Карбоксипептидаза А3 в структуре протеазного фенотипа тучных клеток: цитофизиологические аспекты

Размещено на http://www.allbest.ru/

Карбоксипептидаза А3 в структуре протеазного фенотипа тучных клеток: цитофизиологические аспекты

Д.А. Атякшин, А.А. Костин, И.Д. Троценко, В.В. Шишкина, М. Тиманн, И.Б. Бухвалов

Аннотация

Карбоксипептидаза А3 (СРА3) является специфической протеазой тучных клеток (ТК) с вариабельной экспрессией и входит в число преформированных компонентов секретома. CPA3 принимает участие в регуляции состояния специфического тканевого микроокружения и компонентов интегративно-буферной метаболической среды при адаптивных и патологических процессах, затрагивая реализацию врожденного иммунитета, механизмы ангиогенеза, процессы ремоделирования межклеточного матрикса и др. Идентификация СРА3 c помощью протоколов мультиплексной иммуногистохимии позволяет конкретизировать детали органоспецифических популяционных характеристик тучных клеток, включая протеазный фенотип, механизмы биогенеза с цито- и гистотопографическими критериями, а также особенности секреторных путей. Многочисленные биологические эффекты СРА3, включая участие в регуляции состояния легочной паренхимы и системного кровотока, в биогенезе и ремоделировании волокнистого компонента внеклеточного матрикса, в эпигенетическом репрограммировании, определяют важность фундаментальных исследований физиологической активности протеазы и ее вовлеченности в реализацию патологических процессов. Дальнейшие исследования будут способствовать раскрытию трансляционного значения характеристик экспрессии CPA3 ТК в качестве прогностического фактора и перспективной молекулярной мишени терапии социально значимых заболеваний.

Ключевые слова: карбоксипептидаза А3, тучные клетки, секретом, гранулы, секреторные пути, специфическое тканевое микроокружение

Abstract

Carboxypeptidase A3 in the structure of the protease phenotype of mast cells: cytophysiological aspects

Dmitrii Atiakshin, Andrey Kostin, Ivan Trotsenko, Victoria Shishkina, Markus Tiemann , Igor Buchwalow

Carboxypeptidase A3 (CPA3) is a specific protease of mast cells (MC) with variable expression and appears to be one of the preformed components of the secretome. CPA3 is involved in regulation of the state of a specific tissue microenvironment and components of the integrative-buffer metabolic environment in adaptive and pathological processes; it affects implementation of the innate immunity, mechanisms of angiogenesis, processes of the extracellular matrix remodeling, etc. CPA3 identification using protocols of multiplex immunohistochemistry allows specifying details of the organ-specific mast cell population features, including the protease phenotype, mechanisms of biogenesis with cyto- and histotopographic criteria, and features of secretory pathways. Numerous biological effects of CPA3, including participation in the regulation of the pulmonary parenchyma and systemic blood flow, in biogenesis and remodeling of the fibrous component of the extracellular matrix, in epigenetic reprogramming, determine the importance of fundamental investigation of the physiological activity of protease and its involvement in the implementation of pathological processes. Further studies will contribute to the detection of the translational value of the mast cell CPA3 expression features as a prognostic factor and a promising molecular target for treatment of socially significant diseases.

Keywords: carboxypeptidase A3, mast cells, secretome, granules, secretory pathways, specific tissue microenvironment

Введение

Тучные клетки (ТК) являются важной частью иммунной системы и находятся в центре внимания многочисленных биомедицинских исследований. После открытия Паулем Эрлихом тучных клеток были получены многочисленные данные об особенностях их функционального потенциала в зависимости от состояния специфического тканевого микроокружения, включая сенсорные и регуляторные свойства к клеткам и неклеточным структурам экстрацеллюлярного матрикса [1-9]. Дифференцируясь от CD 34+ клеток красного костного мозга, ТК поступают в кровеносное русло и выборочно заселяют различные ткани и органы, в которых происходит их созревание [10-12]. Регуляторное влияние на дифференцировку ТК оказывают цитокины, хемокины и факторы роста, включая некоторые интерлейкины (ИЛ): ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-33, фактор стволовых клеток, трансформирующий фактор роста бета и др.

В итоге ТК приобретают секретомный фенотип, характеризующийся специфическим соотношением преформированных компонентов, включая протеазы, протеогликаны, лизосомальные ферменты, биогенные амины, факторы роста, хемокины, цитокины и др. [1, 13, 14]. Наиболее часто ТК человека классифицируют в соответствии с содержанием специфических протеаз--химазы и триптазы [15, 16]. В то же время наравне с ними карбоксипептидаза А3 (СРА3) является не менее обильным компонентом секретома тучных клеток в количественном отношении [17-21]. Биогенез СРА3 начинается с процессов транскрипции в ядре, продолжаясь в цитоплазме ТК на рибосомах, цистернах эндоплазматической сети и посттрансляционными модификациями в комплексе Гольджи.

В ходе дальнейшего процессинга СРА3 становится активным ферментом при созревании гранул и приобретает характерную локализацию, определяя особенности цитологического и ультраструктурного фенотипа ТК. Различные секреторные механизмы выведения СРА3 во внеклеточный матрикс приводят к формированию биологических эффектов, наиболее значимыми среди которых можно считать реализацию врожденного иммунитета, регуляцию состояния специфического тканевого микроокружения и компонентов интегративно-буферной метаболической среды, участие в механизмах ангиогенеза, процессах ремоделирования межклеточного матрикса и др. Включение СРА3 в формирование ряда биологических эффектов других специфических протеаз ТК расширяет диапазон функционального значения экзопептидазы. В частности, показана вовлеченность СРА3 в патогенез рака, воспалительных заболеваний органов желудочно-кишечного тракта, дыхательной и сердечни-сосудистой систем, нарушений опорно-двигательного аппарата, в том числе благодаря регуляторным эффектам по отношению к состоянию интегративно-буферной метаболической среды специфического тканевого микроокружения и иммуногенезу [18, 22-39]. Кроме того, CPA3 в плазме крови показал себя как объективный биомаркер для выявления пациентов с тяжелым течением COVID-19 [40].

Ключевая работа в области биологии ТК по систематизации морфофункциональных особенностей СРА3 ТК была выполнена в 2009 году, [17] и к настоящему времени назрела необходимость дополнить имеющиеся сведения новыми результатами. Технологии иммуногистохимической визуализации СРА3 раскрывают новые органоспецифические характеристики популяции ТК и предоставляют дополнительную информацию при интерпретации результатов морфологического анализа, важную как для повышения объективности диагностических алгоритмов, так и более точной оценки результатов проводимого лечения, включая протеазный фенотип, механизмы биогенеза с цито- и гистотопографическими критериями, а также особенности секреторных путей. Фундаментальные аспекты процессинга СРА3 тучных клеток имеют важное прикладное значение в качестве объекта диагностики, фармакологической мишени и критерия эффективности терапии.

Молекулярно-генетические аспекты

Информация о протеазах занимает около 5 % белок-кодирующих последовательностей генома человека, что позволяет уровню общего пула соответствующих мРНК в ТК находиться в сопоставимых величинах с результатами экспрессии генов «домашнего хозяйства». Вследствие высокого уровня экспрессии протеазы могут составлять третью часть от общего количества белков в цитоплазме ТК [16, 41-43]. СРА3 входит в число специфических протеаз ТК, и в отличие от триптазы или химазы является цинк-содержащей металлопротеиназой с экзопептидазной активностью [21]. Ген CPA3 человека состоит из 11 экзонов и локализован на 3 хромосоме 3 (3q24), формируя вместе с геном карбоксипептидазы B 1 поджелудочной железы (CPB 1) обособленный локус «CPB1-CPA3».

Данный локус расположен на границе с областью гена рецептора ангиотензина II типа с одной стороны и, с другой стороны, с генами GYG1 и HLTF. Ген GYG1 кодирует фермент гликогенин-1, участвующий в синтезе гликогена, а ген HLTF кодирует хеликазо- подобный фактор транскрипции [21]. В гранулах ТК CPA3 может составлять от 0,5 до 16 мкг/10⁶ тучных клеток в зависимости в зависимости от органной принадлежности [44]. При этом CPA3 человека имеет гомологичные признаки CPA3 грызунов по молекулярной организации и аминокислотным остаткам, участвующих в связывании цинка с субстратом [44, 45]. На сегодняшний день экспрессия гена CPA3 обнаружена только в ТК, за возможным исключением базофильных лейкоцитов у пациентов с аллергическим анамнезом [41, 45-51]. У крыс до 0,5 % общего пула мРНК в ТК брюшной полости составляет мРНК CPA3, превышая экспрессионный уровень транскрипции гена актина [52].

В тоже время, существуют органоспецифические особенности содержания СРА3 в ТК, поскольку экспрессия гена CPA3 может характеризоваться высокой вариабельностью. Например, у грызунов экспрессия CPA3 выявлялась в субпопуляции соединительнотканных ТК, находящихся в серозной полости, коже и подслизистой оболочки органов пищеварительного тракта, и не обнаруживалась в ТК слизистой оболочки кишечника и дыхательных путей [48, 52, 53-55]. У человека экспрессия карбоксипептидазы А3 была выявлена в соединительнотканных ТК, обладающих, как правило, одновременным биогенезом триптазы и химазы [17, 56]. В то же время в проведенных исследованиях по выявлению специфических протеаз ТК мы обнаружили, что CPA3 может экспрессироваться также и в триптаза-позитивных ТК человека с отсутствием химазы, в том числе в слизистой оболочке желудка и тонкой кишки. Аналогичные данные были получены в недавнем исследовании, показавшими различные уровни содержания СРА3 в тучных клетках кожи, легких и кишечника [20]. ТК с экспрессией обеих специфических протеаз содержали СРА3 в большем количестве по сравнению с фенотипом ТК «триптаза+химаза^-». В то же время уровень экспрессии мРНК СРА3 в некоторых ТК был противоположным содержанию специфической протеазы в клетке [20]. Присутствие СРА3 в триптаза-позитивных ТК существенно дополняет данные о функциональной значимости солокализации СРА3 с химазой [17, 20]. Более того, при некоторых патологических состояниях были обнаружены химаза-негативные тучные клетки с экспрессией СРА3 [37, 57-59].

Количественные показатели внутриклеточного содержания CPA3 могут быть использованы в качестве маркера дифференцировки ТК, поскольку содержание протеазы возрастает во время созревания [53, 60, 61]. Известна определенная роль факторов транскрипции GATA в регуляции экспрессии гена CPA3 [62, 63]. Наоборот, MITF, играющий важную роль в регуляции генов химазы и триптазы ТК, не оказывает влияния на транскрипцию гена CPA3 [64]. Также было показано, что экспрессия гена CPA3 существенно возрастает при влиянии глюкокортикоидов [65, 66]. В ТК легких была показана тесная связь экспрессии гена СРА3 с содержанием мРНК триптазы, а не химазы [20].

Было сделано предположение, что на экспрессию гена СРА3 влияют стимулы, связанные с врожденным, а не с адаптивным иммунитетом [17].

Биогенез CPA3 в ТК реализуется в ходе последовательных внутриклеточных этапов синтеза и завершается постепенной укладкой ее в гранулах в комплексе с другими компонентами секретома. На завершающих этапах биогенеза GPA3 представляет собой форму, обладающую биологической активностью. На предполагаемой структуре молекулы CPA3, по аналогии с панкреатической карбоксипептидазой В свиней, была предсказана ее глобулярная структура, представляющая собой трехслойный белок с расположением восьми в-цепей в центре и а-спиралями снаружи, активный локус которого расположен на С-конце в-слоя [17]. При этом в молекуле CPA3 было предположено преобладание положительно заряженных аминокислотных остатков (Arg, Lys и His), что важно с точки зрения взаимодействия с полианионами секреторных гранул ТК в процессе интрагранулярной укладки, в частности, с гепарином. Секреторные гранулы как источник СРА3 представляют собой уникальные внутриклеточные структуры с высокоспецифичной регуляцией активности выведения протеазы и других компонентов секретома за пределы материнской гранулы в цитозоль и внеклеточный матрикс [1, 17, 67-70].

Биогенез CPA3+ гранул тучных клеток

Начальные этапы формирования предшественников СРА3-позитивных гранул ТК происходят в ЭПС в процессе трансляции и транспорта белков, синтеза липидов и других компонентов секретома. В комплексе Гольджи СРА3 последовательно перемещается от цис-отдела к транс-отделу и в конечном итоге отшнуровывается в составе транспортных везикул, покрытых клатрином [71-73]. Данные оформленные структуры, которые можно назвать «програнулами», могут соединяться друг с другом и ранними эндосомами, постепенно увеличиваясь в объеме [68, 74]. Механизмы слияния «програнул», происходящих с участием секретограни- на III, до сих пор неизвестны и находятся в фокусе фундаментальных исследований [1].

Постепенное созревание «програнул» сопровождается выборочным накоплением в матриксе специфических протеаз, а также других компонентов секретома вместе со снижением рН интрагранулярной среды до 5,5 [61]. Согласно различным предположениям формирование окончательного промежуточного секреторного фенотипа может происходит как за счет селективного включения новых продуктов по мере прохождения в комплексе Гольджи (КГ), так и выборочного удаления некоторых продуктов в процессе созревания гранулы. В частности, с помощью гликозилирования секретом насыщается лизосомальными гидролазами [71, 75]. В механизмах включения СРА3 в интрагранулярный матрикс принимают участие серглицин и гликозаминогликаны, обеспечивающие как накопление, так и регуляцию активности протеазы [1, 17, 76, 77].

Серглицин необходим для хранения СРА3 и обладает способностью модулировать активность протеазы после секреции, принимая участие в транспорте, активации и взаимодействия с субстратами или клетками-мишенями. Следует особенно отметить зависимость количественного интрагранулярного распределения СРА3 от биологических эффектов протеогликанов, принимающих участие в важнейших этапах процессинга и динамической аккумуляции преформированных компонентов секретома [1, 61, 78]. В частности, процессинг про-CPA3 зависит от гепарина, ассоциированного с серглицином [79]. Данные свойства серглицина проявляются аналогичным образом при биогенезе триптазы и химазы [80-83].

При созревании proCPA3 в зрелую специфическую протеазу ТК могут принимать участие цистеиновые протеазы, включая лизосомальные катепсины [84]. При этом особое значение принимают локализованные в секреторных гранулах катепсины E, С, S [85, 86]. Возможность окончательного завершения пострансляционных изменений СРА3 непосредственно в гранулах рассматривалась в работе Rath-Wolfson L. [87]. Степень процессинга про-CPA3 в активную протеазу может зависеть как от возраста клеток, так и всего организма [87, 88].

При образовании секреторных лизосом комплекс Гольджи функционирует как сортировщик белков, создавая необходимые условия для селективного включения и модификации ассоциированных с гранулами протеогликанов, а также сульфатирования углеводных и белковых компонентов, что позволяет осуществлять конститутивные и индуцируемые секреторные механизмы в адекватном объеме [71, 73, 78]. После отшнуровки от КГ секреторные «програнулы» постепенно увеличиваются в размерах и приобретают особенности строения центральной и периферической областей, обусловленные их качественным составом [1]. Высокая аккумуляция лизосомальных гидролаз в составе гранул послужила причиной использования термина «секреторные лизосомы». Созревание гранул сопровождается характерной аккумуляцией определенных компонентов секретома в конкретных областях, при этом формируются качественные особенности центральной и периферической зон, что находит свое отражение на результатах иммуногистохимического и ультраструктурного анализах.

В частности, слияние програнулы с поздней эндосомой приводит к формированию в секреторной лизосоме зоны с высокой плотностью аккумулированного материала, которая ограничена по периферии люминальными везикулами [89] (рис. 1). Последующие этапы созревания гранул приводят селективной концентрации регуляторных протеинов в центральной области, большая часть которых состоит из протеогликанов. Сформированное «ядро» гранулы является ареной многочисленных биохимических и пространственных преобразований, координирующих в дальнейшем специализированные ультраструктурные и функциональные события секреторной деятельности ТК. Как правило, центр гранулы насыщается комплексом серглицина с гепарином или хондроитинсульфатом [90]. В предыдущих исследованиях мы получили морфологические подтверждения данной закономерности, в частности, меньшие размеры гранул ТК после окрашивания толуидиновым синим по сравнению с иммуноги- стохимической идентификацией триптазы ТК [91].

Координирующая роль серглицина для интрагранулярного распределения специфических протеаз и других медиаторов связана с его химической структурой, обеспечивающей формирование электростатических взаимодействий отрицательно заряженных гликозаминогликанов с участками специфических протеаз, обладающих позитивным зарядом [1].

Важным инструментом ТК для качественного и количественного изменения секретома гранул при их созревании и реализации некоторых механизмов секреторных путей является эндосомальный рециркулирующий компартмент [78] (рис. 1). Гранулы ТК могут стать источником формирования протеаза-содержащих экзосом, при этом не исключается включение в них СРА3 (рис. 1) [92, 93]. По степени зрелости секреторные гранулы можно отнести к трем основным типам [1, 72, 78]. Гранулами I типа, по сути, являются эндосомы или лизосомы с люминальными везикулами. Ультраструктурный анализ свидетельствует о низкой степени уплотненности в них составных компонентов и преобладающее содержание микровезикул [94]. В механизмах объединения «програнул» с эндосомами, приводящих к формированию более крупной органеллы, принимает участие белок Rab5 [95] (рис. 1). Циклы объединения могут многократно повторяться между секреторными гранулами различной степени зрелости, приводя к формированию гранул II типа и сопровождаясь избирательным накоплением некоторых преформированных компонентов секретома в определенном соотношении [94, 95]. Исследования на ультраструктурном уровне выявили ряд отличий строения секреторных гранул I и II типов, в том числе образование в последних электронноплотного ядра, вокруг которого аккумулируются мультивезикулярные тельца [72, 94]. Среди посредников RabS-ассоциированного слияния секреторных гранул необходимо учитывать мембранный протеин VAMP8, который принимает участие в определении итоговых размеров гранул [96].

Рис. 1. Основные этапы биогенеза и секреторных путей карбоксипептидазы А3 (CPA3) тучных клеток с учетом цитотопографии, внутригранулярной локализации и секреторных механизмов. (адаптировано по Atiakshin DA с соавт., 2021)

Скорость созревания до формата III типа может существенно различаться [68]. В соответствии с требуемой интенсивностью биогенеза в гранулах с характерной интрагранулярной укладкой аккумулируются протеогликаны, преформированные компоненты секретома и другие медиаторы. Созревшие гранулы III типа обладают наиболее крупными размерами, и при некоторых патологических состояниях могут достигать размера 1 мкм и более. Следует учитывать, что общая совокупность гранул с особенностями содержания медиаторов создают в определенном смысле неповторимый индивидуальный секреторный фенотип каждой ТК. Кроме того, зрелые гранулы сохраняют способность к динамичному изменению своего состава и, возможно, объема. В частности, процессы включения ряда медиаторов в состав гранулы или, наоборот, секреции сопряжены друг с другом. В некоторых из них принимает участие протеин синаптотагмин III, опосредующий селективный обмен и направленный транспорт некоторых компонентов секретома между эндосомальным рециркулирующим компартментом и секреторными гранулами [97]. В результате зрелые гранулы ТК могут накапливать арсенал специфических протеаз в тесной взаимосвязи с другими медиаторами (рис. 1). Поступление гистамина и серотонина в гранулы происходит с использованием системы везикулярного транспорта моноаминов. При этом повышение уровня гистамина в гранулах коррелирует с возрастанием концентрации специфических протеаз, что позволяет предположить различные механизмы данного биогенного амина в биогенезе триптазы, химазы и СРА3 [76, 98]. На конечных этапах созревания секреторных гранул становится различимой преимущественная периферическая локализация СРА3, особенно в случае достижения ими крупных размеров гранул (рис. 2, 3).

При этом важной интрагранулярной особенностью СРА3 по сравнению с другими специфическими протеазами ТК является более центральное расположение, кнутри от локусов аккумуляции триптазы и химазы (рис. 3).

Некоторые компоненты секреторных гранул могут поступать в ТК из внеклеточного матрикса, в том числе фактор некроза опухолей, главный щелочной протеин эозинофилов, гистамин и др. [99-101]. При этом дискутабельным остается вопрос о функциональном значении данного явления по отношению к состоянию специфического тканевого микроокружения.

Рис. 2. Цитотопография и морфологические признаки биогенеза CPA3 ТК: (а) - тонзилла, начальные стадии интрагранулярной укладки CPA3 ТК; (б) - желудок, образование нескольких CPA3+-гранул в ТК, свободно расположенных в цитоплазме; (в, г, д, е) - меланома кожи, различные варианты расположения CPA3+-гранулами в цитоплазме; ж, з - меланома кожи, денуклеация ядра ТК; (з, и) - кожа, преимущественная периферическая локализация секреторных гранул в цитоплазме ТК; (к) - меланома кожи, общий вид тучной клетки, заполненной зрелыми CPA3- позитивными гранулами, протеаза расположена на периферии гранулы (указано стрелкой), происходит процесс гетеротипического слияния гранул, приводящий к увеличению итогового размера формирующейся структуры (двойная стрелка); масштабная шкала: к - 1 мкм; остальные - 5 мкм

При наличии молекулярных сигналов для активации секреторных путей СРА3, особенно, в случае присутствия секреторных стимулов на протяжении длительного времени при хронизации патобиологических процессов, образование гранул интенсифицируется и сопровождается более активным формированием в КГ «програнул» с дальнейшими этапами созревания [13, 61, 74, 102, 103]. Подобно другим специфическим протеазам ТК, CPA3 хранится в секреторных гранулах в активной форме. Это было показано для зрелых ТК в то время как в менее дифференцированных ТК костного мозга выявляли про-СРА3 с сохраненным активационным пептидом, которая может доминировать над активной формой фермента [79, 88]. Низкая ферментативная активность время интрагранулярного хранения обеспечивается кислой средой гранул (рН 5,5), в то время как оптимальный pH для деятельности СРА3 находится в диапазоне рН от 7 до 9.

Локализация карбоксипептидазы А3 в гранулах отражается на их гомеостазе. Эксперименты на мышах с нокаутированным геном СРА3 показали изменение гистохимических свойств тучных клеток, снижение эффекта метахромазии при отсутствии ультрамикроскопических изменений, а также тесную взаимосвязь содержания СРА3 с другой специфической протеазой--Mouse Mast Cell Protease-5 (mMCP-5), являющейся аналогом химазы человека [104, 105]. При этом повышение содержания в тучных клетках СРА3 сопровождалось возрастанием уровня mMCP-5, а недостаток mMCP-5 приводил к неспособности накопления в гранулах CPA3 [85].

Фундаментальные исследования Dvorak AM позволили ей и коллегам приблизиться к понимаю физиологического значения локализации РНК в матриксе гранул [67, 106-108]. Благодаря полученным данным функция накопления, хранения и секреции медиаторов секреторных гранул тучных клеток, включая СРА3, была дополнена возможностью автономного биогенеза некоторых компонентов секретома. Данные процессы в секреторных гранулах могут происходить как внутриклеточно, так, очевидно, и продолжаться после секреции в межклеточный матрикс.

Цитотопографические особенности СРА3

Содержание СРА3 в гранулах и количество СРА3+ гранул в цитоплазме ТК обладает широкой вариабельностью, от отсутствия или малого содержания до полного заполнения объема клетки (рис. 2-5). Локализация карбоксипептидаз в гранулах ТК убедительно показывается иммуногисто-химическими протоколами и может быть использована для характеристики структуры популяции ТК (рис. 2-5) [109]. Технологии мультиплексной иммуногистохимии открывают новые особенности клеточной и интрагранулярной локализации СРА3 в ТК с другими специфическими протеазами (рис. 2), а также характеристику гистотопографического расположения СРА3+ ТК в органах (рис. 5). Иммуноморфологическая оценка секреции СРА3 к селективным мишеням специфического тканевого микроокружения способствует раскрытию ранее неизвестных деталей функционального потенциала экзопептидазы.

Закономерности распределения СРА3 в гранулах до сих пор являются нераскрытым вопросом. Согласно нашим предположениям фермент образует макромолекулярные комплексы с гликозаминоглика- нами в гранулах в тесной взаимосвязи с триптазой и химазой. В то же время возможно избирательное взаимодействие СРА3 с определенными протеогли- канами гранул. В частности, такое суждение было сделано при анализе секреторных гранул после дегрануляции ТК, в которых обнаруживалась химаза с СРА3, либо только триптаза [46, 47, 53]. В то же время мы показали, что после дегрануляции в СРА3+ гранулах детектируется и триптаза (рис. 3). Таким образом, фенотип специфических протеаз секретируемых гранул может быть существенно вариабельным в зависимости от состояния специфического микроокружения. Это находит свое подтверждение в работах по иммуноморфологическому исследованию ТК, показавших наличие гранул с различным качественным составом [109]. Имеются данные о необходимости колокализации СРА3 с химазой для ее депонирования [17].

Наши результаты показывают, что в независимости от наличия триптазы или химазы СРА3 может содержаться в гранулах тучных клеток в высоком количестве. В зависимости от уровня биогенеза гранул СРА3 может занимать центральную область гранул, или быть в виде кольца по периферии (рис. 1-3). В любом случае необходимо отметить, что колокализация МС-СРА3 в гранулах с другими специфическими протеазами происходит с внутренней стороны гранулы, иногда занимая всю площадь при гранулах небольших размеров (рис. 3).

С точки зрения электронной иммуногистохимии проводилась оценка локализации специфических протеаз в гранулах тучных клеток [110, 111]. ТК мукозной субпопуляции (с экспрессией триптазы) обладали гранулами «свиткоподобного ультраструктурного фенотипа» [112]. В этом случае в гранулах идентифицировались похожие на «свитки» однонаправленные концентрические пластины, в некоторых случаях окружающие «ядро» гранулы [110]. В соединительнотканной субпопуляции ТК с одновременной экспрессией триптазы и химазы гранулы имели специфичный ультраструктурный фенотип с малым количеством свитков и аморфной центральной областью, окруженной параллельными пластиноподобными структурами [112]. В зависимости от степени зрелости, центральная зона таких гранул могла содержать электронно-плотный материал в виде решетки, а также одно или несколько аморфных областей с высокой контрастностью [111]. Вместе с этим известны данные о возможности контурирования электронноплотных образований в различных вариантах, включая, помимо свитков, кристаллы, бусины и нитевидные образования [67, 113]. Очевидно, что данные структуры могут быть обусловлены взаимным расположением СРА3 с триптазой и химазой, а также другими преформированными компонентами секретома. В ранее выполненных работах показано принципиальная возможность солокализации СРА3 с химазой, триптазой и катепсином G [112].

Рис. 3. Интрагранулярная локализация CPA3 и триптазы в тучных клетках меланомы кожи; (а) - опухолевое микроокружение, тесная солокализация триптазы и CPA3 в гранулах тучных клеток, часть которых селективно сосредоточена в области контакта с ядром соседней клетки (указано стрелкой); (б) - общий вид тучной клетки, ассоциированной с опухолью, триптаза и CPA3 солокализованы в одних и тех же гранулах ТК, при этом в зрелых гранулах CPA3 располагается кнутри от триптазы (указано стрелкой); (в) - ассоциированная с опухолью тучная клетка вытянутой формы, в которой присутствуют CPA3 гранулы без триптазы (указано стрелкой) и с триптазой (двойная стрелка); масштабная шкала: б - 1 мкм, остальные - 5 мкм

В линии мышей с нокаутом гена CPA3 дефекты гранул не были выявлены на ультраструктурном уровне, однако наблюдалась повышенная растворимость протеогликанов гранул ТК [104]. Возможно, что отсутствие СРА3 приводило к изменению пространственной конфигурации серглицина со специфическими протеазами тучных клеток, и, как следствие, изменению гистохимического окрашивания гранул.

Однако вопрос о молекулярной локализации протеаз в визуализируемых ультраструктурах гранул следует считать открытым, поскольку с момента цитируемых результатов электронномикроскопических исследований к настоящему времени изменилась как техника пробоподготовки, так и технологии микроскопии [114]. Структура гранул будет определяться степенью зрелости, активностью включения компонентов секретома, этапами формирования специфических протеаз, а также интенсивностью секреторных путей, которая будет определяться совокупностью значимых внутриклеточных и экс- трацеллюлярных сигналов.

Аспекты солокализации СРА3 с другими компонентами гранул тучных клеток могут быть исчерпывающе охарактеризованы при использовании технологии мультиплексной иммуногистохимии [109]. Наши исследования показали, что протеазы могут находится как в разных гранулах, так и в одних и тех же, занимая сходные локусы в интрагранулярном матриксе (Рисунок 3). Соотношение тучных клеток с иммунофенотипами CPA3⁺Tr⁺Ch⁺, CPA3⁺Tr⁺Ch^- или CPA3+TrCh+ в органоспецифичной популяции и оценка активности секреции CPA3 имеет важное значение для определения состояния тканевого микроокружения, обладая диагностической значимостью как адаптивных, так и патологических изменений [10, 109, 115]. Кроме того, на уровне отдельно взятой ТК следует учитывать локализацию карбоксипептидаза-позитивных гранул, которые могут располагаться перинуклеарно, заполнять весь объем цитоплазмы с различной степенью плотности расположения либо занимать периферическое положение, локализуясь в периплазмалеммной области (рис. 2). При этом в случае наличия у тучной клетки вытянутой цитоплазмы ее безъядерная часть может напоминать отросток, в котором также сохраняется периферическая локализация гранул. Данная закономерность была обнаружена и в ТК при мастоцитозе [109]. Дальнейшее исследование молекулярной морфологии интрагранулярной солокализации CPA3 c другими компонентами секретома с большой долей вероятности может привести к верификации новых диагностических маркеров, включая социально значимые заболевания.

Можно предположить, что CPA3 необходима для биогенеза как триптазы, так и химазы тучных клеток. В то же время нет уверенности в том, что иммуногистохимическое окрашивание учитывает весь объем популяции тучных клеток в органе. В частности, в экспериментах на крысах с помощью комбинированного гистохимического протокола мы показали, что по признаку метахромазии может выявляться большее большое количество тучных клеток в коже. Это позволяет считать, что общий пул ТК в органе может ускользать от внимания исследователей, если они опираются только на содержание одной из специфических протеаз [91].

Особенностью, которая отличает CPA3 от ферментативных аналогов карбоксипептидаз в поджелудочной железе, является высокое содержание положительно заряженных аминокислотных остатков. Это может опосредовать взаимодействия CPA3 с отрицательно заряженными протеогликанами серглицина в комплексе с гепарином или хондро- итин-сульфатом, которые в большом количестве присутствуют в секреторных гранулах ТК [116]. Была показана высокая афинность связи CPA3 с гепарином, при этом имеются данные об отличии комплексов гепарина с CPA3 и химазой от гепарин-триптазных комплексов [110, 117]. Кроме того, возможно, что после дегрануляции химаза и CPA3 некоторое время могут удерживаться на поверхности ТК [118].

Четкие доказательства необходимости гепарина в регулировании накопления и хранения CPA3 были получены после экспериментов по инактивации гена ключевого фермента в биосинтезе гепарина --^деацетилазы/М-сульфотрансферазы-2 [119, 120]. У таких животных практически полностью отсутствовал белок CPA3, несмотря на поддержание высокого уровня соответствующей мРНК. Показано важное значение гепарина и серглицина для хранения CPA3 [79, 81, 120].

Рис. 4. Морфологические эквиваленты секреторных путей СРА3-позитивных тучных клеток: (а ,б) - тонзилла, смешанный экзоцитоз CPA3 с вероятным участием пейсмекерной дегрануляции; (в) - меланома кожи, высокое содержание экзосом в CPA3+ тучной клетке; (г-д) - тонзилла, морфологические эквиваленты направленной секреции CPA3 к соседним клеткам механизмом экзоцитоза; (е, ж) -- кожа, совместный экзоцитоз двух ТК CPA3+ секреторного материала по направлению ядра фибробласта (указано стрелкой) и коллагеновых волокон (двойная стрелка); (з- и) - тонзилла, начальная (з) и последующая (и) стадии дегрануляции тучных клеток механизмом экзоцитоза (указано стрелкой); (к-л) - кожа, активный экзоцитоз секреторных гранул во внеклеточный матрикс с формированием локусов тканевого микроокружения с высоким содержанием CPA3+ гранул (указано стрелкой), морфологические эквиваленты отшнуровки макровезикулы от материнской CPA3+ ТК (указано стрелкой)

Секреторные пути СРА3

Можно предположить, что хранение СРА3 в активной форме, готовой для реализации физиологических эффектов, позволяет ТК практически моментально использовать ее ферментативный потенциал при различных способах секреции, включая пейсмекерную дегрануляцию, механизм «kiss-and- run», смешанный экзоцитоз и др. (см. рис. 1, 4). При высвобождении СРА3 из интрагранулярных локусов хранения в экстрацеллюлярный матрикс сохранение ее биологической активности может зависеть от связей с гепарином, защищающим от действия эндогенных ингибиторов. Очевидно, что способы секреции СРА3 во внеклеточный матрикс определяют особенности ее биологических эффектов на структуры и клетки тканевого микроокружения. При необходимости поддержания определенных концентраций СРА3 во внеклеточном матриксе ее определенный уровень может создаваться фоновой секрецией протеазы с помощью постепенной (или пейсмекерной) дегрануляции ТК (см. рис. 1).

Активность пейсмекерной секреции определяется существующими в настоящий момент стимулами во внеклеточной среде для достижения определенных фоновых значений СРА3 во внеклеточной среде. Безусловно, эти значения гораздо ниже по сравнению с уровнями, необходимыми для реализации врожденного иммунитета, однако, очевидно, они вносят свой вклад в формирование общей резистентности организма по отношению к некоторым вызовам. Механизмы «челночной» секреции связаны с процессами обособления от материнской гранулы микровезикул, размер которых составляет от 30 до 150 нм [121]. Микровезикулы могут содержать небольшие количества протеаз, протеогликанов и других медиаторов, предназначенных для секреции за пределы материнской ТК для селективных эффектов на компоненты специфического тканевого микроокружения. Показано, что в механизмах пейсмекреной дегрануляции ключевое значение выполняют везикулярные белки (v-SNARE) и белки принимающей органеллы (t-SNARE), обеспечивающие транспорт микровезикул в цитоплазме ТК, а также слияние с другими мембранными ор- ганеллами или плазматической мембраной [122]. Несмотря на то, что интенсивность постепенной дегрануляции с вовлечением СРА3 может меняться в соответствии с существующими потребностями тканевого микроокружения [70, 78; 123], в первую очередь данный секреторный путь используется для организации выведения в экстрацеллюлярный матрикс небольших количеств СРА3 (рис. 1, 4 а, б). Кроме того, функциональный потенциал пейсмекерной дегрануляции используется в обеспечении взаимодействия ТК внутри органоспецифичной популяции, и в некоторых случаях ассоциирован с развитием патологии, в том числе аллергии, воспалении, онкогенезе и др. [70].

Секреция СРА3 с помощью пейсмекерной дегрануляции может быть превалирующим механизмом в тучных клетках. При этом отсутствие СРА3 в гранулах может вызвать ошибочное представление об уровне экспрессии данной протеазы в тучной клетке. Подобное мнение выражают авторы о биогенезе СРА3 в тучных клетках легких, в которых секреция СРА3 предположительно происходила без хранения в гранулах [20]. Секреторные пути предварительно сформированных компонентов секретома тучных клеток с помощью не-IgE-опосредованных механизмов широко используются тучными клетками в ответ воздействие инфекционных агентов, токсинов, гормонов, аларминов, а также при изменении параметров интегративно-буферной метаболической среды тканевого микроокружения [2].

Другим вариантом секреторных путей медиаторов ТК является механизм «kiss-and-run» [78] (рис. 1). В некоторых исследованиях была показана высокая частота использования данного механизма для секреции [124]. При этом секреторная гранула ТК локализуется в периплазмалеммной области, соприкасается с плазматической мембраной, и образует временную пору. В этот момент через соустье с межклеточным матриксом возможна секреция протеаз и других медиаторов, которые могут оказывать свои физиологические эффекты в месте дегрануляции, при этом ресурс медиаторов секреторной гранулы сохраняется. Вероятно, что при таком способе дегрануляции возможно более интенсивное выведение СРА3 за единицу времени.

Имеются морфологические свидетельства о возможности использования в секреторных путях СРА3 ТК молекулярного механизма трансгрануляции (рис. 1). При солокализации с другими клетками в прилегающем локусе плазматической мембраны ТК формируются микровыпячивания, контактирующие с плазмалеммой другой клетки. Описана трансгрануляция между ТК и фибробластами, эндотелием капилляров и нейронами [70]. Можно интерпретировать индуктивное влияние СРА3 при прилежании ТК к другим клеткам и внеклеточным структурам специфического тканевого микроокружения, включая иммунокомпетентные клетки, эпителии, представителей фибробластического дифферона, коллагеновые волокна и т.д. [125] (рис. 5).

Формирование экзосом представляет собой важный механизм по реализации биологических эффектов специфических протеаз тучных клеток как в физиологических условиях секреции, так и патологических состояниях активации дегрануляции [70, 92, 93, 126] (рис. 1). Состав продуцируемых экзосом в ТК является пластичным параметром и может существенно изменяться в зависимости от конститутивной секреции или стимулированной дегрануляции, вызванной различными причинами [93, 101]. В экзосомах могут содержаться различные виды РНК, включая мРНК и микро-РНК, фактор некроза опухоли альфа и другие компоненты секретома, которые могут подвергаются трансферу в другие ТК, а также в другие иммунокомпетентные и стромальные клетки в зоне паракринного влияния, оказывая специфические эффекты на процессы развития, миграции и биосинтеза цитокинов, хемокинов и факторов роста [126]. Возможность либерализации СРА3 из ТК в составе экзосом существенно расширяет регуляторный потенциал протеазы по отношению к клеточным и неклеточным компонентам специфического тканевого микроокружения [93]. В силу известных комплексов химазы с СРА3 вполне возможна секреция последней с помощью экзосом. Различная степень вовлеченности экзосомального механизма в секреторные пути СРА3 ТК подтверждается результатами мультиплексного иммуногистохимического окрашивания (рис. 4в).

В некоторых случаях для интенсификации поступления СРА3 ТК во внеклеточный матрикс могут быть использованы механизмы секреции отдельных гранул или отдельных фрагментов цитоплазмы ТК--«макровезикул» (рис. 4 г-л) [70; 82, 83, 127]. Данные способы секреторной деятельности ТК приводят к формированию обособленных структур, обладающих свойствами автономии и тем самым представлять собой вариант расширения реализации потенциальных эффектов ТК на расстоянии, значительно превышающим область распространения паракринных эффектов. В ряде случаев становится очевидной направленная секреция СРА3 в направлении ядерных структур других клеток (рис. 4 г-ж). Исследование СРА3 в данном аспекте представляется особенно интересным после открытия способности триптазы оказывать регуляторные эффекты на гистоны ядер и тем самым влиять на пролиферативную активность клеток [128-130].

Рис. 5. Гистотопографические особенности распределения CPA3+ тучных клеток в органах: (а) -- тонзилла, локализация CPA3+ ТК в лимфоидной ткани (указано стрелкой) и строме (указано двойной стрелкой); (б, в) -- тощая кишка, распределение ТК в строме ворсин (б -- указано стрелкой) и межкриптальной строме собственной пластинки слизистой оболочки (в -- указано стрелкой); (г) -- тонзилла, ТК в тяжах лимфоидной ткани; (д) -- тощая кишка, взаимодействие ТК с покровным эпителием собственной пластике слизистой оболочки; (е-и) -- желудок, солокализация Тк с покровным эпителием слизистой оболочки (е), гладкими миоцитами в мышечном слое (ж), железистым эпителием собственной пластинки слизистой оболочки (з), периневрием подслизистой оболочки (и); (к, л) -- кожа, капилляры в дерме кожи (указаны стрелкой) и CPA3+ ТК, окружающая один из них (указано стрелкой), (к) -- солокализация ТК со стромальными клетками, очевидно, что КПА3 может воздействовать на несколько клеток одновременно, включая фибробласт (обозначен стрелкой) и иммунокомпетентную клетку (указано двойной стрелкой); (м) - тощая кишка, взаимодействие CPA3+ тучной клетки с активированным лимфоцитом (указано стрелкой); (н-п) -- меланома кожи, солокализация ТК с фибробластом (н), волокнистым компонентом (о), и аморфным компонентом внеклеточного матрикса; масштаб: а-в - 100 мкм, остальные - 5 мкм

Тем более имеются четкие иммуногистохимические доказательства солокализации триптазы и СРА3 при направленной секреции протеаз к ядрам других клеток (рис. 3a). Однако значение СРА3 в данном явлении еще предстоит выяснить. Иногда вследствие активной дегрануляции ТК СРА3+ секреторные гранулы содержатся в высоком количестве в зонах секреции тканевого микроокружения (рис. 4 е, к). Такой способ секреции, с одной стороны, позволяет не только создавать во внеклеточном матриксе значительные количества СРА3 ТК в составе гранул или фрагментах цитоплазмы, но и формировать условия пролонгации координирующей деятельности ТК в отношении некоторых структур [67, 131]. Мы наблюдали образование довольно обширных индуктивных полей с высокой концентрацией СРА3, в частности, у пациентов с меланомой в коже или в тонзилле при хроническом воспалении (рис. 4 к,л). Ультрамикроскопические свидетельства присутствия РНК и рибосом в составе секреторных гранул допускают продолжение биосинтетической активности и после выхода из цитоплазмы ТК [106, 107]. По сравнению с отдельными гранулами фрагменты цитоплазмы ТК можно рассматривать как пролонгацию эффекторного действия специфических протеаз [82, 83]. Кроме того, заслуживает внимания возможность активной миграции к таким образованиям других клеток соединительной ткани, например лейкоцитов, для эндоцитоза необходимых компонентов или получения регуляторных эффектов протеазы.

Анафилактическая дегрануляция ТК представляет собой патологический вариант секреции гранул во внеклеточный матрикс, приводящий к массивной и неконтролируемой экструзии содержимого гранул во внеклеточный матрикс (рис. 1) [78]. При этом взаимодействие IgE с рецепторами FceRI приводит к процессу форсированного транспорта секреторных гранул к плазмалемме ТК, слиянием с ней и дегрануляции медиаторов, включая специфические протеазы ТК. С помощью SNARE-комплекса, в том числе белков SNAP-23, VAMP-7 и VAMP-8, в процесс дегрануляции вовлекаются в первую очередь гранулы, занимающие периплазмалеммное положение, однако в течение короткого в процесс вступают остальные гранулы, что приводит к высвобождению их секреторного пула (рис. 1) [78-132]. Морфологически процесс проявляется потерей интенсивности окрашивания гранул вследствие потери их содержимого, а также формированием крупных цитоплазматических выпячиваний до 1,5 мкм [133]. В цитоплазме ТК можно визуализировать морфологические проявления формирования внутриклеточных магистралей дегрануляции, по которым осуществляется ускоренный транспорт СРА3 к локусам выведения.

Биологические эффекты

Несмотря на обилие СРА3 в тучных клетках в настоящее время отмечается дефицит знаний о ее биологических эффектах по сравнению с другими специфическими протеазами тучных клеток - триптазой и химазой. Наиболее хорошо известно участие CPA3 во врожденном иммунитете. В частности, показано участие протеазы в защите организма от ядов змей и некоторых токсинов [24, 134-136]. Продуцируемые нематодой Ascaris ингибиторы СРА3 ТК существенно увеличивают выживаемость паразита при инфицировании [137]. ТК являются ключевыми игроками в защите от сосудосуживающего пептида эндотелина 1 (ET-1), который играет важную патогенетическую роль при сепсисе, кожном зуде, развитии фиброза и др. [24, 138-141]. Кроме того, ограничивая биологические эффекты ET-1 с помощью СРА3, ТК оказывают важные эффекты на состояние легочной паренхимы и системный кровоток [138, 142].

Также было показано, что СРА3 ТК опосредованно обладает вазодилаторными и бронходилаторными эффектами благодаря способности к трансформации лейкотриена С4 в лейкотриен F4 и тем самым снижения вероятности образования лейкотриенов D 4 и E 4 с более мощными бронхо- и сосудосуживающим эффектами [143].

Известно, что CPA3 может расщеплять ней- ротензин, кинетензин, нейромедин N и ангиотензин I [23, 25, 134, 144, 145]. Деградация сарафо- токсина, нейротензина и ET-1 приводит к потере их биологической активности, тогда как деградация аполипопротеина B может способствовать слиянию липопротеинов низкой плотности и, таким образом, образованию атеросклеротических бляшек [146, 147, 148]. Недостаток CPA3 в плазме крови был отмечен как фактор риска для развития заболеваний сердечно-сосудистой системы, включая элементы микроциркуляторного русла [34].

Функциональное значение комплекса CPA3 с химазой неоднократно рассматривалось, в том числе в аспекте более эффективной деградации субстрата при солокализация протеаз [17, 139, 148]. Кроме того, химаза и CPA3 могут также взаимодействовать в ферментативном расщеплении ангиотензина II [23], при котором каждый из ферментов обладает своей каталитической активностью по отношению к конкретным субстратным белкам. Достаточно тесная морфологическая солокализация химазы и СРА3 может сохраняться после дегрануляции ТК и принимать участие в конвейерном расщеплении белков или других пептидных мишеней внеклеточного матрикса, требующих одновременного присутствия эндо- и экзопептидаз. Предполагается важное значение СРА3 в биогенезе волокнистого компонента внеклеточного матрикса и ремоделировании внеклеточного матрикса. С одной стороны, комплекс СРА3-химаза может индуцировать возрастание митотической активности фибробластов вместе с их биосинтетическим потенциалом [149]. С другой стороны, данный комплекс или протеазы по отдельности могут принимать участие в модификации молекул проколлагена, индуцируя образование коллагеновых фибрилл [15, 150]. Проведенные исследования свидетельствуют об активном участии ТК в механизмах фибриллогенеза, которое проявляется индуктивным влиянием на образование волокнистого компонента тканевого микроокружения, прежде всего рядом с клеточными представителями фибробластического дифферона [125] (рис. 5 д, е, л, н). Также в непосредственной близости к плазмалемме ТК показано наличие ретикулярных волокон или точек инициации фибриллогенеза [125]. Данные аспекты косвенно подтверждаются исследованиями по моделированию спаечных процессов в брюшной полости на лабораторных животных, а также в исследовании легких, подверженных хроническому воспалению или фиброзу, и почках [20, 25, 151].

Недавно были показаны эпигенетические эффекты триптазы благодаря влиянию на состояние гистонов ядра и стабилизацию ДНК [128-130]. Тесная солокализация СРА3 с триптазой создает определенный интерес к степени вовлеченности экзопептидазы в данные эффекты (рис. 3).

У мышей линии Cpa3^Cre+^/ с дефицитом CPA в ТК было обнаружено неполноценное восстановление костной ткани, обусловленное уменьшением численности интраорганной популяции ТК, задержкой реваскуляризации, накопления и минерализации межклеточного вещества новообразованного оссе- оида, а также изменением активности остеокластов и макрофагов [30]. Детекция изменения экспрессии СРА3 при многих заболеваниях подчеркивает существование многих других точек приложения протеазы, исследования которых в будущем поможет идентифицировать новые молекулярные мишени таргетной терапии для повышения эффективности лечения [33, 36, 37, 152-154].

Заключение

Показанные особенности процессинга, аккумуляции и секреторных путей СРА3 вместе с фактами обильного содержания в ТК позволяют считать данную протеазу важной характеристикой протеазного фенотипа ТК и одним из ключевых компонентов органоспецифических характеристик их популяции. Особенности внутриклеточной солокализации СРА3 с другими специфическими протеазами тучных клеток, а также пространственное распределение СРА3+тучных клеток в ткани с установлением закономерностей их солокализации с иммуноком-петентными и стромальными клетками формируют новые представления о фундаментальных механизмах регуляции состояния интегративно-буферной метаболической среды и внеклеточного матрикса. В то же время очевидно, что наши знания о биологических эффектах данной протеазы по сравнению с триптазой и химазой существенно ограничены. Будущие исследования прольют свет на механизмы вовлеченности СРА3 в патогенез различных заболеваний, и что особенно важно, механизмы их зарождения на уровне специфического тканевого микроокружения. СРА3 является перспективной мишенью в трансляционной медицине, как с точки зрения диагностического значения, так и в качестве потенциальной мишени таргетной терапии.