Влияние многократной гипотермии 30°с на свободно-радикальные процессы в крови крыс

Холодовой стресс характеризуется существенным снижением ёмкости антиоксидантной системы, о чём свидетельствует ингибирование активности антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы и каталазы соответственно на 30,4% и 50% в мозгу, на 53,6 и 50,3% в печени, на 55,7 и 18,2% в эритроцитах крыс по сравнению с контролем, причём разная степень торможения активности антиоксидантных ферментов создает условия для накопления активных форм кислорода. Воздействие на животных холодового стресса однонаправлено изменяет активность глутатионзависимых ферментов (Дубинина, 1992).

Происходит смещение прооксидантно-антиоксидантного равновесия организма в сторону усиления активности прооксидантного фермента ксантиноксидазы в мозге и печени и снижения активности миелопероксидазы в нейтрофилах крови крыс. Истощение при холодовом стрессе главным образом ферментативной внутриклеточной антиоксидантной системы в результате ингибирования активности супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионзависимых ферментов в мозгу, печени и эритроцитах компенсируется активацией неферментативных антиоксидантных механизмов (Шустанова и др., 2004).

Разнонаправленные изменения компонентов АОС авторы (Бородин и др., 1992; Дорошенко, 1995) расценивают, как показатель ее дискоординации и напряжения, следствием чего является усиление процессов ПОЛ. Наличие подобной дискоординации говорит о том, что столь сильное холодовое воздействие превышает адаптационные возможности организма.

В эритроцитах крови крыс активность СОД, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы достоверно возрастает при гипотермии 33-34°С, значительно снижается при гипотермии 24-25°С и частично возвращается к контрольному уровню при глубокой (15-16°С) гипотермии (Василькова, 1988; Василькова, Кухта, 1988; Василькова и др., 1990). Подобная закономерность для каталазы крови крыс была обнаружена З.Я. Долговой (1981) при гипотермии 30°С и 20°С.

В отличие от эритроцитов, в печени крыс, подвергнутых острому (глубокому (18-19°С) охлаждению, существенно возрастает активность глутатионпероксидазы и каталазы, активность глутатионредуктазы увеличивается в меньшей степени (Шепелев, Костромина, 1979). Активность СОД при этом практически не отличалась от показателей у контрольных животных.

Несколько иные результаты были получены при исследовании СОД миокарда крыс. Оказалось, что при снижении температуры тела крыс до 30°С в миокарде снижалась активность СОД, при дальнейшем снижении температуры до 20°С активность СОД возрастает (Шкестерс и др., 1991).

А.Г. Гасангаджиева (1999) исследовала влияние гипотермии на активность СОД и каталазы в больших полушариях головного мозга, гипоталамусе, печени, почках, миокарде, скелетной мышце, сыворотке крови крыс. Оказалось, что в начальный период гипотермии (30°С) наблюдается снижение активности СОД в большинстве исследованных тканей (кроме больших полушарий и гипоталамуса) и разнонаправленные изменения активности каталазы. Однако активность каталазы в большинстве исследованных тканей сохраняется на достаточно высоком уровне. При пролонгировании гипотермии 30°С в течение 3 часов, сниженная активность СОД, возрастает в больших полушариях мозга, гипоталамусе, печени, почке, скелетной мышце. Активность каталазы в этих условиях снижается во всех тканях, кроме сыворотки крови, по сравнению с кратковременной умеренной гипотермией. По данным автора углубление гипотермии до 20°С приводит к значительному снижению (на 26-27%) активности СОД и росту активности каталазы в тканях. Активность каталазы при глубокой гипотермии подвержена менее резким колебаниям, чем активность СОД. Длительная (3 ч) глубокая гипотермия, также как и умеренная, вызывает нормализацию активности СОД и каталазы.

В отличие от острого холодового стресса, длительное действие низкой температуры окружающей среды (0…+4°С) приводит к постепенному переходу от стресса к адаптации, что обеспечивается рядом специфических и неспецифических реакций (Барабаш, 1996). При умеренном периодическом воздействии холода вырабатывается адаптация не только к холоду, но и к другим неблагоприятным факторам - перекрестный защитный эффект (Меерсон, 1993; Барабаш, 1996).

Повышение устойчивости к холоду при его многократном периодическом действии на организм обеспечивается системными изменениями метаболизма, функции и структуры. О формировании такого рода устойчивого «следа» при повторных воздействиях на организм свидетельствуют феномены «адаптивной памяти». Сущность феномена заключается в сохранении после действия холода адаптивных сдвигов метаболизма и функции (Меерсон, 1993). При тренирующих умеренных холодовых воздействиях уже через несколько недель интенсивность ПОЛ в печени и легких возвращается к норме. При более сильном периодическом действии холода наблюдалось развитие определенной диспропорции в динамике отдельных компонентов АОС. В сыворотке крови при этом росло содержание токоферола, увеличивалась, примерно в 2 раза, активность глутатионредуктазы, а активность каталазы достоверно понижалась. Наблюдалось также снижение концентрации восстановленного глутатиона (Куликов и др., 1988).

В естественных условиях существования человек и большинство животных чаще сталкиваются с периодическим, сезонным действием холода. Цена адаптации к периодическому действию холода значительно меньше, чем при непрерывном действии, вероятность положительных перекрестных эффектов возрастает (Барабаш, 1996).

Таким образом, анализ литературы показывает, что стабилизация или снижение интенсивности пероксидации липидов, видимо, может служить одним из показателей адаптации к стрессу, в том числе к холоду. Показателем наступления определенной адаптации к действию холодового агента является также нормализация температуры тела.

Таким образом, литературные данные свидетельствуют о том, что на начальных этапах гипотермии происходит интенсификация СРП в тканях гомойотермного организма. Однако недостаточно известно, как меняется интенсивность процессов ПОЛ и ОМБ, а также содержание восстановленного глутатиона при многократной гипотермии 30°С и при охлаждении животных до 30°С и 20°С после многократной гипотермии.

2. Материалы и методы исследования

2.1 Объект исследования

Опыты выполнены на белых крысах-самцах Вистар, массой 200-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище.

2.2 Постановка экспериментов

2.2.1 Искусственное охлаждение животных

Гипотермию вызывали в холодовой камере, в рубашке которой циркулировала вода с температурой 4-5°С. При этом тело животных остается сухим. Температуру измеряли в прямой кишке на глубине 4-5 см ртутным термометром. Температуру тела животных снижали равномерно и медленно, так что за 15-20 мин она достигала 30°С, а за 55-60 мин - 20°С. Такая скорость гипотермии обоснована тем, что при снижении температуры тела крыс до 20-19^°С за 60 мин почти исчезает температурный градиент тканей (Эмирбеков, Львова, 1985). Выбор данных уровней гипотермии обоснован тем, что именно при 30°С и 20°С гипотермии наблюдается существенное изменение интенсивности свободно-радикальных процессов в тканях (Василькова, Кухта, 1988; Эмирбеков и др., 1991; Эмирбеков, Львова, 1995). Интерес к гипотермии 30°С объясняется тем, что это состояние, когда наблюдается резкое усиление терморегуляционных механизмов, сопровождающихся увеличением теплообразования и снижением теплоотдачи.

Глубокая гипотермия (20°С) характеризуется как состояние «холодового наркоза», сопровождается резким снижением обменных процессов. Снижается потребление кислорода в головном мозге и миокарде (Эмирбеков, Львова, 1985). Таким образом, снижение интенсивности метаболических процессов в организме при глубокой гипотермии более выражено.

2.2.2 Многократная гипотермия

Животных в течение 7 дней охлаждали ежедневно до 30°С за 30 мин. После чего животных возвращали в виварий. Через неделю животных брали в опыт. Исследовали следующие серии:

1. контроль после многократной гипотермии 30°С;

2. гипотермия 30°С после многократной гипотермии 30°С;

3. гипотермия 20°С после многократной гипотермии 20°С.

2.3 Препаративные методы исследования

2.3.1 Получение плазмы крови и эритроцитов

Животных забивали декапитацией. Свободно вытекающую смешанную артериальную и венозную кровь собирали в стеклянные центрифужные пробирки, обработанные гепарином (200 ед/мл), и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Плазму осторожно отбирали и хранили на холоду для дальнейшего анализа. Верхний слой лейкоцитов аккуратно отбирали пипеткой и удаляли. Эритроциты три раза промывали охлажденным раствором, содержащим 0,145 моль/л NaCl в 0,01 моль/л трис-HCl буфере (рН 7,8 при 20°С), каждый раз осаждая клетки в том же режиме (при 3000 об/мин в течение 10 мин).

2.4 Биохимические методы исследования

2.4.1 Определение содержания ТБК-активных продуктов в плазме крови

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в эритроцитах оценивали по содержанию малонового диальдегида по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Андреева и др., 1988). К 0,2 мл плазмы крови приливают 3 мл 1%-ного раствора фосфорной кислоты, 1 мл 0,6% ТБК и 0,1 мл раствора сернокислого железа (железо необходимо для полного разрушения липоперекисей), что соответствует 1 мкмоль в пробе. Пробирки ставят в кипящую водную баню на 1 ч. Затем их охлаждают в холодной воде. Тщательно перемешивают и центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин. Оптическую плотность измеряют при длине волны 532 нм против контрольной пробы, содержащей вместо плазмы крови 0,2 мл дистиллированной воды. Расчет содержания продуктов, реагирующих с ТБК, производят с учетом коэффициента молярной экстинкции МДА, равного 1,56·10⁵ моль-¹см-¹:

,

где X - содержание МДА (в мкмоль/л); 4 - общий объем; 0,2 - объем плазмы; Е₅₃₂ - оптическая плотность пробы.

2.4.2 Определение содержания ТБК-активных продуктов в эритроцитах крови

Для исследования отбирают 0,1 мл эритроцитов, трижды отмытых охлажденным изотоническим раствором, и гемолизируют внесением в пробирку 2 мл дистиллированной воды. К полученному гемолизату добавляют 1 мл раствора ТХУ и 1 мл раствора ТБК. Пробу прогревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин.

Интенсивность окраски измеряют при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контрольной пробы (вместо эритроцитов вносится 0,1 мл физ. раствора и проводится через все вышеперечисленные процедуры). Для проведения расчётов используют формулу:

С (мкмоль/л) = ,

где Е_оп - оптическая плотность опытной пробы; 4 мл - объем водной фазы; 0,1 мл - объём эритроцитарной массы; 10⁶ - коэффициент перевода «моль/л» в «мкмоль/л»; 1,56·10⁵ - коэффициент молярной экстинкции.

2.4.3 Определение окислительной модификации белков плазмы крови

В результате окисления белков под действием свободных радикалов кислорода образуются альдегидные и кетонные группировки аминокислотных остатков (карбонильные группы), которые взаимодействуют с 2,4 - динитрофенилгидразином (2,4 - ДНФГ) с образованием производных 2,4 - динитрофенилгидразона. Образующиеся 2,4 - динитрофенилгидразоны имеют максимум поглощения около 370 нм (Дубинина и др., 1998; Levin et al., 1990; Dubinina et al., 2002).

При определении окислительной модификации белков плазмы крови использовались два показателя: исходный уровень окислительной модификации белков и окислительная модификация белков, индуцированная системой Фентона. Если первый показатель характеризует конститутивную активность окислительной модификации белков, то второй, характеризующий приращение окислительной модификации белков после стимуляции системой Фентона, указывает на количество субстрата для окислительной модификации белков и возможность его вовлечения в эти процессы. В целом индуцированную окислительную модификацию белков можно рассматривать как показатель устойчивости системы к переокислению, индикатор стрессоустойчивости исследуемой ткани (Дубинина, 2001).

При определении исходного уровня карбонильных групп белков в опытную пробирку вносили 0,05 мл неразведённой плазмы, 0,95 мл 0,067 М фосфатного буфера рН 7,4; 1,0 мл 10 мМ 2,4 - ДНФГ и последним вносили 1,0 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольную пробирку вносили те же компоненты, кроме 2,4 - ДНФГ, вместо него вносили 1,0 мл 2 н НCl.

При определении карбонильных групп белков, стимулированных системой Fe²⁺-H₂O₂ в пробирку вносили 0,05 мл разведённой в 7 раз плазмы, 0,75 мл фосфатного буфера, рН 7,4; 0,1 мл смеси 1 мМ ЭДТА и 1 мМ сульфата железа (1:1, готовят перед опытом) и 0,1 мл 0,1 мМ Н₂О₂. Пробы инкубировали 15 мин при 37єС. Затем в опытную пробирку добавляли 1,0 мл 10 мМ 2,4 - ДНФГ и 1,0 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольную пробирку вместо 2,4 - ДНФГ вносили такой же объём 2 н соляной кислоты.

Все пробы после добавления ТХУ оставляли на 1 час при комнатной температуре, перемешивая каждые 15 мин. По истечении времени пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок промывали 2 раза 4,0 мл смеси этилацетат-этиловый спирт (1:1) для отмывания белков от не связавшегося ДНФГ и липидов.

Промытые осадки белков высушивали либо в сушильном шкафу при 40єС, либо помещением пробирок в холодильник на ночь без крышек.

Высушенные осадки растворяли в 8 М растворе мочевины. Для этого к осадкам добавляли 3,0 мл 8 М мочевины и по капле 2 н соляной кислоты. Пробы перемешивали и оставляли на 30 мин. Затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 370 нм.

Уровень карбонильных групп, измеренный по поглощению при 370 нм, рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 21000 М^-1 см^-1 для ДНФГ-производных.

А= ,

где А - содержание фенилгидразонов в нМолях на 1 г белка; С - содержание белка в пробе в граммах.

2.4.4 Определение содержания белка в плазме крови

Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей с ионами двухвалентной меди в щелочной среде (Scopes, 1982).

К 1 мл разведённой в 10 раз плазмы добавляли 4 мл биуретового реактива, тщательно перемешивали и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Через 30 мин колориметрировали при длине волны 540 нм в кюветах толщиной 10 мм против контрольной пробы. В контрольную пробу вместо исследуемого материала добавляли 1 мл дистиллированной воды. Содержание белка в пробе в мг находили по калибровочному графику.

2.4.5 Определение содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах

Содержание восстановленного глутатиона в синаптосомах определяли методом Эллмана (Арутюнян и др., 2000).

К 0,6 мл гемолизата эритроцитов (1 объем отмытой эритроцитарной взвеси и 10 объемов дистиллированной воды) добавляют 0,2 мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты. Пробы перемешивают и центрифугируют при 3000 об./мин в течение 10 мин при температуре 2°С. 0,2 мл супернатанта переносят в пробирки, содержащие 2,55 мл трис-буфера с ЭДТА. К полученной смеси добавляют 25 мкл раствора ДТНБ. Измеряют оптическую плотность проб против дистиллированной воды при л = 412 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчёт производят с помощью калибровочной кривой, для построения которой используют растворы восстановленного глутатиона с концентрациями от 0,02 до 2,0 мМ.

2.5 Статистическая обработка результатов

Полученные данные подвергли вариационно-статистической обработке по методу малой выборки (Кокунин, 1975). Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакетов прикладных программ Statistica-6.0 (Windows XP) и Microsoft Excel с использованием методов одномерной статистики. На гистограммах и в таблицах результаты представлены в виде средних значений (М) ± стандартная ошибка (m). Достоверность различий средних величин оценивали при помощи t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при значениях р<0,05.

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1 Интенсивность процессов ПОЛ в плазме крови и эритроцитах крыс при многократной гипотермии

Нами было обнаружено, что содержание МДА в плазме крови контрольных крыс составляет 1,89±0,09 мкмоль/л, а в эритроцитах - 47,4±1,3 мкмоль/л (табл. 1, рис. 1).

Однократная умеренная гипотермия 30°С приводит к увеличению накопления МДА в плазме крови и эритроцитах крыс на 26% и на 21,5% относительно контроля соответственно (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1. Содержание МДА (мкмоль/л) в плазме крови и эритроцитах крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности (Мm; n=4-6)

№	Состояние животного	МДА, плазма крови	МДА, эритроциты
1	Контроль	1,88±0,08	47,42±1,31
2	Контроль после многократной 30єС гипотермии	1,85±0,08	40,56±1,21
3	Гипотермия 30°С	2,36 ± 0,11*	57,43 ± 0,84*
4	Гипотермия 30єС после многократной 30єС гипотермии	1,41±0,26+	50,66±0,73+
5	Гипотермия 20°С	2,10±0,06	40,12±1,85
6	Гипотермия 20єС после многократной 30єС гипотермии	2,05±0,13	39,73±0,53*

P < 0,05, * - достоверность различий по сравнению с контролем, ⁺ - по сравнению с соответствующим уровнем гипотермии

Известно, что начальные этапы гипотермии ненаркотизированных эндотермных животных характеризуются развитием холодового стресса (Эмирбеков, Львова, 1985), в ходе которого существенно активизируется симпатоадреналовая система (Гурин, 1989; Судаков, 1997). В этот период активно работают терморегуляторные механизмы, возрастает теплопродукция за счет усиления катаболитических процессов (Розен, 1984; Гурин, 1989). Одновременно резко ограничивается теплоотдача. Теплообразование у крыс увеличивается в 3-4 раза (Хаскин, 1975). Усиливается поступление в кровь катехоламинов, кортикостероидов, которые стимулируют распад гликогена и липидов, активируют фосфорилазу и липазу (Эмирбеков, Львова, 1985; Гурин, 1989).

При действии низкой температуры и на начальных этапах гипотермии активизируется деятельность организма, что направленно на предотвращение падения температуры тела (Майстрах, 1975). При этом повышаются энергозатраты и, стало быть, стимулируется главный поставляющий энергию процесс - дыхание. Действительно, показано, что при умеренной гипотермии существенно увеличивается, как внешнее дыхание, так и дыхание на уровне митохондрий (Чуйкин, Вовенко, 1993). Активизация дыхания увеличивает поток электронов по дыхательной цепи, что неизбежно влечет за собой повышение продукции О₂, а стало быть и OHя (Скулачев, 1998). Можно подумать, что такая последовательность событий имеет место при умеренной гипотермии. Ускорение процессов генерации активных метаболитов кислорода в тканях при гипотермии может способствовать повышению их содержания в плазме.

Однократная глубокая (20°С) гипотермия приводит к некоторому снижению уровня МДА в плазме крови, но он остается выше контроля на 11,7%, в эритроцитах уровень МДА снижается на 15,4% по сравнению с контролем (табл. 1, рис. 1).

Глубокая гипотермия (20-19°С) характеризуется как состояние холодового наркоза, так как сопровождается резким снижением обменных процессов (Эмирбеков, Львова, 1985). При этом потребности тканей в энергии существенно понижаются, что позволяет значительно продлить время реанимации и имеет огромное практическое значение (Эмирбеков, Львова, 1985; Шкестерс и др., 1991). Глубокая гипотермия сопровождается резким снижением обмена белков, фосфолипидов, которые являются важнейшей составной частью биомембран, снижением мембранного потенциала (Иванов, 1990).

В несколько раз понижается кровоток и дыхание тканей (Чуйкин, Федорова, 1995; Иванов и др., 1996). При ректальной температуре 20°С наблюдается снижение потребления кислорода, связанное с выраженным угнетением внешнего дыхания, нарушением объемно-временных параметров дыхания, снижением напряжения кислорода, нарастанием ацидоза в артериальной крови, снижением артериального давления и минутного объема кровообращения (Чуйкин, Федорова, 1995).

При многократной умеренной (30°С) гипотермии обнаружено, что содержание малонового диальдегида в плазме остается на одном уровне с интактным контролем, а в эритроцитах незначительно снижается, что, по-видимому, связано с выработкой адаптации к гипотермии (табл. 1, рис. 1).

Рис. 1. Динамика изменения (в% по отношению к контролю) содержания малонового диальдегида в плазме крови и эритроцитах крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности. * - достоверность различий относительно контроля, + - относительно соответствующей гипотермии

Умеренная (30°С) однократная гипотермия после многократной умеренной (30°С) гипотермии привела к резкому снижению (на 40,3% относительно гипотермии 30°С) накопления малонового диальдегида в плазме крови крыс, а в случае глубокой (20°С) гипотермии после многократной умеренной (30°С) гипотермии содержание малонового диальдегида в плазме крови существенно не изменяется. Аналогичная картина наблюдается и в эритроцитах (табл. 1, рис. 1).

Согласно литературным данным, многократный холодовой стресс, в отличие от однократного (Эмирбеков и др., 1998), существенно подавляет процессы пероксидации липидов в различных органах и тканях. Это свидетельствует о том, что активация ПОЛ, видимо, сопутствует только начальным стадиям стресса. В ходе тренирующего умеренного воздействия стрессора, в том числе холода, процессы ПОЛ стабилизируются. Следовательно, интенсивность ПОЛ может служить одним из тестов на наступление адаптационной стадии стресса.

Наблюдаемое снижение интенсивности ПОЛ при повторяющихся умеренных стрессорных воздействиях может быть связано с рядом причин. Во-первых, оно может быть следствием изменения мембранных липидов при тренирующих умеренных холодовых нагрузках. Например, с «выгоранием» при многократном стрессе легко окисляемых липидов и, вследствие этого, обогащение липидов фракциями, более устойчивыми к действию свободных радикалов кислорода. Возможно также изменение «упаковки» мембранных липидов, что делает их более устойчивыми к окислению.

Во-вторых, снижение интенсивности ПОЛ при многократном холодовом стрессе может быть связано с уменьшением гипоксических явлений в тканях, которые возникают при однократном холодовом стрессе (Эмирбеков, Львова, 1985) и существенно интенсифицируют ПОЛ (Львова и др., 1993). Акклиматизация к холодовому агенту улучшает кровоснабжение тканей, доставку в них кислорода, усиливает через повышение секреции тиреоидных гормонов (Исмаилходжаева и др., 1986; Божко, Городецкая, 1994) синтез дыхательных ферментов, повышает интенсивность аэробных процессов и препятствует гипоксии.

Помимо выше перечисленных, причиной падения ПОЛ может служить активизация АОС. В процессе длительного действия холода возрастает роль стресслимитирующих систем, среди которых наибольшее значение имеет АОС.

По данным Гасангаджиевой А.Г. (1999) наблюдается повышение суммарной антиокислительной активности и активности каталазы у крыс, адаптированных к холоду. Вместе с тем, изменение активности СОД в тканях крыс, подвергнутых прерывистому воздействию холода, имеет органо-тканевые особенности: не изменяется в больших полушариях и гипоталамусе, и достоверно снижается в других органах. Автор объясняет это возможной модификацией мембран митохондрий, которая приводит к снижению «сбоев» в электронно-транспортной цепи и снижению генерации активных форм кислорода (Гасангаджиева, 1999).

Поскольку при адаптации к холоду в тканях усиливаются процессы дыхания (Барбараш, 1996), то следствием этого является усиление выработки СО₂. Вместе с тем, в последние годы накапливается все больше данных о том, что СО2 является естественным ингибитором генерации свободных радикалов кислорода (Коган и др., 1995, 1997). Так, в опытах А.Х. Когана с сотрудниками (1996) обнаружено, что СО2 в концентрации близкой к содержанию в крови (5,1%, Рсо₂, 37 мм рт. ст.) и в высоких концентрациях (8,2-20%, Рсо2 60-120 мм рт. ст.) способен оказывать мощное ингибирующее влияние на генерацию активных форм кислорода клетками печени, сердца, легких, мозга, почек, желудка и скелетных мышц.

Таким образом, многократная умеренная (30°С) гипотермия приводит к нормализации и к снижению содержания малонового диальдегида в плазме и эритроцитах крови, что может послужить критерием эффективности адаптивности организма в условиях низких температур.

3.2 Интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови крыс при многократной гипотермии

Содержание карбонильных групп в белках плазмы крови интактных крыс составляет 1,50±0,06 нмоль/мг белка (табл. 2). В условиях in vitro при инкубации в среде Фентона количество карбонильных групп в белках плазмы крови увеличивается в 37 раз по сравнению с исходным уровнем (табл. 2).

Таблица 2. Содержание карбонильных групп в белках плазмы крови крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности (Мm; n= 4-6)

№	Состояние животного	Исходный уровень	Прирост карбонильных групп за 15 мин инкубации в среде Фентона
1	Контроль	1,50±0,06	55,74±0,35
2	Контроль после многократной 30єС гипотермии	1,34±0,09*	42,77±0,71*
3	Гипотермия 30єС	3,91±0,10*	54,91±0,56
4	Гипотермия 30єС после многократной 30єС гипотермии	2,97±0,61*+	47,76±0,10*
5	Гипотермия 20єС	1,97±0,22*	47,41±1,24*
6	Гипотермия 20єС после многократной 30єС гипотермии	1,68±0,37	40,44±1,32*

P < 0,05, * - достоверность различий по сравнению с контролем, ⁺ - по сравнению с соответствующим уровнем гипотермии

Это связано с тем, что комплекс Fe²⁺ - ЭДТА в присутствии H₂O₂ генерирует один из самых реакционноспособных радикалов - OHя (Stadtman et al., 1990). Гидроксильный радикал, атакуя ближайшие аминокислотные остатки белков, формирует карбонильные группы (Дубинина, Шугалей, 1993; Davies, 1987; Griffiths, 2000; Dalle-Donne et al., 2003).

Как видно из таблицы 2, однократная умеренная гипотермия 30°С приводит к увеличению содержания карбонильных групп в белках плазмы крови крыс более чем в 2 раза (160,7%). Скорость Fe-зависимого накопления при этом существенно не изменяется (табл. 2, рис. 2).

Повышение уровня окислительной модификации белков плазмы крови при умеренной гипотермии свидетельствует об активации процессов образования активных форм кислорода.

Клетки организма постоянно поддерживают такой баланс процессов образования и дезактивации АФК, при которых их концентрация находится на низком, но всегда отличном от нуля уровне. При действии низкой температуры и на начальных этапах гипотермии активизируется деятельность организма, что направлено на предотвращение падения температуры тела. При этом повышаются энергозатраты и, стало быть, стимулируется главный поставляющий энергию процесс - дыхание. Действительно, показано, что при умеренной гипотермии существенно увеличивается как внешнее дыхание, так и дыхание на уровне митохондрий (Чуйкин, Вовенко, 1993). Активизация дыхания увеличивает поток электронов по дыхательной цепи, что неизбежно влечет за собой повышение продукции О₂, а стало быть и OHя (Скулачев, 1998). Можно подумать, что такая последовательность имеет место при умеренной гипотермии.

Усиление свободно-радикальных процессов при умеренной гипотермии было обнаружено и исследовано разными учеными (Василькова, Кухта, 1988; Ломакина, 1980; Львова и др., 1993 Халдун, 1998; Эмирбеков и др., 1991).

При глубокой (20°С) гипотермии уровень карбонильных групп в белках плазмы крови крыс снижается относительно умеренной гипотермии, но при этом остается выше контроля на 31%. Прирост карбонильных групп в белках при инкубации в среде Фентона при этом уменьшается на 14,9% (табл. 2, рис. 2).

Снижение степени окислительной модификации белков при гипотермии 20°C, является выражением защитной функции глубокой гипотермии и связана, по-видимому, с существенным подавлением метаболических процессов, в том числе и тех, в которых образуются активные формы кислорода (Тимофеев, 1983; Эмирбеков и др., 1995).

Рис. 2. Динамика изменения (в% по отношению к контролю) содержания карбонильных групп в белках плазмы крови крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности. * - достоверность различий относительно контроля, + - относительно соответствующей гипотермии

Многократная умеренная (30°С) гипотермия приводит к снижению исходного уровня карбонильных групп в белках плазмы крови на 10,7%, в то время как накопление карбонильных групп за 15 мин инкубации в среде Фентона уменьшается на 23,3%. Умеренная (30°С) гипотермия после многократной умеренной гипотермии привела к снижению исходного уровня карбонильных групп на 24% относительно гипотермии 30°С, а накопление карбонильных групп за 15 мин инкубации в среде Фентона уменьшилось на 13% относительно однократной умеренной гипотермии.

Глубокая (20°С) гипотермия после многократной умеренной (30°С) гипотермии снижает исходный уровень карбонильных групп в белках плазмы крови и прирост карбонильных групп в белках на 14,7% относительно однократной глубокой гипотермии.

Полученные данные позволяют предположить, что многократная гипотермия 30єС снижает риск развития окислительного повреждения белков плазмы крови при умеренной и глубокой гипотермии. Уменьшение интенсивности окислительной модификации белков, вероятно, связано с активацией антиоксидантной системы при адаптации к холодовому воздействию. В связи с этим нами было исследовано содержание восстановленного глутатиона, как одного из компонентов актиоксидантной защиты организма.

3.3 Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс при многократной умеренной гипотермии

Глутатион - трипептид (GSH: г-L-глутамил-L-цистеинил-глицин) присутствует в клетках млекопитающих с концентрацией до 12 мМ. GSH синтезируется в естественных условиях под действием двух ферментов: глутамилцистеин (г-GluCys) синтетазы и глутатионсинтетазы. Первый фермент использует глутамат и цистеин в качестве субстратов, образуя дипептид г-Glu-Cys, который вступает в реакцию с глицином. Эту реакцию катализирует глутатионсинтетазой, конечным продуктом этой реакции является глутатион (Dringen et al., 2000). Глутатион содержит необычную пептидную связь между амино-группой цистеина и карбокси-группой боковой цепи глутамата. Фактически глутатион не только защищает клетку от таких токсичных агентов, как свободные радикалы, но и в целом определяет редокс-статус внутриклеточной среды (Struїсka et al., 2005).

Обнаружено, что у контрольных животных содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах составляет 2,43 ± 0,09 ммоль/л (табл. 3). Однократная умеренная (30°С) гипотермия приводит к снижению содержания восстановленного глутатиона на 16,5% относительно уровня контрольных животных (табл. 3, рис. 3). Глубокая (20°С) гипотермия приводит к увеличению уровня восстановленного глутатиона на 28,6% относительно однократной умеренной гипотермии, и он превышает уровень глутатиона у контрольных животных на 7,5% (табл. 3, рис. 3).

Таблица 3. Содержание восстановленного глутатиона (ммоль/л) в эритроцитах крыс при многократной 30єС гипотермии (Мm; n= 4-6)

№	Состояние животного	Глутатион
1	Контроль	2,43 ± 0,09
2	Контроль после многократной 30єС гипотермии	2,42±0,04
3	Гипотермия 30єС	2,03 ± 0,10*
4	Гипотермия 30єС после многократной 30єС гипотермии	2,43±0,13+
5	Гипотермия 20єС	2,61±0,08*
6	Гипотермия 20єС после 30єС многократной гипотермии	2,47±0,12

P < 0,05, * - достоверность различий по сравнению с контролем, ⁺ - по сравнению с соответствующим уровнем гипотермии

Глутатион, выполняя функцию естественного антиоксиданта ингибирует ПОЛ на этапах развития цепной реакции. Восстановленный глутатион и ферменты его обмена способствуют обезвреживанию пероксидов и токсических веществ, тем самым принимают участие в регуляции уровня токсичных интермедиатов (Керимов, 2004).

Снижение содержания восстановленного глутатиона при однократной умеренной гипотермии, вероятно, связано с тем, что на этом этапе охлаждения животных восстановленный глутатион усиленно окисляется за счет того, что при этом состоянии происходит усиленное образование АФК (Василькова, Кухта, 1988; Львова и др., 1993). Увеличение содержания восстановленного глутатиона при углублении гипотермии может свидетельствовать о том, что при глубокой гипотермии существенно подавляются метаболические процессы, в том числе и те, в которых образуются активные формы кислорода (Тимофеев, 1983; Эмирбеков и др., 1995).

Многократная умеренная гипотермия существенно не влияет на содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах (табл. 3, рис. 3). Гипотермия 30°С после многократной умеренной гипотермии приводит к увеличению уровня восстановленного глутатиона на 19,7% относительно однократной умеренной гипотермии (табл. 3, рис. 3). При глубокой (20°С) гипотермии после многократной умеренной гипотермии содержание восстановленного глутатиона имеет тенденцию к снижению (на 5,4% меньше уровня при однократной глубокой гипотермии) (табл. 3, рис. 3).

Рис. 3. Динамика изменения (в% по отношению к контролю) содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс при принудительной гипотермии разной глубины и длительности. * - достоверность различий относительно контроля, + - относительно соответствующей гипотермии

Полученные нами данные согласуются с литературными данными о том, что при адаптации к холоду происходит активация АОС, как неферментативной, так и ферментативной (Гасангаджиева, 1999).

Заключение

Одним из важнейших факторов, существенно сказывающихся на течении физиологических и биохимических процессов в организме, является температура. При изменении температуры среды в организме гомойотермных незимоспящих животных развиваются как специфические терморегуляторные сдвиги, направленные на сохранение температурного гомеостаза, так и неспецифические стрессорные изменения, обусловленные действием температуры как чрезвычайного раздражителя (Гурин, 1989). Жесткое и продолжительное действие низкой температуры способствует развитию гипотермии.

Вместе с тем, прерывистое или постоянное действие холодового фактора на организм приводит к возникновению адаптации.

Для оценки роли свободно-радикальных процессов при адаптации организма к холоду, нами была исследована интенсивность ПОЛ и ОМБ в крови крыс, а также восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс при многократной умеренной гипотермии 30°С.

Оказалось, что однократная умеренная гипотермия сопровождается увеличением интенсивности как процессов ПОЛ в плазме крови и эритроцитах крыс, так и ОМБ. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс при этом снижается. Однократная глубокая гипотермия приводит к некоторому снижению степени ПОЛ и ОМБ в плазме крови и эритроцитах, а содержание восстановленного глутатиона при этом увеличивается относительно предыдущего уровня гипотермии.

Полученные нами данные согласуются с литературными. По мнению многих исследователей на начальных этапах гипотермии активируются процессы метаболизма, что сопровождается увеличением образования АФК. Глубокая же гипотермии рассматривается как состояние «холодового наркоза», при котором подавляется функционирование всех систем организма (Тимофеев, 1983; Эмирбеков и др., 1995).

При многократной умеренной гипотермии содержание МДА в плазме крови и эритроцитах имеет тенденцию к снижению. В белках плазмы крови при этом состоянии снижается как исходный уровень карбонильных групп, так и их накопление при инкубации в среде Фентона. Умеренная (30°С) однократная гипотермия после многократной умеренной гипотермии привела к резкому снижению содержания МДА в плазме крови и эритроцитах крыс, содержание карбонильных групп в белках плазмы крови и их накопление при инкубации в среде Фентона при этом также снижается. В случае глубокой гипотермии после многократной умеренной гипотермии содержание МДА в плазме крови и эритроцитах существенно не изменяется. Интенсивность ОМБ плазмы крови при этом состоянии снижается.

Причиной снижения интенсивности процессов ПОЛ и ОМБ при многократной умеренной гипотермии может служить активизация антиоксидантной системы. В связи с этим мы исследовали содержание одного из компонентов антиоксидантной защиты - восстановленного глутатиона в эритроцитах.

Многократная умеренная гипотермия не оказывает существенного влияния на содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах. Гипотермия 30°С после многократной умеренной гипотермии увеличивает уровень восстановленного глутатиона относительно однократной умеренной гипотермии. При глубокой гипотермии после многократной умеренной гипотермии содержание восстановленного глутатиона имеет тенденцию к снижению.

Полученные нами данные согласуются с литературными данными об активации как ферментативной, так и неферментативной АОС при адаптации к холоду (Гасангаджиева, 1999).

Таким образом, можно предположить, что многократная умеренная гипотермия 30єС снижает риск развития окислительного повреждения липидов и белков плазмы крови при умеренной и глубокой гипотермии, что может рассматриваться как критерий эффективности адаптивности организма в условиях низких температур.

Выводы

1. Исследование содержания МДА и карбонильных групп показало, что при однократной умеренной (30°С) гипотермии активируются процессы перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков в крови крыс. Однократная глубокая (20°С) гипотермия, напротив, снижает окислительную модификацию липидов и белков.

2. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс снижается на 16,5% относительно контроля при однократной умеренной гипотермии, и увеличивается на 7,5 относительно контроля при однократной глубокой гипотермии.

3. Умеренная (30°С) однократная гипотермия после многократной умеренной гипотермии приводит к снижению на 40,3% относительно гипотермии 30°С содержания МДА в плазме крови крыс, и на 11,8% относительно умеренной гипотермии в эритроцитах крыс. Глубокая (20°С) гипотермия после многократной умеренной гипотермии не оказывает существенного влияния на уровень МДА относительно однократной глубокой гипотермии.

4. Умеренная (30°С) гипотермия после многократной умеренной гипотермии приводит к снижению исходного уровня карбонильных групп в белках плазмы крови крыс на 24% относительно гипотермии 30°С, и накопления карбонильных групп за 15 мин инкубации в среде Фентона на 13% относительно однократной умеренной гипотермии. Глубокая (20°С) гипотермия после многократной умеренной гипотермии снижает исходный уровень карбонильных групп в белках плазмы крови и прирост карбонильных групп в белках на 14,7% относительно однократной глубокой гипотермии.

5. Гипотермия 30°С после многократной гипотермии приводит к увеличению содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс на 19,7% относительно однократной умеренной гипотермии. При гипотермии 20°С после многократной умеренной гипотермии содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс имеет тенденцию к снижению.

Литература

1. Андреева Л.И., Кожемякина А.А., Кишкун А.А. Модификация метода определения перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело. - 1988. - №11. - С. 41-43.

2. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободно-радикального окисления и антиоксидантной системы организма. Методические рекомендации. - СПб.: ИКФ «Фолиант», 2000. - 104 с.

3. Арчаков А.И., Мохосоев И.М. Модификация белков активным кислородом и их распад // Биохимия. - 1989. - Т. 54, вып. 2. - С. 179-186.

4. Ахалая М.Я., Платонов А.Г., Байжуманов А.А. Кратковременное охлаждение повышает антиоксидантный статус и общую устойчивость животных // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2006. - Т. 141, №1. - С. 31-34.

5. Баблоянц А. Молекулы, динамика и жизнь. - М.: Мир, 1990. - 373 с.

6. Барабаш Н.А. Периодическое действие холода и устойчивость организма // Успехи физиол. наук. - 1996. - Т. 27, №4. - С. 116-132.

7. Белоус A.M., Бондаренко В.И. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. - Киев: Наук. думка, 1982. - 255 с.

8. Божко А.П., Городецкая И.В. Значение тиреоидного статуса организма в реализации адаптационного эффекта холода // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 1994. - №3. - С. 28-36.

9. Болдырев А.А. Парадоксы окислительного метаболизма мозга // Биохимия. - 1995. - Т.60, вып. 9. - С. 1536-1542.

10. Болдырев А.А. Окислительный стресс и мозг // Сорос. образ. журн. - 2001. - Т. 7, №4. - С. 21-28.

11. Бородин Е.А., Бородина Г.П. Доровский В.А., Дорошенко Г.К., Заражевская Е.В., Киндеева С.Г. Перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов и микросом печени и антиокислительной системы тканей крыс при длительном действии холода // Биол. мемб. - 1992. - Т.9, №6. - С. 622-627.

12. Брискин, Б.С. Панкреонекроз в свете современных представлений диагностики и лечения / Б.С. Брискин, Г.С. Рыбаков // Тезисы докладов IX съезда хирургов, (Волгоград, 20-22 сентября 2000 г.): - Волгоград, 2000. - С. 20.

13. Василькова Т.В., Кухта В.К., Королёв А.Р. Сезонные различия в антиоксидантной защите эритроцитов при общей перфузионной гипотермии организма // Здравоохр. Белоруссии. - 1990. - №7. - С. 26-29.

14. Василькова Т.В. Состояние окислительно-восстановительной системы глутатион-глутатионредуктазы, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и мембранносвязанных ферментов эритроцитов при общей гипотермии организма // Здравоохр. Белоруссии. - 1988. - №1. - С. 40-42.

15. Василькова Т.В., Кухта В.К. Применение б-токоферола ацетата для коррекции процесса перекисного окисления липидов эритроцитов при общей гипотермии организма // Здравохр. Белоруссии. - 1988. - №8. - С. 45-48.

16. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов // Пат. физиол. и эксп. терап. - 1989. - №4. - С. 7-19.

17. Вьюшина А.В., Герасимова И.Г., Флеров М.А. Перекисное окисление белков сыворотки крови у крыс, селектированных по выработке условного рефлекса активного избегания в норме и при патологии // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2002. - Т. 133, №5. - С. 286-288.

18. Гасангаджиева А.Г. Антиоксидантная активность тканей адаптированных к холоду крыс при гипотермии и самосогревании: Дисс…. канд. биол. наук. - Махачкала, 1999. - 145 с.

19. Голиков А.П., Бойцов С.А., Михин В.П., Полумиксов В.Ю. Свободно-радикальное окисление и сердечно-сосудистая патология: коррекция антиоксидантами // Лечащий врач. - 2003. - №4. - С. 35-37.

20. Гурин В.Н. Обмен липидов при гипотермии, гипертермии и лихорадке. Мн.: Беларусь. - 1986. - 190 с.

21. Гурин В.Н. Синаптическая нервная система и регуляция температуры тела у эндотермных животных // Усп. физиол. наук. - 1989. - Т. 20, №2. - С. 3-19.

22. Долгова З.Я. Изменение активности каталазы и угольной ангидразы в условиях легкой и глубокой гипотермии // Биол. науки. - 1981. - №1. - С. 30-32.

23. Дорохина Л.В., Зинчук В.В. Прооксидантно-антиоксидантное равновесие у крыс при гипотермии в условиях коррекции L-аргинин-NO системы // Bесцi НАН РБ. Сер. бiял. нав. - 2000. - №4. - С. 87-90.

24. Дорохина Л.В., Зинчук В.В. Эффект карнитина и l-аргинина на свободнорадикальное окисление липидов тканей при глубокой гипотермии // Бюллетень смоленской ассоциации ученых новости науки и техники [электрон. монография on-line]. 2003. Доступно по URL: http://globus.smolensk.ru/user/sgma/MMORPH/N-9-html/dorokhina/dorokhi-na.htm.

25. Дорошенко Г.К. Перекисное окисление липидов и антиокислительная система тканей при длительном действии холода на организм: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Иркутск, 1995 - 21 с.

26. Дубинина Е.Е. Биологическая роль супероксидного анион-радикала и супероксиддисмутаза в тканях организма // Успехи современ. биол. - 1989. - Т.108, вып. 1 (4). - С. 3-18.

27. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови // Укр. биох. журн. - 1992. - Т. 64, №2. - С. 3-14.

28. Дубинина Е.Е., Леонова Н.В., Зыбина Н.Н., Коновалов П.В., Морозова М.Г., Солитернова И.Б., Ковругина С.В. Окислительная деструкция белков, особенности окислительной модификации белков с использованием модельных систем и в плазме крови пожилых людей с деменциями // Фундамент. и приклад. аспекты совр. биохимии: Труды конф. СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1998. - Т. 2. - С. 425-429.

29. Дубинина Е.Е. Активные формы кислорода и их роль в развитии оксидативного стресса // Фундамент. и приклад. аспекты совр. биохимии: Труды конф. СПб.: Изд-во СПбГМУ, 1998. - Т. 2. - С. 386-398.

30. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса // Вопр. мед. хим. - 2001. - Т. 47, №6. - С. 561-581.

31. Дубинина Е.Е., Шугалей А.В. Окислительная модификация белков // Усп. совр. биол. - 1993 - Т.113, вып. 2. - С. 71-81.

32. Журавлев А.И Механизмы биофизических адаптационных процессов. Гомеостаз свободно радикальных процессов. Метод ЭПР. Фон электромагнитного поля Земли. «Квантовая биофизика животных и человека», типография МГАВМиБ, М., 2006 г.

33. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Активированные кислотные метаболиты в биологических системах // Успехи современ. биол. - 1993. - Т. 113, вып. 3. - С. 286-296.

34. Иванов К.П. Основы энергетики организма. - Л.: Наука, 1990. - Т.1. - 305 с.

35. Иванов К.П., Левкович Ю.И. Московская СВ., Мальцев Н.А. Нарушение и восстановление микроциркуляции в мозгу крыс при глубокой гипотермии // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 1996. - Т. 82, №4. - С. 86-92.

36. Исмаилходжаева Г., Борникова В.Т. Гагельсанс А.И., Саатов Т.С. Влияние содержание тиреоидных гормонов на жирнокислотный состав митохондрий печени крысы // Биохимия. - 1986. - Т.51, вып. 1. - С. 80-83.

37. Казеннов А.М., Маслова М.К., Шалабодов А.Д. Исследование активности АТФазы в эритроцитарных мембранах // Биохимия. - 1984. - Т. 49, №7. - С. 1089-1095.

38. Керимов Б.Ф. Глутатиондефицитное состояние нервной ткани голодавших животных интенсифицирует пероксидное окисление липидов и окисление белковых SH-групп // Укр. биохим. журнал. - 2004. - Т. 76, №1. - С. 108-113.

39. Кличханов Н.К. Метаболические и структурно-функциональные изменения в плазме крови и эритроцитах при гипотермии // Науч. мысль Кавказа. Приложение. Спецвыпуск. - 2001. - С. 38-50.

40. Коган А.Х., Грачев СВ., Елисеева СВ. Углекислый газ и генерация активных форм кислорода клетками разных тканей и митохондрий (к расшифровке одной загадки эволюции) // ДАН. Серия биологическая. - 1995. - Т. 340, №1. - С. 132-134.

41. Коган А.Х., Грачев С.В., Елисеева С.В. Ингибирование углекислым газом генерации активных форм кислорода клетками внутренних органов и его биологическое значение // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1996. - №4. - С 407-410.

42. Коган А.Х., Грачев С.В., Елисеева С.В., Баличев С. Углекислый газ - универсальный ингибитор генерации активных форм кислорода клетками (к расшифровке одной загадки эволюции) // Изв. АН. Серия биологическая. - 1997. - №2. - С. 204-217.

43. Кокунин В.А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов // Укр. биохим. журн. - 1995. - Т. 47, №6. - С. 776-791.

44. Куликов В.Ю., Семенюк А.В., Колесникова Л.Н. Перекисное окисление липидов и холодовой фактор. - Новосибирск: Наука, 1988 - 191 с.

45. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита // Сорос. Образ. журн. - 1999. - №1.

46. Кулинский В.И., Ольховский И.А. Две адаптационные стратегии в неблагоприятных условиях - резистентная и толерантная. Роль гормонов и рецепторов // Усп. совр. биол. - 1992. - Т. 112, №5-6. - С. 697-714.

47. Ленинджер А. Основы биохимии. - М.: Мир, 1985. - 957 с.

48. Линчевская А.А., Кондратьева Л.А. Влияние гипотермии на структурно-функциональные свойства мембран эритроцитов белых крыс // Вопр. мед. химии. - 1989. - Т. 35, вып. 6. - С. 36-39.

49. Логинов А. С, Матюшин Б.Н. Цитотоксическое действие активных форм кислорода и механизмы развития хронического процесса в печени при ее патологии // Пат. физиол. и экспер. терапия. - 1996. - №4. - С. 3-6.

50. Ломакина Л.В. Действие низкой температуры на перекисное окисление и интенсивность протеолиза в мозгу и печени крыс // Укр. биохим. журн. - 1980. - Т. 52, №3. - С. 305-308.

51. Львова С.П., Горбунова Т.Ф., Абаева Е.М. Влияние гипотермии и даларгина на перекисное окисление липидов в тканях крыс // Вопр. мед. хим. -1993. - Т. 39, вып. 3. - С. 21-24.

52. Львова С.П., Абаева Е.М., Гасангаджиева А.Г., Михайленко И.К. Антиоксидантная система тканей крыс при гипотермии и введении даларгина // Вопр. мед. хим. - 2002. - Т.48. - С. 189-195.

53. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Активированные кислородные метаболиты в монооксидазных реакциях // Бюллетень СО РАМН. -2005. - №4 (118). - С. 7-12.

54. Майстрах Е.В. Патологическая физиология охлаждения человека. Л.: Медицина, 1975. - 216 с.

55. Меерсон Ф.З. Защитные эффекты адаптации и некоторые перспективы развития адаптационной медицины // Успехи физиол. наук. - 1993. - Т. 22, №2. - С. 52-59.

56. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Сафина А.Ф. Механизмы развития окислительного стресса при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда // Успехи совр. биол. - 1997. - Т. 117, вып. 3. - С. 362-372.

57. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтетазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. - 2000. - Т. 65, вып. 4. - С. 485-503.

...