Одна из типичных схем оптического микроскопа приведена на рис. 1. Объект 7, расположенный на предметном столике 10, освещается обычно искусственным светом от осветителя (лампа 1 и линза-коллектор 2) с помощью зеркала 4 и конденсора 6. Для увеличения объекта служит объектив 8 и окуляр 9. Объектив создает действительное перевернутое и увеличенное изображение 7' объекта 7. Окуляр образует вторично увеличенное мнимое изображение 7" обычно на расстоянии наилучшего видения D=250 мм. Если окуляр сдвинуть так, чтобы изображение 7' оказалось перед передним фокусом окуляра F_ок, то изображение, даваемое окуляром, становится действительным и его можно получить на экране или фотопленке. Общее увеличение равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра:

x=bX_ок.

Увеличение объектива выражается формулой:

b=D/F_об,

где D - расстояние между задним фокусом объектива F_об и передним фокусом окуляра F_ок (так называемая оптическая длина тубуса микроскопа); F_об - фокусное расстояние объектива. Увеличение окуляра, подобно увеличению лупы, выражается формулой:

X_ок = 250/F_ок,

где F_ок - фокусное расстояние окуляра. Обычно объективы оптических микроскопов имеют увеличения от 6,3 до 100, а окуляры от 7 до 15. Поэтому общее увеличение такого микроскопа лежит в пределах от 44 до 1500. Полевая диафрагма 3 и апертурная 5 служат для ограничения светового пучка и уменьшения рассеянного света. Важной характеристикой оптического микроскопа является его разрешающая способность, определяемая как величина, обратная тому наименьшему расстоянию, на котором два соседних элемента структуры еще могут быть видимы раздельно. Разрешающая способность оптического микроскопа ограничена, что объясняется дифракцией света. Вследствие дифракции изображение бесконечно малой светящейся точки, даваемое объективом такого микроскопа, имеет вид не точки, а круглого светлого диска (окруженного темными и светлыми кольцами), диаметр которого равен: d = 1,22 /А, где - длина волны света и А - числовая апертура объектива, равная: А = nsin (a/2) (n - показатель преломления среды, находящейся между предметом и объективом, a - угол между крайними лучами конического светового пучка, выходящего из точки предмета и попадающего в объектив). Если две светящиеся точки расположены близко друг от друга, их дифракционные картины накладываются одна на другую, давая в плоскости изображения сложное распределение освещенности. Наименьшая относительная разница освещенностей, которая может быть замечена глазом, равна 4%. Этому соответствует наименьшее расстояние, разрешаемое в оптическом микроскопе,

d=0,51/А.

Для несамосветящихся объектов предельное разрешение d_пр составляет

/ (А+А'),

где А' - числовая апертура конденсора микроскопа. Таким образом, разрешающая способность (1/d) прямо пропорциональна апертуре объектива и для ее повышения пространство между предметом и объективом заполняется жидкостью с большим показателем преломления. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины А=1,3 (у обычных "сухих" объективов А=0,9). Существование предела разрешающей способности влияет на выбор увеличения оптического микроскопа. Увеличение оптического микроскопа в пределах 500А - 1000А называется полезным, так как при нем глаз различает все элементы структуры объекта, разрешаемые микроскопом. При увеличениях свыше 1000А не выявляются никакие новые подробности структуры объекта; все же иногда такие увеличения применяются, например, в микрофотографии, при микропроекции.

Методы наблюдения при оптической микроскопии

Структуру объекта можно различить, если разные его части по-разному поглощают и отражают свет, либо отличаются одна от другой (или от среды) показателями преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, отраженных или прошедших через различные участки объекта, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения, применяемые в оптической микроскопии, выбираются в зависимости от характера и свойств изучаемого объекта.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных объектов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Таковы, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и материалов радиоэлектроники. В отсутствии объекта пучок лучей из конденсора 6 (см. рис. 1) проходит через объектив 8 и дает равномерно освещенное поле вблизи фокальной плоскости окуляра 9. Если в объекте 7 имеется абсорбирующий объект, то он отчасти поглощает и отчасти рассеивает падающий на него свет (штриховая линия), что и обусловливает, согласно дифракционной теории, возникновение изображения. Метод может быть полезен и при неабсорбирующих объектах, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть пучка не попадает в объектив.

Метод светлого поля в отраженном свете (рис.2) применяется для наблюдения непрозрачных объектов, например, шлифов металлов 4.

Рис. 2. Метод светлого поля в отраженном свете

Освещение объекта производится от осветителя 1 и полупрозрачного зеркала 2 сверху через объектив 3, который выполняет одновременно и роль конденсора. Изображение создается в плоскости 6 объективом совместно с тубусной линзой 5; структура объекта видна из-за различия в отражающей способности ее элементов; на светлом поле выделяются неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.

Метод темного поля в проходящем свете (рис.3) применяется для получения изображений прозрачных, неабсорбирующих объектов. Свет от осветителя 1 и зеркала 2 проходит специальный конденсор темного поля 3 в виде полого конуса и непосредственно в объектив 5 не попадает. Изображение создается только светом, рассеянным микрочастицами объекта 4. В поле зрения 6 на темном фоне видны светлые изображения частиц, отличающихся от окружающей среды по показателю преломления.

Рис. 3. Метод темного поля в проходящем свете

Метод ультрамикроскопии, основанный на этом же принципе (освещение объекта в ультрамикроскопах производится перпендикулярно направлению наблюдения), дает возможность обнаруживать сверхмелкие детали, размеры которых (2 нм) лежат далеко за пределами разрешения оптического микроскопа. Возможность обнаружения таких объектов, например, мельчайших коллоидных частиц, с помощью ультрамикроскопа обусловлена дифракцией света на них. При сильном боковом освещении каждая частица в ультрамикроскопе отмечается наблюдателем как яркая точка (светящееся дифракционное пятно) на темном фоне. Вследствие дифракции на мельчайших частицах рассеивается очень мало света. Поэтому в ультрамикроскопии применяют, как правило, сильные источники света. В зависимости от интенсивности освещения, длины световой волны, разности показателей преломления частицы и среды обнаруживаемые частицы имеют размеры (2-50) нм. По дифракционным пятнам нельзя определить истинные размеры, форму и структуру частиц: ультрамикроскоп не дает изображений оптических исследуемых объектов. Однако, используя ультрамикроскоп, можно установить наличие и численную концентрацию частиц, изучать их движение, а также рассчитать средний размер частиц, если известна их весовая концентрация и плотность. Ультрамикроскоп создали в 1903г. немецкий физик Г. Зидентопф и австрийский химик Р. Зигмонди. В предложенной ими схеме щелевого ультрамикроскопа (рис.4, а) исследуемая система неподвижна. Кювета 5 с изучаемым объектом освещается источником света 1 (2 - конденсор; 4 - осветительный объектив) через узкую прямоугольную щель 3, изображение которой проецируется в зону наблюдения.

Рис. 4. Принципиальные схемы щелевого (а) и поточного (б) ультрамикроскопов

В окуляр наблюдательного микроскопа 6 видны светящиеся точки частиц, находящихся в плоскости изображения щели. Выше и ниже освещенной зоны присутствие частиц не обнаруживается. В поточном ультрамикроскопе (рис.4, б) изучаемые частицы движутся по трубке навстречу глазу наблюдателя. Пересекая зону освещения, они регистрируются как яркие вспышки визуально или с помощью фотометрического устройства. Регулируя яркость освещения наблюдаемых частиц подвижным фотометрическим клином 7, можно выделять для регистрации частицы, размер которых превышает заданный предел. Ультрамикроскоп применяют при исследованиях дисперсных систем, для контроля чистоты атмосферного воздуха, воды, степени загрязнения оптически прозрачных сред посторонними включениями.

При наблюдении по методу темного поля в отраженном свете (рис.5) непрозрачные объекты (например, шлифы металлов) освещают сверху специальной кольцевой системой, расположенной вокруг объектива и называемой эпиконденсором.

Рис. 5. Схема прибора для контроля чистоты поверхностей подложек в темном поле микроскопа: 1 - лампа осветителя темного поля; 2 - эпиконденсор; 3 - подложка; 4, 5 - линзы объектива микроскопа; 6 - отражающее зеркало призмы микроскопа; 7 - линза окуляра микроскопа

Лучи света от лампы осветителя темного поля 1, отражающиеся от эпиконденсора 2 и падающие под углом к поверхности подложки 3, рассеиваются инородными частицами. Эти рассеянные от инородных частиц лучи света проходят через линзы объектива микроскопа 4 и 5, отражаются от зеркала призмы микроскопа 6 и, проходя через линзу окуляра микроскопа 7, различаются наблюдателем в виде светящихся точек в темном поле.

Метод наблюдения в поляризованном свете (в проходящем и отраженном) применяется для исследования анизотропных объектов, таких как минералы, руды, зерна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и клетки. Оптическая анизотропия - это различие оптических свойств среды в зависимости от направления распространения в ней оптического излучения (света) и его поляризации. Поляризация света - физическая характеристика оптического излучения, описывающая поперечную анизотропию световых волн, то есть неэквивалентность различных направлений в плоскости, перпендикулярной световому лучу. Поперечность электромагнитных волн лишает волну осевой симметрии относительно направления распространения из-за наличия выделенных направлений (вектора Е - напряженности электрического поля и вектора Н - напряженности магнитного поля) в плоскости, перпендикулярной направлению распространения. Поскольку векторы Е и Н электромагнитной волны перпендикулярны друг другу, для полного описания состояния поляризации светового пучка требуется знание поведения лишь одного из них. Обычно для этой цели выбирается вектор Е. Свет, испускаемый каким-либо отдельно взятым элементарным излучателем (атомом, молекулой), в каждом акте излучения всегда поляризован. Но макроскопические источники света состоят из огромного числа таких частиц-излучателей; пространственные ориентации векторов Е и моменты актов испускания света отдельными частицами в большинстве случаев распределены хаотически. Поэтому в общем излучении направление Е в каждый момент времени непредсказуемо. Подобное излучение называется неполяризованным, или естественным светом. Свет называется полностью поляризованным, если две взаимно перпендикулярные компоненты (проекции) вектора Е светового пучка совершают колебания с постоянной во времени разностью фаз. Обычно состояние поляризации света изображается с помощью эллипса поляризации - проекции траектории конца вектора Е на плоскость, перпендикулярную лучу (рис.6)

Рис. 6. Примеры различных поляризаций светового луча при различных разностях фаз между взаимно перпендикулярными проекциями E_x и E_y. Плоскость рисунков перпендикулярна направлению распространения света. а) и д) - линейные поляризации; в) - круговая поляризация; б), г) и е) - эллиптические поляризации

Оптическая анизотропия проявляется в двойном лучепреломлении, изменении поляризации света и во вращении плоскости поляризации, происходящем в оптически активных веществах. Естественная оптическая анизотропия кристаллов обусловлена неодинаковостью по различным направлениям поля сил, связывающих атомы решетки. Естественная оптическая активность веществ, которые проявляют ее в любом агрегатном состоянии, связана с асимметрией строения отдельных молекул таких веществ и обусловленным ею различием во взаимодействии этих молекул с излучением различных поляризаций, а также с особенностями возбужденных состояний электронов и "ионных остовов" в оптически активных кристаллах. Наведенная (искусственная) оптическая анизотропия возникает в средах, от природы оптически изотропных под действием внешних полей, выделяющих в таких средах определенное направление. Это может быть электрическое поле, магнитное поле, поле упругих сил, а также поле сил в потоке жидкости. В методе наблюдения в поляризованном свете с помощью анализаторов и компенсаторов, которые включены в оптическую систему, изучается изменение поляризации света, прошедшего через объект.

Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при малом различии показателей преломления объекта и среды световая волна, прошедшая сквозь них, претерпевает разные изменения по фазе и приобретает фазовый рельеф. Эти фазовые изменения преобразуются в изменения яркости ("амплитудный рельеф") с помощью специальной фазовой пластинки (фазового кольца), расположенной вблизи заднего фокуса объектива. Лучи, прошедшие через объект, полностью проходят через фазовое кольцо, которое изменяет их фазу на /4. В то же время лучи, рассеянные в объекте (отклоненные), не попадают в фазовое кольцо и не получают дополнительного сдвига фазы. С учетом фазового сдвига в объекте разность фаз между лучами отклоненными и неотклоненными оказывается близкой к 0 или /2, и в результате интерференции света в плоскости изображения объекта они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры объекта, в котором распределение яркостей воспроизводит указанный выше фазовый рельеф.

Рис. 4. Метод интерференционного контраста

Метод интерференционного контраста состоит в том, что каждый луч, входящий в микроскоп, раздваивается: один проходит сквозь наблюдаемую частицу, а второй - мимо нее. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Результат интерференции определяется разностью хода лучей d, которая выражается формулой: d=N= (n₀-n_m) d₀, где n₀, n_m - показатели преломления соответственно частицы и окружающей среды, d₀ - толщина частицы, N - порядок интерференции. Принципиальная схема одного из способов осуществления интерференционного контраста показана на рис.4. Конденсор 1 и объектив 4 снабжены двоякопреломляющими пластинками (помечены на рисунке диагональными стрелками), первая из которых расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект 3, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом); величина этого запаздывания измеряется компенсатором 5. Метод интерференционного контраста в некоторых отношениях сходен с методом фазового контраста - оба они основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших ее. Отличие интерференционного метода от метода фазового контраста заключается главным образом в возможности с высокой точностью (до /300) измерять разности хода, вносимые микрообъектом, используя компенсаторы. На основании этих измерений можно производить количественные расчеты, например, общей массы и концентрации сухого вещества в клетках биологических объектов.

Метод исследования в свете люминесценции основан на том, что под микроскопом изучается зелено-оранжевое свечение объекта, возникающее при его освещении сине-фиолетовым или УФ светом. Для этой цели перед конденсором и после объектива микроскопа вводят соответствующие светофильтры. Первый из них пропускает от источника-осветителя только излучение, вызывающее люминесценцию объекта, второй (после объектива) пропускает к глазу наблюдателя только свет люминесценции. Метод применяется в микрохимическом анализе, дефектоскопии.

Метод наблюдения в УФ лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа, пропорциональную 1/. Этот метод расширяет возможности микроскопических исследований также за счет того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определенных длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографированием, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана.

Метод наблюдения в ИК лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путем его фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например, темных стекол, некоторых кристаллов, минералов.

Основные узлы оптического микроскопа. Кроме указанных выше оптических узлов (например, объектив, окуляр), в оптическом микроскопе имеются также штатив или корпус, предметный столик для крепления исследуемого объекта, механизмы для грубой и точной фокусировки, устройство для крепления объективов и тубус для установки окуляров. Применение того или иного типа конденсора (светлопольные, темнопольные и т.д.) зависит от выбора необходимого метода наблюдения. Объективы в большинстве современных оптических микроскопов съемные. Объективы различаются:

а) по спектральным характеристикам - на объективы для видимой области спектра и для УФ и ИК микроскопии (линзовые и зеркально-линзовые);

б) по длине тубуса, на которую они рассчитаны (в зависимости от конструкции микроскопа);

в) по среде между объективом и объектом - на сухие и иммерсионные;

г) по методу наблюдения - на обычные, фазово-контрастные и др.

Рис. 5. Микрофотографии нетравленого шлифа металла в светлом поле (а) и с фазово-контрастным устройством (б)

Тип применяемого окуляра при данном методе наблюдения определяется выбором объектива оптического микроскопа. Приспособления к оптическим микроскопам позволяют улучшить условия наблюдения и расширить возможности исследований, осуществлять разные виды освещения объектов, определять размеры объектов, фотографировать объекты через микроскоп, и т.п. Типы микроскопов определяются либо областью применения, либо методом наблюдения. Например, биологические микроскопы предназначены для исследований в микробиологии, гистологии, цитологии, ботанике, медицине, а также для наблюдения прозрачных объектов в физике, химии и т.д. Металлографические микроскопы предназначены для исследования микроструктур металлов и сплавов. Снятые с помощью такого микроскопа микрофотографии нетравленого шлифа металла представлены на рис. 5 (а - в светлом поле, б - с фазово-контрастным устройством). Поляризационные микроскопы снабжены дополнительно поляризационными устройствами и предназначены главным образом для исследования шлифов минералов и руд. Стереомикроскопы служат для получения объемных изображений наблюдаемых предметов. Измерительные микроскопы предназначены для различных точных измерений в машиностроении. Кроме этих групп микроскопов имеются специализированные оптические микроскопы, например: микроустановка для киносъемки быстрых и медленных процессов (движение микроорганизмов, процессы деления клеток, роста кристаллов и т.п.); высокотемпературные микроскопы для исследования объектов, нагретых до 2000°С; хирургические микроскопы слабого увеличения, применяемые при операциях. Весьма сложными приборами являются микроспектрофотометрические установки для определения спектров поглощения объектов, телевизионные анализаторы микроизображений и др.

Как уже было сказано, независимо от вида используемых линз и способа их соединения, разрешающая способность оптических микроскопов ограничивается основным правилом оптической техники, сформулированным еще в 1873г. (так называемый дифракционный предел разрешения Рэлея), в соответствии с которым минимальные размеры различаемых деталей рассматриваемого объекта не могут быть меньше, чем половина длины волны света, используемого для освещения. Поскольку самые короткие длины волн диапазона соответствуют примерно 400 нм, разрешающая способность оптических микроскопов принципиально ограничена половиной этой величины, то есть составляет около 200 нм. Единственным выходом из возникшей ситуации стало создание приборов, в которых используются волновые излучения с меньшей длиной волны, то есть излучения не световой природы.

Электронная микроскопия

В квантовой механике электрон может рассматриваться в качестве волны, на которую, в свою очередь, можно воздействовать электрическими или магнитными линзами (в полной аналогии с законами привычной геометрической оптики). На этом основан принцип действия электронных микроскопов, позволяющих значительно расширить возможности исследования вещества на микроскопическом уровне (за счет увеличения разрешающей способности на порядки). В электронном микроскопе вместо света используются сами электроны, представляющие собой в данной ситуации излучение со значительно более короткой длиной волны (примерно в 50 000 раз меньше световой). В таких устройствах вместо стеклянных линз, естественно, применяются электронные линзы (то есть поля соответствующей конфигурации). Электронные пучки не могут распространяться без рассеяния даже в газовых средах, поэтому внутри электронного микроскопа, вдоль всей траектории электронов, должен поддерживаться высокий вакуум (давление до 10^-6 мм. рт. ст. или 10^-4 Па). Электронные микроскопы разделяются на два больших класса по методике применения: просвечивающие электронные микроскопы (ПЭМ) и сканирующие (СЭМ) или по-другому растровые (РЭМ). Основное различие между ними заключается в том, что в ПЭМ электронный пучок пропускается через очень тонкие слои исследуемого вещества, с толщиной менее 1 мкм (как бы "просвечивая" эти слои насквозь), а в сканирующих микроскопах электронный пучок последовательно отражается от маленьких участков поверхности (структура поверхности и ее характерные особенности могут быть определены при этом регистрацией отраженных электронов или вторичных электронов, возникающих при взаимодействии пучка с поверхностью).

Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ)

Конструкция ПЭМ похожа на схему обычного оптического микроскопа (рис. 1), только вместо лучей света используются электроны (то есть соответствующие им волны). Первое устройство такого типа было создано в 1932 г. немецкими учеными М. Кноллом и Е. Руска. В таком микроскопе источник света заменен так называемой электронной пушкой (источником электронов). Источником электронов обычно служит нагреваемый катод из вольфрама или гексаборида лантана. Катод электрически изолирован от остальной части прибора, и электроны ускоряются сильным электрическим полем. Металлический катод 2 испускает электроны, которые собираются в пучок с помощью фокусирующего электрода 3 и получают энергию под действием сильного электрического поля в пространстве между катодом и анодом 1. Для создания этого поля к электродам прикладывается высокое напряжение - 100 кВ и более. Выходящий из электронной пушки пучок электронов с помощью линзы-конденсора 4 направляется на рассматриваемый объект, который рассеивает, отражает и поглощает электроны. Они фокусируются линзой-объективом 5, которая создает промежуточное изображение объекта 7. Проекционная линза 6 снова собирает электроны и создает второе, еще более увеличенное изображение объекта на люминесцентном экране, на котором под действием электронов создается светящееся изображение объекта. С помощью помещенной под экраном фотопластины получают фотографию рассматриваемого объекта.

Рис. 1. Схема просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ):

1 - анод; 2 - катод; 3 - фокусирующий электрод; 4 - линза-конденсор; 5 - линза-объектив; 6 - проекционная линза; 7 - промежуточное изображение

Рис. 2. Схема действия магнитной линзы

Электронная оптика. Электронное изображение формируется электрическими и магнитными полями примерно так же, как световое - оптическими линзами. Принцип действия магнитной линзы поясняется схемой (рис. 2). Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, действует как собирающая линза, фокусное расстояние которой можно изменять, изменяя ток. Поскольку оптическая сила такой линзы, то есть способность фокусировать электроны, зависит от напряженности магнитного поля вблизи оси, для ее увеличения желательно сконцентрировать магнитное поле в минимально возможном объеме. Практически это достигается тем, что катушку почти полностью закрывают магнитной "броней" из специального никель-кобальтового сплава, оставляя лишь узкий зазор в ее внутренней части. Создаваемое таким образом магнитное поле может быть в 10-100 тыс. раз более сильным, чем магнитное поле Земли на земной поверхности.

Увеличение, которое можно получить в современных ПЭМ, составляет до 1 000 000. (При увеличении в миллион раз грейпфрут вырастает до размеров Земли). Исследуемый объект обычно помещают на очень мелкую сетку, вкладываемую в специальный держатель. Держатель можно механическим или электрическим способом плавно перемещать вверх-вниз и вправо-влево.

Изображение. Контраст в ПЭМ обусловлен рассеянием электронов при прохождении электронного пучка через образец. Если образец достаточно тонок, то доля рассеянных электронов невелика. При прохождении электронов через образец одни из них рассеиваются из-за столкновений с ядрами атомов образца, другие - из-за столкновений с электронами атомов, а третьи проходят, не претерпевая рассеяния. Степень рассеяния в какой-либо области образца зависит от толщины образца в этой области, его плотности и средней атомной массы (числа протонов) в данной точке. Электроны, выходящие из образца с угловым отклонением, превышающим некоторый предел, уже не могут вернуться в пучок, несущий изображение, а поэтому сильно рассеивающие участки повышенной плотности, увеличенной толщины, места расположения тяжелых атомов выглядят на изображении как темные зоны на светлом фоне. Такое изображение называется светлопольным, поскольку на нем окружающее поле светлее объекта. Но можно сделать так, чтобы электрическая отклоняющая система пропускала в диафрагму объектива только те или иные из рассеянных электронов. Тогда образец выглядит светлым на темном поле. На рис.3 показано расположение детекторов сигнала в колонне электронного микроскопа. Слабо рассеивающий объект часто бывает удобнее рассматривать в режиме темного поля. Окончательное увеличенное электронное изображение преобразуется в видимое посредством люминесцентного экрана, который светится под действием электронной бомбардировки. Это изображение, обычно слабоконтрастное, как правило, рассматривают через бинокулярный световой микроскоп. При той же яркости такой микроскоп с увеличением 10 может создавать на сетчатке глаза изображение, в 10 раз более крупное, чем при наблюдении невооруженным глазом. Иногда для повышения яркости слабого изображения применяется люминофорный экран с электронно-оптическим преобразователем. В этом случае окончательное изображение может быть выведено на обычный телевизионный либо компьютерный экран. Видеозапись применяется для регистрации изображений, меняющихся во времени, например, в связи с протеканием химической реакции. Чаще всего окончательное изображение регистрируется на фотопленке или фотопластинке. Фотопластинка обычно позволяет получить более четкое изображение, чем наблюдаемое простым глазом или записанное в видеоформате, так как фотоматериалы, вообще говоря, более эффективно регистрируют электроны.

Рис. 3. Расположение детекторов сигнала в колонне электронного микроскопа

Разрешающая способность. Электронные пучки имеют свойства, аналогичные свойствам световых пучков. В частности, каждый электрон характеризуется определенной длиной волны. Разрешающая способность электронных микроскопов определяется эффективной длиной волны электронов. Длина волны зависит от скорости электронов, а следовательно, от ускоряющего напряжения; чем больше ускоряющее напряжение, тем больше скорость электронов и тем меньше длина волны, а значит, выше разрешение. Длина волны электронов в падающем пучке выражается формулой:

нм (1)

где энергия, полученная электронами E = eV, а V - ускоряющее напряжение, выраженное в киловольтах. Если присутствуют удаленные друг от друга тяжелые атомы, то они дают основной вклад в рассеяние со средним углом рассеяния , выражающемся как /d, где d - средний диаметр таких атомов. Для ускоряющего напряжения 100 кВ и среднего диаметра атомов 0,15 нм получаем 0,026 радиана, или 1,5. Изображение формируется вследствие того, что разные атомы рассеивают и поглощают быстрые электроны с разной эффективностью.

Значительное преимущество электронной микроскопии в разрешающей способности объясняется тем, что длина волны электронов намного меньше длины волны света. Но поскольку электронные линзы не так хорошо фокусируют, как оптические (числовая апертура хорошей электронной линзы составляет всего лишь 0,09, тогда как для хорошего оптического объектива эта величина достигает 0,95), разрешение электронной микроскопии равно 50 - 100 длинам волн электронов. Даже со столь слабыми линзами в электронном микроскопе можно получить предел разрешения около 0,17 нм, что позволяет различать отдельные атомы в кристаллах. Для достижения разрешения такого порядка необходима очень тщательная настройка прибора; в частности, требуются высокостабильные источники питания, а сам прибор (который может быть высотой около 2,5 м и иметь массу в несколько тонн) и его дополнительное оборудование требуют монтажа, исключающего вибрацию.

Рис. 4. Растровый электронный микроскоп (РЭМ).

1 - источник электронов; 2 - ускоряющая система; 3 - магнитная линза; 4 - отклоняющие катушки; 5 - образец; 6 - детектор отраженных электронов; 7 - кольцевой детектор; 8 - анализатор.

Растровый (сканирующий) электронный микроскоп (РЭМ)

РЭМ, ставший важнейшим прибором для научных исследований, служит хорошим дополнением ПЭМ. В РЭМ применяются электронные линзы для фокусировки электронного пучка в пятно очень малых размеров. Можно отрегулировать РЭМ так, чтобы диаметр пятна в нем не превышал 0,2 нм, но, как правило, он составляет единицы или десятки нанометров. Это пятно непрерывно обегает некоторый участок образца аналогично лучу, обегающему экран телевизионной трубки. Электрический сигнал, возникающий при бомбардировке объекта электронами пучка, используется для формирования изображения на экране телевизионного кинескопа или электронно-лучевой трубки (ЭЛТ), развертка которой синхронизирована с системой отклонения электронного пучка (рис. 4). Увеличение в данном случае понимается как отношение размера изображения на экране к размеру области, обегаемой пучком на образце. Это увеличение составляет от 10 до 10 млн.

Электроны, идущие от источника, ускоряются и фокусируются в узкий пучок на образце. Этот пучок перемещается по образцу отклоняющими катушками с током. Детекторы, расположенные выше образца, регистрируют рентгеновское излучение, вторичные и отраженные электроны. Электроны, прошедшие сквозь тонкий образец, регистрируются кольцевым детектором или, пройдя через энергетический анализатор, используются для формирования изображения на экране. РЭМ в отличие от ПЭМ позволяет исследовать и "толстые" образцы.

Отражательный РЭМ. Отражательный РЭМ предназначен для исследования массивных образцов. Поскольку контраст, возникающий при регистрации отраженных, то есть обратно-рассеянных, и вторичных электронов, связан в основном с углом падения электронов на образец, на изображении выявляется поверхностная структура. (Интенсивность обратного рассеяния и глубина, на которой оно происходит, зависят от энергии электронов падающего пучка. Эмиссия вторичных электронов определяется, в основном составом поверхности и электропроводностью образца.) Оба эти сигнала несут информацию об общих характеристиках образца. Регистрируя рентгеновское излучение, испускаемое образцом, можно в дополнение к данным о рельефе получать информацию о химическом составе образца в поверхностном слое глубиной 0,001 мм. О составе материала на поверхности можно судить и по измеренной энергии, с которой эмиттируются те или иные электроны. Все сложности работы с РЭМ обусловлены, в основном, его системами регистрации и электронной визуализации.

Растровый просвечивающий электронный микроскоп (РПЭМ). РПЭМ - это особый вид РЭМ. Он рассчитан на тонкие образцы, такие же, как и исследуемые в ПЭМ. Схема РПЭМ отличается от схемы на рис. 4 только тем, что в ней нет детекторов, расположенных выше образца. Поскольку изображение формируется бегущим пучком (а не пучком, освещающим весь исследуемый участок образца), требуется высокоинтенсивный источник электронов, чтобы изображение можно было зарегистрировать за приемлемое время. В РПЭМ высокого разрешения используются автоэлектронные эмиттеры высокой яркости. В таком источнике электронов создается очень сильное электрическое поле вблизи поверхности заостренной травлением вольфрамовой проволочки очень малого диаметра. Это поле буквально вытягивает миллиарды электронов из проволочки без всякого нагрева. Яркость такого источника почти в 10 000 раз больше, чем источника с нагреваемой вольфрамовой проволокой, а испускаемые им электроны могут быть сфокусированы в пучок диаметром менее 1 нм. Были даже получены пучки, диаметр которых близок к 0,2 нм. Автоэлектронные источники могут работать только в условиях сверхвысокого вакуума, в которых полностью отсутствуют такие загрязнения, как пары углеводородов и воды, и становится возможным получение изображений с высоким разрешением. Благодаря таким сверхчистым условиям можно исследовать процессы и явления, недоступные ЭМ с обычными вакуумными системами. Исследования в РПЭМ проводятся на сверхтонких образцах. Электроны проходят сквозь такие образцы почти без рассеяния. Электроны, рассеянные на углы более нескольких градусов без замедления, регистрируются, попадая на кольцевой электрод, расположенный под образцом (рис. 4). Сигнал, снимаемый с этого электрода, сильно зависит от атомного номера атомов в той области, через которую проходят электроны, - более тяжелые атомы рассеивают больше электронов в направлении детектора, чем легкие. Если электронный пучок сфокусирован в точку диаметром менее 0,5 нм, то можно получить изображение отдельных атомов. Реально удается различать на изображении, полученном в РПЭМ, отдельные атомы с атомной массой железа (то есть 26 и более). Электроны, не претерпевшие рассеяния в образце, а также электроны, замедлившиеся в результате взаимодействия с образцом, проходят в отверстие кольцевого детектора. Энергетический анализатор, расположенный под этим детектором, позволяет отделить первые от вторых. Измеряя энергию, потерянную электронами при рассеянии, можно получить важную информацию об образце. Потери энергии, связанные с возбуждением рентгеновского излучения или выбиванием вторичных электронов из образца, позволяют судить о химических свойствах вещества в области, через которую проходит электронный пучок.

Вряд ли остался какой-либо сектор исследований в области материаловедения, где бы не применялась просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ); это обеспечено успехами техники приготовления образцов. Все применяемые в электронной микроскопии методики нацелены на получение предельно тонкого образца и обеспечение максимального контраста между ним и подложкой, которая необходима ему в качестве опоры. Основная методика рассчитана на образцы толщиной 2-200 нм, поддерживаемые тонкими пластмассовыми или углеродными пленками, которые кладутся на сетку с размером ячейки около 0,05 мм. (Подходящий образец, каким бы способом он ни был получен, обрабатывается так, чтобы увеличить интенсивность рассеяния электронов на исследуемом объекте.) Если контраст достаточно велик, то глаз наблюдателя может без напряжения различить детали, находящиеся на расстоянии 0,1-0,2 мм друг от друга. Следовательно, для того, чтобы на изображении, создаваемом электронным микроскопом, были различимы детали, разделенные на образце расстоянием в 1 нм, необходимо полное увеличение порядка 100-200 тыс. Лучшие из микроскопов могут создать на фотопластинке изображение образца с таким увеличением, но при этом изображается слишком малый участок. Обычно делают микроснимок с меньшим увеличением, а затем увеличивают его фотографически. Фотопластинка разрешает на длине 10 см около 10 000 линий. Если каждая линия соответствует на образце некой структуре протяженностью 0,5 нм, то для регистрации такой структуры необходимо увеличение не менее 20 000, тогда как при помощи РЭМ и РПЭМ, в которых изображение регистрируется электронной системой и развертывается на телевизионном экране, может быть разрешено только около 1000 линий. Таким образом, при использовании телевизионного монитора минимально необходимое увеличение примерно в 10 раз больше, чем при фоторегистрации.

Объекты исследования.

Небиологические материалы. ПЭМ применяется в исследованиях материалов для изучения тонких кристаллов и границ между разными материалами. Чтобы получить изображение границы раздела с большим разрешением, образец заливают пластмассой, делают срез образца, перпендикулярный границе, а затем утоньшают его так, чтобы граница была видна на заостренной кромке. Кристаллическая решетка сильно рассеивает электроны в определенных направлениях, давая дифракционную картину. Изображение кристаллического образца в значительной мере определяется этой картиной; контраст сильно зависит от ориентации, толщины и совершенства кристаллической решетки. Изменения контраста на изображении позволяют изучать кристаллическую решетку и ее несовершенства в масштабе атомных размеров. Получаемая при этом информация дополняет ту, которую дает рентгенографический анализ объемных образцов, так как ЭМ дает возможность непосредственно видеть во всех деталях дислокации, дефекты упаковки и границы зерен. Кроме того, в ЭМ можно снимать электронограммы и наблюдать картины дифракции от выделенных участков образца. Если диафрагму объектива настроить так, чтобы через нее проходили только один дифрагированный и нерассеянный центральный пучки, то можно получать изображение определенной системы кристаллических плоскостей, которая дает этот дифрагированный пучок. Современные приборы позволяют разрешать периоды решетки величиной 0,1 нм. Исследовать кристаллы можно также методом темнопольного изображения, при котором перекрывают центральный пучок, так что изображение формируется одним или несколькими дифрагированными пучками. Все эти методы дали важную информацию о структуре очень многих материалов и существенно прояснили физику кристаллов и их свойства.

Высоковольтная микроскопия. В настоящее время промышленность выпускает высоковольтные варианты ПЭМ и РПЭМ с ускоряющим напряжением от 300 до 400 кВ. Такие микроскопы имеют более высокую проникающую способность, чем у низковольтных приборов, причем почти не уступают в этом отношении микроскопам с напряжением 1 млн. вольт, которые строились в прошлом. Современные высоковольтные микроскопы достаточно компактны и могут быть установлены в обычном лабораторном помещении. Их повышенная проникающая способность оказывается очень ценным свойством при исследовании дефектов в более толстых кристаллах, особенно таких, из которых невозможно сделать тонкие образцы. В биологии их высокая проникающая способность дает возможность исследовать целые клетки, не разрезая их. Кроме того, с помощью таких микроскопов можно получать объемные изображения толстых объектов.

Низковольтная микроскопия. Выпускаются также РЭМ с ускоряющим напряжением, составляющим всего несколько сот вольт. Даже при столь низких напряжениях длина волны электронов меньше 0,1 нм, так что пространственное разрешение и здесь ограничивается нестабильностью магнитных линз. Однако, поскольку электроны с такой низкой энергией проникают неглубоко под поверхность образца, почти все электроны, участвующие в формировании изображения, приходят из области, расположенной очень близко к поверхности, благодаря чему повышается разрешение поверхностного рельефа. С помощью низковольтных РЭМ были получены изображения на твердых поверхностях объектов размером менее 1 нм.

Радиационное повреждение. Поскольку электроны представляют собой ионизирующее излучение, образец в электронном микроскопе постоянно подвергается его воздействию. (В результате этого воздействия возникают вторичные электроны, используемые в РЭМ.) Следовательно, образцы всегда подвергаются радиационному повреждению. Типичная доза излучения, поглощаемая тонким образцом за время регистрации микрофотографии в ПЭМ, примерно соответствует энергии, которой было бы достаточно для полного испарения холодной воды из пруда глубиной 4 м с площадью поверхности 1 га. Чтобы уменьшить радиационное повреждение образца, необходимо использовать различные методы его подготовки: окрашивание, заливку, замораживание. Кроме того, можно регистрировать изображение при дозах электронов, в 100-1000 раз меньших, нежели по стандартной методике, а затем улучшать его методами компьютерной обработки изображений.

Ионно-полевая микроскопия. Другая техника, дающая разрешение, приближающееся к межатомным расстояниям, это ионно-полевая микроскопия. В ионно-полевом микроскопе на металлическую иглу с острым концом, находящуюся в камере с высоким вакуумом, подается положительный потенциал. И электрическое поле, и его градиент вблизи острия весьма велики, так что остаточные молекулы газа при приближении к нему ионизируются, передавая электроны игле, а сами заряжаясь положительно. Эти газообразные катионы отталкиваются иглой и летят от нее вдоль линий электростатического поля на расположенную вблизи фотопластинку, на которой при соударениях создаются засвеченные точки. Каждая точка на пластинке соответствует атому на кончике зонда, так что распределение точек на фотопластинке представляет собой сильно увеличенное изображение распределения атомов на вершине иглы. Международные таблицы кристаллографии под редакцией Т. Хана содержат стереографические проекции для разных точечных групп и классов кристаллов, позволяющие получить информацию о структуре поверхности твердых тел.

Как уже отмечалось, работа с электронными микроскопами является достаточно сложной, в первую очередь, из-за необходимости тщательной подготовки образцов и обеспечения высокого вакуума внутри всей экспериментальной установки. Этих недостатков лишены сканирующие зондовые микроскопы (СЗМ). Основные этапы развития техники микроскопии представлены в табл.1.

Таблица 1. Основные этапы развития техники микроскопии

Сканирующая зондовая микроскопия

Принцип работы сканирующих зондовых микроскопов. В сканирующих зондовых микроскопах исследование микрорельефа поверхности и ее локальных свойств проводится с помощью специальным образом приготовленных зондов в виде игл. Рабочая часть таких зондов (острие) имеет размеры порядка десяти нанометров. Характерное расстояние между зондом и поверхностью образцов в зондовых микроскопах по порядку величин составляет 0,1-10 нм. В основе работы зондовых микроскопов лежат различные типы взаимодействия зонда с поверхностью. Так, работа туннельного микроскопа основана на явлении протекания туннельного тока между металлической иглой и проводящим образцом; различные типы силового взаимодействия лежат в основе работы атомно-силового, магнито-силового и электросилового микроскопов.

Рассмотрим общие черты, присущие различным зондовым микроскопам. Пусть взаимодействие образца с поверхностью характеризуется некоторым параметром P. Если существует достаточно резкая и взаимно однозначная зависимость параметра P от расстояния зонд-образец P = P (z), то данный параметр может быть использован для организации системы обратной связи (ОС), контролирующей расстояние между зондом и образцом. На рис.1 схематично показан общий принцип организации обратной связи сканирующего зондового микроскопа.

Рис. 1. Схема организации системы обратной связи зондового микроскопа

Система обратной связи поддерживает значение параметра P постоянным, равным величине P₀, задаваемой оператором. Если расстояние зонд-поверхность изменяется, то происходит изменение параметра P. В системе обратной связи формируется разностный сигнал, пропорциональный величине P = P - P₀, который усиливается до нужной величины и подается на исполнительный элемент ИЭ. Исполнительный элемент отрабатывает данный разностный сигнал, приближая зонд к поверхности или отодвигая его до тех пор, пока разностный сигнал не станет равным нулю. Таким образом можно поддерживать расстояние зонд-образец с высокой точностью. В существующих зондовых микроскопах точность удержания расстояния зонд-поверхность достигает величины 0,01Е. При перемещении зонда вдоль поверхности образца происходит изменение параметра взаимодействия P, обусловленное рельефом поверхности. Система обратной связи отрабатывает эти изменения, так что при перемещении зонда в плоскости X, Y сигнал на исполнительном элементе оказывается пропорциональным рельефу поверхности. Для получения СЗМ изображения осуществляют специальным образом организованный процесс сканирования образца. При сканировании зонд вначале движется над образцом вдоль определенной линии (строчная развертка), при этом величина сигнала на исполнительном элементе, пропорциональная рельефу поверхности, записывается в память компьютера. Затем зонд возвращается в исходную точку и переходит на следующую строку сканирования (кадровая развертка), и процесс повторяется вновь. Записанный таким образом при сканировании сигнал обратной связи обрабатывается компьютером, и затем СЗМ изображение рельефа поверхности Z=f (x,y) строится с помощью средств компьютерной графики.