Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное агентство по здравоохранению социальному развитию

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Первый московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова

Фармацевтический факультет

Кафедра фармацевтической и токсикологической химии

Масс-спектрометрические методы исследования. Применение масс-спектрометрии-DART в фармацевтическом анализе.

Выполнила: студентка 5 курса

9 группы Гусева Анастасия Сергеевна

Руководитель:

Кокорекин Владимир Алексеевич

Москва 2015 год



Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

1. ПРИНЦИПЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

1.1 ИОНИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛ

1.2 ФРАГМЕНТАЦИЯ ИОНОВ

1.3 РАЗДЕЛЕНИЕ ИОНОВ

1.4 УСТРОЙСТВО МАСС-СПЕКТРОМЕТРОВ

2. МЕТОДЫ ИОНИЗАЦИИ

2.1 ИОНИЗАЦИЯ ЭЛЕКТРОННЫМ УДАРОМ

2.2 ФОТОИОНИЗАЦИЯ

2.3 ХИМИЧЕСКАЯ ИОНИЗАЦИЯ

2.4.ИОНИЗАЦИЯ ПОЛЕМ

2.5 ПОЛЕВАЯ ДЕСОРБЦИЯ

2.6 БОМБАРДИРОВКА УСКОРЕННЫМИ ИОНАМИ ИЛИ АТОМАМИ (МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ВТОРИЧНЫХ ИОНОВ)

2.7 МЕТОД ДЕСОРБЦИИ ПЛАЗМОЙ

2.8 ИОНИЗАЦИЯ В ПРОЦЕССЕ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИИ

2.9 ИОНИЗАЦИЯ ЭЛЕКТРОРАСПЫЛЕНИЕМ

2.10 ПРОЧИЕ МЕТОДЫ ИОНИЗАЦИИ

3. МАСС-АНАЛИЗАТОРЫ

3.1 ДЕТЕКТОРЫ

3.2 ХАРАКТЕРИСТИКИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРОВ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ДЕТЕКТОРОВ

3.3 ВАКУУМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

4. Масс-спектрометрия DART

4.1 Принцип ионизации DART

4.2 Применение DART-MS в фармацевтическом анализе

Вывод

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

ионизация спектрометр молекула бомбардировка

Физико-химические методы - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), УФ-, ИК-, ЯМР-спектроскопия и масс-спектроскопия - приобрели решающее значение при изучении состава, строения, свойств и превращений лекарственных средств на всех этапах от создания и разработки до их применения в лекарственной терапии. Данная работа посвящена одному из вышеперечисленных методов - масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрия - инструментальный метод изучения органических соединении. С помощью этого метода устанавливают молекулярную массу органического вещества и строение его молекул, определяют его элементный состав. Данный метод обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаружить следовые количества органического вещества в больших объемах газов и жидкостей, биологических системах. С помощью масс-спектрометрии можно изучать превращения вещества в процессе химической реакции, что существенно для установления механизмов реакций. Этот метод может использоваться и для изучения микроструктуры макромолекул, определения состава и структуры поверхностей полимерных материалов. В настоящее время масс-спектрометрия эффективно применяется в различных областях науки и техники, например, в органической и элементоорганической химии, химии природных соединений, аналитической и физической химии, нефтехимии, биохимии, фармакологии, экологии, фармацевтическом анализе.

Началом масс-спектрометрии как научного направления и как инструментального метода изучения органических веществ являются работы В. Вина (1898), который установил, что положительно заряженные частицы, перемещающиеся в электрическом и магнитном полях, отклоняются от прямолинейного направления, причем величина отклонения зависит от массы и заряда частицы. Этот принцип разделения ионов использовал Дж. Томсон (1912) для доказательства существования двух изотопов неона. Метод масс-спектрометрии основан на ионизации молекул, разделении ионов в газовой фазе, которое происходит в зависимости от соотношения их массы и заряда, и регистрации разделенных ионов. По физическому принципу метод масс-спектрометрии отличается от оптических методов спектрометрии (ИК-, УФ-, КР-) и ЯМР. При изучении вещества этими методами, их молекулы сохраняются. Поглощая энергию электромагнитного излучения того или иного рода, молекулы переходят на более высокий энергетический уровень, в колебательно-возбужденное, электронно-возбужденное или спиновое состояние. При обратном переходе молекул в невозбужденное состояние происходит излучении энергии, которая регистрируется соответствующими устройствами. Этот процесс можно многократно повторять. Масс-спектрометрия, в отличии от указанных методов, является деструктивным методом анализа. Из образующихся при разрушении молекул ионов исходная молекула регенерироваться не может.

Первые масс-спектрометры были сконструированы А. Демпстером (1918) и Ф. Астоном (1919). В 1924 г. Дж. Маттаух и Р. Герцог определили основные принципы двойной фокусировки, обеспечивающие регистрацию масс-спектров высокого разрешения. Первый промышленный масс-спектрометр, с помощью которого проводились быстрые и эффективные анализы смесей углеводородов каталитического крекинга нефти, появился в 1940 г.

Особенно интенсивное развитие масс-спектрометрии как уникального метода структурных исследований произошло в последние 30 лет. Были разработаны принципиально новые методы ионизации, позволившие получать ионы не только из газообразных веществ, но и из веществ, находящихся в конденсированном состоянии, из труднолетучих, термически лабильных, высокомолекулярных соединений. Разработка метода, в котором реализована комбинация масс-спектрометрии и хроматографии, позволила исследовать сложные смеси веществ и детектировать в них вещества, содержащиеся в микро- и субмикрограммовых количествах.

Среди многих применяемых в масс-спектрометрии способов ионизации наиболее распространенными являются ионизация электронным ударом. Этот способ универсален, прост в использовании и позволяет получать многолинейчатые масс-спектры, содержащие большой объем структурной информации. В большинстве промышленных масс-спектрометров применяется именно этот способ ионизации.

Ниже приведены сокращения, символы и определения, рекомендованные правилами ИЮПАК для описания процессов в масс-спектрометрии.

ЭУ Электронный удар

ХИ Химическая ионизация

m/z Отношение массы к заряду

1. ПРИНЦИПЫ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Ионизация молекул с образованием газообразных ионов, разделение ионов, регистрация их масс и относительных количеств происходят в масс-спектрометре. Каждый ион, который может быть положительным или отрицательным, характеризуется отношением его массы к заряду (m/z). В соответствии с этим отношением происходит разделение различных ионов. В масс-спектрометре исследуемое вещество переводится в газообразное состояние до или в процессе ионизации.

1.1 ИОНИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛ

Ионизация - явление превращения нейтрального атома или молекулы в заряженную частицу путем удаления из них или присоединения к ним одного или нескольких электронов. Наиболее распространенным методом ионизации является ионизация электронным ударом (ЭУ), при которой исследуемое вещество подвергается воздействию потока электронов определенной энергии. Ионизация происходит, когда электрон сталкивается с молекулой или пролетает рядом с ней. Обычно при этом молекула теряет электрон и превращается в положительно заряженный ион. Образование отрицательно заряженного иона происходит, когда энергия ионизирующих электронов близка к 0-5 эВ (тепловые электроны). При энергии ионизирующего электрона в несколько десятков электрон-вольт вероятность его захвата молекулой в 100 раз меньше, чем вероятность удаления электрона из молекулы.

При образовании положительно заряженного иона молекула переходит в возбужденное состояние. Молекулы всех органических соединений имеют четное число электронов, которые занимают связывающие или несвязывающие орбитали. При удалении из молекулы одного электрона образуется молекулярный ион с нечетным число электронов - катион-радикал: M > M⁺ + з.

Взаимодействие электрона с молекулой, протекающее за время ~ 17^-17 с, является неупругим столкновением, при котором энергия электрона передается молекуле. Эта энергия вызывает вращательное, колебательное и электронное возбуждение молекулярного иона одновременно или неодновременно с ионизацией. В результате многоэлектронного возбуждения может происходить автоионизация за время, большее чем 10^-16 с.

Образующиеся при ЭУ молекулярные ионы могут находится в различных электронных состояниях, заселенность которых почти одинакова. На рис. 1.1 показана совокупность молекулярных орбиталей, которые возникают после ионизации молекулы А. Состояние I, которое возникает при отрыве наименее прочно связанного электрона, называется основным. Электронно-возбужденным ионам соответствуют состояния II и III. При потере энергии молекулярным ионом, находящимся в состоянии III, он может переходить в состояния II и I. Аналогично происходит переход молекулярного иона из состояния II в состояние I.

Процесс ионизации характеризуется энергией (потенциалом) ионизации молекулы. Эта термодинамическая характеристика ионизации оценивается минимальной энергией, необходимой для отрыва электрона. В зависимости от того, с какой орбитали удаляется электрон, различают первую, вторую, третью и т.д. энергию ионизации. Наименьшее значение имеет первая энергия ионизации, так как при этом удаляется валентный электрон с внешней орбитали. Состояние I, показанное на рис 1.1, соответствует первой энергии ионизации, а состояния II и III - соответственно второй и третьей энергии ионизации.

Электронный переход при ионизации происходит за время 10^-17 с, что значительно меньше периода колебаний атомов в молекуле (10^-13 - 10^-14 с). Поэтому при ионизации межатомные состояния не успевают измениться (принцип Франка-Кондона*), и молекулярный ион оказывается колебательно-возбужденным. Поскольку каждой молекулярной орбитали соответствует свой колебательный уровень (v = 0, 1, 2, 3, …), то молекулярный ион, возникающий при удалении электрона с высшей занятой молекулярной орбитали (Ш₀), может иметь различную колебательную энергию. Нахождение иона на нулевом колебательном уровне (v = 0) называют основным состоянием, а энергию (потенциал) иоанизации, необходимую для возникновения этого иона, - адиабатической. Адиабатическую энергию обычно измеряют методами УФ-, фотоионизационной или фотоэлектронной спектроскопии.

Энергии ионизации, определенные с использованием немонохроматического измерения, например, с помощью УФ, называют вертикальным, так как они отвечают переходу иона на более высокий колебательный уровень. На рис. 1.2 схематически показаны адиабатическая (а) и вертикальная (б) энергии ионизации.

Количество внутренней энергии, приобретенной молекулой при взаимодействии с ионизирующим электроном, зависит от энергии электрона и характера его взаимодействий с молекулой. Энергии ионизации большинства органических молекул лежат в пределах 7 - 10 эВ. Для получения масс-спектров используют электроны с энергией выше 20 эВ (чаще всего 70 эВ), поэтому полученные в таких условиях молекулярные ионы имеют большой избыток энергии электронного или электронного и колебательного возбуждения. Избыток энергии колебательного возбуждения и приводит к разрыву связей, т.е. к фрагментации молекулярных ионов.

1.2 ФРАГМЕНТАЦИЯ ИОНОВ

Молекулярные ионы в зависимости от избытка внутренней энергии находятся в различных возбужденных состояниях, что обусловливает различное время их фрагментации или диссоциации. Обычно такой процесс протекает за время 10^-13 с. При этом молекулярные ионы превращаются в осколочные (фрагментные) ионы с более низкой электронной энергией. Фрагментные ионы, которые обладают еще достаточным избытком колебательной энергии, претерпевают дальнейший распад. Этот процесс продолжается до тех пор, пока не будет израсходован весь избыток внутренней энергии, присущий родоначальному молекулярному иону.

Образование фрагментных ионов характеризуется энергией (потенциалом) появления, т.е. минимальной энергией электронов, при которой начинает детектироваться соответствующий ион. Нетрудно представить, что энергия появления молекулярного иона есть не что иное, как энергия ионизации молекулы.

При распаде молекулярного иона, который является нечетно-электронной частицей, образуется фрагментный ион и нейтральная частица. Последняя может быть как четно-электронной, так и нечетно-электронной, т.е. радикалом типа H^•, ^•СH₃ и т.д. При отщеплении нейтральной частицы возникает новый нечетно-электронный ион - радикал:

M^+•> [Ф₁]^+• + N,

а при выбросе радикала - четно-электронный ион:

M^+•> [Ф₂]⁺ + N^•.

Дальнейшие направления распада этих ионов различны. Нечетно-электронный ион [Ф₁]^+• способен далее подобно M^+• элиминировать либо нейтральную четно-электронную молекулу, либо радикал, а катион [Ф₂]⁺ в подавляющем большинстве случаев может терять лишь четно-электронную молекулу (четно-электронное правило).

Процессы фрагментации молекулярных ионов характеризуются значительным числом последовательных и конкурирующих направлений распада, вероятность которых определяется природой молекулы и элементов, ее составляющих, энергией разрывающихся связей, внутренней энергией образующихся ионов, стабильностью ионов и элиминирующихся нейтральных частиц, а также временным интервалом между образованием иона и его детектированием.

1.3 РАЗДЕЛЕНИЕ ИОНОВ

Для разделения ионов по массам или, точнее, в соответствии с отношением их массы к заряду используют чаще всего магнитные, электростатические и квадрупольные анализаторы. Тип используемого анализатора в значительной степени определяет одну из важнейших характеристик масс-спектрометров - разрешающую способность, определяющую точность, с которой может быть установлена масс иона.

В общем случае разрешающую способность (R) масс-спектрометра определяют, как отношение измеряемой массы к разности масс между двумя соседними идентифицируемыми ионами:

R = M/?M.

Обычно говорят о разрешении на какой-то высоте между пиками, например, 5 или 10% (рис. 1.3). Из формулы следует, что если разрешающая способность масс-спектрометра равна 600, то пики с массовыми числами 600 и 601 или 599 и 600 (?M = 1) полностью разделяются и перекрываются лишь на уровне 5 или 10%.

В зависимости от разрешающей способности масс-спектрометры условно делят на два типа: низкого и среднего разрешения (R = 500: 1500) и высокого разрешения (R >15000). Приборы первого типа наиболее часто используют для определения только целочисленной массы ионов. Все элементы и изотопы из-за дефекта масс имеют нецелочисленную массу. Дробную масс имеют и частицы, составленные из них. Ионы, которые образуются из молекул, содержащих различные элементы, и имеют одинаковую целочисленную массу (изобарные ионы), как правило, различаются в дробной части.

Иллюстрацией этого служит сравнение молекул азота, оксида углерода и этилена, которые имеют целочисленную массу 28, но различаются в дробной части (N₂:28,0061; CO:27,9949; C₄H₄:28,031). На приборах низкого разрешения ионы этих трех молекул проявляются виде одного пика с m/z (рис. 1.4, а). Однако на приборе высокого разрешения каждый из этих ионов дает собственный пик (рис. 1.4, б). Используя приведенную выше формулу и точные массы ионов, можно рассчитывать минимальную разрешающую способность прибора, необходимую для разделения любой пары соседних пиков ионов с одинаковой целочисленной массой. Чем больше целочисленная масса ионов и меньше разница в нецелочисленных значениях, тем необходима большая разрешающая способность прибора.

Масс-спектрометр высокого разрешения позволяет определять точную массу иона. Для этого в прибор вместе с анализируемым веществом вводят образец соединения сравнения (эталон). Это соединение в измеряемом диапазоне масс имеет ряд характеристических ионов с известным точным значением масс (таким веществом чаще всего является перфторкеросин). Точную массу определяемого иона находят путем сравнения с точным значением массы ближайшего характеристического иона - эталона.

Установив точную массу иона, находят его элементный состав. Чем выше точность определения массы, тем выше вероятность различения изобарных ионов и точность определения их элементного состава. Таким образом, масс-спектрометрия высокого разрешения может служить эффективным методом элементного анализа органических соединений.

1.4 УСТРОЙСТВО МАСС-СПЕКТРОМЕТРОВ

Основные блоки, из которых построены масс-спектрометры, в большинстве случае практически идентичны. Схема компановки приведена на рис. 1.5.

Система ввода обеспечивает подачу образца в конденсированном состоянии или в виде паров в ионный источник, где происходит ионизация нейтральных молекул. Анализатор масс обеспечивает разделение ионов в соответствии с отношением массы к заряду (m/z). Пучки ионов, разделенные в масс-анализаторе, попадают в детектор ионов и регистрируются тем или иным способом.

В качестве детектора применяют электронный умножитель (рис. 1.6), который присоединяют к выходной части масс-спектрометра. Умножитель состоит из серии электродов, к которым приложена разность потенциалов (V). Ион, ударяясь о поверхность первого динода (рис. 1.6), выбивает из нее несколько электронов, которые под действием разности потенциалов ускоряются и попадают на второй динод. При этом с поверхности последнего выбрасывается больше электронов, чем туда попадает. Эти электроны в свою очередь попадают на третий электрод и т.д. В результате такого каскадного процесса очень слабый электрический ток, создаваемый первичными ионами, резко усиливается. Степень усиления тока пропорциональна разности потенциалов между первым и последним динодами. Величина тока становится уже достаточной для фиксирования его регистрирующим устройством.

В первых масс-спектрометрах в качестве регистрирующего устройства использовали обыкновенный самописец. Затем стали применять многошлейфовые осциллографы, что позволяло записывать масс-спектры на фоторегистрирующей бумаге. Такой метод регистрации обеспечивал запись одновременно нескольких масс-спектров при разной чувствительности гальванометров. В результате интенсивность пиков, зашкаленных на чувствительных шлейфах, может быть определена из записей на более грубых. На рис. 1.7 приведен масс-спектр тетрадекана, полученный с помощью четырехшлейфового осциллографа.

В современных масс-спектрометрах для записи и обработки масс-спектров используют компьютеры, присоединенные к выходу детектора ионов. Компьютеры в совокупности с интерфейсом, дисплеем и цифропечатающим устройством - графопостроителем (принтер-плоттер) - образует так называемую систему сбора и обработки данных.

Сигнал, выходящий из электронного умножителя, представляет собой меняющийся во времени электрический ток или потенциал (аналоговый сигнал). Чтобы такой сигнал воспринял компьютер, его превращают в цифровую форму с помощью аналого-цифрового преобразователя. Система сбора

данных позволяет через определенные, очень точные, промежутки времени считывать аналоговый сигнал, превращать его в цифровую информацию и подавать в компьютер (рис. 1.8). Последний определяет максимум пика, время его появления и с помощью системы калибровки определяет массовое число этого пика. В результате этого для каждого пика иона в память машины закладываются интенсивность и массовое число, т.е. те количественные характеристики, которыми оперируют при масс-спектрометрических исследованиях. Система обработки накопленных данных позволяет проводить разнообразные операции, среди которых наиболее важными являются представление масс-спектров в табличном и графическом виде, вычитание спектров один из другого, построение хроматограмм, масс-фрагментограмм, точное определение масс и др.

С помощью паромасляных диффузионных или турбомолекулярных насосов, имеющих на выходе форвакуумные насосы, в аналитической части масс-спектрометра создается высокий вакуум. Вакуум необходим для сохранения катода (филамент) при работе с ЭУ ХИ, так как в присутствии воздуха он бы сгорел. Вакуум нужен также для испарения исследуемого образца, так как у многих жидких и твердых органических веществ при атмосферном давлении незначительное давление пара. Переводу вещества в газообразное состояние способствует нагревание образца до 200-300 °С. В вакууме происходит удаление из зоны анализа части вещества, которая не подвергалась ионизации (~99%). Кроме того, в вакууме обеспечиваются условия для увеличения свободного пробега образовавшихся ионов, так как исключаются их столкновения с молекулами атмосферных газов, и тем самым предотвращается ионно-молекулярных реакций.

Применяемые масс-спектрометры (см. таблицу) характеризуются следующими показателями:

· типом применяемых методов ионизации;

· типом масс-анализатора и зависящей от него величиной разрешающей способности;

· чувствительностью, которая зависит от типа ионного источника и детектора;

· диапазоном определенных масс.

Большинство современных приборов позволяет исследовать вещества с молекулярной массой ~2000, а на специализированных приборах - с массой более 10 000 дальтон (Д).



2. МЕТОДЫ ИОНИЗАЦИИ

2.1 ИОНИЗАЦИЯ ЭЛЕКТРОННЫМ УДАРОМ

Ионизация под действием электронного удара (ЭУ) наиболее часто применяется в современных масс-спектрометрах. В данном разделе будут рассмотрены устройство ионного источника и основные параметры, определяющие характер масс-спектра.

Принципиальная схема ионного источника ЭУ приведена на рис. 2.1. Бомбардирующие электроны образуются в результате термической эмиссии из нагретого до высокой температуры катода (филамент), изготовленного из рениевой или вольфрамовой проволоки. Электроны ускоряются разностью потенциалов (V) между катодом (1) и анодом (2) и попадают в область ионизации. Постоянный магнит (4) коллимирует электронный пучок и ограничивает его в узкой спиральной траектории, что увеличивает вероятность взаимодействия электронов с молекулами исследуемого вещества (М⁰), которое поступает из системы напуска в парообразном состоянии. Парциальное давление вещества в газообразном состоянии 10^-5 -10^-6 торр.

Ионы, образующиеся в ионном источнике, с помощью ионно-оптической системы формируются в узкий пучок и специальным потенциалом (на рис. 2.1 не показан) выталкиваются из области ионизации, ускоряются с помощью высокого напряжения, которое обычно более 2000 В, и попадают в зону действия масс-анализатора.

Под действием ионизирующих электронов молекулы исследуемого вещества могут претерпевать следующие превращения:

Вероятность протекания того или иного процесса определяется прежде всего энергией ионизирующих электронов, которая выражается в электрон-вольтах (эВ) и равна произведению заряда электрона (з) на разность потенциалов (V) между катодом и анодом.

Если энергия ионизирующих электронов равна энергии ионизации молекулы, которая для большинства органических соединений лежит в пределах 7-12 эВ, происходит ионизация. Вероятность протекания этого процесса возрастает с увеличением энергии электронов. Одновременно с ионизацией начинает происходить и фрагментация молекулярных ионов. Зависимость выхода молекулярных ионов (величина ионного тока) от энергии ионизирующих электронов, выдаваемая кривой эффективности ионизации, приведена на рис. 2.2. Здесь же приведена аналогичная кривая и для фрагментного иона. Естественно, что эта кривая начинается при более высоких значениях энергии ионизирующих электронов, поскольку энергия появления фрагментарных ионов всегда выше энергии

ионизации. Кривые эффективности ионизации имеют участки крутого подъема ионного тока (обычно до энергии 30-40 эВ), за которым следует область насыщения, где величина ионного тока практически не изменяется с возрастанием энергии ионизирующих электронов.

В большинстве случаев масс-спектры получают при энергии 70 эВ, т.е. в области насыщения. Это позволяет обеспечить наибольшую чувствительность прибора и получение воспроизводимых результатов. Работа при энергии до 30-40 эВ, т.е. на участках крутого подъема, не дает воспроизводимых результатов, поскольку небольшое изменение энергии ионизирующих электронов ведет к заметным колебаниям интенсивности ионного тока. Однако в ряде случаев для аналитических целей используют масс-спектры, полученные при низких энергиях электронов (низковольтные масс-спектры), например, для идентификации молекулярного иона при низкой интенсивности его пика в высоковольтном масс-спектре. В низковольтных масс-спектрах вследствие резкого уменьшения фрагментации увеличивается доля молекулярных ионов в полном ионном токе. Для иллюстрации сказанного выше на рис. 2.3 приведены масс-спектры бензойной кислоты, полученные при различной энергии ионизирующих электронов. Этот пример свидетельствует о том, что снижение энергии электронов дает возможность идентифицировать молекулярный ион, особенно в том случае, когда интенсивность его пика в масс-спектре невелика.

В условиях ЭУ в результате захвата молекулой электрона возможно образование отрицательных ионов. Взаимодействие электрона с молекулой может сопровождаться ее гетеролитическим расщеплением с образованием ионной пары. При низких энергиях электронов, близких к тепловым, обычно происходит резонансный захват электрона. Этот процесс может быть недиссоциативным:

АBC + з > АBC^{¬ ? •}

и диссоциативным:

АBC^{¬ ? •} > [АB]^? + C^•.

Важными характеристиками ионного источника для ЭУ являются ток катода (ток, который течет по ленточке катода), ток эмиссии (электронный ток между катодом и анодом) и температура ионного источника. Меняя ток эмиссии, можно варьировать чувствительность прибора. Высокая температура (~200-250°С) необходима для перевода молекул образца в газообразное состояние, удаления основной массы исследуемого вещества из ионного источника, что предотвращает его осаждение на элементы источника. Загрязнение источника ионов органическим веществом особенно опасно для изолирующих материалов (фарфор, стекло, кварц), которые в результате загрязнения приобретают значительную проводимость и сильно изменяют подаваемые электростатические потенциалы. Это может приводить к опасному пробою между электродами.

Таким образом, с помощью ЭУ можно анализировать только достаточно летучие соединения, которые могут быть переведены в газообразное состояние, или создавать необходимое парциальное давление пара в ионном источнике (~10^-15-10^-16 торр.) Термически неустойчивые соединения методом ЭУ исследовать нельзя. Предварительно такие соединения должны быть превращены в их стабильные производные.

2.2 ФОТОИОНИЗАЦИЯ

Ионизация молекул может быть осуществлена также фотонами. Для этой цели используют УФ-свет короткой длины волны:

M⁰ + hv > M^+• + з.

Устройство источника ионов, применяемого для фотоионизации, такое же, как и при ЭУ. Принципиальной особенностью является отсутствие катода (филамент) и электрических систем, коллимирующих электронный пучок. В качестве источника УФ-света используется газоразрядная лампа, чаще всего водородная, дающая интенсивное излучение света с энергией фотонов в диапазоне 7-13 эВ. Одним из элементов фотоионизационного масс-спектрометра является монохроматор, позволяющий подавать в ионный источник световые потоки с монохроматичностью до 0,01 эВ. Чаще всего для этой цели применяют дифракционную решетку.

Используемые в фотоионизации энергии лежат в пределах 7-13 эВ, т.е. вблизи энергий ионизации молекул, поэтому масс-спектры близки по информативности низковольтным спектрам, полученным при ЭУ. Чувствительность этого метода довольно низка. Фотоионизационные масс-спектрометры сложнее по устройству и дороже по стоимости приборов с ЭУ, поэтому их редко используют для съемки масс-спектров. Наиболее распространенной областью применения этого метода является определение пороговых энергий образования молекулярных и осколочных ионов, т.е. определения энергий ионизации и появления. С этой целью измеряют кривые эффективности фотоионизации соответствующих ионов и проводят анализ их начальных участков. Следует иметь в виду, что нахождение пороговых значений энергий по кривым эффективности фотоионизации не всегда просто. Например, кривые, построенные для M^+• и ионов [CH₂S]⁺, образующихся при фотоионизации диметилсульфида (CH₃-S-CH₃) (рис.2.4), резко различаются начальными участками. Наличие участка крутого подъема на кривой позволяет легко определить пороговое значение энергии появления иона M^+• (т.е. энергии ионизации молекулы). На кривой эффективности (2) фотоионизации иона [CH₂S]⁺ такой участок крутого подъема отсутствует, и для определения энергии появления этого иона требуется специальная математическая обработка начального участка кривой.

Метод фотоионизации используют только для изучения соединений, которые могут быть переведены в парообразное состояние без разложения.

2.3 ХИМИЧЕСКАЯ ИОНИЗАЦИЯ

При ионизации ЭУ и фотоионизации, для того чтобы исключить протекание ионно-молекулярных реакций, в приборе поддерживают высокий вакуум - ~ 10^-6 торр. Напротив, при химической ионизации (ХИ) создают специальные условия для протекания таких реакций, вводя в ионизационную камеру вместе с анализируемым веществом газ-реагент и поддерживая давление ~ 1 торр. Применяемый в данном методе ионный источник конструкционно близок к применяемому при ЭУ.

Масс-спектрометр с ХИ снабжают эффективной системой откачки ионизационной камеры для быстрого удаления больших потоков попадающего в нее газа-реагента. В качестве газов-реагентов используют углеводороды (метан, изобутан, изопентан), аммиак, воду, тетраметилсилан и ряд других специфических веществ, обеспечивающих кислотно-основные взаимодействия, а также благородные газы, N₂, CO, CO₂, NO, O₂ и другие, обуславливающие протекание реакций так называемой перезарядки.

1. Образование первичных ионов газа-реагента при действии ЭУ (энергия электронов 50-70 эВ). Например, из метана при ЭУ возникают следующие первичные ионы:

Ионизация имеет место уже при давлениях метана 10^-5 - 10^-6 торр, т.е. в условиях обычного ЭУ.

2. Образование вторичных ионов. При увеличении давления происходят столкновения между первичными ионами и нейтральными молекулами газа-реагента. В результате этого взаимодействия образуются следующие вторичные ионы:

Эти процессы протекают уже при 0,01 торр, а при 1 торр плазма газа-реагента на 95% состоит из ионов [CH₅]⁺, [C₂H₅]⁺ и [C₃H₅]⁺.

3. Ионно-молекулярные реакции с участием молекул исследуемого вещества и вторичных ионов. При введении паров исследуемого вещества в количестве до 0,1% в зону газа-реагента происходит взаимодействие его молекул со вторичными ионами. Последние в зависимости от природы газа-реагента могут проявлять кислотно-основные или окислительно-восстановительные свойства. В результате этого при ХИ имеют место перенос протона, отщепление гидрид-иона или перезарядка. На схеме показаны следующие процессы: а) перенос протона от вторичного иона к молекуле исследуемого вещества, б) отщепление гидрид-иона от исходной молекулы и перенос его на вторичный ион:

Ион [BH₂]⁺ называют молекулярным протонированным ионом и обозначают [M + H]⁺, или [MH]⁺. Ион [B]⁺ называют квазимолекулярным ионом - [M-H]⁺, Оба эти иона могут претерпевать следующие виды распада:

а) превращение молекулярного протонированного иона в квазимолекулярный ион или молекулу водорода

[BH₂]⁺ > [B]⁺ + Н₂;

б) превращение молекулярного протонированного иона в ион меньшей массы [A]⁺ и в молекулу с массой, которая равна массе молекулы водорода и разности масс квазимолекулярного иона и вновь возникшего иона

[BH₂]⁺ > [А]⁺ + С;

в) превращение квазимолекулярного иона в ион меньшей массы [А]⁺ и молекулу D

[B]⁺ >[А]⁺ + D.

Вероятность протонирования молекулы субстрата зависит от сравнительного сродства к протону (RA) ее и газа-реагента. Чем выше сродство к протону субстрата, тем больше вероятность и скорость его протонирования. Величины сродства к протону различных органических соединений можно найти в соответствующих справочниках.

Вероятность диссоциации ионов [M + H]⁺ или [M-H]⁺ значительно ниже, чем таковая молекулярных ионов, генерируемых ЭУ. Это связано с тем, что внутренняя энергия ионов, образующихся при ХИ, гораздо меньше, чем внутренняя энергия при ионизации электронами, и приближается к энергии ионов при реакциях в конденсированной фазе. Тем не менее есть примеры, когда фрагментация проходит довольно интенсивно.

Другой тип ХИ основан на протекании окислительно-восстановительных процессов, т.е. на переносе заряда или перезарядке. В этом случае ионизация происходит в результате переноса электрона с субстрата (М) на ион ионизированного реагента [Х]^+•:

М + Х^+• > М^+• + Х.

В качестве реагентов обычно используют одноатомные благородные газы и редко газы, содержащие более трех атомов. При ионизации происходит перераспределение энергии между субстратом и ионизированным реагентом. Ион реагента, находящийся в основном состоянии, переносит на молекулу субстрата определенное количество энергии, которую называю энергией рекомбинации (RE). Например, аргон имеет RE = 15,8 эВ, и при ионизации с помощью аргона

M + [Ar]^+• > [М]^+• + Ar,

Образующийся ион [М]^+• приобретает внутреннюю энергию, равную разности энергии рекомбинации аргона и энергии ионизации (ЭИ) молекулы субстрата - [15,8 - ЭИ] эВ. Этой избыточной энергией определяется степень дальнейшего распада молекулярного иона [М]⁺ во временной шкале масс-спектрометра. Используя различные газы-реагенты, можно варьировать степень его распада. Например, используя [Не]^+• (RE = 24,6 эВ), можно получить самые высокоэнергетические катион-радикалы [М]^+•, а в случае [NO₂]^+• (RE = 11,8 эВ) - самые низкоэнергетические, т.е. наиболее стабильные.

Спектры ХИ, полученные с использованием перезарядки, не имеют преимуществ по сравнению со спектрами, полученными при ЭУ. Напротив, спектры ХИ, основанные на кислотно-основных процессах, широко используют для структурно-аналитических целей. Эти масс-спектры вследствие «мягких» условий ионизации характеризуются наличием интенсивных пиков ионов [M + H]⁺ или [M-H]^?, что позволяет однозначно определять молекулярную массу соединений, в спектрах ЭУ которых пики молекулярных ионов малоинтенсивны или вовсе отсутствуют (рис. 2.5).

В последнее время широкое распространение получил метод ХИ с регистрацией отрицательных ионов. Как известно, метод ЭУ малопригоден для генерирования отрицательных ионов, поскольку электроны, используемые в этом методе для ионизации, имеют высокую кинетическую энергию (~70 эВ) и вероятность их захвата молекулой с небольшим сродством к электрону мала. Кроме того, отрицательные ионы могут возникать только в составе ионной пары, что не дает возможности фиксировать молекулярный ион, а создаваемый ими ток крайне мал. В условиях же ХИ электроны с высокой энергией, эмитированные с катода, в результате соударения с нейтральными молекулами теряют энергию и превращаются в «тепловые» электроны с низкой энергией. При взаимодействии с «тепловыми» электронами молекулы вещества претерпевают резонансный захват, диссоциативный резонансный захват или образуют ионную пару:

Если молекула АВ имеет большое сродство к электрону, то чувствительность при регистрации отрицательных ионов может быть в 100-1000 раз выше по сравнению с другими методами ионизации.

Для генерирования отрицательных ионов при ХИ широко используют ионизацию с помощью отрицательных ионов газа-реагента. Последние образуются в результате бомбардировки электронами молекул соответствующего газа-реагента. Например, из СCl₄, NO₂ и СH₃ONO при ионизации электронами могут быть генерированы ионы Сl^?, O^? и CH₃O^? соответственно. Эти ионы затем реагируют с молекулами субстрата, давая отрицательные ионы. Так, CH₃O^?, действуя как основание, может отщеплять протон, образуя ионы [M-H]^?:

В других случаях отрицательный ион реагента может присоединяться к молекуле образца. Например, в результате присоединения Сl^? к карбонильным соединениям образуется ион [M + Сl]^?:

Поскольку при ХИ исследуемое вещество должно быть в парообразном состоянии, то требования, предъявляемые к исследуемым соединениям, те же, что и при ЭУ. Необходимо отметить высокую селективность метода ХИ относительно соединений различных классов, что позволяет качественно и количественно определять в составе сложных смесей соединения различных типов, которые различаются по способности к захвату электронов. Особенно высоким сродством к электрону обладают галогениды, в частности фториды. Поэтому при исследовании органических соединений методом ХИ с регистрацией отрицательных ионов их предварительно превращают во фторсодержащие производные. Для примера на рис. 2.6 приведен масс-спектр отрицательных ионов N-трифторацетильного производного н-пропиламина (CF₃CONHC₃H₇-н).

2.4 ИОНИЗАЦИЯ ПОЛЕМ

Полевая ионизация относится к группе «мягких» методов ионизации. Принципиальная схема ионного источника представлена на рис.2.7. Наиболее важными элементами источника являются анод (1) (эмиттер) и катод (2), разность потенциалов между которыми составляет ~ 10 кВ. Оба электрода

располагаются настолько близко друг к другу, чтобы градиент потенциала был 10⁸ В/см. Эмиттер представляет собой проволоку, поверхность которой покрыта большим количеством микроигл с радиусом кривизны ~ 10^-5 см. Когда молекула образца в паровой фазе попадает на эмиттер или пролетает вблизи от него, происходит туннельный переход валентного электрона с молекулы на эмиттер с образованием катион-радикала. Положительные ионы ускоряются катодом, проходят через отверстие в нем и попадают в область фокусировки (3), а затем ионный луч через выходную щель (4) поступает в зону действия масс-анализатора.

При ионизации полем образуются ионы [М]^+•, а иногда и ионы [M + H]⁺. Степень фрагментации ионов [М]^+• и [M + H]⁺ обычно ниже, чем при ЭУ, поскольку в процессе туннелирования электрона

молекулярный ион не переходит в высоковозбужденное состояние и не содержит достаточно энергии для интенсивной фрагментации. Изменение характера масс-спектра при переходе от ЭУ к полевой ионизации показано на примере лейцина (рис.2.5, а и рис.2.8, а).

Как и в случае ЭУ и ХИ, этим методом исследуют только те соединения, которые могут быть переведены в газообразное состояние без разложения.

2.5 ПОЛЕВАЯ ДЕСОРБЦИЯ

Все рассмотренные методы ионизации неприменимы к термически лабильным и нелетучим соединениям. Это ограничение в значительной степени отсутствует в методе полевой десорбции, который позволяет генерировать ионы непосредственно из конденсированного состояния.

Используемый в этом случае ионный источник по принципу действия и конструкции близок к источнику, применяемому в полевой ионизации (рис.2.7). Принципиальным отличием является только то, что вещество наносится непосредственно на анод (эмиттер), часто подогреваемый. Ионизация молекул происходит на поверхности эмиттера за счет туннелирования электронов, а образовавшиеся ионы десорбируются благодаря отталкиванию их одноименно заряженным анодом. В тех случаях, когда ионы особенно прочно связаны с эмиттером, через последний пропускается ток.

Полевую десорбцию следует рассматривать как один из наиболее «мягких» методов ионизации. В общем случае метод позволяет получить ионы [М]^+• и [M + H]⁺, которые из-за пониженной внутренней энергии слабо распадаются. На рис.2.8, б приведен масс-спектр лейцина, полученный в условиях полевой десорбции. Интересно сравнить его вид с видом масс-спектров, зарегистрированных с помощью других методов ионизации (рис.2.8, а и 2.5, а, б).

Наряду с протонированием, т.е. с образованием ионов [M + H]⁺, при полевой десорбции может происходить и присоединение катиона, чаще всего катиона щелочного металла. Поэтому в ряде случаев к исследуемому образцу, нанесенному на эмиттер, прибавляю NaI или соли других щелочных металлов (K, Li, Cs). Появление в масс-спектре пиков ионов [M + Met]⁺, которые часто бывают очень интенсивными, наряду с ионами [М]^+• и [M + H]⁺ позволяет более уверенно определять молекулярную массу.

Полевую десорбцию используют при исследовании многих термически нестабильных и полярных соединений, особенно сахаров, пептидов, олигонуклеотидов, а также полярных и неполярных синтетических материалов с массой до 10 000Д и выше.

2.6 БОМБАРДИРОВКА УСКОРЕННЫМИ ИОНАМИ ИЛИ АТОМАМИ (МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ВТОРИЧНЫХ ИОНОВ)

Бомбардировка ускоренными атомами или ионами - также «мягкий» и довольно универсальный метод анализа труднолетучих, полярных и термически лабильных соединений. В основу метода положен следующий принцип. Пучок быстро движущихся атомов или ионов ударяется под углом 60-70° о металлическую поверхность, покрытую образцом, передавая большую часть своей высокой кинетической энергии молекулам образца. Образец при этом интенсивно разогревается, молекулы частично отрываются от его поверхностных слоев, переходя в газообразное состояние. При этом происходит также образование положительных и отрицательных ионов. Нейтральные молекулы образца могут ионизироваться в плазме над поверхностью.

Устройство ионного источника для вторично-ионной масс-спектрометрии довольно простое (рис.2.9). Он содержи пушку (4), генерирующую быстрые атомы или ионы, шток (1) с металлическим (обычно медным) скошенным наконечником (2), на который наносится образец (3), и систему фокусировки и ускорения образующихся вторичных ионов (6). Изменяя заряд мишени относительно выходной щели источника, в масс-анализатор можно подавать или положительно, или отрицательно заряженные ионы.

В зависимости от характера ионизирующего излучения (ионы, атомы) различают вторично-ионную масс-спектрометрию и масс-спектрометрию с бомбардировкой ускоренными атомами. В первом случае в качестве ионизирующего излучения применяют пучок первичных ионов, получаемых либо ионизацией в разряде инертного газа (Ar⁺, Xe⁺), либо разложением солей (Cs⁺) и ускорением их до энергии 6-8 кэВ. Во втором случае используют ускоренные атомы, которые образуются путем предварительной ионизации в разряде молекул благородного газа (Ar, Xe), ускорения возникающих ионов и последующей их перезарядки:

Быстрые атомы Хе сохраняют большую часть исходной кинетической энергии ионов и направление движения последних.

Вторично-ионную масс-спектрометрию часто используют для изучения поверхности нанесенного конденсированного образца. Хотя в результате нагрева в этом случае может происходить разрушение образца, что приводит к уменьшению выхода вторичных ионов, метод имеет свои преимущества при решении именно подобных задач. Более удобным является растворение исследуемого образца в жидкой матрице типа глицерина, поскольку быстрая диффузия в жидкости обеспечивает постоянное восстановление поверхности.

Бомбардировка быстрыми атомами применяют только для тех веществ, которые способны растворятся в жидкой матрице. Наряду с глицерином для этой цели используют а-тиоглицерин, тригол, тетракол, ди- и триэтанолмаины, полиэтиленгликоль. Необходимо отметить, что масс-спектры, зарегистрированные при ионизации быстрыми атомами и ионами, довольно близки. Однако бомбардировка атомами нашла большее применение в исследовательской практике, особенно при изучении сложных биоорганических молекул.

По существу, бомбардировку быстрыми атомами нельзя рассматривать как «мягкий» метод ионизации, поскольку высокоэнергетические атомы передают молекулам образца значительную энергию, вследствие чего образующиеся родоначальные ионы способны к фрагментации. По характеру же такие спектры близки к спектрам, которые получают при ХИ: они содержат ионы [M+Na]^+• или [M-Н]^?, но не M^+• и М^?•.

Метод бомбардировки ускоренными атомами особенно удобен при исследовании соединений, содержащих кислотные или основные центры, а также имеющих ионные центры (кислоты, аммониевые и другие соли). Для увеличения интенсивности пиков к матрице часто добавляют кислоты, гидроксиды или соли. В случае пептидов, например, добавление НСI резко увеличивает интенсивность пиков ионов [M + H]⁺. Добавление NaCl применяется при исследовании олигосахаридов и некоторых других соединений, поскольку при этом образуются интенсивные ионы[M+Na]^+•. Добавку NH₄OH, NaOH или Ca(OH)₂ используют для увеличения выхода отрицательных ионов.

Таким образом, методом бомбардировки ускоренными атомами можно исследовать довольно сложные высокомолекулярные и нелетучие соединения: олигопептиды, олигосахариды, нуклеотиды, витамины, антибиотики. Однако для изучения неполярных соединений этот метод практически непригоден.

В конце 1980-х годов появилась еще одна разновидность этого метода, обеспечивающая бомбардировку быстрыми атомами непрерывного потока. Схема ионного источника в этом случае та же, что и для статического варианта. Отличие заключается лишь в том, что шток содержит капиллярное отверстие, находящееся против мишени. По этому капилляру подается раствор, который вытекает из отверстия на мишень, где и бомбардируется атомами. Метод интересен для исследования смесей биополимеров, разделяемых тем+ или иным методом (жидкостная хроматография, электрофорез). Растворитель, одновременно являющийся матрицей, обычно состоит из воды (более 90%), глицерина и ацетонитрила.



2.7 МЕТОД ДЕСОРБЦИИ ПЛАЗМОЙ

Разложение термически нестабильных соединений может быть предотвращено очень быстрым их нагреванием. Этот принцип лежит в основе плазменной десорбции (рис.2.10). Анализируемое вещество помещают на никелевую или алюминизированную полиэфирную фольгу (2) толщиной ~10^-3 мм. С противоположной стороны от образца располагается источник с ²⁵²Cf. При самопроизвольном делении ядер калифорния образуется пара осколков с разной массой и энергией, летящих строго в противоположных направлениях. Таких пар осколков в случае с ²⁵²Cf получается ~40. Типичными из них являются ¹⁴⁶Ва и ¹⁰⁶Тс с кинетическими энергиями 794 и 104 МэВ. Когда такой высокоэнергетичный фрагмент проходит через фольгу, происходит чрезвычайно быстрый нагрев до 10 000 К. Молекулы образца, находящиеся в этой зоне, не успевают разложиться, но десорбируются с образованием положительных и отрицательных ионов, которые ускоряются в зоне анализатора. До сих пор этот метод реализуется на времяпролетных масс-спектрометрах.

При десорбции плазмой наиболее характерными пиками являются [M+Н]⁺ и [M-Н]^?. Метод особенно эффективен при исследовании биомолекул с массой до 3000 Д.

2.8 ИОНИЗАЦИЯ В ПРОЦЕССЕ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИИ

Метод лазерной десорбции используют при исследовании сравнительно нелетучих и термически нестабильных материалов. Эффективность этого метода ионизации определяется тем, что скорости процесса перевода молекулы из конденсированной фазы под воздействием лазерного излучения и связанной с ним ионизации гораздо выше, чем скорость разложения вещества. Устройство ионного источника в данном случае довольно простое. Такой источник содержит источник лазерного излучения (с длинной волны в области дальнего ультрафиолета или ИК-области), которое фокусируется на мишень. На последнюю нанесен образец. Кроме того, источник содержит ионно-оптическую систему, позволяющую выталкивать ионы в область масс-анализатора. Образец наносится на мишень либо осаждением из раствора, либо в смеси с соответствующей матрицей. Последний метод, называемый ионизацией в процессе лазерной десорбции, облегчаемой матрицей (matrix-assisted laser desorption ionization - MALDI) сейчас получил наибольшее распространение, поскольку в сочетании с времяпролетными масс-спектрами позволяет анализировать не только биополимеры, но и синтетические полимеры с молекулярными массами более 500 000 Д. Единственная проблема в этом случае состоит лишь в подборе подходящей матрицы, обеспечивающей наибольший выход ионов исследуемого вещества. Нужно отметить, что чаще всего в таких масс-спектрометрах регистрируются протонированные молекулярные ионы [M+Н]⁺. Если же образец нанесен на мишень в виде пасты с NaI или KI, то характерной особенностью масс-спектров является наличие пиков ионов [M + Met]⁺.

...