). Более того, в литературе встречаются указания о большей чувствительности белков к свободно-радикальному окислению, чем липидов (Рагино др., 2006; Швец, 2008). Специфика окислительной модификации белков (ОМБ) определяется особенностью аминокислотного состава и уникальной структурной организацией биомолекул (Дубинина, Шугалей, 1993).

Свободные радикалы кислорода и азота могут воздействовать на каждый уровень белковой структуры (от первичной до четвертичной, если белок мультимерный) (Giulivi, Davies, 1993). Любое влияние АФК на белки различного типа приводит к сложным окислительным модификациям в структуре белковой молекулы и её физико-химических и биологических свойств (Merker et al., 2001).

Взаимодействуя с белками, АФК снижают уровень мономеров, образуют продукты белковой интеграции и липопротеиновые комплексы. Образование межмолекулярных белковых сшивок скорее всего не связано с окислением сульфгидрильных групп, а обусловлено соединениями типа альдегидов, выступающих в качестве сшивающих агентов. Степень устойчивости белков к цитопатогенному воздействию АФК зависит от аминокислотного состава белка, причем наиболее чувствительны циклические и серосодержащие аминокислоты, в частности, цистеин и цистин, а наиболее устойчивы - пролин и оксипролин. Однако под действием HO· - радикалов гидролизируются и устойчивые белки (Чеснокова и др., 2007).

В процессе окисления белков часто возникают новые функциональные группы, такие как гидроксилы и карбонилы, которые вносят вклад в изменение функций белков (Griffiths, 2000).

Характер ОМБ зависит от типа АФК (Дубинина, Шугалей, 1993). Так, радикал ОНя чаще всего вызывает агрегацию белков, а в комбинации с О₂ или О₂ - фрагментацию (Davies, 1987). В первом случае образуются ковалентно-связанные белковые агрегаты в виде высокомолекулярных форм - димеров, тримеров и даже тетрамеров (Дубинина, Шугалей, 1993). Ароматические и серосодержащие аминокислотные остатки служат мишенью для атаки со стороны ОНя, что сопровождается их необратимыми изменениями (Dean et al., 1997).

Модификация белков инициируется главным образом реакциями с яОН, ход окислительного процесса детерминируется доступностью О₂ и О₂ или их протонированных форм (НО₂я) (Berlett, Stadtman, 1997).

В настоящее время предложены следующие механизмы ОМБ. Первый механизм ОМБ - конъюгация липидных пероксидов с аминокислотными остатками гистидина, цистеина и лизина в белках. Второй механизм - окисление при участии АФК с образованием карбонильных производных, а также дисульфидов Cys-S-S-Cys, цистеин-сульфеновой (SO), - сульфиновой (SO^2-) или - сульфоновой (SO^3-) кислот, сульфоксида метионина (MetSO). В последнее время к ОМБ предложено относить и гликирование, и гликоксидацию лизиновых и аспарагиновых остатков (Муравлева и др. 2010).

Процессу агрегации белков предшествует процесс образования радикальных продуктов под влиянием АФК (преимущественно ОНя) в различных структурных компонентах биомолекул, что повышает их склонность к агрегации. Структурными участками сложных белков, подвергающихся модификациям, могут быть углеводные, нуклеотидные, серосодержащие и другие фрагменты биомолекул (Дубинина, Шугалей, 1993).

Образование 90% агрегатов белков при действии ОНя обусловлено межмолекулярным образованием битирозина (Davies, 1997), который представляет собой ковалентный бифенол, возникший в результате реакции радикалов тирозина (двух) или тирозила и молекулы тирозина через бифенольные компоненты различной стабильности. Поскольку битирозин чаще участвует в образовании связей между белковыми молекулами, это может быть одним из важных факторов агрегации белков под действием АФК.

Менее 10% исследуемых белков образуют агрегаты за счет дисульфидных или не ковалентных связей (Davies, 1997).

Процесс фрагментации белка под влиянием ОНя и О₂ или О₂ связан с отщеплением Н⁺ от б-карбонильной группы аминокислот за счет ОНя и образованием в дальнейшем при взаимодействии с О₂или О₂ перекисных соединений. Распад образующихся перекисных соединений при б-карбонильных группах рассматривается как один из возможных механизмов этого процесса (Stadtman, 1990; Dean et al., 1997):

RCONHC(R') HCONHR'' > RCONH₂ + R'COCNHR''

В физиологических условиях и при патологических состояниях разной интенсивности может протекать металлкатализируемое окисление (МКО) белков, затрагивающее ту часть белковой молекулы, которая участвует в связывании таких металлов переменной валентности как Fe, Cu (Дубинина, 1998; Stadtman, 1990; Meucci et al., 1991; Dean et al., 1997; Fridovich, 1998). В этих системах должен присутствовать донатор электронов, который участвует в восстановлении О₂ в Н₂О₂ и Fe³⁺ в Fe²⁺. Этот процесс может протекать либо по двухэлектронному пути с образованием Н₂О₂, либо по одноэлектронному пути с генерацией в начале О₂ и последующей дисмутацией до Н₂О₂. Соответственно и восстановление металлов, в частности Fe³⁺ и Fe²⁺ может проходить непосредственно за счет донаторов электронов, либо через промежуточное образование радикала О₂. Последний взаимодействует с Fe³⁺ и дает Fe²⁺ и O₂ (Dean et al., 1997; Zwart et al., 1999; Fridovich, 1998). Ион Fe²⁺ фиксируется на металлсвязывающей поверхности белка. Комплекс белок-Fe²⁺ реагирует с Н₂О₂ и генерирует in situ радикал ОНя:

ОНя в последующем и вызывает окислительную модификацию аминокислотного остатка при металлсвязывающем участке белка. Это приводит к превращению отдельных аминокислотных остатков ферментов в карбонил-производные, их дезаминированию, потере белком каталитической активности и повышению чувствительности к протеолитической деградации (Дубинина, Шугалей, 1993, Stadtman, 1990). Установлено, что особенно чувствительны к МКО пролин, гистидин, аргинин и лизин. (Дубинина, Шугалей, 1993; Stadtman, 1990). Таким образом, МКО представляет собой местный специфический процесс, обусловленный взаимодействием Н₂О₂ и Fe²⁺ на металлсвязывающей поверхности белка.

Ещё одним механизмом ОМБ является образование гидропероксидов белков. С. Гебицки и Я.М. Гебицки (Gebicki, Gebicki, 1993) впервые обнаружили образование перекисных соединений при действии АФК на аминокислоты, а позднее был предложен механизм этого процесса (Gebicki, 1997; Griffiths, 2000):

PrH + O_x Prя + восстановленный О₂ (1)

Prя + O₂ PrOOя (2)

PrOOя + з PrOO? (3)

PrOO^- + H⁺ PrOOH (4)

PrOOя+ PrH PrOOH + Prя (5)

Prя - радикал, образующийся при отщеплении Н от -углеродного атома, его продолжительности существования достаточно для осуществления второй реакции. Донор з в реакции (3) неизвестен, но существует предположение, что з может отдавать О₂. Реакция (5) может осуществляться в результате отщепления Н от другой части молекулы белка радикалом PrOOя (Gebicki, 1997).

Способность аминокислот к окислению определяется не только их чувствительностью, но и местом локализации. Так, в случае -радиации основным воздействующим радикалом является ОНя, который в силу своего короткого периода жизни будет взаимодействовать только с первой поверхностной группой. Перекисное окисление белков в ряде случаев (для растворимых белков) может выполнять и антиоксидантные функции.

Модификация белков может так же происходить при взаимодействии с пероксинитритом. Пероксинитрит - анион, имеющий формулу ONOO^? Он образуется в результате реакции перекиси водорода с нитрит-ионом:

H₂O₂ + NO₂^? > ONOO^? + H₂O

Пероксинитрит является сильным окислителем. Благодаря своим свойствам он способен вызывать повреждения широкого спектра молекул в клетке, в том числе ДНК и белков. Образование пероксинитрита in vivo происходит в результате взаимодействия супероксид-иона и оксида азота:

^·O₂^? + ^·NO > ONO₂^?.

Мишенями пероксинитрита являются белки, имеющие в центре металл с переменной валентностью. Пероксинитрит таким образом, модифицирует белки, содержащие гем простетической группы, такие как гемоглобин, миоглобин, цитохром С. Особенно быстро пероксинитрит взаимодействует с железо-серными кластерами, инактивируя ферменты участвующие в метаболических процессах, в том числе митохондриальная аконитаза, фосфоглюконат дегидратаза.

Пероксинитрит так же воздействуют на аминокислоты: цистеин, тирозин, триптофан, метионин, гистидин (Pacher et al, 2007).

Карбонильные производные белков - это стабильные продукты, которые образуются при участии аминокислотных остатков пролина, аргинина, лизина, треонина с образованием аддуктов Михаэля. Также карбонильные производные белков могут образовываться при участии аминокислотных остатков лизина, цистеина и гистидина с продуктами перекисного окисления липидов. Причем карбонилирование аргинина и лизина сопровождается потерей одного или более атомов азота. Кроме этого, они могут образовываться в процессе гликирования / гликооксидации аминогрупп лизина. По мнению ряда исследователей, карбонильные производные формируются при металлкатализируемом окислении белков. Наиболее важным следствием ОМБ белков является инактивация ферментов. Например, альдегиды вызывают инактивацию мембранных транспортеров, таких, как Na⁺-K⁺-ATP-азы, транспортеров глюкозы в головном мозге, что приводит к нейродегенеративным расстройствам. (Муравлева и др., 2010).

Модификация белков делает их более чувствительными к протеолизу. Удаление модифицированных белков идет двумя механизмами: с помощью протеасом и протеаз.

Окисление ферментов является маркером оборота белков. Окисленные белки служат субстратом для протеолитических ферментов. Протеолитические ферменты быстрее расщепляют окисленные формы, чем нативные (Дубинина, 1998). Большинство общих протеаз деградирует окисленные белки значительно быстрее, чем неокисленные формы. Практически все ткани животных содержат мультикаталитическую протеиназу, которая деградирует окисленные формы ферментов, но имеет слабую способность или не способна деградировать их неокисленные формы (Stadtman, 1992).

Воздействие на ферменты или белки свободных радикалов кислорода in vitro увеличивает их чувствительность к деградации за счёт аденозин-5^/-трифосфат-независимых протеаз в экстрактах печени, митохондриях сердца и эритроцитах (Stadtman, 1992).

В цитозоле эукариот селективную деградацию белков осуществляют большие мультикаталитические комплексы с молекулярной массой около 2 млн - 26S-протеасомы (Ротанова, 2001; Merker et al., 2001). Мишенями 26S-протеасом являются белки, вовлеченные во многие внутриклеточные процессы (регуляция метаболизма, дифференцировка клеток, контроль клеточного цикла, ответ на стресс и др.) или дефектные белки, возникающие в результате мутаций или посттрансляционных повреждений (Iwai, 2003). 26S-протеасома - это сложный комлпекс, образованный 20S - протеасомой, играющей роль протеолитического ядра, и двумя регуляторными 19S - комплексами, которые обеспечивают проявление ферментативной активности и определяют субстратную специфичность 26S-комплекса (Merker et al., 2001). 20S-протеасома представляет собой цилиндрическую частицу и состоит из 4 кольцевых структур: 2 внешних б-кольца и 2 внутренних в-кольца, которые располагаются в порядке бввб. (Dahlmann et al., 2001; Kruger et al., 2001). Каждое кольцо состоит из 7 маленьких субъединиц (Dunlop et al., 2002; Iwai, 2003). в-субъединица имеет каталитические центры, которые располагаются на внутренней стороне цилиндра. Центр внешнего б-кольца закрыт, предотвращая вход в полость неродственного белка (Groll et al., 1997). Связывание регуляторной частицы с внешним б-кольцом 20S-протеасомы открывает центр кольца для субстратов, поступающих в цилиндр, и увеличивает активность протеаз (Voges et al., 1999).

In vitro 20S-протеасома обладает широким спектром пептидгиролазной активности. Каждое кольцо из семи в-субъединиц содержит три активных центра, проявляющих разную первичную специфичность: химотрипсино-, трипсино- и каспазоподобную, т.е. в белках-мишенях атакуются пептидные связи, образованные, соответственно, гидрофобными, положительно заряжёнными или дикарбоновыми аминокислотами (Ding, Keller, 2001). При этом каталитически активным остатком каждого из активных центров является N-концевой остаток треонина (Seemuller et al., 1996). Протеасома осуществляет процессивную деградацию белковых субстратов с образованием пептидных продуктов размером от 3 до 22 аминокислотных остатков (Kisselev et al., 1999). Длина и тип пептидов, генерируемых протеасомами, диктуются строением протеасомных субъединиц и близостью между отдельными протеолитическими сайтами (Ding, Keller, 2001). В последнее время обнаружен феномен аллостерической взаиморегуляции активных центров, обладающих различной специфичностью (Kisselev et al., 1999). Функционирует ли 20S-протеасома in vivo - неизвестно.

26S-протеасома образуется при АТФ-зависимой ассоциации 20S-протеасомы и регуляторного 19S-комплекса, включающего около 28 различных субъединиц (Kisselev et al., 1999). Этот комплекс обладает АТФазной активностью и выполняет функции селективного распознавания субстратов и взаимодействия с ними, активации пептидазной активности 20S-комплекса, обеспечения сборки полного 26S-комплекса и др. (Ротанова, 2001). 19S-комплекс содержит, по крайней мере, 6 различных АТФазных субъединиц, которые принадлежат к белкам ААА-типа. Роль этих субъединиц может заключаться в обеспечении взаимодействия с 20S-протеасомой и в ее активации, высвобождении полиубиквитиновых цепей и их гидролизе, поддержании структуры 26S-комплекса, взаимодействии с субстратами и их презентации 20S-протеасоме (Coux et al., 1996).

Сравнительно недавно высказано предположение, что развитие карбонилового стресса может происходить и в отсутствие избыточной генерации АФК, снижения антиоксидантной защиты (АОЗ) и уменьшения протеазной активности. Причем этот путь карбонилирования строго связан с продукцией абберантных белков, образующихся при нарушении трансляции, дефиците шаперонов, действии стресс-факторов, например, температуры и денатурирующих агентов. Образование карбониловых производных абберантных белков с нарушенным фолдингом необходимо для их деградации. По этому сценарию карбонилирование можно рассматривать как один из способов контроля качества фолдинга белков (Муравлева и др., 2010).

Протеолиз окислительно модифицированных белков 20S-протеасомой более эффективен после умеренного окислительного стресса, тогда как субстратное окислительное повреждение приводит к уменьшению протеолитической чувствительности (Giulivi, Davies, 2001).

Таким образом, селективный внутриклеточный протеолиз, осуществляемый АТФ-зависимыми протеиназами, обеспечивает контроль качества функциональных белков и поддержание необходимого уровня их в клетке.

В нормально функционирующем организме содержание радикальных продуктов ПОЛ регулируется за счет действия антиоксидантной защиты (АОЗ), которая обеспечивает поддержание их в определенном стационарном уровне, обеспечивающем обновление липидов, и, в первую очередь, липидов мембран, и поддержание структурного гомеостаза. Нарушение этого сбалансированного состояния между процессами ПОЛ и активностью АОЗ приводит к инициированию ПОЛ в биологических мембранах, что сопровождается расстройством функций клеток.

В процессе эволюции выработались ферментативная и неферментативная АОС. В качестве неферментативной АОС могут выступать: жирорастворимые антиоксиданты (витамин Е, в-каротин, убихиноны, лютеин и др.); водорастворимые (аскорбат, рутин, глутатион, пируват, мочевая кислота и др.). Гидрофобные антиоксиданты локализованы в биомембранах, гидрофильные - в цитозоле клетки (Журавлев, 2007; Poljak, Dahmane, 2003).

Ферментативная АОС включает: супероксиддисмутазу (СОД), катализирующую реакцию дисмутации О₂ в Н₂О₂, каталазу, разлагающую Н₂О₂, глутатионпероксидазу, глутатион-S-трансферазу, глюкозо-6 - фосфатдегидрогеназу, глутатионредуктазу, глутатионзависимые ферменты удаляют органические перекиси (Брискин, 2000; Poljak, Dahmane, 2003).

Защита живых организмов от окислительных повреждений не ограничивается рассмотренными выше антиоксидантными системами, а осуществляется так же большим количеством репарационных систем, специфическими протеолитическими ферментами; макрофагами и гепатоцитами, эффективно захватывающими окисленные липопротеины через специальные «скэвенджер-рецепторы». Это еще раз свидетельствует о важности и сложности окислительных процессов с участием АФК, протекающих в живом организме.

Регулирующие функции активного кислорода у здорового человека могут трансформироваться в их повреждающее влияние. Оно существенно при воздействии свободных радикалов на конформацию структурных и функциональных белков, на процессы образования биологически активных соединений, в том числе и гормонов.

Нарушение энергетического метаболизма, сопряженного с образованием АФК, приводит к изменению трансмембранных ионных потоков и накоплению внутриклеточного кальция. Одновременно развивается атака активными формами кислорода белков, липидов и нуклеиновых кислот, протекающая по механизму свободно-радикального окисления. Особую опасность реакции свободно-радикального окисления представляют для нервной ткани (Трофимова и др., 2007).

Процесс свободно-радикального окисления в настоящее время признан абсолютно универсальным и общебиологическим механизмом при развитии любого вида патологии.

1.2 Влияние многократной гипотермии на повышение устойчивости к холодовому стрессу

Одним из наиболее переменных факторов внешней среды, определяющих стабильность биоструктур и интенсивность биологических процессов, является температура. Температурный диапазон, на фоне которого происходит жизнь в естественных условиях существования, довольно широк. В умеренных широтах живые организмы, в том числе человек, часто подвергаются действию холодового стресса. Стресс предшествует приспособлению организма к новым экологическим условиям, это начальная стадия адаптации (Слоним, 1971; Озернюк, 1989).

Различают три главные стратегии температурной адаптации: пойкилотермия, гомойотермия, гетеротермия.

Гомойотермия способствовала интенсификации обмена веществ и сопровождалась прогрессивным развитием кровеносной, гормональной и нервной системы, особенно её высших отделов.

Истинные гомойотермы переносят колебания температуры тела лишь в узком диапазоне температур (38±4°С). Снижение температуры тела сопровождается минимализацией метаболизма в органах и тканях, что является одним из главных защитных механизмов выживания животных в условиях недостатка энергии и кислорода (Эмирбеков и др., 1985).

В длительном и многостадийном процессе адаптации организма к холоду принято различать три основных варианта терморегуляционного ответа: возрастание термогенеза, усиление термоизоляции и развитие гипотермии - снижение установочной точки. Их вклад не равнозначен и зависит от силы и длительности воздействия (Шабалина др., 1995).

При изменении температуры среды в организме гомойотермного незимоспящего животного развиваются как специфические терморегуляторные сдвиги, направленные на сохранение температурного гомеостаза, так и неспецифические стрессорные изменения, обусловленные действием температуры, как чрезвычайного раздражителя (Гурин, 1989).

Для поддержания постоянства температуры тела при холодовом воздействии у гомойотермных животных увеличивается теплопродукция за счет интенсификации окислительных процессов, частичного разобщения процессов окисления и фосфорилирования (Эмирбеков, Львова, 1985; Кулинский, Ольховский, 1992; Erecinska et al., 2003). Активация окислительных процессов - важнейшее звено биохимической терморегуляции у теплокровных животных, которое включает интенсификацию не только реакций окисления субстратов дыхания в дыхательной цепи, но и реакций свободно-радикального окисления.

Различают периодическое действие холода и длительное, постоянное выдерживание организмов при низких температурах.

Установлено, что холодовой стресс активирует гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему (Кулинский, Ольховский, 1992). Следствием этого является существенное усиление синтеза и секреции катехоламинов и глюкокортикоидов, которые способствуют распаду депонированных липидов и гликогена, а также усилению их утилизации в тканях (Гурин, 1989; Чернышова, 1995; McEwen, 2007). Таким образом, продукты аутоокисления катехоламинов в тканях индуцируют свободно-радикальные процессы (Эмирбеков и др., 1995).

Действие различных физических и химических факторов окружающей среды на организм сопровождается активацией ПОЛ биологических мембран (Львова и др., 1993, 2002; Дорохина, Зинчук, 2004). При действии низких температур на организм теплокровных животных в обмене липидов происходят сдвиги, степень и направленность которых зависит от продолжительности холодового воздействия и уровня гипотермии (Кулинский, Ольховский, 1992; Меньщикова, Зенков, 1997).

Состояние гипотермии затрагивает практически все функциональные системы, причём сдвиги могут протекать по-разному в зависимости от ряда условий: вида животного, его возраста, состояния организма, особенностей охлаждения (способа, скорости и глубины понижения температуры тела).

На начальных стадиях гипотермия ускоряет биологические процессы. Так же начальной реакцией теплокровного организмы на охлаждение является включение вазомоторных и пиломоторных реакций, изменение общих параметров кровообращения, мобилизация липидов и углеводов, соответствующая перестройка метаболических процессов (Гурин, 1986; Кулинский, Ольховский, 1992). Во второй фазе происходит снижение, а в третьей - общее подавление основных жизненных функций.

Развитие холодового стресса у крыс характеризуется резкой активацией липопереокисления, сопровождающейся существенным повышением уровня первичных (диеновые конъюгаты) и вторичных (кетодиены и сопряжённые триены, МДА) продуктов ПОЛ в тканях мозга, печени и в ещё большей степени в эритроцитах (Бородин и др., 1992; Эмирбеков и др., 1995).

Интенсивность процессов ПОЛ в крови крыс в динамике гипотермии была исследована Т.В. Васильковой с сотрудниками (Василькова, Кухта, 1988; Василькова, 1988; Василькова и др., 1990). По результатам этих работ выяснилось, что в эритроцитах крыс содержание диеновых конъюгатов возрастает на начальном этапе действия низкой температуры (33-34°С), резко увеличивается при дальнейшем снижении температуры тела (24-25°С) и возвращается к исходному уровню при глубокой (15-16°С) гипотермии. При этом содержание МДА в эритроцитах на всех этапах гипотермии остаётся без изменений. Повышение содержания диеновых конъюгатов в мембранах эритроцитов крыс при гипотермии было обнаружено также А.А. Линчевской, Л.А. Кондратьевой (1989).

В условиях холодового стресса отмечается дестабилизация структуры мембран эритроцитов крыс, характеризующаяся снижением микровязкости зон белок-липидных контактов и уменьшением степени погружения белков в липидный бислой вследствие экспонирования белков из гидрофобной зоны мембран, либо их агрегации, увеличением полярности липидной фазы и отрицательного поверхностного заряда (Шустанова и др., 2004).

Интенсификация процессов ПОЛ в крови представляет наибольшую опасность для мембран форменных элементов и, в первую очередь, для эритроцитов. Показано, что при гипотермии в плазме крови крыс значительно увеличивается концентрация свободного гемоглобина, что свидетельствует об усилении внутрисосудистого гемолиза и снижении стабильности мембран. Изменение физико-химического состояния мембран клетки под действием низкой температуры приводит к повышению доступности липидов для атаки молекулярным кислородом и его активными формами (Бородин и др., 1992).

Охлаждение крыс до 20°С приводит к возникновению у них «холодового наркоза», характеризующегося значительным понижением метаболизма, в том числе окислительных процессов, снижением выработки и рецепции гормонов, понижением координирующего действия нервной системы, неравномерным затуханием скорости отдельных реакций, в том числе связанных с трансформацией энергии (Львова и др., 1993). При глубокой (20°С) гипотермии наблюдается тенденция к нормализации процессов ПОЛ (Эмирбеков и др., 1995). При глубокой гипотермии происходит активация процессов ПОЛ и в плазме крови крыс (Утно и др., 1989).

Установлено, что при охлаждении со снижением температуры тела до 20°С в процесс метаболизма наряду с НЭЖК активно включаются и фосфолипиды. Это приводит к снижению их количества в печени и скелетных мышцах и сопровождается повышением количества холестерина. Длительное воздействие холода приводило к значительным изменениям процентного соотношения жирных кислот в фосфолипидах мозга. В них снижался процент насыщенности и мононенасыщенности жирных кислот и одновременно увеличивался процент полиненасыщенности жирных кислот (Гурин, 1986).

Действие катехоламинов и гормонов приводит к ускорению процессов мобилизации энергетических субстратов и создает условия для адаптации организма к новым условиям существования (Кулинский, Ольховский, 1992).

В соответствии с фазовыми изменениями интенсивности ПОЛ и ОМБ в динамике гипотермии изменяется и активность ключевых антиоксидантных ферментов. Максимальная интенсификация ПОЛ и ОМБ при гипотермии 30°С приводит к повышению антиокислительной активности (АОА) плазмы, а дальнейшее снижение окислительных процессов при гипотермии 20°С сопровождается снижением активности компонентов антиокислительной активности крови (Кличханов, 2001). Оказалось, что при умеренной гипотермии повышается в основном активность гидрофильных антиоксидантов. Стрессорное действие холода приводит к компенсаторному увеличению ёмкости неферментативной антиоксидантной системы, о чём свидетельствует резкое повышение уровня мочевины и мочевой кислоты в мозге и в плазме крови крыс.

Прерывистое сильное действие холодового агента (3 часа ежедневно в течение 1-3 мес. крыс выдерживали при t = -15°С) приводило к дискоординации отдельных компонентов АОС (Бородин и др., 1992; Дорошенко, 1995). При этом наблюдали органно-тканевые особенности. Во всех исследованных тканях (эритроциты, миокард, легкие, печень) возрастала активность глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназы и падало содержание аскорбиновой кислоты и витамина Е. Активность каталазы снижалась в легких и печени и не изменялась в сердце и эритроцитах. В эритроцитах активность СОД возрастала в 1,3 раза, а в легких и печени не изменялась.

...