Особливості кальцієвої сигналізації в різних типах первинних ноцицептивних нейронів та її модуляція

Роботу присвячена дослідженню особливостей функціонування каналів TRPV1, що експресуються в сомах нейронів дорсальнокорінцевих гангліїв (ДКГ) малого (менше 25 мкм) та середнього (35-25 мкм) розмірів, їхньому впливу на осциляції концентрації внутрішньоклітинного вільного кальцію при збудженні цих нейронів. Усі транзієнти вимірювали за допомогою кальцій чутливого флуоресцентного зонда Fura 2/AM.

При блокуванні каналів TRPV1 капсазепіном амплітуда транзієнтів, обумовлених деполяризацією нейронів, зменшується на 21% та 17,5% для середніх та малих нейронів. Аналіз виявив значні зміни у швидкій фазі кальцієвого транзієнта при блокуванні каналів TRPV1. Виявлено зміни у транзієнтах нейронів ДКГ при аплікації капсаїцину - селективного агоніста TRPV1 - на тлі розвитку деполяризаційного транзієнта. Амплітуди відповідей при дії капсаїцину через 3, 7 та 10 с після деполяризації, є менші від самостійних транзієнтів на: 26,8, 22,1 та 4,5 %, відповідно, для середніх нейронів; 35,3, 21,1 та 22,4% - для маленьких нейронів.

З'ясовано фармакологічну дію габапентіну (25 мкМ) на викликані деполяризацією кальцієві транзієнти в нейронах ДКГ щурів. Так, аплікація габапентіну на великі нейрони не виявила ефекту, для середніх нейронів виявили 27% зменшення відносно контрольного значення, для маленьких - 4% (Р>0,05). Показано вибірковість дії габапентіну на середні нейрони. Аплікація габапентіну при активації TRPV1 призводить до зменшення амплітуди на 50,4%, тривалості - на 66,2%, півширини - на 57,9%. Показано опосередкований вплив габапентіну на функцію каналів TRPV1 в сомах нейронів ДКГ.

В умовах стрептозотоциніндукованого діабету аплікація габапентіну призводила до зменшення параметрів кальцієвих транзієнтів; найбільше у великих нейронах ДКГ - амплітуда менша на 36%. Показано здатність габапентіну нормалізувати параметри змінених в результаті розвитку діабету кальцієвих транзієнтів в нейронах ДКГ, аплікація габапентіну на середні нейрони діабетичних тварин при активації TRPV1 каналів призводить до зменшення амплітуди транзієнта на 16% відносно контрольного, тривалості - на 28,7%.

Ключові слова: нейрони дорсальнокорінцевих гангліїв, кальцієві транзієнти, габапентін, ноцицепція, діабет, TRPV1 рецептори, модуляція.

Романенко С. В. Особенности кальциевой сигнализации в разных типах первичных ноцицептивних нейронов и ее модуляция. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата биологических наук за специальностью 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. О.О. Богомольца НАН Украины, Киев, 2010.

Работа посвящена исследованию особенностей функционирования каналов TRPV1 экспресируемые в сомах нейронов дорсальнокорешковых ганглиев (ДКГ) малого (меньше 25 мкм) и среднего (35-25 мкм) размеров, их влиянию на осцилляции концентрации внутриклеточного свободного кальция при возбуждении этих нейронов. Все транзиенты измеряли с помощью кальций чувствительного флуоресцентного зонда Fura 2/AM.

При ингибировании каналов TRPV1 капсазепином амплитуда транзиентов, обусловленных деполяризацией нейронов, уменьшается на 21% и 17,5% для средних и малых нейронов. Анализ обнаружил значительные изменения в быстрой фазе кальциевого транзиента при ингибировании каналов TRPV1. Обнаружены изменения в транзиентах нейронов ДКГ при аппликации капсаицину - селективного агониста TRPV1 - на фоне развития деполяризационного транзиента. Амплитуды ответов при действии капсаицина через 3, 7 и 10 с после деполяризации, были меньше самостоятельных транзиентов на: 26,8, 22,1 и 4,5 %, соответственно, для средних нейронов; 35,3, 21,1 и 22,4% - для маленьких нейронов.

Исследовано фармакологическое действие габапентина (25 мкм) на вызванные деполяризацией кальциевые транзиенты в нейронах ДКГ крыс. Аппликация габапентина на большие нейроны не показала эффекта, для средних нейронов обнаружили 27% уменьшения относительно контрольного значения, для маленьких - 4% (Р>0,05). Показана избирательность действия габапентіна на средние нейроны. Так, аппликация габапентина при активации TRPV1 приводит к уменьшению амплитуды на 50,4%, длительности - на 66,2%, полуширины - на 57,9%. Показано опосредствованное влияние габапентина на функцию каналов TRPV1 в сомах нейронов ДКГ.

В условиях стрептозотоцининдуцированного диабета аппликация габапентина приводила к уменьшению параметров кальциевых транзиентов; наиболее в больших нейронах ДКГ - амплитуда меньше на 36%. Показана свойство габапентина нормализовать параметры измененных в результате развития диабета кальциевых транзиентов в нейронах ДКГ, аппликация габапентина на средние нейроны диабетических животных при активации TRPV1 каналов приводит к уменьшению амплитуды транзиента на 16% относительно контрольного, длительности - на 28,7%.

Ключевые слова: нейроны дорсальнокорешковых ганглиев, кальциевые транзиенты, габапентин, ноцицепция, диабет, TRPV1 рецепторы, модуляция.

Romanenko S. V. Calcium signaling specificity in the different types of primary nociceptive neurons and its modulation. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree (PhD) in Biology by speciality 03.00.02 - biophysics. -Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

These thesis is devoted to investigation of functioning features of TRPV1 channels, which are expressed in dorsal root ganglion neurons somas of small (25 mkm and less) and medium (35-25 mkm) sizes as well to their influence on free calcium intracellular concentration oscillations in these neurons at their excitation, and also to the features of changes in intracellular calcium transients caused by depolarization of membrane of neurons of small, middle and large size or caused by first type vanilloid receptors activation under conditions of N-type voltage operated calcium channels blockage by the modern painkiller gabapentin.

All mentioned further calcium transients were measured with calcium sensitive fluorescent dye Fura 2/AM.

The blockage of TRPV1 channels by capsazepine lead to the alteration in amplitude of calcium transient caused by depolarization of neuron's membrane. Transient amplitude decreases on the average on 21 % among neurons with a middle size somas, and on 17.5 % - for neurons with a small size somas as compared to respect control transients. Comparative analysis of control transients and those obtained in neurons treated with capsazepine discovered considerable changes in the rapid phase of calcium transients under condition of blockage of TRPV1 channels.

The changes of calcium transients caused by activation of TRPV1 channels by its selective agonist capsaicin in populations of medium and small sized dorsal root ganglion neurons on a background development of calcium transient caused previous depolarization of neuronal membrane were investigated. In both groups of neurons the amplitudes of calcium responses caused by application of capsaicin in 3, 7 and 10 sec after previous cell depolarization were decreased in comparison to independent capsaicin evoked calcium transient on the average on: 26.8, 22.1 and 4.5 % respectively in case of medium size neurons; 35.3, 21.1 and 22.4 % - in case of small size neurons. Moreover, it was found nonlinear delays of capsaicin evoked responses, on a background development of calcium transient caused previous depolarization, relatively to the moment of its application. In addition to these the alterations in intracellular free calcium level the capsaicin evoked transients were begun with were decreased in comparison to values of intracellular calcium observed in independent transient caused by depolarization. It is suggested that TRPV1 channels acts as a supervisory and protective element in the processes of regulation of intracellular calcium level and рН.

The influence of antiepileptic drug gabapentin (25 mkM) on calcium transients caused by rat dorsal root ganglion neurons membranes' depolarization was investigated. Gabapentin treatment of large size neurons does not change any characteristic parameters in calcium transients. Calcium transients of medium size neurons indicate 27 % of decreasing in amplitude. In the case of small size neurons the calcium transient amplitude indicate 4% diminishing comparatively to control and does not have statistical significance. An additional capsaicin test was conducted with aim to identify the primary nociceptive sensory neurons with medium size somas that express TRPV1 channels. Gabapentin application among capsaicinsensitive neurons results into 37 % diminishing of calcium transient amplitude. For neurons which do not show sensitiveness to capsaicin, analogous changes were 16 % diminishing. On the basis of data had been obtained in conducted experiments taken together with ability of gabapentin to associate with high affinity to б2д auxiliary subunit of voltage dependent calcium channels and pattern of distribution of these channels among proper types of sensory neurons, suggestion about pattern of expression of б2д-1 subunit in different primary sensory neurons was done. The selective effect of gabapentin on medium size soma primary nociceptive neurons which conduct the sharp pain feelings was shown.

The application of gabapentin on the dorsal root ganglion neurons during activating of TRPV1 channels by capsaicin causes considerable changes in the calcium transient parameters values comparatively with control ones. Transient amplitude of the former was decreased on 50.4 %, duration - on 66.2 %, and semiduration - on 57.9 % in comparison with latter. Thus, gabapentin mediated influence on function of TRPV1 channels in somas of primary sensory neurons was shown.

The effect of gabapentin on calcium transients caused by depolarization in the dorsal root ganglion neurons of rats under condition of streptozotocin induced diabetes was investigated. Calcium transients of rats with diabetes had amplitude rather higher than healthy animals (in the large and medium dorsal root ganglion neurons average alterations were approximately on 12%, and in small on 8% of increasing). Development of diabetes resulted in significant increase of complete transients' durations: in the large, middle and small dorsal root ganglion neurons mean values of those were in 2.6, 4.3 and 2.5 times greater for animals with diabetes comparatively to the normal ones. The result of diabetes development on duration of transients at the half of amplitude level was considerably less dramatic in comparison with full duration. Application of gabapentin resulted in diminishing of calcium transient's amplitude, as well its complete duration and semiduration. The most significant effect of gabapentin was observed for the large dorsal root ganglion neurons where calcium transient amplitude diminished on 36%, and general duration - more than three times. Diminishes in semiduration under the action of gabapentin were rather moderate (the decreasing in the range of 8-12 % in all groups of neurons). Alterations of calcium transient's amplitude under the action of gabapentin were distinctive for different sub-groups of medium size soma neurons: in case of capsaicinpositive neurons the diminishing this parameter was 16.3 %, and in case capsaicinnegative - 36.7 %. Obtained data points on ability of gabapentin to normalize, in some extent, alterations in calcium transients observed under development of diabetes in dorsal root ganglion neurons. The best effect of gabapentin was observed for large neurons of animals with diabetes, and also to part of medium dorsal root ganglion neurons which participating in forming of sharp pain feelings.

Application of gabapentin on sensory neurons with medium size somas of diabetic animals during activating of TRPV1 channels results in diminishing of transient's amplitude value on 16 % in relation to control. Most significant changes were observed for duration of the transient, in relation to a control value it was decreased on 28.7 %. Such result indicates that the taken in the experiment neurons were belonged to the animals with the hypoalgesic form of neuropathy.

Keywords: dorsal root ganglion neurons, calcium transient, gabapentin, nociception, diabetes, TRPV1 receptors, modulation.

Размещено на Allbest.ru