Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ІМ. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

03.00.02 - Біофізика

УДК 612.014.04+577.352.465/612.816

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Особливості кальцієвої сигналізації в різних типах первинних ноцицептивних нейронів та її модуляція

Романенко Сергій

Вячеславович

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі загальної фізіології нервової системи

Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий доктор біологічних наук, aкадемік НАН України, професор, директор

керівник: Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідуючий відділом загальної фізіології нервової системи, Костюк Платон Григорович

Офіційні доктор біологічних наук, професор Ліманський Юрій Петрович, опоненти: Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, зав. відділом фізіології стовбуру мозку доктор біологічних наук Тишкін Сергій Михайлович, Інститут фармакології та токсикології АМН України, головний науковий співробітник відділу експериментальної терапії

Захист відбудеться 18.05.2010 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

Автореферат розісланий 12.04.2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. При багатьох захворюваннях біль є одним із перших, а іноді і єдиним проявом патології та важливим симптомокомплексним індикатором для діагностики. Аналіз відповідних досліджень виявив, що хронічним болем страждає близько 15 % дорослого населення планети. За умов розвитку больових синдромів, що є наслідком патологічних процесів хронічної чи іншої природи такий процент збільшується. Зокрема серед онкохворих такий відсоток складає 67 %. У випадку цукрового діабету частка пацієнтів, що страждає нейропатичними розладами, коливається в діапазоні від 5 % до 100 % в залежності від умов перебігу хвороби. Загалом встановлено, що дві третини загального населення страждають від тих чи інших больових відчуттів протягом тривалого часу і 25 % з них характеризують такий біль як гострий. Отже, проблема болю складає собою значну клінічну проблему, адже сильні больові відчуття призводять до зайвих страждань і, таким чином, ускладнюють процес одужання для пацієнта та проведення успішного лікування для лікаря (Лысенко Г. И., 2007). Крім того, правильне діагностування та відповідний підбір методу лікування болю є складним завданням для лікаря.

Сучасна фармакологія має широкий спектр препаратів, що використовуються для лікування болю. До них відносяться опіати, не стероїдні протизапальні препарати, місцеві анестетики, агоністи і антагоністи гальмівних та збуджувальних медіаторів відповідно, блокатори високопорогових кальцієвих каналів та ін.. Проте обмежуючим фактором у ефективному використанні цих препаратів є не лише часом недостатня їхня ефективність, а й значний рівень побічних ефектів.

Успішне вирішення цієї проблеми можливе за умов специфічного впливу на первинні ноцицептивні нейрони, оскільки вони є першою ланкою у ланцюгу проведення больового імпульсу. У молекулярному сенсі для забезпечення такої специфічності необхідно впливати на активність тих функціональних структур, що безпосередньо сприймають та передають больові стимули. Такими структурами є, зокрема, кальційпроникний рецептор канальний комплекс рецептор гарячих температур - TRPV1 (Cortright D. N., 2009), та потенціал залежний кальцієвий канал N-типу. Слід зауважити, що відомі на сьогодні специфічні блокатори каналів TRPV1 є загалом токсичними для організму речовинами, крім того цей білок досить розповсюджений і в центральній нервовій системі, тобто пряма блокада цього каналу може становити небезпеку. N-тип кальцієвих каналів так само вельми розповсюджений у центральних та периферичних нейронах. Проте комбінація цих каналів є специфічною виключно для первинних ноцицептивних сенсорних нейронів. Питання про роль та активність каналів TRPV1, що експресуються на сомі нейрона дорсальнокорінцевого ганглія (ДКГ) під час його активації дією на чутливе закічення ноцицептивного стимулу, залишається недослідженим. Таким чином, безумовний інтерес становить з'ясування особливостей внутрішньоклітинного кальцієвого сигналу обумовленого активністю каналів TRPV1 в різних типах первинних сенсорних нейронів, а також роль цих каналів в процесах транзієнтної зміни внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію при природньому збудженні плазматичної мембрани соми первинного сенсорного нейрона, а також зміни у внутрішньоклітинній регуляції кальцію, обумовлені модуляцією цих каналів специфічними фармакологічними агентами, впливи цих змін на больову чутливість. Важливим, також, є дослідження взаємодії та/або взаємовпливу між різними типами кальційпроникних каналів, зокрема каналів TRPV1 та потенціалзалежних каналів N- типу, їхнього поодинокого та поєднаного впливу на процеси формування внутрішньоклітинного кальцієвого сигналу, а також впливу блокування однієї з зазаначених кальцій регулюючих структур на активність іншої.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилася в рамках наукової програми відділу загальної фізіології нервової системи інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України - «Пошук ефективних засобів впливу на молекулярні механізми, що обумовлюють збудливість клітин», в рамках спеціальної інноваційної програми НАН України - «Застосування препарату Габагамма, як антинейропатичного препарату при лікуванні діабетичних нейропатій», а також в рамках дослідницької програми Міжнародного центру молекулярної фізіології НАН України - «З'ясування можливих засобів корекції змін ефективності синаптичної передачі на різних рівнях нервової системи» (№ держреєстрації: 0106U010931, 2007-2009).

Мета дослідження. З'ясування особливостей активності та впливу рецептор-канального комплексу TRPV1 на процес збудження в різних типах первинних сенсорних нейронів та дослідження особливостей дії специфічного блокатора кальцієвих каналів N- типу габапентіна на різні типи нейронів ДКГ за нормальних умов та при розвитку стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету, а також можливості опосередкованого моделюючого впливу на канали TRPV1, шляхом блокування каналів N- типу.

Завдання дослідження.

· Простежити участь та вплив каналів TRPV1 в процесі збудження соми нейрона дорсальнокорінцевого ганглія.

· Дослідити активність каналу TRPV1 при різних рівнях концентрації внутрішньоклітинного вільного кальцію, обумовленого деполяризацією нейрона в різних типах первинних сенсорних нейронів.

· З'ясувати ефект антагоніста потенціалзалежного кальцієвого каналу N- типу габапентіна на кальцієві транзієнти в різних популяціях первинних сенсорних нейронів.

· Вивчити ефект антагоніста потенціалзалежного кальцієвого каналу N- типу габапентіна на кальцієві транзієнти в різних популяціях первинних сенсорних нейронів за умов розвитку стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету.

· З'ясувати ефективність модулюючого впливу габапентіну на кальцієві транзієнти, обумовлені активацією каналів TPRV1 в різних типах первинних ноцицепторів.

Об'єкт дослідження - особливості кальцієвої сигналізації в різних типах первинних ноцицептивних нейронів та її модуляція.

Предмет дослідження - модуляція кальцієвих транзієнтів, обумовлених активацією рецепторів TRPV1, шляхом активації потенціал керованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани нейронів ДКГ, або їх пригнічення новітнім препаратом габапентіном.

Методи дослідження - метод вимірювання внутрішньоклітинної концентрації вільних іонів кальцію за допомогою кальцій чутливого флуоресцентного зонду Fura-2/AM, спосіб отримання препарату нейронів ДКГ в умовах гострого експерименту, модель індукції експериментального цукрового діабету.

Наукова новизна отриманих результатів. У роботі вперше показано роль каналів TPRV1 не лише як температурних сенсорів ноцицептивного рівня у первинних сенсорних нейронах, а також як учасників регуляції процесу транзієнтного підвищення внутрішньоклітинної концентрації вільного кальцію. Показано залежність рівня внутрішньоклітинних кальцієвих осциляцій обумовлених деполяризацією нейронів ДКГ при блокуванні капсаїцинових рецепторів, що експресуються в сомі даних нейронів. Виявлено залежність активаційної здатності TPRV1 при активації їх специфічними агоністами від рівня внутрішньоклітинного рівня кальцію при деполяризації клітини. Вперше досліджено особливості впливу габапентіну на різні типи сенсорних нейронів в нормі та за умов розвитку стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету. Показано модулюючі можливості габапентіна у процесі формування кальцієвих транзієнтів, обумовлених активацією каналів TPRV1.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів. Теоретичне значення отриманих даних полягає в молекулярно-мембранних особливостях функції і активності каналів TPRV1 в процесах кальцієвого гомеостазу та кальцієвої сигналізації в різних нейронах ДКГ під час їх природної активності. Практичне значення мають дані, що стосуються особливостей впливу антибольового препарату габапентіну на внутрішньоклітинну кальцієву сигналізацію в різних популяціях первинних сенсорних нейронів як за нормальних умов, так і при розвитку неврологічних ускладнень при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті. Виявлено експериментальним шляхом характерний вплив габапентіну на первинні ноцицептивні нейрони за нормальних умов та нормалізуючий вплив даного агента на первинні сенсорні нейрони при розвитку експериментального цукрового діабету, що свідчить про низький рівень побічних ефектів цього препарату, його потенційну нейропротекторну функцію при розвитку цукрового діабету, що вказує на важливе практичне значення його клінічного застосування з метою ефективного лікування больових синдромів.

Особистий внесок здобувача. Опрацювання літературних джерел і постановка експериментів та інтерпретація отриманих результатів проводилися здобувачем особисто та за участі наукового керівника роботи. Автором спільно з науковим керівником здійснено розробку основних теоретичних та практичних положень роботи, самостійно проведено аналіз та реферування джерел фахової літератури. Експерименти з дослідження особливостей впливу габапентіну на різні популяції первинних сенсорних нейронів щурів за нормальних умов та при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті, а також дослідження особливостей активності каналів TPRV1 в первинних ноцицепторах, статистична обробка даних, підготовка наукової роботи до друку, написання всіх розділів дисертації проводились автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Результати проведеної роботи були представлені на семінарах сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця (Київ, 2007-2009 р.); на літній школі з нейробіології Університету Відня (Відень, 2008); 13-тій зимовій школі СІМО «Biomolecules in health and disease» (Хельсінкі, 2009); міжнародній конференції «Молекулярні механізми внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації» (Київ, 2009).

Публікації. За результатами роботи було опубліковано чотири статті у фахових наукових журналах , затверджених ВАК України, та двоє тез доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, викладення результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних літературних джерел (171 найменування, з них - 159 іноземних джерел). Робота викладена на 135 сторінках та проілюстрована 48 рисунками.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літературних даних складається із 6 підрозділів в яких висвітлені проблеми терапевтичних підходів у лікуванні захворювань, що ускладнені визначеними больовими відчуттями у пацієнтів; зроблено огляд фізіологічних механізмів ноцицепції на рівні первинної ланки шляху передачі больового сигналу - сенсорних нейронів дорсальних гангліїв, розглянуто основні типи больових відчуттів та їх характерні прояви. Окремо розглянуто випадки хронічного та нейропатичного больових синдромів, висвітлено сучасні уявлення про механізми формування даних форм болю; розглянуто етіологію, характер протікання та характерні прояви такого ускладнення, при розвитку цукрового діабету, як діабетична полінейропатія; висвітлено роль кальцієвого гомеостазу та кальцієвих цитозольних осциляцій в сомах нейронів дорсальнокорінцевих гангліїв у регуляції окремих внутрішньоклітинних процесів та, як наслідок, вплив на процес функціонування нейронів та модуляції ноцицептивної модальності в цілому. Детально розглянуто роль різних типів плазмалемальних кальцій проникних структур, що приймають участь у процесі транзієнтного підвищення внутрішньоклітинного кальцію та відповідний їх вплив на процеси формування больового сигналу, зокрема розглянуто потенціалкеровані кальцієві канали L-, N-, P/Q- та T- типу, канали родини TRP, пурінергічні кальцій проникні рецептор-іонофорні комплекси - Р2Х рецептори, чутливі до іонів водню рецептор-іонофорні плазмалемальні комплекси - ASIC канали; наведено відомості про сучасні фармакологічні підходи у лікуванні болю, різновиди таких впливів, проаналізовано ефективність та шкідливість побічних ефектів кожного виду лікування, присвячено окрему увагу новітньому протибольовому препарату - габапентін.

Матеріали та методи досліджень. В експериментах використовували щурів самців лінії Вістар віком 21 день для дослідження особливостей активності каналів TRPV1, та щурів віком 45-50 днів для дослідження впливу габапентіна. При проведенні експериментів дотримувалися національних «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (Україна, 2001), що відповідають вимогам «Європейської конвенції із зхисту хребетних тварин, яких використовують із експериментальною та науковою метою» (ETS №123, Страсбург, 18 березня 1986). Виділені на грудному та поперековому рівнях ганглії переносили в охолоджений модифікований розчин Тіроде наступного складу (у ммоль/л): NaCl - 140, KCl - 2, MgCl2 - 2, CaCl2 - 2, HEPES - 10, глюкоза - 10, рН - 7,35. Для отримання окремих клітин виділені ганглії ферментативно обробляли підігрітим до 36 °С розчином Тіроде, котрий вміщував 1 мг/мл колагенази (тип 1А; «Sigma» , США) та 1 мг/мл протеази (тип XIV; “Sigma”, США) протягом 30 хв. Отриману клітинну суспензію наносили на покривні скельця та вміщували на 30 хв у термостат при температурі 36 ° С та в подальшому використовували у експерименті протягом 4-6 годин після завантаження їх флуоресцентним зондом. Дослідження проводили для 3-х груп нейронів ДКГ: великих (> 35мкм), середніх (25-35 мкм) та маленьких (<25 мкм).

Для індукції експериментально цукрового діабету у щурів ми використовували стрептозотоцинову модель цукрового діабету (Like et. al., 1976), для чого щурам самцям віком 21 день внутрішньочеревинно двічі з інтервалом 24 год. уводили 80 мг/кг стрептозотоцину у 0,9%-му розчині NaCl. Розвиток діабету спостерігали через три-чотири тижні. Рівень глюкози 12-28 ммоль/л вважався достовірною ознакою розвитку діабету, і до групи експериментальних тварин були віднесені щури тільки з такими показниками (Кругліков та ін., 2001).

Для кількісного визначення концентрації кальцію в нейронах дорсальних гангліїв використовувалася мембраннопроникна форма барвника Fura-2 (Fura - 2/АМ), хімічна формула даної речовини - C29H22N3O14. Знаючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати концентрацію внутрішньоклітинного кальцію по формулі яка була запропонована Грінкевічем (Grynkiewicz et. al., 1985):

[Ca2+]i = Kd b (R - Rmin)/(Rmax - R),

де Кd - константа дисоціації комплексу Fura-2 з кальцієм, R=F360/F390 - поточне відношення флуоресцентних сигналів, Rmin = F360/F390 - відношення флуоресцентних сигналів в розчині з гранично низькою концентрацією Ca2+ або повною відсутністю іона, Rmax = F360/F390 - відношення флуоресцентних сигналів в розчині з насичуючою концентрацією Ca2+, b = F390(Ca0 - ммоль/л) / F390(Ca - 10 ммоль/л) - відношення флуоресцентних сигналів в низькій і високій концентрації Ca2+ при збудженні довжиною хвилі 390 нм. В результаті калібрування значення даних констант склали: Rmin=0.9; Rmax=19 і b=26; Кd=224 нмоль/л. Для завантаження нейронів ДКГ флуоресцентним зондом прикріплені до скелець клітини вміщували в розчин Тіроде із додаванням диметилсульфоксидного розчину Fura?2/AM у концентрації 5 мкмоль/л і додаванням 10 мкл/мл 0,05 %-вого розчину детергенту плуронік (F-127, “Molecular Probes”,США) та витримували в термостаті протягом 30 хв. З метою забезпечення деестерифікації незарядженої форми зонду клітини промивали нормальним розчином Тіроде та витримували у темряві при температурі 35 °С протягом 30 хв.

Записи транзієнтів піддавали низькочастотній цифровій фільтрації, застосовуючи програми «Тida 4.11» («HEKA Elektronic», ФРН). Числові дані представлені нижче у вигляді середніх значень ± похибка середнього (s.е.m.); кількість досліджуваних нейронів у кожній группі вказано при першому згадуванні у дужках та разом з відповідним параметром. Статистичну вірогідність між групових різниць оцінювали з використанням критерію Ст'юдента; граничним значенням вважалося Р < 0.05. Склад бімодальних розподілів визначали із застосуванням апроксимації їх сумою розподілів Гауса за методом найменших квадратів з використанням програми «MathLab 2007».

Для кількісного опису отримуваних у експериментах кальцієвих транзієнтів були взяті наступні параметри: амплітуда транзієнта (А); повна тривалість транзієнта (Т); тривалість на рівні половини амплітуди, або півширина (Т 0.5).

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Кальцієві сигнали обумовлені деполяризацією мембрани клітини в первинних сенсорних нейронах щурів у контрольних умовах. Зважаючи на експериментально встановлені відмінності властивостей нейронів дорзальних гангліїв в залежності від величини діаметру їхньої соми та товщини нервового волокна, відповідні зміни кальцієвого транзіента досліджувались окремо для трьох окремих груп нейронів: малого діаметру (до 25 мкм); середнього діаметру (від 25 до 35 мкм) та великого діаметру (більше 35 мкм). Згідно з літературними даними, межі таких діапазонів відповідають об'єктивним характеристикам статистичного розподілу значень розміру нейронів ДКГ (Scroggs et. al., 1992). Чутливі периферичні закінчення маленьких та середніх нейронів ДКГ відносяться до групи ноцицепторів, а відповідні аферентні волокна - до С- та Ад- типу. Великі нейрони ДКГ мають мієлінізовані волокна більшого діаметру та відносяться до відносно низькопорогових соматичних рецепторів (Ганонг, 2002).

Середнє значення базового цитозольного рівня кальцію у спокої ([Ca2+]i0) становило 104,5 ± 4,7 нмоль/л для нейронів великого діаметру (n = 13), 107,6 ± 4,2 нмоль/л - для середніх нейронів (n = 16) та 114,2 ± 4,7 нмоль/л - для маленьких нейронів (n = 9). Для деполяризації нейронів ДКГ використовували аплікацію гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К+ - 50 ммоль/л. Даний розчин аплікували в робочій камері експериментальної установки при повній заміні ним попереднього в усьому об'ємі камери протягом 7 с. Наступна повторна короткочасна деполяризація плазматичної мембрани здійснена прикладанням гіперкалієвого розчину призводила до формування кальцієвих транзієнтів, характеристики яких вважали контрольними.

За своїм характером кальцієві транзієнти у всіх популяціях нейронів були подібними, проте відрізнялися за величинами характерних параметрів. Середнє значення амплітуди кальцієвого транзієнта для великих нейронів у контрольному випадку становило 397,1±17,9 нмоль/л (n=13). Для нейронів середнього розміру середня амплітуда у контрольному випадку складала 411,8±5,6 нмоль/л (n=21). У випадку з нейронами з малим діаметром соми середнє значення амплітуди у контролі дорівнювало 381,1±4,8 нмоль/л (n=21). Середні значення тривалості кальцієвого транзієнта та його тривалості на рівні половини амплітуди (півширини) для великих нейронів у контрольному випадку дорівнювали відповідно 55,4±4,1 с та 17,4±1,6 с. У випадку нейронів середнього розміру відповідні контрольні середні значення тривалості та півширини становлять 31,3±2,4 с та 12,0±0,8 с. Для нейронів з малим діаметром соми середні тривалість та півширина у контролі дорівнювали 44,6±3,1 с та 12,4±0,8 с відповідно.

2. Зміни кальцієвих транзієнтів, обумовлених деполяризацією мембрани нейронів ДКГ різних популяцій, при блокуванні каналів ТRPV1. При проведенні дослідів блокада TRPV1 капсазепіном забезпечувалась аплікацією нормального розчину Тіроде та гіперкалієвого розчину кожен з яких містив капсазепін у концентрації 10 мкмоль/л. Аплікація касазепіну проводилася не менш за 30 секунд до прикладання гіперкалієвого розчину та під час його прикладання (рис. 1).

Амплітуда кальцієвого транзієнта, обумовленого деполяризацією нейрона ДКГ з сомою середнього розміру на тлі коаплікації капсазепіну, складала в середньому 341,5 ± 24,5 нмоль/л (n=13). В порівнянні з аналогічним контрольним транзієнтом дане значення амплітуди є меншим на 21% (p<0,05).

У випадку нейронів с малим розміром соми середнє значення амплітуди склало 330±12,0 нмоль/л (n=9), що у порівнянні з відповідним контрольним значенням було достовірно меншим на 17,5 %. Таким чином в обох групах нейронів спостерігається зменшення амплітуди кальцієвого транзієнта при блокуванні каналів TRPV1 (рис. 2).

Лінією під записами показано тривалість прикладання капсазепіну, стрілками позначені моменти прикладання гіперкалієвого розчину.

Середні значення тривалості та півширини кальцієвих транзієнтів обумовлених прикладанням гіперкалієвого розчину, що вміщував капсазепін, для середніх нейронів становили відповідно 14,2±2,3 с та 13,8±1,0 с.

Порівняння із значенням тривалості транзієнта у контрольних умовах виявило достовірне збільшення цього параметра при застосуванні капсазепіну на 26,9 %. Значення півширини транзієнта фактично не відрізнялося від контрольного та становило 3,1% недостовірного зменшення.

Для нейронів малого розміру значення тривалості кальцієвого транзієнта на тлі коаплікації капсазепіну та його півширини становили відповідно 97,8±10,4 с та 11,7±1,3 с. Відносно контрольного значення тривалість транзієнта під дією капсазепіну була більшою на 46,9 %, проте цей показник не мав статистичної достовірності (р<0,08). Значення півширини транзієнта майже не відрізнялося від контрольного.

Таким чином виявлено, що роль каналів TRPV1, що експресуються у сомах нейронів ДКГ полягає в безпосередній їх участі в процесі формування кальцієвого сигналу в середині клітини при деполяризації мембрани.

3. Зміни активності каналів TRPV1 в первинних ноцицептивних нейронах ДКГ при різних рівнях внутрішньоклітинного кальцію. У даній серії експериментів розділили досліджувані нейрони ДКГ на дві розмірні групи: середні та маленькі. Усі досліджувані нейрони були капсаїцинпозитивними, що характерно лише для ноцицептивних нейронів ДКГ (Liu Min et. al., 2003).

Дослідження впливу транзієнтного підвищення кальцію, обумовленого активацією потенціалкерованих кальцієвих каналів мембрани нейрона на наступний кальцієвий транзієнт, обумовлений активацією ванілоїдних рецепторів, проводили шляхом послідовного прикладання гіперкалієвого розчину, що призводив до деполяризації мембрани, та розчину капсаїцину (специфічного агоніста TRPV1). Для з'ясування того, як змінюється здатність TRPV1 бути активованим капсаїцином протягом розвитку кальцієвого транзієнта обумовленого деполяризацією мембрани, проводили послідовне прикладання вказаних активаторів із затримкою між моментами початку відповідних аплікацій (ДТ), що становили 3, 7 та 10 секунд від моменту початку аплікації гіперкалієвого розчину. Потрібно зазначити, що власне тривалість аплікації гіперкалієвого розчину у наших експериментах становила 7 с, а розчину капсаїцину 10 с. Таким чином, затримка у 3 секунди досягалася шляхом послідовної аплікації гіперкалієвого розчину (3 с), сумішшю гіперкалієвого розчину та капсаїцину (4 с), та розчином капсаїцину у розчині Тіроде (6 с). Затримка у 7 с досягалася послідовним прикладанням активатора, а затримка у 10 с мала проміжок відмивання нормальним розчином Тіроде у 3 с.

На відміну від кальцієвих транзієнтів, викликаних аплікацією гіперкалієвого розчину, які мало відрізняються між групами середніх та маленьких нейронів ДКГ, кальцієві транзієнти викликані прикладанням капсаїцину суттєво відрізнялися між досліджуваними популяціями нейронів. Так амплітуда такого кальцієвого транзієнта у групі середніх нейронів складала 509.7 ± 21.0 нмоль/л (n=8), а у групі маленьких - 619.4 ± 28.9 нмоль/л (n=11). Найбільш суттєвою була різниця у тривалості відповідних транзієнтів. Так, якщо у групі середніх нейронів тривалість транзієнта варіювалася у межах від 120 с до 220 с, то у групі маленьких тривалість перевищувала 450 с. Приклади транзієнтного підвищення кальцію в первинних нейронах ДКГ середнього розміру, обумовленого прикладанням капсаїцину після попередньої деполяризації мембрани із ДТ = 3, 7 та 10 с показані на рис. 3. Зміни внутрішньоклітинного вільного кальцію, обумовлені застосуванням аналогічного попередньому експериментального протоколу в сенсорних нейронах з сомами маленького розміру показано на рис. 4.

У випадку затримки у 3 с таке підвищення, відраховане від базового рівня, складало для середніх нейронів 373.2 ± 11.6 нмоль/л (n=7) (рис. 3 А), а для групи маленьких нейронів ДКГ - 400.1 ± 18.7 нмоль/л (n=7) (рис. 4 А). У випадку затримки від моментами аплікацій у 7 с транзієнтне підвищення кальцію у популяції середніх нейронів в середньому складало 396.9 ± 18.6 нмоль/л (n=9) (рис. 3 Б), в той час як аналогічне значення для маленьких нейронів склало 488.5 ± 42.7 нмоль/л (n=10) (рис. 4 Б). Якщо проміжок часу між прикладанням гіперкалієвого розчину та розчину капсаїцину становив 10 с, то амплітуда транзієнтного підвищення кальцію обумовленого аплікацією капсаїцину для нейронів середнього розміру становила в середньому 486.7 ± 45.1 нмоль/л (n=11) (рис. 3 В ), той самий показник для групи маленьких нейронів склав 480.4 ± 19.3 нмоль/л (n=8) (рис. 4 В).

Як видно із порівняльних діаграм (рис. 5), амплітуди транзієнтного підвищення внутрішньоклітинного кальцію, обумовленого прикладанням капсаїцину після попередньої деполяризації мембрани, в усіх випадках були менші від амплітуд транзієнтів, обумовлених безпоседньою аплікацією капсаїцину (independent), як для групи середніх (рис. 5 А), так і для групи маленьких нейронів ДКГ (рис. 5 Б).

Це свідчить про те, що протягом розвитку кальцієвого транзієнта, обумовленого прикладанням гіперкалієвого розчину здатніть TRPV1 бути активованим селективним агоністом - капсаїцином - зменшується. Реакція на капсаїцин при затримці у 10 с в групі середніх нейронів мало відрізняється за амплітудою від транзієнтів, обумовлених безпоседньою аплікацією капсаїцину. У групі маленьких нейронів ДКГ усі «після деполяризаційні» реакції на капсаїцин значно менші порівняно з незалежним капсаїцинобумовленим транзієнтом (рис. 5 Б), за ам

Особливістю реакцій клітин на капсаїцин після деполяризації було не лише менші амплітуди підвищення внутрішньоклітинного кальцію, але і затримка відповіді на капсаїцин, тобто існувала затримка між моментами початку прикладання капсаїцину та моментом початку формування реакції на даний агент протягом розвитку обумовленого деполяризацією транзієнта -ДtR - (рис. 6).

Так, у групі середніх нейронів ДКГ при ДТ = 3 с затримка ДtR становила в середньому 4.6 ± 0.4 с, а для маленьких нейронів ДКГ цей показник становив 10.0 ± 0.5 с. При ДТ в 7 с такі затримки у реакції на капсаїцин становили в середньому 8.6 ± 0.3 с та 3.8 ± 0.4 с відповідно.

Аналогічні показники у випадку різниці між початками аплікації гіперкалієвого розчину та капсаїцину - 10 с, становили відповідно 6.3 ± 0.5 с та 6.4 ± 0.5 с для середніх та маленьких нейронів ДКГ. Тобто, згадані затримки відповідей на аплікацію капсаїцину, у кожній окремій групі нейронів, вірогідно відрізняються. Це є свідченням впливу внутрішньоклітинних процесів, що мають місце протягом розвитку кальцієвого транзієнта, обумовленого деполяризацією, на вхід кальцію при активації TRPV1.

Ще одною особливістю реакцій нейронів ДКГ обох досліджуваних груп на аплікацію капсаїцину є значення внутрішньоклітинного кальцію з якого починалося формування відповідної реакції (V0). Так, при аплікації капсаїцину через 3 с після початку аплікації гіперкалієвого розчину значення внутрішньоклітинного кальцію з якого починалося формування відповіді на касаїцин в середньому становило: для групи середніх нейронів - 235.6 ± 10.1 нмоль/л, для маленьких нейронів ДКГ - 190.2 ± 10.7 нмоль/л. При з ДТ у 7 с відповідні середні значення становили 153.6 ± 5.7 нмоль/л та 143.6 ± 5.8 нмоль/л. Значення аналогічних параметрів у випадку ДТ = 10 с становили для середніх нейронів 162.7 ± 9.7 нмоль/л, а у групі маленьких нейронів - 131.3 ± 11.4 нмоль/л. рецептор нейрон антагоніст кальцієвий

Отже, cпостерігається чітка тенденція від найменшої реакції на капсаїцин до рівня повного відновлення (як при незалежній відповіді на капсаїцин) при збільшенні часу затримки між моментами прикладання гіперкалієвого та капсаїцинвмісного розчинів. Такий результат вказує на те, що протягом розвитку деполяризаційного транзієнта канали TRPV1 піддаються впливу внутрішньоклітинних чинників, що змінюють їх здатність бути активованими капсаїцином.

4. Особливості впливу габапентіну на різні типи первинних сенсорних нейронів. Для дослідження впливу габапентіну на сенсорні нейрони щурів проводилося порівняння змін внутрішньоклітинної концентрації кальцію у відповідь на короткочасне прикладання гіперкалієвого розчину у контрольних умовах та за умов преаплікації габапентіну протягом п'яти хвилин у насичуючій концентрації 25 мкмоль/л (McClelland et. al., 2004). Дослідження проводились для нейронів малого, середнього та великого діаметру.

Такий результат, зважаючи на те, що нейрони ДКГ з сомами великого розміру відносяться до низькопорогових сенсорних волокон, дає передумови робити висновок, що дія габапентіну скоріш за все спрямована на зменшення саме больових сигналів і не виявляє побічних ефектів на пропріоцептивні нейрони.

Для нейронів середнього розміру преаплікація габапентіну призводила до значного зменшення середньої амплітуди кальцієвого транзієнта та становила 284,0±14,9 нмоль/л (n=16). Як видно із порівняльної діаграми (рис. 8), аплікація габапентіну призводила до значного зменшення амплітуди кальцієвого транзієнти у популяції нейронів середнього розміру. Це в свою чергу означає, що габапентін здатний до модуляції активності первинних сенсорних нейронів, що залучені до передачі больової інформації.

У випадку з нейронами з малим діаметром соми середня амплітуда кальцієвого транзієнта після попередньої аплікації габапентіну дещо зменшувалась та становила 381,6±16,7 нмоль/л (n=9) (рис. 7). Отриманий результат є дещо несподіваним зважаючи на те, що нейрони з малим діаметром соми виконують специфічну функцію проведення ноцицептивних сигналів.

Середні значення тривалості кальцієвого транзієнта та його тривалості на рівні половини амплітуди (півширини) для великих нейронів після преаплікації габапентіну не зазнало істотних змін та становило 63,3±4,1 с та 18,5±1,0 с, а після відмивання - 50,4±4,1 с та 19,9±1,7 с відповідно. У випадку нейронів середнього розміру за умов попередньої аплікації габапентіну значення тривалості дорівнювало 42,0±2,4 с, півширини - 12,8±0,9 с, а після відмивання клітин становило 40,1±3,0 с та 13,7±1,0 с відповідно. Для нейронів з малим діаметром соми преаплікація габапентіну призводила до незначного збільшення як тривалості, так і півширини кальцієвого транзієнта, що становили 54,6±5,9 с та 13,8±1,7 с відповідно. Після відмивання клітин значення цих параметрів дорівнювали 62,7±6,8 с та 11,8±1,2 с відповідно. Для часових параметрів не було виявлено статистичної вірогідності різниць відповідних параметрів.

Для нейронів середнього розміру проводився додатковий тест на чутливість до капсаїцину, що виявляє два типи нейронів з середнім діаметром соми та відмінностями у експресії цього рецептора. Нейрони, що не виявляли чутливості до прикладання капсаїцину (60 нмоль/л) мали середнє значення амплітуди викликаного деполяризацією транзієнта на тлі прикладання габапентіну 330,8±14,0 нмоль/л. Середнє значення амплітуди кальцієвого транзієнта у випадку нейронів, що демонстрували значне підвищення кальцію у відповідь на прикладання капсаїцину становило 247,5±18,4 нмоль/л за умов попередньої аплікації габапентіну.

Таким чином габапентін володіє відносно вибірковим впливом на різні типи первинних сенсорних нейронів. Зокрема відсутність реакції нейронів ДКГ великого розміру свідчить про відсутність додаткових небажаних ефектів на низькопорогові пропріоцептивні нейрони. З іншого боку не було виявлено статистично достовірної зміни у характеристиках кальцієвих транзієнтів обумовлених деполяризацією мембрани нейронів ДКГ з сомою маленького розміру. Тобто, за умов, які не характеризуються хронічними змінами у функціонуванні даних нейронів, габапентін виступає модулятором гострих больових відчуттів.

5. Вплив габапентіна на кальцієві транзієнти, обумовлені активацією каналів TRPV1, в первинних сенсорних нейронах. Протокол, за яким визначали особливості впливу габапентіну на первинні сенсорні нейрони, був аналогічний такому, що використовувався у попередніх дослідах. Проте замість гіперкалієвого розчину ми використовували капсаїцинвмісний розчин (рис. 9). Середнє значення амплітуди кальцієвого транзієнта, обумовленого прикладанням розчину капсаїцину на фоні аплікації габапентіну, становило 250±22,8 нмоль/л (n=11). Після відмивання аналогічний параметр становив 482,4±31,3 нмоль/л (рис. 10).

Таким чином, вплив габапентіну призводив до зменшення амплітуди капсаїцин обумовленого кальцієвого транзієнта в середньому на 50,4 % відносно контрольного значення. Кальцієвий транзієнт, отриманий після відмивання фактично не відрізнявся від початкового контрольного транзієнта.

Під впливом габапентіну змінилися також і часові характеристики кальцієвого транзієнта: тривалість транзієнта за умов аплікації габапентіну становила в середньому 74,1±6,3 с, що в порівнянні із контрольним значенням є достовірно меншим на 66,2 %. Середнє значення півширини кальцієвого транзієнта в умовах аплікації габапентіну становило 23,9±2,3 с. В порівнянні із контрольним це значення півширини є меншим на 57,9 % (р<0,05).

6. Особливості впливу габапентіну на різні типи первинних сенсорних нейронів при стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті. Задачами даного дослідження було з'ясування потенційних можливостей застосування габапентіну при невропатичних розладах, особливостей його впливу у різних типах первинних сенсорних нейронів (рис. 11).

Порівняння значень, що відповідають рівню базального кальцію діабетичних тварин з такими для здорових тварин показали, що у нейронах середнього розміру діабетичних тварин цей рівень був більший на 4 %, у групах маленьких та великих нейронів змін не виявлено.

Значення амплітуд кальцієвих транзієнтів у групі контролю діабетичних щурів складали для великих клітин ДКГ 445.4±12,5 нмоль/л (n=8), для середніх - 439.9±4,7 нмоль/л (n=29), для маленьких нейронів - 442.4±14,1 нмоль/л (n=6) - рис. 12.

Амплітуди кальцієвих транзієнтів для різних популяцій нейронів в разі розвитку діабету суттєво перевищували такі у здорових тварин. У нейронів з сомами великого розміру таке перевищення складало в середньому 12.2%, аналогічно різниця для середніх нейронів становила 12.0%, а для популяції маленьких нейронів - 8.2%. Найбільш істотні зміни, пов'язані з розвитком діабету, демонстрував такий параметр викликаних деполяризацією кальцієвих транзієнтів, як їх повна тривалість. Остання у великих нейронах ДКГ перевищувала таку у інтактних тварин більш ніж в три рази (на 261 %), у середніх нейронах - більш ніж вчетверо (331.1 %), а у маленьких нейронах - у 2.5 рази (на 153.6 %). Середнє значення півширини транзієнтів у великих нейронах ДКГ діабетичних тварин було навіть меншим ніж у здорових тварин (на 15 %, Р>0.05). Аналогічне порівняння для середніх нейронів ДКГ виявило незначне збільшення (на 17.3%, Р>0.05), а у маленьких нейронів ця різниця була невиразною (32.4%, Р>0.05).Тобто, розвиток експериментального цукрового діабету у щурів зумовлював в цілому досить помірне підвищення амплітуди викликаних деполяризацією кальцієвих транзієнтів у всіх розмірних групах нейронів ДКГ.

Середня амплітуда кальцієвих транзієнтів в умовах аплікації габапентіну у великих нейронах ДКГ діабетичних щурів склала 285.9±12,7 нмоль/л, у групі середніх нейронів - 352.1±16,3 нмоль/л, а у маленьких нейронах ДКГ- 497.9±13,9 нмоль/л (рис. 12).

У порівнянні з контрольним кальцієвим транзієнтом, дія габапентіну призвела у великих нейронах ДКГ до зменшення амплітуди на 35.8 % (Р<0.05). У групі середніх нейронів таке зменшення склало 20% (Р<0.05), а у маленьких нейронах - 7.8 % (Р>0.05).

Таким чином, найбільший ефект, спричинений дією габапентіну на нейрони ДКГ щурів з діабетом, спостерігався у групі великих нейронів, для середніх нейронів ефект був істотним, а для маленьких нейронів зміни були вельми помірними та невірогідними.

Значення повної тривалості кальцієвого транзієнта під впливом габапентіну для великих нейронів ДКГ тварин з діабетом в середньому склало 59.6±6,6 с, для групи середніх нейронів цей показник становив 133.4±6,2 с, а для маленьких - 104.6±4,4 с. У порівнянні з першим контрольним кальцієвим транзієнтом середнє значення повної тривалості транзієнта під дією габапентіну у великих нейронах ДКГ драматично зменшувалось та складало лише 30 % попереднього. У середніх нейронах таке зменшення було практично відсутнім (становило в середньому лише 1.2 %), а у маленьких нейронах досить помітним - 7.5 %. Значення півширини під дією габапентіну помітно зменшувалося у всіх розмірних групах нейронів ДКГ. Таке зменшення становило 12.3 % для великих нейронів ДКГ, 8.1 % - для середніх нейронів та 10.3 % для маленьких нейронів щурів з діабетом. Таким чином у щурів з діабетом вплив габапентіну на нейрони ДКГ є найістотнішими щодо нейронів великого розміру та частини клітин із сомами середніх розмірів.

Для більш чіткого з'ясування особливостей впливу габапентіну на середні нейрони ми проводили додатковий капсаїциновий тест. Так, середня амплітуда гіперкалієвого транзієнта при аплікації габапентіну для капсаїцинпозитивних нейронів середнього розміру (n=22) щурів з діабетом становила 371,7±15,4 нмоль/л, а для капсаїциннегативних нейронів (n=6) - 267,7±31,5 нмоль/л, що було на 16,3 % та 36,7 % відповідно менше відносно контрольних показників.

Середнє значення півширини для капсаїцинпозитивних та капсаїциннегативних нейронів ДКГ середнього розміру щурів з діабетом 13,0±0,5 с та 12,6±1,1 с відповідно, а середні значення повної тривалості транзієнтів становили 131,5±7,5 с та 142,2±8,2 с. Цей результат вказує на більшу чутливість капсаїциннегативних нейронів до габапентіну порівняно з капсаїцинпозитивними, що в узгодженні з показниками для групи великих нейронів.

Ефект габапентіну для середніх нейронів ДКГ мав характерний бімодальний розподіл даних, що свідчило про наявність двох груп даних серед всієї популяції середніх нейронів. Це означає, що серед нейронів середнього розміру існують такі, що значно більш чутливі до впливу габапентіну порівняно з іншими. Для розділення цих двох груп нейронів ми використали апроксимацію загального масиву даних за допомогою двох функцій Гауса. В результаті отримали відповідні кожному розподілу медіани та дисперсії, за якими і зробили розподіл наявного масиву даних. Для визначення особливостей впливу габапентіну в різних за чутливістю до даного агента нейронах ДКГ середнього розміру, порівняли отримані результати для цих двох груп нейронів із ефектом габапентіну серед популяції середніх нейронів ДКГ здорових тварин (рис. 13).

Третій кальцієвий викликаний деполяризацією транзиєнт проводився після недовготривалого відмивання та характеризував слідові характеристики дії габапентіну. Так, група великих нейронів мала середнє значення амплітуди 428,2 ±8,6 нмоль/л, для середніх нейронів цей показник складав 395,7±9,4 нмоль/л, а для групи маленьких - 439,3±5,6 нмоль/л (рис. 12). Значення повної тривалості транзиєнтів для великих, середніх та маленьких нейронів ДКГ тварин з діабетом становили відповідно 144,5±10,5 с, 90,3±2,6 с та 90,3±5,7 с. Середнє значення півширини для великих нейронів ДКГ склало 12,3±0,9 с, для середніх нейронів середнє значення цього параметра дорівнювало - 15,6±0,7 с, а для маленьких - 13,8±1,1 с. Таким чином, у великих нейронах ДКГ спостерігається тенденція до зменшення завантаження клітини кальцієм після попередньої дії габапентіну. У групі середніх нейронів такий ефект спостерігається лише для амплітуди транзієнта, тобто характерні зміни стосуються лише швидкої первинної фази підвищення внутрішньоклітинного кальцію. Для маленьких нейронів найбільші зміни спостерігаються для повної тривалості та півширини, і хоча ці зміни не мали статистичної вірогідності, однак можуть вказувати на помірний ефект габапентіну у цій групі нейронів.

7. Вплив габапентіна на кальцієві транзієнти в первинних сенсорних нейронах обумовлені активацією каналів TRPV1 при стрептозотоциніндукованому цукровому діабеті. Кальцієві транзієнти обумовлені активацією каналів TRPV1 за допомогою капсаїцину в нейронах ДКГ при експериментальному діабеті, що демонструють вплив габапентіну показано на рис. 14. Середнє значення амплітуди капсаїцинобумовленого кальцієвого транзієнта в контрольних умовах становило 438,8±26,5 нмоль/л (n=16). При аплікації габапентіну цей показник складав 371,4±15,4 нмоль/л (рис. 15). Тобто, аплікація габапентіну призводила до зменшення амплітуди капсаїцинобумовленого кальцієвого транзієнта на 16 %. Середнє значення тривалості контрольного кальцієвого транзієнта та його півширини становило відповідно 224,6±18,0 с та 51,1±4,0 с, а для транзієнта під впливом габапентіну аналогічні параметри становили відповідно 160±13,2 с та 47,8±3,8 с. Порівняння значень амплітуди, тривалості та півширини контрольних капсаїцинобумовлених кальцієвих транзієнтів нейронах ДКГ щурів із стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом із аналогічними значеннями у здорових тварин, показує, що у діабетичних щурів значення амплітуди менше на 13 %, тривалість більша на 2,4 %, а півширина - на 19,3 %. Аналогічне порівняння в умовах аплікації габапентіну демонструє, що амплітуда відповідного транзієнта в нейронах ДКГ діабетичних тварин на 32,7 % більша відповідного значення у здорових тварин, тривалість та півширина більші відповідно на 53,7 % та 50,1 %. Загалом, капсаїцинобумовлений кальцієвий транзієнт діабетичних тварин в наших експериментах мав меншу амплітуду та збільшенні часові характеристики. Одночасно з цим вплив габапентіну не мав ефекту пропорційно до такого, що спостерігали для нормальних тварин.

Тобто, за умов нашого експерименту вплив габапентіну на нейрони ДКГ діабетичних щурів був значно меншим від аналогічного ефекту у здорових тварин. Це загалом узгоджується з попередніми результатами стосовно розподілу нейронів ДКГ за чутливістю до габапентіну, та імовірно обумовлено типом невропатичного розладу при цукровому діабеті. Дійсно, за попередніми результатами, було зроблено припущення, що більша частина досліджених нейронів належала щурам із гіпоалгезивною формою діабетичної нейропатії.

Відомо також, що при розвитку даної форми больового синдрому спостерігається зменшення експресії каналів TRPV1 в первинних ноцицепторах. Разом з тим, наведені дані та відомості узгоджуються із отриманим результатом та повністю його розкривають. Проте, головним результатом даної групи експериментів є виявлення пригнічуючого впливу габапентіну на мобілізацію вільного внутрішньоклітинного кальцію обумовлену активацією ванілоїдних рецепторів першого типу, що може бути однією із причин формування больової чцтливості.

ВИСНОВКИ

У дисертації досліджено вплив каналів TRPV1 на процес транзієнтного підвищення внутрішньоклітинного рівня вільного кальцію та особливості транзієнтів, обумовлених активацією даних каналів, виявлено взаємовплив між потенціалкерованими кальцієвими каналами та ванілоїдними рецепторами першого типу в процесі транзієнтного підвищення кальцію в первинних ноцицептивних нейронах, з'ясовано особливості впливу блокатора потенціалкерованих кальцієвих каналів N- типу - габапентіну - на кальцієві транзієнти в різних типах первинних сенсорних нейронів в нормі та при нейропатичних розладах в умовах розвитку експериментального цукрового діабету, а також модулюючий вплив такої блокади на кальцієві транзієнти, обумовлені активністю каналів TRPV1.

1. Блокування каналів TRPV1 впливає на процеси формування кальцієвого транзієнта, обумовленого деполяризацією мембрани первинних ноцицептивних нейронів, та призводить до зменшення амплітуди кальцієвих транзієнтів в середньому на 21% та 17,5% в середніх та маленьких нейронах ДКГ відповідно.

2. В процесі тривалого збільшення цитозольного вільного кальцію при деполяризації нейронів ДКГ змінюється чутливість каналів TRPV1 до специфічних агоністів, що виявляється у зменшенні амплітуди відповідних реакцій в середньому на 4,5%-26,8% для середніх нейронів та 22,4%-35,3% - для маленьких. В групі первинних сенсорних нейронів середнього розміру існують нечутливі до впливу капсаїцину нейрони.

3. 1-(амінометил) циклогексаноцтова кислота (габапентін) виявляє високу специфічність дії виключно на нейрони ДКГ середнього розміру, при відсутності ефекту на великі та маленькі нейрони. Найбільш суттєві зміни - в середньому зменшення на 27% - спостерігалися у амплітудах відповідних транзієнтів у капсаїцинпозитивних нейронах, що дозволяє вважати, що габапентін впливає на первинні ноцицептивні нейрони як протибольовий препарат. Зменшується також амплітуди кальцієвих транзієнтів, обумовлених активацією ванілоїдних рецепторів капсаїцином, при одночасній аплікації габапентіну, в середньому на 50,4%.

4. При стрептозотоцин-індукованому цукровому діабеті змінюється чутливість різних типів нейронів до дії габапентіну порівняно із такою для нормальних тварин. Ефективність впливу габапентіну на кальцієві транзієнти у нейронах середнього розміру діабетичних тварин зменшується в середньому на 20%. Аплікація габапентіну при активації TRPV1 каналів призводить до зменшення амплітуди транзієнта на 16% відносно контрольного, тривалості - на 28,7%.

5. Виявлено існування двох груп нейронів середнього розміру: у першої групи аплікація габапентіну має помірний ефект, а у другої - вплив габапентіну призводить до драматичного зменшення амплітуди кальцієвого транзієнта в середньому на 55%. Такий феномен призводить до існування різних типів нейропатичних розладів, що розвиваються при цукровому діабеті, а саме гіпочутливістю та гіперчутливістю.

6. Аномальні зміни - зменшення в середньому на 36% - у амплітуді кальцієвих транзієнтів виявлено при аплікації габапентіну за умов деполяризації мембрани у нейронах ДКГ великого розміру діабетичних тварин при відсутності аналогічного ефекту у здорових тварин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Романенко С. В. Вплив габапентіну на кальцієві транзиєнти в нейронах дорсальнокорінцевих гангліїв щурів / С. В. Романенко, П. Г. Костюк, Е. П. Костюк // Нейрофізіологія. - 2008. - № 4. - С. 281-287. Особистий внесок здобувача - виконано весь об'єм експериментальної роботи, підготовлено матеріали до друку.

2. Романенко С. В. Вплив габапентіну на різні популяції нейронів дорсальнокорінцевих гангліїв щурів із стрептозотоциніндукованим цукровим діабетом / С. В. Романенко, П. Г. Костюк, Е. П. Костюк // Нейрофізіологія. - 2009. - № 2. - С. 119-130. Особистий внесок здобувача - виконано весь об'єм експериментальної роботи, проведено аналіз отриманих результатів, підготовлено матеріали до друку.

3. Романенко С. В. Активність каналів TRPV1 у первинних ноцицептивних нейронах щурів: вплив змін внутрішньоклітинного рівня кальцію / С. В. Романенко, П. Г. Костюк, Е. П. Костюк // Нейрофізіологія. - 2009. - № 4. - С. 288-300. Особистий внесок здобувача - виконано весь об'єм експериментальної роботи, проведено аналіз отриманих результатів, підготовлено матеріали до друку.

4. Романенко С. В. Перспективы применения препарата «Габагамма» для лечения диабетических полинейропатий / С. В. Романенко, П. Г. Костюк, Е. П. Костюк // Наука та інновації. - 2009. - № 6. - С. 64-69. Особистий внесокздобувача - проведено аналіз отриманих результатів, підготовлено матеріали до друку.

5. Specificity of gabapentin action in different dorsal root ganglion neurons / Romanenko S. V. // Neurobiology Summer School Vienna: from receptor to cognition, September 8 - 12, 2008: Abstracts. - Vienna, Austria. - 2008. - P. 22.

6. Effect of gabapentin in different rat dorsal root ganglion neurons in norma and under streptozotocin-induced diabetes / S. V. Romanenko, O. P. Kostyuk, P. G. Kostyuk // International Conference: Molecular mechanisms of intracellular calcium signaling, October 11 - 13, 2009: Abstracts. - Kyiv, Ukraine. - Fiziologichnyi Zhurnal. - 2009. - Vol. 55, № 6. - P. 141.

АНОТАЦІЯ

Романенко С. В. Особливості кальцієвої сигналізації в різних типах первинних ноцицептивних нейронів та її модуляція. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2010.