2.9 ИОНИЗАЦИЯ ЭЛЕКТРОРАСПЫЛЕНИЕМ

Этот метод основан на том, что в растворах полярные соединения в результате взаимодействия с растворителем легко образуют ионы и заряженные комплексы, и поэтому масс-спектрометрический анализ таких растворов не требует предварительной ионизации пробы. Электрораспыление включает три основные стадии: 1) собственно распыление, которое сопровождается образованием маленьких высокозаряженных капель; 2) десорбцию ионов из этих капель, сопряженную с образованием псевдомолекулярных ионов; 3) формирование в масс-спектрометре ионного пучка для анализа.

На практике эти процессы происходят следующим образом. Раствор подают в источник по металлическому капилляру, вблизи торца которого создается сильное неоднородное электрическое поле. Под действием последнего мениск жидкости вытягивается и принимает конусообразную форму. При этом с поверхности происходит быстрое газокинетическое испарение заряженных микрокапель. Часть из них несет избыток положительного заряда, а часть - отрицательного, хотя раствор в целом электронейтрален. При атмосферном давлении капли сталкиваются с нейтральными молекулами газа, испаряются и распадаются с выделением ионов из ионных кластеров. Далее ионы вводятся в масс-спектрометр.

Следует заметить, что ионизацию электрораспылением полезно использовать вместе с времяпролетными масс-спектрометрами, обеспечивающими измерение массы больших молекул. Однако простые секторные и квадрупольные масс-спектрометры также вполне пригодны для этих целей. Дело в том, что при электрораспылении возникают многозарядные ионы, которые регистрируются при значениях массовых чисел m/nz (где n - число зарядов в ионе). Например, пятизарядный молекулярный ион биополимера с молекулярной массой 50 000 проявляется в масс-спектре при m/z 10 000.

2.10 ПРОЧИЕ МЕТОДЫ ИОНИЗАЦИИ

Ионизация «в пучке» и десорбционная химическая ионизация. Масс-спектры некоторых труднолетучих соединений можно получить, если образец нагревать с такой скоростью, при которой в газовую фазу переходит гораздо больше молекул по сравнению с количеством молекул, претерпевающих термоспад.

Один из способов реализации этого эффекта состоит в помещении образца, нанесенного на поверхность инертного наконечника штока непосредственно рядом с пучком электронов (ионизация «в пучке»). При этом происходит образование молекулярных протонированных ионов, а процесс, возможно, является химической самоионизаией.

Другой вариант реализации указанного принципа состоит в том, что образец, нанесенный на удлиненный наконечник штока (проволока диаметром 50-200мкм; быстрый нагрев со скоростью 10°/ с до 50-1000°С), вводят непосредственно в источник для ХИ (десорбционная химическая ионизация). Регистрируемые масс-спектры аналогичны масс-спектрам ХИ, т.е. содержат интенсивные пики ионов [M+Н]⁺ и мало фрагментных ионов. Следует отметить, что качество масс-спектров при этом способе ионизации тем выше, чем больше скорость нагрева образца. Наилучшие спектры регистрируются в течение очень короткого промежутка времени после достижения оптимальной температуры. Это диктует необходимость использования для реализации данного метода масс-спектрометров с большими скоростями сканирования.

Ионизация при атмосферном давлении. Этот метод интересен тем, что ионизация происходит вне вакуумной системы масс-спектрометра, а образующиеся ионы и нейтральные молекулы в потоке газа-носителя через диафрагму поступают в аналитическую часть масс-спектрометра. При ионизации в качестве источника электронов применяют в-источник ⁶²Ni или коронный разряд. В качестве газа-носителя используют азот или аргон. Характер масс-спектров очень сильно зависит от чистоты газа-носителя, расстояния между электродами и диафрагмой. В общем случае масс-спектры, полученные этим методом, близки к регистрируемым при ХИ. Примеси в газе-носителе (H₂O, N₂, О₂ и др.) проявляются своими пиками в масс-спектрах. Интересно, что этот метод позволяет проводить ионизацию и в парах растворителя, тем самым обеспечивая прямой анализ растворов.

Ионизация в искровом источнике происходит при вакуумном разряде между двумя электродами, на один из которых нанесен образец. В наиболее распространенных радиочастотных источниках разность потенциалов между электродами составляет от 20 до 100 кВ. Метод предназначен в основном для анализа неорганических веществ.

3. МАСС-АНАЛИЗАТОРЫ

Полученные при ионизации ионы с помощью электрического поля переносятся в масс-анализатор. Там начинается второй этап масс-спектрометрического анализа - сортировка ионов по массам. Существуют следующие типы масс-анализаторов:

непрерывные масс-анализаторы

· Магнитный и электростатический секторный масс-анализатор (англ. Sector instrument)

· Квадрупольный масс-анализатор (англ. Quadrupole mass analyzer)

Импульсные масс-анализаторы

· Времяпролетный масс-анализатор (англ. Time-of-flight mass spectrometry);

· Ионная ловушка (англ. Ion trap);

· Квадрупольная линейная ловушка (англ. Quadrupole ion trap);

· Масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (англ. Fourier transform ion cyclotron resonance);

· Орбитрэп (англ. Orbitrap);

Разница между непрерывными и импульсными масс-анализаторами заключается в том, что в первые ионы поступают непрерывным потоком, а во вторые - порциями, через определенные интервалы времени.

Масс-спектрометр может иметь два масс-анализатора. Такой масс-спектрометр называется тандемным. Тандемные масс-спектрометры применяются, как правило, вместе с «мягкими» методами ионизации, при которых не происходит фрагментации ионов анализируемых молекул (молекулярных ионов). Таким образом первый масс-анализатор анализирует молекулярные ионы. Покидая первый масс-анализатор, молекулярные ионы фрагментируются под действием соударений с молекулами инертного газа или излучения лазера, после чего их фрагментация анализируется во втором масс-анализаторе. Наиболее распространенными конфигурациями тандемных масс-спектрометров являются квадруполь - квадрупольная и квадруполь - времяпролетная.

Общее сравнение анализаторов масс (эти значения могут варьироваться в зависимости от производителя прибора)

3.1 ДЕТЕКТОРЫ

Последним элементом масс-спектрометра, является детектор заряженных частиц. Первые масс-спектрометры использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод, выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него ещё большее количество электронов и т. д. Другой вариант -- фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора. Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея).

3.2 ХАРАКТЕРИСТИКИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРОВ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ДЕТЕКТОРОВ

Важнейшими техническими характеристиками масс-спектрометров являются:

· чувствительность;

· динамический диапазон;

· разрешение;

· скорость сканирования.

Важнейшая характеристика при анализе органических соединений - чувствительность. Для того, чтобы достигнуть как можно большей чувствительности при улучшении отношения сигнала к шуму, прибегают к детектированию по отдельным выбранным ионам. Выигрыш в чувствительности и селективности при этом колоссальный, но при использовании приборов низкого разрешения приходится приносить в жертву другой важный параметр -- достоверность. Ведь если Вы записывали только один пик из всего характеристического масс-спектра, Вам понадобится ещё много поработать, чтобы доказать, что этот пик соответствует именно тому компоненту, который Вас интересует. Как же разрешить эту проблему? Использовать высокое разрешение на приборах с двойной фокусировкой, где можно добиться высокого уровня достоверности, не жертвуя чувствительностью. Или использовать тандемную масс-спектрометрию, когда каждый пик, соответствующий одиночному иону можно подтвердить масс-спектром дочерних ионов. Абсолютным рекордсменом по чувствительности является органический хромато-масс-спектрометр высокого разрешения с двойной фокусировкой. По характеристике сочетания чувствительности с достоверностью определения компонентов следом за приборами высокого разрешения идут ионные ловушки. Классические квадрупольные приборы нового поколения имеют улучшенные характеристики благодаря ряду инноваций, примененных в них, например, использованию искривленного квадрупольного префильтра, предотвращающего попадание нейтральных частиц на детектор и, следовательно, снижению шума.

3.3 ВАКУУМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

Всем масс-спектрометрам нужен вакуум, чтобы ионы могли достичь детектора без столкновений с другими газообразными молекулами или атомами.

Если такие столкновения возникают, прибор подвергается уменьшению разрешения и чувствительности. Высокие давления также могут вызывать разряд напряжений в землю, что ведет к повреждению прибора, его электроники или компьютерной системы, обслуживающей масс-спектрометр. Мощная утечка, и основанный на ней прорыв атмосферы внутрь прибора, может серьезно повредить масс-спектрометр, уничтожив электростатические линзы, забрызгав оптику насосным маслом или повредив детектор. В общем, поддержание хорошего вакуума является ключевым моментом в получении высококачественных спектров.

4. ????-????????????? DART

В 2005 г. был предложен новый способ скрининга таблетированных лекарственных препаратов на наличие действующего вещества, основанный на использовании масс-спектрометрии DART. Длительность одного анализа составляет несколько секунд. При этом регистрируемые масс-спектры настолько просты по составу, что для их расшифровки достаточно информации о молекулярной массе действующего вещества и не требуется никаких дополнительных баз данных или атласов спектров.

Масс-спектрометрия DART не требует стадии пробоподготовки и хроматографирования [6,7]. Аббревиатура DART (Direct Analysis in Real Time) переводится на русский язык как «прямой анализ в реальном времени», но она имеет и другой смысл: слово «Dart» означает «Стрела», что отражает суть метода -- стремительное и точное попадание в цель, то есть быстрое получение важной информации об анализируемом объекте. Метод позволяет проводить сверхбыструю идентификацию низкомолекулярных компонентов любых твердых или жидких объектов. Процедура анализа сводится к тому, что объект вносят пинцетом (в случае твердых образцов) или палочкой (в случае жидких объектов) в ионный источник DART, где происходит испарение вещества и его ионизация с последующей регистрацией образуемых ионов масс-спектрометром. При этом образуются очень простые спектры, обычно содержащие протонированные молекулярные ионы низкомолекулярных компонентов пробы, то есть ионы, образованные путем присоединения протона к молекуле -- [M+H]+. Для получения масс- спектра образца достаточно внести его в ионный источник DART на несколько секунд, при этом оператор масс-спектрометра сразу же видит образуемый масс-спектр на мониторе компьютера, подключенного к масс-спектрометру.

4.1 Принцип ионизации DART

Схема источника DART приведена на рис. 4.1. Поток газа проходит через область разряда, в которой образуются ионы, электроны и метастабильные (возбужденные) частицы - молекулы или атомы.

Рис. 4.1 общая (а) и детальная (b) схемы источника DART. 1 - подача газа, 2 - иглообразный электрод, 3 - дисковые электроды, 4 - нагреватель газа, 5 - решетчатый электрод, 6 - уплотняющий колпачок, 7 - вход в масс-спектрометр

В камере разряда по мере прохождения газа через источник образуются ионы, электроны и возбужденные атомы или молекулы, а затем большинство заряженных частиц удаляется на электродах, т.е. из источника выходит поток метастабильных частиц газа. Газ нагревают для обеспечения термодесорбции молекул аналитов. Поток газа из источника направляют непосредственно на исследуемый образец, помещенный в воздушный зазор между этим источником и выходом в масс-анализатор. В большинстве экспериментов с использованием DART-MS используют гелий чистотой 99.999%. Потенциал на газоразрядной игле в источнике - от 1 до 5 кВ, первый перфорированный дисковой электрод заземлен, а значения потенциалов на втором перфорированном и на решетчатом электродах составляют около ±100 и ±250В соответственно (знак плюс - в режиме регистрации положительных потенциалов, знак минус - в режиме регистрации отрицательных ионов). Скорость потока газа обычно ? 0.55 л*мин^-1, температура - от комнатной до 350є C. Ширина воздушного зазора между выходом из источника DART и входным отверстием скиммера или вакуумного интерфейса масс-спектрометра обычно колеблется в интервале от 5 до 25 мм.

Механизмы ионизации аналитов при использовании DART-MS сложны и изучены неполно. Большинство работ, посвященных их исследованию, выполнены с использованием гелия. Предполагается, что одновременно протекают несколько сложных процессов в зависимости от сродства к протону и потенциала ионизации аналита, его концентрации в образце, полярности и природы используемого газа, а также наличия вспомогательных реагентов. В некоторых публикациях проводится аналогия механизмов ионизации DART, с одной стороны, и фото- и химической ионизации при атмосферном давлении - с другой.

4.2 Применение DART-MS в фармацевтическом анализе

Для фармацевтического анализа метод масс-спектрометрии DART представляет интерес с различных точек зрения, предварительно показаны возможности его применения для решения самых разных задач: отслеживания полноты прохождения реакций органического синтеза новых лекарственных веществ [8], прямой анализ компонентов смесей, разделенных на ТСХ-пластине, с ее поверхности [9], идентификации запрещенных лекарственных веществ в напитках [10] и для количественного анализа в исследованиях фармакокинетики и метаболизма [11]. Однако наиболее широкое применение масс-спектрометрия DART может найти в анализе фармацевтических субстанций и лекарственных препаратов. Вместе с тем, поскольку метод весьма нов, на сегодняшний день имеющиеся сведения о его применении в контроле качества лекарственных препаратов опубликованы только в англоязычной литературе и ограничены данными об анализе нескольких твердых лекарственных форм и субстанций и лишь одной мази. Тем не менее эти данные указывают на большой потенциал масс-спектрометрии DART в этой области. Актуальным является дальнейшее тщательное изучение возможности контроля качества лекарственных препаратов методом масс-спектрометрии DART на большем числе различных фармацевтических препаратов.

В качестве примера использования масс-спектрометрического метода анализа в данной работе приведена выдержка из статьи журнала «Вестник Росздравнадзора» о результатах проведенных исследований в области быстрого контроля качества таблетированных лекарственных препаратов путем сверхбыстрой идентификации действующего вещества методом масс-спектрометрии DART.

В результате исследований на примере ряда отечественных препаратов (Глицин, Ноотропил, Анаприлин, Мексидол и др.) была показана возможность идентификации действующего вещества этих препаратов в течение нескольких секунд и без какого-либо сопоставления с базами данных или атласами спектров. Исследуемые таблетки помещали пинцетом на несколько секунд в зазор между источником DART и входным отверстием в масс-спектрометр (рис. 4.2) и регистрировали их масс-спектры. Идентификацию активных компонентов осуществляли путем сопоставления значений известных нам

Рис. 4.2 Ввод исследуемой таблетки в зазор между ионным источником DART и входным отверстием в масс-спектрометр

Рис. 4.3 Масс-спектр DART таблетки препарата Мексидол

молекулярных масс активных компонентов изученных препаратов с зарегистрированными для интенсивных сигналов в масс-спектре отношениями массы к заряду (m/z). На рисунке 4.3. в качестве примера приведен масс-спектр препарата Мексидол, активным компонентом которого является этилметилгидроксипиридин. Его относительная молекулярная масса составляет 137 г/моль. Как видно из рисунка 4.3, в спектре DART препарата Мексидол наблюдался интенсивный сигнал протонированного молекулярного иона [M+H]+ с соотношением m/z, равным 138, т.е. на единицу большим относительной молекулярной массы этилметилгидроксипиридина, что позволяло мгновенно подтвердить наличие искомого компонента в таблетке. Для остальных исследуемых препаратов также наблюдались спектры весьма простого состава, по которым можно было фактически мгновенно судить о наличии действующего вещества в исследуемой таблетке.

Вывод

Масс-спектрометрия - важнейший метод анализа биологических и небиологических молекул. Ее развитие неизменно следует развитию научных и прикладных интересов общества. Существует множество вариантов проведения масс-спектрометрического анализа. Одной из современных интерпретаций масс-спектрометрии на сегодняшний день является масс-спектрометрия DART. С момента ее появления в 2005 году интерес к ней возрастал, особенно с точки зрения возможности проведения экспрессных анализов твердых и жидких объектов сложного состава, в том числе лекарственных средств. Так как методология фармацевтического DART-MS анализа в начале 2000-ых не была развита, требовалось подробное изучение возможностей и ограничений метода. Для этого были изучены масс-спектры DART разных органических соединений и выбраны критерии оптимизации условий анализа. Визуализация ионизирующего потока из источника DART на поверхности позволяет проводить точное позиционирование и, благодаря этому, воспроизводимое сканирование различных объектов, в том числе пластин для планарной хроматографии, методом DART-MS. С момента введения в практику масс-спектрометрии DART были проведены различные исследования возможности анализа ряда лекарственных средств (таблеток, мазей, природного растительного сырья и др.), показана возможность экспрессного обнаружения компонентов изученных объектов, изучены возможности и ограничения DART-MS. В результате проведенных исследований разработана методология масс-спектрометрии DART для быстрого анализа лекарственных средств.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. В.Г. Заикин, А.В. Варламов, А.И Микая, Н.С. Простаков. Основы масс-спектрометрии органических соединений. 2001.

2. http://ru.science.wikia.com/wiki/Спектрометрия.

3. http://www.bestreferat.ru.

4. Материал из курса лекций по элективу «Физико-химические методы исследования органических соединений». 2013.

5. http://ru.wikipedia.org.

6. Cody R.B., Laramee J.A. and Dupont Durst H., Anal. Chem., vol. 77, P. 2294 (2005).

7. Cody R.B., SpectroscopyEurope, vol. 18, P. S12 (2006).

8. Petucci C., Diffendal J., Kaufman D., et al., Anal. Chem., vol. 79, P. 5064 (2007).

9. Morlock G., Ueda Y., J. Chromatogr. A, vol. 1143, P. 243 (2007).

10. Bennett M.J., Steiner R.R., J. Forensic Sci., vol. 54, P. 370 (2009).

11. Zhao Y., Lam M., Wu D. and Mak R., Rapid Commun. Mass Spectrom., vol. 22, P. 3217 (2008).

Размещено на Allbest.ru