Алгоритм использования аллергологических тестов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Производственная фирма Симеста»

Алгоритм использования аллергологических тестов

Гареев А.Л.

Аннотация

В статье дана характеристика сложившейся практики взаимоотношений врачей-клиницистов с врачами-лаборантами. Прослеживается зависимость в формировании перечня и содержания лабораторных услуг от задач, выдвигаемые клиницистом. Это могут быть тесты, основанные исключительно на экстрактных маркерах, тесты могут включать компоненты экстрактов, вполне возможно, что в будущем тесты будут эпитопными. Описан процесс резорбции белков во внутреннюю среду макроорганизма. Подчеркнута исключительно важная роль микробиома слизистых и кожи в поступательной деструкции белковых структур. Определяющим является то, что пути проникновения, минуя среду обитания микробиома, не существует. Сделан акцент на том, что аллергологическая реакция возможна только в том случае, при котором деструкция белка не приводит к полному расщеплению до аминокислот, сохранившиеся белковые структуры, проникая во внутреннюю среду, воспринимаются иммунной системой как антиген (аллерген) с последующим запуском каскада гуморальных и клеточных реакций. Это дает основание утверждать, что основой патогенеза аллергологического заболевания является недостаточность факторов деструкции белков, участвующих как со стороны макроорганизма, так и со стороны микробиома. Нормализация функционирования этих факторов должна привести к выздоровлению аллергологического больного. АСИТ должно рассматриваться как паллиатив. Основным и единственным механизмом резорбции является пассивная диффузия. Оценена определяющая роль степени диссоциации электролитных растворов, создаваемых белковыми молекулами. Микробиом представлен как дополнительный, химерный для макроорганизма орган, роль которого заключается в формировании барьерных, защитных функций, не допускающий проникновение во внутреннюю среду антигенных структур. Делается вывод, что основной задачей врача аллерголога на этапе диагностики должно являться стремление выявить сенсибилизацию к белкам гомологам, составляющих одну группу. Такой подход дает возможность оценить распространение сенсибилизации среди белков гомологов различной природы происхождения, тем самым оценить максимально широко патологический процесс у конкретного больного. Лабораторные тесты производства Симесты учитывают изложенные представления, по этой причине выстроены в систему с продуманной последовательностью использования в зависимости от клинических проявлений и результатов предыдущего исследования. В линейке предложений присутствуют тесты оригинальной компоновки, не предлагаемые иными производителями. Это линейные блоты, собранные исключительно по групповому признаку, а именно блот «Profilins Polcalcins», блот «PR-10, nsLTP», блот «Storage proteins», блот «Serum albumins, Lipocalins», блот «Tropomyosins». Алгоритм применения тестов разнесен на три уровня, гибко используя с привязкой к конкретной клинической ситуации, у врача клинициста появляется возможность получить максимально возможную информацию при минимальных затратах. Оценивая перспективы развития аллергологии, делается предположение о разработке с последующим внедрением в практику эпитопных тестов, результаты исследования по которым даст возможность с использованием математических инструментов моделировать конструкцию белковой структуры, проникшую во внутреннюю среду. Это позволит определить недостающие факторы деструкции аллергена у конкретного пациента, что выведет на патогенетическое лечение.

Ключевые слова: экстрактная аллергология, молекулярная аллергология, эпитопная аллергология, гомологичные белки-аллергены, перекрестная реактивность, амфотерность белков, диссоциация электролитов, деструкция белков, пассивная диффузия, линейные блоты, аллергологические тесты.

Abstract

Algorithm for the use of allergy tests

Gareev A.L.

«Production enterprise Simesta»

The article describes the current practice of the relationship between clinicians and laboratory doctors. The dependence in the formation of the list and content of laboratory services on the tasks put forward by the clinician is traced. These may be tests based solely on extractable markers, tests may include extract components, it is possible that in the future the tests will be epitope. The process of protein resorption into the internal environment of a macroorganism is described. The extremely important role of the microbiome of the mucous membranes and the skin in the translational destruction of protein structures is emphasized. The determining factor is that the path of penetration, bypassing the habitat of the microbiome, does not exist. The emphasis is placed on the fact that an allergological reaction is possible only in the case where protein destruction does not lead to complete degradation to amino acids, preserved protein structures, penetrating into the internal environment, are perceived by the immune system as an antigen (allergen) with the subsequent launch of a cascade of humoral and cellular reactions. This suggests that the basis of the pathogenesis of an allergic disease is the insufficiency of protein destruction factors, which are involved both from the macroorganism and from the microbiome. Normalization of the functioning of these factors should lead to the recovery of the allergic patient. ASIT should be considered as a palliative. The main and only resorption mechanism is passive diffusion. The determining role of the degree of dissociation of electrolyte solutions created by protein molecules is estimated. The microbiome is presented as an additional organ, chimeric for a macroorganism, whose role is to form barrier, protective functions, preventing the penetration of antigenic structures into the internal environment. It is concluded that the main task of the allergist doctor at the stage of diagnosis should be the desire to identify sensitization to protein homologs that make up one group. This approach makes it possible to assess the spread of sensitization among proteins of homologs of various nature of origin, thereby assessing the most widespread pathological process in a particular patient. Laboratory tests for the production of Simesta take into account the ideas presented, for this reason they are arranged in a system with a thought-out sequence of use, depending on the clinical manifestations and the results of the previous study. In the line of proposals there are tests of the original layout, not offered by other manufacturers. These are linear blots collected exclusively on a group basis, namely the Profilins Polcalcins blot, the PR-10, nsLTP blot, the Storage proteins blot, the Serum albumins, Lipocalins blot, the Tropomyosins blot. The test application algorithm is divided into three levels, flexibly using with reference to a specific clinical situation, the clinician's doctor has the opportunity to obtain the most possible information at the lowest possible cost. Assessing the prospects for the development of allergology, an assumption is made about the development with subsequent implementation of epitope tests into practice, the results of the study on which will make it possible using mathematical tools to model the structure of the protein structure that has penetrated the internal environment. This will determine the missing factors of the destruction of the allergen in a particular patient, which will lead to pathogenetic treatment.

Keywords: extract allergology, molecular allergology, epitope allergology, homologous allergen proteins, cross-reactivity, protein amphotericity, electrolyte dissociation, protein destruction, passive diffusion, linear blots, allergological tests.

Анотація

Алгоритм використання алергологічних тестів Гарєєв А.Л.

«Виробнича фірма Сіместа»

У статті дана характеристика сформованій практиці взаємовідносин лікарів-клініцистів з лікарями лаборантами. Простежується залежність у формуванні переліку та змісту лабораторних послуг від завдань, що висуваються клініцистом. Це можуть бути тести, засновані виключно на екстрактивних маркерах, тести можуть включати компоненти екстрактів, цілком можливо, що в майбутньому тести будуть епітопними. Описано процес резорбції білків у внутрішнє середовище макроорганізму. Підкреслено виключно важливу роль мікробіома слизових і шкіри в поступальній деструкції білкових структур. Визначальним є те, що шляхів проникнення, минаючи середовище проживання мікробіому, не існує. Зроблено акцент на тому, що алергологічна реакція можлива тільки в тому випадку, при якому деструкція білка не приводить до повного розщеплення до амінокислот, на якій залишилися білкові структури, проникаючи у внутрішнє середовище, сприймаються імунною системою як антиген (алерген) з наступним запуском каскаду гуморальних і клітинних реакцій. Це дає підставу стверджувати, що основою патогенезу алергологічного захворювання є недостатність факторів деструкції білків, що беруть участь як з боку макроорганізму, так і з боку мікробіома. Нормалізація функціонування цих факторів повинна привести до одужання алергологічного хворого. АСИТ має розглядатися як паліатив. Основним і єдиним механізмом резорбції є пасивна дифузія. Оцінена визначальна роль ступеня дисоціації електролітних розчинів, що створюються білковими молекулами. Мікробом представлений як додатковий, химерний для макроорганізму орган, роль якого полягає у формуванні бар'єрних, захисних функцій, який не допускає проникнення у внутрішнє середовище антигенних структур. Робиться висновок, що основним завданням лікаря алерголога на етапі діагностики повинно бути прагнення виявити сенсибілізацію до білків гомологів, що становлять одну групу. Такий підхід дає можливість оцінити поширення сенсибілізації серед білків гомологів різної природи походження, тим самим оцінити максимально широко патологічний процес у конкретного хворого. Лабораторні тести виробництва СІМЕСТА враховують викладені уявлення, з цієї причини вбудовані в систему з продуманою послідовністю використання в залежності від клінічних проявів і результатів попереднього дослідження. У лінійці пропозицій присутні тести оригінального компонування, що не пропонуються іншими виробниками. Це лінійні блоти, зібрані виключно за груповою ознакою, а саме блот «Profilins Polcalcins», блот «PR-10, nsLTP», блот «Storage proteins», блот «Serum albumins, Lipocalins», блот «Tropomyosins». Алгоритм застосування тестів рознесений на три рівні, гнучко використовуючи з прив'язкою до конкретної клінічної ситуації, у лікаря клініциста з'являється можливість отримати максимально можливу інформацію при мінімальних витратах. Оцінюючи перспективи розвитку алергології, робиться припущення про розробку з подальшим впровадження в практику епітопних тестів, результати дослідження за якими дасть можливість з використанням математичних інструментів моделювати конструкцію білкової структури, що проникла у внутрішнє середовище. Це дозволить визначити відсутні чинники деструкції алергену у конкретного пацієнта, що виведе на патогенетичне лікування.

Ключові слова. Екстрактивні алергологія, молекулярна алергологія, епітопной алергологія, гомологічні білки-аллергенв, перехресна реактивність, амфотерность білків, дисоціація електролітів, деструкція білків, пасивна діффузія, лінєйні блоти, алергологічні тести

Вступление

Развитие лабораторного дела напрямую связано с тенденциями в клинической практике любой медицинской дисциплины. Аллергология не исключение. Будучи дополнительным инструментом, используя который, можно подтвердить, уточнить, несколько изменить понимания врача о природе патологического состояния пациента, ибо только клиническое течение заболевания может быть основой результативной диагностики. Это не ново, но живо. Врач клиницист в силу своей квалификации формирует заказ, ставит задачу перед лабораторией о проведении исследований с тем информационным содержанием, которое для клинициста необходимо. Заложенные в 1906 году Клементсом Перке принципы классической аллергологии на протяжении 20-го века развивались. В этой работе принимали участие отечественные и зарубежные исследователи. [1-5]

Эти принципы сохраняют свою актуальность до сегодняшнего дня. В представлениях об этиологии и патогенезе аллергологического заболевания неизменным остается факт того, что безвредное вещество внешней среды в прошлом, никак не вызывающее патологическую реакцию при контакте с макроорганизмом, в настоящем такую реакцию вызывает. И второе обстоятельство - свидетельство того, что одно и то же вещество у одного макроорганизма реакцию не вызывает, а у другого в тот же момент времени - вызывает. Вывод, который очень естественен - защитные механизмы, будучи эффективными ранее, перестают быть таковыми. Роль такого барьера отводится иммунной системе. Значит, здоровая ранее иммунная система заболевает, что проявляется в гиперчувствительности. Аллергия - это болезнь иммунной системы, которая подлежит лечению. Из этого исходил сто лет назад Перке, этим руководствуются современные аллергологи.

Не сомневаясь в том, что в окружающей человека сфере находятся вещества с повышенной аллергенностью, была развернута работа по исследованию свойства тысяч веществ внешней среды с оценкой степени аллергенности. Был достигнут прогресс в количественном определении характеристик, которые отличают аллергены от неаллергенов. Полученная информация легла в основу Структурной базы данных аллергенных белков (SDAP, http://fermi.utmb. edu/SDAP/). SDAP содержит характеристики более чем 800 аллергенов, включая название, групповую принадлежность, структуру белка, значимые эпитопы и ссылки на дополнительные электронные и печатные источники (PubMed, MEDLINE). [6-8]

Представление о том, что аллергия является заболеванием иммунной системы, формировала направления в изучении патогенетических механизмов такого процесса. Были определены сложнейшие взаимосвязи иммунокомпетентных клеток и гуморальных факторов, определяющих тяжесть клинических проявлений аллергологического заболевания у конкретного пациента. [9]

Сложившаяся практика лабораторных исследований в зависимости от поставленных задач врачом-клиницистом

Сенсибилизация к целостным экстрактам аллергенов является пусковым элементом патологического процесса. Такое представление о патогенезе аллергии определяет востребованность лабораторных исследований, маркерами в которых являются экстракты аллергенов с тенденцией расширить перечень аллергенов в тесте максимально, от признанных аллергенными цитрусовые, ракообразные, латекс и т.д. до экзотических, таких как корм для аквариумных рыбок. Информативность таких тестов дает возможность врачу клиницисту делать однозначный вывод об этиологии заболевания пациента и назначать лечение, исходя из перечня выявленных сенсибилизирующих аллергенов. Тесты, скомпонованные исключительно маркерами экстрактных аллергенов, востребованы врачами клиницистами, что делает необходимым иметь их в арсенале лаборатории.

Несколько десятилетий назад развитие теории привело к формированию понятия молекулярной аллергологии. Была определена компонентная структура аллергена. Представления о целостности, однородности, монолитности аллергена претерпели изменения. Были выявлены отдельные белки - компоненты экстракта, которые отвечают за специфическую сенсибилизацию у больного аллергологическим заболеванием. Трендом молекулярной аллергологии является представление о сенсибилизации к мажорным аллергенам, которая является истинной. [10]

Такое понимание отражается на формировании лабораторных услуг, которые сводятся к работе с мажорными и минорными аллергенами. Перечень известных на сегодня мажоров и миноров достаточно ограничен, что определяет компоновку относительно небольшого числа тестов. Врач аллерголог заинтересован получить информацию о сенсибилизации к мажорному аллергену, что определит тактику лечения больного. Лабораторное подтверждение такой сенсибилизации дает основания назначить АСИТ, Сенсибилизация к минору ограничивает врача приемами симптоматического лечении. [11]

Проявленной реактивности к даже одному мажору воспринимается врачом исчерпывающим, необходимость проводить дополнительные лабораторные исследования не наступает.

Но взаимоотношения клинициста с лаборантом могут формироваться не только в одностороннем порядке, где заказчиком выступает клиницист, а лаборант выполняет востребованное исследование. Аллергология развивается стремительно и не всегда действующие врачи аллергологи имеют информацию о новых тенденциях. Производственная фирма Симеста разработала линейку аллергологических тестов, компоновка которых отлична от принятых схем.

Были оценены сложившиеся основные направления в лабораторной аллергологии. Эти направления описываются как движение «top-down» сверху вниз и противоположное - «bottom-up» движение снизу вверх. [12]

Первое из них предполагает, что врач аллерголог оценивает всю сумму клинических проявлений и, основываясь на выявленных симптомах, назначает целенаправленно для подтверждения предполагаемого диагноза тесты с выборочным перечнем маркеров. Тесты, дающие возможность собрать в одно исследование под конкретного больного нужную только ему комбинацию маркеров и количественно, и с учетом их специфических характеристик, доступны, присутствуют на рынке лабораторных услуг. Это реализуемо в силу максимально длинной линейки аллергологических как экстрактных, так и молекулярных маркеров у производителя тестов в таком формате. [13]

Однако, эти возможности искусственно ограничиваются запросами клиницистов-аллергологов, сконцентрировавших свое внимание исключительно на исследованиях мажорных и минорных аллергенов, выводя за рамки оценки сенсибилизацию к не вошедшим в это число аллергенам. Сенсибилизация к остальным не оценивается, не востребована в лабораторной практике.

Формат тестов «движение снизу вверх» также присутствует на рынке лабораторных услуг. Это мультиплексные тесты на чиповой платформе, позволяющие производителю нанести на тестовую основу несколько сотен маркеров для одномоментного исследования. [14, 15]

Очевидно, такой объем информации может носить характер эпидемиологического исследования, удобен для изучения среза сенсибилизации по территориальному, возрастному, иному признаку. Насколько информация по результатам такого тестирования для конкретного пациента оптимальна или избыточна, определяет врач клиницист, заказывая в лаборатории выполнение исследования в таком формате. Поскольку востребованность в таком исследовании сформировалась, лаборатории отвечают своим предложением.

Финансовая доступность для больного того и другого из описанных видов тестирования должна иметь значение и учитываться в иных альтернативных тестах.

Врач аллерголог формулирует задачу перед лабораторией, которая должна иметь в своем распоряжении тесты в формате, обеспечивающий выполнение поставленной задачи. Если аллерголог убежден, что ему достаточно получить результат по сенсибилизации к цельному аллергену, лаборатории подчиненно имеют тесты с экстрактными маркерами. Такая задача сопряжена с пониманием, что сенсибилизация к каждому известному как изначально избыточно «аллергенному» (цитрусовые, морепродукты, латекс и т.д.) продукту растительного и / или животного происхождения носит самостоятельный характер, не принимая во внимание компонентную структуру, существующие связи между гомологами внутри одной группы белков-компонентов этого «аллергенного» экстракта. Диагностика при такой задаче сводится к необходимости тестировать как можно большее число экстрактных маркеров, что отражается на формате тестов - все, что считается «аллергенным», попадает в такие тесты, комбинируется в разных сочетаниях. Чем больше экстрактных маркеров в таком тесте, тем большую ценность он приобретает для врача аллерголога, заказывающий такой тест, а за ним и для лаборанта.

Если врач нацелен выявить сенсибилизацию к мажорным и минорным аллергенам, то тесты в лаборатории под такую задачу выстроены исключительно с наличием мажорных и минорных компонентов экстрактов, без чего-либо дополнительного, становящегося избыточным. Врача-лаборанта мажорный аллерген выводит в приоритетные маркеры, поскольку выявленная сенсибилизация к ним считается истинной, диагностический процесс - выполненным, исчерпывающим, поэтому прекращается. Выявленная сенсибилизация к минорным аллергенам воспринимается как мешающая, «размывающая», «заслоняющая» ответ в отношении истинной сенсибилизации, не имеющая диагностической значимости. Случай же выявления сенсибилизации к аллергену, не входящему в систему градаций мажор-минор, как правило, ставит врача аллерголога в тупик.

Задачей может быть необходимость оценить развитие закономерностей в сенсибилизации к белкам гомологам с учетом перекрестной реактивности для полноценного понимания патологических процессов у конкретного больного. Гомологичность белков предполагает схожесть конструкций аминокислотных цепей, образующих в третичной структуре глобулу. Наличие линейных и конформационных эпитопов с одинаковой последовательностью аминокислот их составляющих, обуславливает схожий по клинике иммунный ответ группы гомологов на реакцию с одним клоном антител. [16]

Количественные характеристики, число белков, индуцирующих сенсибилизацию, их групповая принадлежность отражается на клинической тяжести аллергологического заболевания. [17]

Оценка известных характеристик сенсибилизаторов по третичной белковой структуре, устойчивости ее к деструктивным процессам, которым подвергаются белки при пенетрации микробиомных барьеров слизистых и кожи во внутреннюю среду макроорганизма, дает возможность прогнозировать эпитопную последовательность конструктивных «обломков» белков, вступивших в контакт с иммунокомпетентными клетками больного. [18]

Оценка влияния микробиома на формирование аллергологической реактивности

На пути проникновения антигенных структур во внутреннюю среду человека природой сформированы физиологические барьеры. Такими барьерами являются слизистые респираторного, желудочно-кишечного тракта и кожа, как основные, а также слизистыми органов мочеполовой системы, глаза. [19]

Эти поверхности заселены микроорганизмами, массированно и разнообразно настолько, что это жизненное множество рассматривается в качестве микроэкологической системы. [http://propionix.ru/mikrobiom-cheloveka]

Вариативность типов окислительно-восстановительных реакций энергетического метаболизма у хемотрофных микроорганизмов обеспечивает высокий уровень приспосабли - ваемости к среде обитания, позволяет заселять ареалы барьерных слизистых и кожи. Факультативность дыхания (энергетический обмен) дает микроорганизмам возможность переходить с аэробного на анаэробное сульфатное, нитратное, карбонатное, фумаратное дыхание, в сочетании со спиртовым, молочнокислым, муравьинокислым, маслянокислым, пропионовокислым и другими типами брожения, что обеспечивает циркуляцию штаммов между слизистыми ЖКТ, РТ, кожей, формируя индивидуальный состав микробиома для каждого макроорганизма.

Жизнедеятельность микробиома кожи, слизистых ЖКТ, РТ и макроорганизма находится в динамическом равновесии, гомеостазе, сбалансирована в процессе взаимодействия чрезвычайно разнообразных клеточных и гуморальных факторов. Эта многомерность проявляется в симбиозе, синергизме, комменсализме, метабиозе, конкуренции, паразитизме, нейтрализме между микроорганизмами, составляющих микробиом, и с макроорганизмом-хозяином этого разнообразия жизни.

Вся эта вариабельность постоянно протекающих биохимических, иммунологических процессов, образует бесчисленное количество метаболитов, проявляет себя в качестве барьера, за которым располагается внутренняя среда макроорганизма. Будучи в динамическом равновесии, складывающаяся при постоянной циркуляции бесчисленного числа субстратов из внутренней среды вовне и обратно, микро - экологическая система сохраняет непроницаемость для генетически чужеродных, обладающих антигенными свойствами, агентов, что определяет состояние здоровья для макроорганизма. Эта непроницаемость обеспечивается отчасти механическим удалением со слизистых и кожи агентов воздействия, отчасти сложным биохимическим, иммунологическим воздействием, что призвано привести к полному разрушению внешних чужеродных агентов. Возникновение дисбаланса в микроэкосистеме делает возможным проникновение неизмененного структурно, а чаще в той или иной степени разрушенной, антигенной органической субстанции. [20]

Факт того, что, неизбежно взаимодействуя с физиологическим барьером макроорганизма, органические вещества внешней среды подвергаются деструкции, является определяющим. Многообразие и сложность энергетического метаболизма (катаболизма) и конструктивного метаболизма (анаболизма) делают деструкцию белков при пенетрации неизбежным. [21]

Некоторые авторы, процессы, связанные с метаболизмом микробиома в своих публикациях, сравнивают с «метаболическим реактором», «плавильным котлом». В большей степени уместным такое сравнение представить строительной площадкой по возведению сложных конструктивно устроенных сооружений. Процесс строительства начинается с первых часов жизни макроорганизма, не прекращается до его гибели. Более того, если труп макроорганизма не будет кремирован, а его зароют в землю, то несколько переформатировавшись, процесс будет продолжаться. При этом, строительными материалами служит то, что было получено при разборке построенного ранее, а также, принесенного с каждым вдохом воздушной взвеси, с каждой порцией пищи, с осевшим на кожу биологическим субстратом, и то, что поступило из внутренней среды макроорганизма. Разбирая предыдущие строения, и полученные извне, стройматериалы не вывозятся, не складируются, а запускаются в строительство нового сооружения, которое может быть осуществлено в сложившихся на момент работ условий окружающей среде (показатели рН, влажности, температуры, аэрации, электростатической константы) и требованиям задач, возникших по ходу строительства. Вновь возведенное сооружение с некоторым дискретным шагом во времени разбирается и запускается новый цикл. Интенсивность процесса высока, один цикл составляет несколько десятков минут.

Конструктивные и энергетические процессы протекают в клетке одновременно. У большинства прокариот они тесно связаны между собой. В процессе анаболизма синтезируются многочисленные ферменты, участвующие в энергетическом метаболизме. С другой стороны, в реакциях катаболизма образуется не только энергия для биосинтетических целей, но и многие промежуточные продукты, которые необходимы для синтеза веществ, входящих в состав клеточных структур. Метаболизм прокариот, как энергетический, так и конструктивный, отличается чрезвычайным разнообразием. Это является результатом того, что бактерии в качестве источников энергии и углерода могут использовать самый широкий набор органических и неорганических соединений. Такая способность обусловлена различиями в наборе клеточных периферических ферментов, или экзоферментов, относящихся к классу гидролаз, которые выделяются наружу и разрушают макромолекулы исходных субстратов до веществ с низкой молекулярной массой. Образующиеся в результате действия таких ферментов вещества поступают в клетку бактерий и подвергаются действию ферментов промежуточного метаболизма. Эти ферменты называются эндоферментами, так как они локализуются внутри клетки. Эндоферменты, синтезируемые микроорганизмами, относятся ко всем известным классам ферментов - оксидоредуктазам, трансферазам, гидролазам, лиазам, изомеразам и др. Многие из эндоферментов локализованы на мембранах или на рибосомах, в таком состоянии они называются связанными ферментами. Другие ферменты находятся в свободном, растворенном состоянии в цитоплазме. Набор ферментов в клетке может изменяться в зависимости от условий, в которых обитают бактерии, соответственно все ферменты подразделяют на две группы: конститутивные и индуцибельные. Конститутивные ферменты синтезируются постоянно, независимо от наличия веществ-субстратов. В клетке они обнаруживаются в более или менее постоянных концентрациях. Примером конститутивного фермента является ДНК-полимераза. Ин - дуцибельные ферменты синтезируются в ответ на появление в среде субстрата-индуктора. К ним относится большинство гидролаз. Способность к индукции синтеза таких ферментов обеспечивает быструю приспособляемость бактерий к конкретным условиям.

Как видно, все органические и неорганические вещества, попадающие извне в среду обитания микробиома, используются в качестве субстрата для осуществления своей жизнедеятельности в конструктивных и энергетических процессах. От этого напрямую зависит существование микробиома как такового, что заставляет микроорганизмы использовать все доступные субстраты в их циклическом расщеплении до микросоставляюших с последующим синтезом необходимых для своего выживания макромолекул. Макроорганизму не досталось бы ничего, не существуя синергизма, мутуализма. [22]

В качестве аллергенных агентов выступают белки. Попав в среду обитания микробиома, они неизбежно подвергаются воздействию продуктов катаболизма и анаболизма.

Процесс пассивной диффузии как определяющий в резорбции белковых структур во внутреннюю среду макроорганизма

Растворение в водной среде, процесс денатурации как разрушение третичной структуры белков с последующим распадом пептидных связей накопления свободных аминокислот наступает в неизменной последовательности.

Белки являются амфотерными электролитами. При формировании третичной структуры все гидрофобные части погружаются внутрь молекулы, а на поверхности ориентируются гидрофильные группировки, обеспечивающие взаимодействие белковой молекулы с молекулами воды, составляющие гидратную оболочку, которая возникает за счет электростатического притяжения дипольных молекул воды к заряженной частице белка. Между зарядом белка и гидратацией существует тесная связь: чем больше полярных аминокислот содержится в белке, тем больше связывается молекул воды, что характеризует степень растворимости белка в воде. В растворенном состоянии белок представляет собой коллоидный раствор со свойствами слабых электролитов, в водном растворе аминокислоты ионизированы. Находясь в среде обитания микробиома на слизистых и коже, где с высокой интенсивностью образуется большое количество метаболитов в ходе жизнедеятельности микроорганизмов, меняющееся значение рН в месте пространства расположения белкового раствора в момент времени воздействия на этот раствор, приводит к перманентным изменениям диссоциации белковых молекул. Суммарный заряд карбоксильных и аминогрупп с положительного значения меняется на отрицательное и в обратном порядке беспрерывно, проходя изоэлектрическое состояние при определенном значении рН. В этом состоянии суммарный заряд белка равен нулю. Нулевой заряд определяет минимальную вязкость, максимальную резорбцию через слизистые и кожу, которые выполняют функцию мембранного раздела внешней и внутренней сред. Величина рН является определяющим фактором для каждого белка его изоэлектрического состояния. Поскольку рН перманентно меняется, ни в каком, либо минимальном количестве времени белки в изоэлектрическом состоянии не находятся. Они ионизированы, степень диссоциации, выраженная величиной рКа, постоянно колеблется вслед за колебаниями рН среды. Чем выше валентность зарядов ионизированных молекул белка, тем выше вязкость, снижается пенетри - рующий эффект.

Кроме рН среды имеет значение воздействие на белковые молекулы мицелл детергентов и иных химических структур, обладающих денатурирующими свойствами, такими как мочевина, спирты, фенолы - продукты текущего метаболизма микроорганизмов. Известный пульмонологам сурфактант (в переводе с английского - поверхностно-активное вещество) - выстилающий лёгочные альвеолы изнутри (то есть находящийся на границе воздух-жидкость), препятствует слипанию стенок альвеол при дыхании за счёт снижения поверхностного натяжения плёнки тканевой жидкости, покрывающей альвеолярный эпителий, выступает классическим детергентом, участвуя в денатурации белков, проникшие с потоком воздуха в альвеолы. В настоящее время известно несколько сот различных детергентов. Все они разделяются на два основных класса: ионные и неионные детергенты в зависимости от наличия или отсутствия заряженных групп в гидрофильной области их молекул. Денатурация белка увеличивает степень диссоциации, уменьшая тем самым резорбцию белка. [23,24]

Воздействие протеолитических ферментов связано с постоянным присутствием их в среде микробиома и / или периодическим выделением пищеварительной системой макроорганизма. Образующиеся в ходе расщепления белковых молекул пептиды и отдельные аминокислоты создают градиент концентрации, что путем пассивной диффузии перемещает метаболит из внешней среды через полупроницаемую мембрану слизистой, во внутреннюю. Процесс описан законами Фика. Любая субстанция, метаболит, несколько задержавшийся в своем процессе расщепления, белок, накопившись в критическом значении концентрации, резорбцирует во внутреннюю среду.

Аминокислоты, пенетрировавшие во внутреннюю среду, иммунной системой человека воспринимаются толерантно, аллергологическая реакция не наступает. Пептиды, состоящие более чем из 5-7 аминокислот, воспринимаются как антигены (аллергены) с последующим запуском образования специфических антител. От характера иммуногенных свойств попавшего во внутреннюю среду антигена (аллергена), зависит формирование клинической картины аллергологического воспаления.

Можно предположить, что процесс расщепления белков до аминокислот остается незавершенным при возникшем у конкретного больного сочетанием факторов - значение рН среды воздействия на белок, близкая к изоэлектрической точке по отношению к белку, вызывающего сенсибилизацию у больного, количественная и/ или функциональная недостаточность денатурирующего и протеолитического воздействия на этот белок со стороны микробиома и макроорганизма. Нормализация этих показателей является задачей, стоящей перед врачом-специалистом, взявшегося пользовать аллергологического больного. При этом функционирование иммунной системы с формированием специфического IgE опосредованного ответа необходимо расценивать как норму. Аллергия не является заболеванием иммунной системы, а формируется как один из видов воспаления, в качестве флогогена в котором выступают сохраняющие антигенные свойства, пептиды. [25-27]

Случайность пребывания белковой молекулы, принесенной ли с потоком воздушной взвеси при вдохе, перистальтически ли продвинутый с пищевым комком, тактильным ли контактом с кожей, в момент времени, в месте пространства в сочетании со случайностью значения рН среды того места, в момент времени пребывания белковой молекулы, со случайностью присутствия некоторого количества детергентов там же, со случайностью выделившегося в этот самый момент в описываемое место комплекса протеолитических ферментов, определяет закономерность формирования болезненного (аллергологического) состояния или сохранения здоровья.

Не имеет никакого значения, назван ли этот белок мажорным или он минорный, паналлерген, истинный сенсибилизатор или сопутствующий. Определяющим является сочетание факторов - устойчивость пространственной структуры белковой молекулы, её сохранность, накладываемая на протеолитические потенции конкретного макроорганизма с учетом клиренса поступившего белка в среду микробиома, где и происходит деструкция белков. Если результатом такого взаимодействия остается белковая структура с определенным набором эпитопов, сохраняющие иммуногеные (аллергенные) свойства, и она проникает во внутреннюю среду, возникает аллергологическое заболевание. Вариабельность результатов деструкции белков определяет разнообразие индивидуальных клинических проявлений при сенсибилизации к аллергену с одной пространственной конструкцией белка. [28,29]

Именно количество и разнообразие эпитопов, сохранившихся в процессе деструкции при пенетрации защитного барьера слизистых и кожи определяет клиническую картину аллергологического заболевания. [28]

Можно с достаточно большой степенью уверенности прогнозировать развитие аллергологии от экстрактной, - через молекулярную, - к эпитопной. Рекомбинантные белки, используемые в качестве средств диагностики и лечения, являются предтечей эпитопной аллергологии.

Поскольку клинические проявления определяются иммуногенностью оставшегося по ходу деструкции эпитопного разнообразия, с диагностической точки зрения важно спрогнозировать состав разрушенной структуры белка во внутренней среде макрооргнаизма. Сделать это крайне затруднительно, если возможно вообще. Но понимание того, что степень сохранности белковой структуры внешней среды связана с нарушением гомеостаза микробиома и/ или заболеваниями респираторной, желудочно-кишечной систем, кожи, делает необходимым принимать меры, восстанавливающие функции микробиома, используя, в качестве примера, пробиотические средства и заниматься лечением заболеваний ЖКТ, РТ, кожи с привлечением профильных специалистов. Именно эти факторы, а не «болезнь иммунной системы», определяют патогенез аллергологического воспаления.

Это возможно при понимании пространственной структуры цельного белка, присутствующего во внешней среде. Поскольку феномен гомологичной реактивности делает возможным собрать белки схожей структуры в отдельные группы, диагностический поиск таких групп становится определяющим. Количество белков гомологов, собранных по групповому признаку, имеющих описанные характеристики их структур на сегодня намного больше, чем доступных в качестве лабораторных маркеров. Это ограничивает возможности лабораторной диагностики, но отработанные методики изготовления нативных и рекомбинантных маркеров делают возможным нарастить число новых, ранее не используемых в лаборатории, маркеров. Скорость такого процесса увеличивается со временем.

Выявленная сенсибилизация к одному или нескольким гомологам дает возможность провести анализ известных характеристик белковых структур, которые уже вовлечены или с высокой степенью вероятности как гомологи могут быть вовлечены в процесс формирования клинической картины у конкретного больного. Известно, что структура белков хранителей (storage proteins) устойчива к воздействию внешних факторов, сохраняет жесткость своей конструкции, что объясняет крайнюю тяжесть клинических проявлений при сенсибилизации к Ara h 1,2,3,6,9 Cor a14 Jug r1 и другим. При этом внутри группы гомологов не существует абсолютной идентичности. Это означает, что разрушение в равных условиях у белков-гомологов происходит в разной степени. [30-33]

Напротив, профилины, а, р лактальбулины не стойки, клинические симптомы при сенсибилизации к этим белкам чаще всего легкие.

Поставленная задача на поиск белков-гомологов, дающих сенсибилизацию, определяет формат лабораторных тестов. Тесты при такой задаче должны быть скомпонованы по групповому признаку гомологии. [34]

Алгоритм использования аллергологических тестов

Выбранный производственной фирмой Си - места формат линейного блота дает возможность оптимизировать набор маркеров на каждом из блотов, а количество видовых форм бло - тов, используя которые в определенной последовательности алгоритма, даст, стремящийся к объективности, набор информации при низких затратах для больного. При этом основной целью выбрана необходимость оценить наличие сенсибилизации к максимально доступному числу белков гомологов, не растрачивая ресурсы на оценку белков из гомологичных групп, не затронутых сенсибилизацией, тем самым концентрируя усилия в диагностически значимом направлении. Такая информация даст возможность охарактеризовать, при необходимости прогнозировать, тяжесть аллергологического заболевания, выяснить первопричину в таких цепях как респираторные и пищевые аллергены, клещи-таракан-ракообразные, сывороточных альбуминов молока-красного мяса - эпителия животных и т.д. У врача появляется набор инструментов, которые в зависимости от клинической ситуации, можно применить с максимальной отдачей. Поскольку в каждом конкретном случае объем лабораторного исследования определяется жалобами, анамнезом, клиническими проявлениями, заложена возможность избирательно назначить тест с таким набором маркеров, который для пациента будет приемлемо необходим.

Алгоритм, предлагаемый разработчиками Симесты, предполагает на первом этапе использовать тест с комплектацией исключительно экстрактными маркерами в качестве скрининга. Надо учитывать, что экстрактный тест информационно ограничен, не дает представления о реактивности белков-компонентов, входящих в экстракт. [35]

Но в некоторых случаях респираторной аллергии, когда в ходе опроса пациента, врачу не удается выявить группу аллергенов, которая могла бы сузить и дать направление детализации в поиске сенсибилизатора, использование такого теста оправдано, целесообразно. На рисунке №1 представлен блот «Респираторный экстрактный»

Рисунок 1. Линейный блот «Респираторный экстрактный»

При оценке результата, полученного на основе экстрактного теста, необходимо учитывать важную особенность, которая сводится к тому, что уровень реактивности на экстрактный аллерген, выявленный при инкубации сыворотки пациента, не составляет сумму уровней реактивности каждого составляющего экстракт компонента. Это значит, что в некоторых случаях реактивность на экстракт может быть ниже уровня реактивности одного из компонентов. [12]

В публикации за авторством Jan Hed, Crossreactivity in plant food allergy - Clinical impact of Component Resolved Diagnostics (CRD) Clinical Immunology Karolinska Institute, Stockholm, Sweden приведены результаты аллергологической реактивности сывороток восьми больных, которые инкубировали с экстрактом тимофеевки и ее восьмью белками компонентами. В трех из них уровень реактивности одного из компонента превышал уровень реактивности на экстракт.

Аналогичный результат демонстрируется на мультиплексном блоте Симеста «Пыльца деревьев», (рисунок №2)

Рисунок 2. Фото линейного блота «Пыльца деревьев» с полученным результатом тестирования где реакция на экстракт березы у обследуемого пациента (правая стрелка) с использованием такого блота значительно ниже реакции на Bet v 1 (левая стрелка). Пренебрежением такой особенностью экстрактных тестов ведет к неверной диагностике.

При разработке скринингового респираторного блота принималось во внимание разнообразие аллергенов из различных биологических групп. Это и пыльцевые аллергены, и аллергены клещей и плесеней, эпителий домашних животных и грызунов, обитающих в жилищах человека, и латекс. Гомология дает возможность сократить число маркеров, что освобождает место для компактной структуры теста. Наглядно это отразилось на подборе пыльцевых аллергенов. Число их ограничено не произвольно, а с учетом феномена перекрестной реактивности среди гомологов.

Перекрестная реактивность не относится исключительно к аллергологии. Описанное явление характерно, например, для альбуминов, коллагенов, миоглобинов различных видов животных. Обнаружено также сходство антигенных детерминант стрептококка, сарколеммы миокарда и базальной мембраны почек, Treponema pallidum и липидной вытяжки из миокарда крупного рогатого скота, возбудителя чумы и эритроцитов человека О (I) группы крови.

Возможность использовать принципы перекрестной реактивности в лечебно-диагностических целях зафиксирована в нормативных документах Guidance on Allergen Products CPMP/ BWP/243/96 «Руководстве по продуктам для аллергенов» CPMP/BWP/ 243/96, выпущенном Европейским агентством по лекарственным средствам, содержатся нормативные инструкции, касающиеся качества экстрактов аллергенов для диагностических или терапевтических целей. Текущая редакция данного руководства направлена на преобразование так называемого «принципа таксономических семейств» в «принцип гомологичных групп». Согласно этой концепции, данные одного экстракта аллергена, демонстрирующего стабильность, эффективность и безопасность, могут быть в ограниченной степени экстраполированы на другие экстракты аллергена, принадлежащие к тем же гомологичным группам. [36]

Перечисленные аргументы призваны убедить в правильности выбранного принципа формирования аллергологических тестов «Симесты».

Перекрестная реактивность внутри группы белков-гомологов

Перекрестная реактивность, как явление, возможна в случае структурного сходства белков антигенов, которые в силу своей идентичности в строении, объединены в группы гомологов. Гомологичность обеспечивает комплементарное связывание антител, образованных к эпитопам одного белкового аллергена к идентичным по аминокислотной конфигурации эпитопам других белков-аллергенов, входящих в одну группу. Используя этот принцип, возможно значительно, без существенного ущерба в информативности, сократить число маркеров в тесте. Так, пыльца березы выбрана манифестным маркеров в большом сообществе пыльцевых аллергенов из семейства Fagales. В это семейство входят ольха, орешник, граб, каштан, бук, дуб и еще достаточно большое число деревьев (allergen.org.). Пыльца кипариса (Pinales) гомологична пыльце можжевельников и хвойных деревьев. Близким родственником оливкового дерева (Lamiales) в средних широтах является сирень. По аналогичному принципу выстраиваются гомологичные ряды пыльцы трав. Использовать в тесте экстрактных маркеров тимофеевки, амброзии, полыни, подорожника, постеницы, чертополоха достаточно для оценки возможной сенсибилизации ко всему разнообразию трав средней полосы. Информация, полученная при работе скринингового респираторного теста, не может быть исчерпывающей, что делает необходимым прибегнуть к тестам, уточняющие компонентный состав экстракта и взаимоотношения выявленных гомологов.

С учетом того, что тест содержит экстрактные маркеры растительного происхождения, в составе которых большая вероятность присутствия гликозилированных протеинов, таких как Phl p 4, Сахарная составляющая таких гликопротеинов может содержать карбогидратные детерминанты, антигенность которых достаточна для формирования антител, которые, при их наличии, будут выявляться в сыворотке больного. Поскольку иммуногенность ССЭ крайне низка, присутствие антител к ним клинически не проявляется. Это значит, что выявленные антитела к ССЭ в ходе лабораторного теста могут расцениваться как ложно положительный результат. На экстрактном респираторном блоте «Симе - сты» размещены три маркера ССЭ - бромила- ин, аскорбат оксидазы, пероксидаза хрена. [37]

В случае присутствия в сыворотке пациента антител к ССЭ, маркеры ССЭ на блоте дадут положительную реакцию, что должно свидетельствовать о несколько завышенной реактивности по другим растительным экстрактным маркерам этого блота. В таком случае целесообразно использовать ССЭ блокер, входящий в линейку предлагаемых «Симестой», реактивов. При обработке сыворотки ССЭ блокером, присутствующие в ней антитела с ССЭ будут связаны компонентами блокера с последующим удалением образовавшегося комплекса из исследуемой сыворотки.

Для пищевых аллергенов скрининговым тестом первого этапа был выбран формат мультиплексного блота, на котором одновременно размещены экстрактные и молекулярные маркеры - компоненты этих экстрактов (рисунок №3). Выбор маркеров на этом блоте связан с разнообразием пищевого рациона, что в некотором числе случаев не дает возможность даже больному определить аллерген, вызывающий реакцию на его прием в пищу.

Рисунок 3. Линейный блот «Мультиплексный пищевой профиль»

Маркеры продуктов питания, которые используются в пищевом рационе с раннего до преклонного возраста, оправданно использовать в случаях неопределенности на этапе опроса пациента. Информационный объем достаточно велик и составляет следующее.

Выявленная сенсибилизация к казеину Bos d 8 будет требовать вывести цельное молоко из рациона больного. Сенсибилизация к - лактальбумин Bos d 4 и - лактоглобулины Bos d 5 допускает прием пастеризованного молока. Сенсибилизация к бычьему сывороточному альбумину (BSA) Bos d 6 предполагает возможные перекрестные реакции с сывороточными альбуминами эпителия домашних животных и красного мяса (синдром «кошка-свинина»). Выявить такие связи возможно, используя блот «Сывороточный альбумин, липокалин».

Овомукоид Gal d 1 и Овотрансферрин Gal d 3 являются термостабильными и стойкими к деструкции белками, что предполагает возможность тяжелых аллергических осложнений. Ово - альбумин Gal d 2 не настолько стоек, но выявлены перекрестные реакции с противогриппозной вакциной, очевидно вследствие использования куриных яиц в технологическом процессе изготовления вирусных вакцин.

Tri a 14 белок, ассоциирован с астмой пекаря. Очевидно, что при таком заболевании превалирующее значение имеет такой фактор иммуногенности (аллергенности) как клиренс аллергена. Находясь всю рабочую смену в атмосфере с избыточным содержанием мучной пыли, даже полноценно функционирующая протеолитическая система пекаря не сможет расщепить избыточного количества пшеничного белка. Будучи белком семейства nsLTP, дает перекрестные реакции с гомологами из других ботанических групп. Выявить перекресты внутри этой группы, возможно, используя блот «Симесты» «PR-10 nsLTP». Омега-5-глиадин (Tri a 19) - пшенично-зависимая анафилаксия, вызванная физическими нагрузками (WDEIA), характеризуется анафилактическими реакциями после приема пшеницы и физических упражнений. WDEIA - это редкая, но потенциально тяжелая форма пищевой аллергии. Было показано, что омега-5-глиадин информативен для диагностики WDEIA in vitro.

Gly m 5, Gly m 6. Сенсибилизация к этим белкам определяет тяжесть реакции на сою, могут рассматриваться как диагностические маркеры для выявления больных с высоким риском серьезных клинических симптомов. Gly m 4 относится к семейству PR-10, является основным соевым аллергеном для пациентов, страдающих аллергией на пыльцу березы. Тяжесть аллергической реакции вплоть до анафилаксии определяется сочетанной сенсибилизацией к Bet v 1 и Gly m 4. Выявить перекрестные реакции внутри группы белков PR-10 возможно, используя блот «Симеста» «PR-10 sLTP».

Ara h 1 (викилин), А h 2 (проламин) являются белками хранителями (storage proteins), пространственная структура которых чрезвычайна стойкая, жесткая, устойчивая к процессу деструкции, с чем связаны максимально тяжелые проявления аллергического заболевания при сенсибилизации к этим белкам. Ara h 8 - относится к семейству PR-10, что обуславливает перекрестные реакции с Bet v 1 и Gyl m 4. Ara h 9 - является маркером сенсибилизации к белкам группы nsLTP, которые связаны с системными и тяжелыми реакциями в дополнение к синдрому оральной аллергии (ОАБ).