Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы

Размещено на http://www.allbest.ru/

42

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ ПРИ ПОМОЩИ БИОСОВМЕСТИМЫХ ЗОНДОВ: НОВЫЕ ПОДХОДЫ

Богданов Алексей Алексеевич

Специальность 03.00.02 - Биофизика

МОСКВА 2009

Работа выполнена в Центре Молекулярного Имаджинга Главного Госпиталя Штата Массачузеттс (г. Бостон) и Медицинском отделении Массачузеттского Университета (г. Вустер).

Официальные оппоненты:

Академик РАН и РАМН, докт. биол. наук, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич

Чл.-корр. РАН, докт. физ.-мат. наук Гурский Георгий Валерьянович

Докт. хим. наук, профессор Польшаков Владимир Иванович

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита состоится «29» октября 2009 г. в 15.30 ч. на заседании Диссертационного совета Д.501.001.96 по биологическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 13, МГУ имени М.В.Ломоносова, Биологический факультет, аудитория "Новая".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «________» _________________ 2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Кренделева Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микроскопическое исследование морфологии образцов тканей традиционно является одним из главнейших методических подходов в экспериментальной биологии уже на протяжении нескольких столетий. Тем не менее, потребности развития современной биологии диктуют необходимость проведения исследований биохимических процессов в интактных (живых) системах. Внедрение неинвазивных методов диагностики в экспериментальную биологию представляет собой одну из наиболее активно развивающихся областей биомедицины. Применение методов неинвазивной диагностики в биологических исследованиях позволяет: 1) получать и анализировать информацию, отражающую изменение физиологических и молекулярных параметров во времени в живом организме с высоким пространственным разрешением, т.е. вплоть до уровня визуализации отдельных клеток (шкала разрешения от 50 мкм до 2 мм); 2) одновременно регистрировать различные классы изображений, анатомически точно картирующие живые ткани и отражающие функциональный статус органов; 3) более эффективно внедрять достижения фундаментальной физико-химической биологии непосредственно в клинические испытания. В последнее время широкую известность получила неинвазивная диагностика на молекулярном уровне (т.н. «molecular imaging»), основанная либо на использовании сигнала молекулярных зондов, введенных искусственно, либо на интерпретации сигнала, вызванного присутствием эндогенных молекул живой системы. Молекулярная неинвазивная диагностика в живых системах развивается на стыке многих наук, включающих, прежде всего, медицинскую физику, биофизику, синтетическую органическую химию и молекулярную биологию. В последние годы на практике было показано, что одним из необходимых условий для успешного проведения неинвазивной диагностики на молекулярном уровне является применение молекулярных зондов (т.н. «репортеров»), которые обладают способностью генерировать специфические сигналы, отражающие наличие компонентов микроокружения зонда в живом организме. Эти сигналы регистрируются при помощи современных диагностических методов (магнитно-резонансная томография (МРТ), гамма сцинтиграфия, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), оптическая визуализация флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне). Для применения подобных зондов в живых системах необходимым условием является наличие биосовместимости, специфичности и низкой эффективной (граничной) концентрации зонда в живой ткани организма. В 90-х и начале 2000-х годов нами были разработаны несколько классов подобных биосовместимых зондов для визуализации биологически важных процессов в живых интактных системах. Наиболее широкое практическое использование и научное признание получили биосовместимые зонды для визуализации: 1) лизосомной и экстраклеточной ферментативной активности катепсинов; 2) визуализации ангиогенеза и аномальной проницаемости стенки сосудов; 3) оксидоредуктазной (в том числе, пероксидазной) активности. Эти три класса зондов объединяет способность усиливать специфические сигналы, которые регистрируются приборами, разработанными для диагностической визуализации в живых системах. Их активность в первом случае основана на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (как излучательного, так и темного), а во втором и третьем случаях - на эффекте увеличения молярной релаксивности парамагнитных катионов (т.е. изменения способности укорачивать времена релаксации протонов воды). Это происходит за счет положительных изменений корреляционных времен в парамагнитных зондах, достигнутых либо с применением методов химической иммобилизации, либо в результате ферментативной реакции. Все три класса диагностических зондов в настоящее время успешно используются для решения нескольких фундаментальных и прикладных задач в ряде лабораторий, в том числе, в качестве коммерчески доступных макромолекулярных оптических зондов для преклинических исследований (Visen Medical, Inc.), МРТ препаратов для преклинического тестирования экспериментальных лекарственных средств (Novartis Research Inst., Sanofi) или в качестве носителя для доставки биологически активных пептидов и рекомбинантных белков (PharmaIn Corp).

Целью работы явилось развитие методических подходов к визуализации специфической ферментативной активности и активации факторов транскрипции в живых системах. В качестве основных направлений работы были выбраны прикладные исследования, целью которых являлось изучение ответа живого организма на стимуляцию воспалительного каскада, в частности, модельное исследование визуализации оксидоредуктазной активности при развитии нестабильной атеромы и рака, а также активации стромы и ангиогенеза в раковых опухолях.

Задачи исследования. Для достижения целей работы были поставлены и поэтапно решены следующие задачи:

1) Разработка и синтез макромолекулярного наноносителя (PGC) для диагностических меток (НМН).

2) Изучение поведения парамагнитного аналога PGC в кровотоке нормальных животных и в экспериментальных моделях рака, ишемии головного мозга и инсульта с помощью МРТ.

3) Создание зонда для оптической визуализации протеолиза в живых системах на основе PGC.

4) Изучение и идентификация источников протеолитической активности в раковых опухолях путем флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн.

5) Разработка, синтез и изучение свойств парамагнитных субстратов оксидоредуктаз (пероксидаз растений и миелопероксидазы), а также тирозиназ и лакказ.

6) Разработка метода визуализации активности миелопероксидазы в модельных системах в качестве маркера нестабильной атеромы.

Научная новизна и практическая значимость. В 1992 году нами был впервые разработан и запатентован макромолекулярный синтетический парамагнитный нанозонд (Protected Graft Copolymer, PGC), с характерной длительной циркуляцией в кровотоке и относительно узким молекулярно-массовым распределением. Этот зонд был использован для визуализации обьема крови в моделях рака и тромбоза легочных артерий, а также для одновременного определения объема и скорости кровотока в головном мозге в норме и патологии при индуцированном ишемическом инсульте. Использование PGC в сочетании с МРТ показало, что этот нанозонд позволяет определить эффективность антиангиогенных терапевтических средств на ранних стадиях испытаний на экспериментальных животных. Высокоэффективное мечение PGC радиоизотопом 99mТс дало возможность провести предварительные клинические испытания (Фаза 1А) этого зонда в качестве макромолекулярного радиоизотопного маркера для вентрикулографии, а также позволило исследовать некоторые особенности метаболизма PGC в организме человека.

Важной особенностью подобных контрастирующих веществ (зондов) является сильное изменение свойств диагностических меток в ковалентно связанной форме. В то время как релаксивность парамагнитных хелатов Gd(III) (т.е. способность катионов гадолиния к сокращению времени релаксации координированных протонов воды), связанных с PGC, возрастает в несколько раз, интенсивность флуоресценции ковалентно связанных молекул инфракрасных флуорохромов резко уменьшается. Использование этого явления в исследованиях на животных впервые позволило использовать возрастание интенсивности флуоресценции в ткани в результате деградации PGC лизосомными катепсинами для полуколичественной оценки протеолитической активности в раковых опухолях. Дальнейшие исследования на моделях рака позволило идентифицировать фракции клеток опухолей с наиболее выраженной протеолитической активностью, присутствие которых связано с повышенной инвазивностью аденокарцином.

В начале 2000-х годов нам впервые удалось показать, что каталитическую активность пероксидаз в живой ткани можно обнаруживать с помощью МРТ, при условии, если в качестве восстанавливающего субстрата были использованы парамагнитные моно- и бис- фенэтиламидные или оксииндолэтиламидные производные хелатов парамагнитного Gd(III) в качестве пероксидазо- чувствительных контрастирующих зондов. Данные производные восстанавливают окисленные формы пероксидаз с высокой эффективностью, и в результате ферментативного окисления вступают в реакции гомоолигомеризации, а также ковалентной модификации белков, и, тем самым, повышают релаксивность хелатированного гадолиния. Релаксометрические измерения показали, что МРТ сигнал возрастает преимущественно за счет удлинения корреляционного времени реориентации спинов протонов воды (р), взаимодействующих с локальным электромагнитным полем парамагнитного катиона. Данные контрастирующие зонды были использованы для визуализации трех классов оксидоредуктаз: 1) миелопероксидаз (т.е. эндогенных высокомолекулярных белков первичных секреторных гранул гранулоцитов); 2) пероксидаз растений, используемых в качестве меток для ферментативного обнаружения антител, связанных с антигенами в системах in vitro, а также in vivo; 3) тирозиназ; 4) лакказ. Миелопероксидаза (МПО) секретируется преимущественно нейтрофилами, при трансмиграции через стенку сосудов в ответ на локальную активацию эндотелиальных клеток. Активация происходит в результате воздействия различных эндогенных и экзогенных факторов, с высокой вероятностью приводящим к развитию ишемической болезни. Обнаружение миелопероксидаз в живой ткани организма при помощи неинвазивной диагностики позволяет проводить прямое обнаружение очагов воспаления в стенке кровеносных сосудов, что важно для проведения оценки нестабильности атеросклеротической бляшки. Подобная оценка нестабильности при помощи МРТ была проведена нами в живых моделях спонтанного атеросклероза и экспериментального аневризма сонных артерий. Детекция миелопероксидазной активности, проведенной на основе анализа результатов томографической визуализации ферментативной активности, в отличие от определения концентрации МПО в плазме крови, позволит различать стабильные и нестабильные атеросклеротические бляшки и определять степень риска острых сердечно- сосудистых заболеваний. Подобная же практическая направленность наших исследований на живой модели, полученной искусственно с применением катетеризации и частичной окклюзии сонной артерии кролика, позволила произвести оценку специфичности визуализации воспаления в области расширения стенки экспериментальной аневризмы. Как и в случае атеросклеротического поражения стенок сердечно-сосудистой системы, развитие нестабильности аневризм артерий головного мозга зависит от интенсивности местных воспалительных процессов. Предсказание нестабильности аневризмы на основании МРТ визуализации с применением парамагнитных субстратов миелопероксидазы важно потому, что субарахноидальное кровоизлияние из разорвавшейся аневризмы приводит к геморрагическому инсульту с летальным исходом у 55-60% пациентов.

Обнаружение ферментативной активности иммуноконъюгатов в живых системах при помощи МРТ было впервые предложено и исследовано нами в 2001 году с применением модельных систем с целью визуализации клеток, экспрессирующих маркеры клеточной поверхности, типичные для онкологической трансформации. Активность данных рецепторов (например, EGFR, т.е. рецептора эпидермального фактора роста) можно ингибировать антителами, которые препятствуют димеризации рецепторов и, как следствие, ингибируют рецептор-опосредованную передачу сигнала. Мы показали, что блокирующие химерные антитела, используемые в клинических испытаниях в качестве антипролиферативного средства при раке головы и шеи, можно ковалентно связывать с пероксидазами для визуализации рецепторположительных опухолей. Эксперименты, проведенные с помощью МРТ в живых моделях плоскоклеточной карциномы и глиомы человека у атимусных мышей и крыс, соответственно, показали, что после двухстадийного последовательного внутривенного введения конъюгатов антител и субстрата происходит не только общее возрастание МРТ сигнала (по сравнению с контрольным введением субстрата без конъюгатов), но и замедление скорости выведения парамагнитного МРТ контраста, связанное с образованием олигомеров и хелат-белковых конъюгатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный макромолекулярный носитель (PGC) является нанобиотехнологической системой, предназначенной для синтеза зондов-носителей диагностических меток, используемых для проведения исследований в живых системах с применением МРТ, радиоизотопных и флуоресцентных методов.

2. Связывание парамагнитных катионов PGC приводит к 2-3 кратному увеличению молярной спин-спиновой и спин-решеточной релаксации. Визуализация и биораспределение парамагнитного зонда на основе PGC в кровотоке нормальных животных свидетельствует о длительном времени полужизни при отсутствии детектируемой токсичности и иммунногенности.

3. PGC применим для визуализации и слежения за изменениями перфузируемого объема крови, отражающими особенности кровоснабжения раковой опухоли и ответ на антиангиогенную терапию.

4. Ковалентное связывание карбоцианиновых красителей с PGC приводит к самотушению флуоресценции, позволяя разрабатывать зонды для визуализации источников протеолитической активности в раковых опухолях с применением флуоресцентной визуализации в интактных животных в ближне-инфракрасном диапазоне длин волн.

5. Низкомолекулярные конъюгаты парамагнитных хелатов и соединений, содержащих монофенольные или триптаминовые остатки, являются эффективными субстратами-восстановителями пероксидаз, катализирующих образование продуктов с высокой релаксивностью парамагнитного Gd(III). Визуализация рецепторов на поверхности клеток может быть достигнута с применением МРТ, пероксидазной амплификации и парамагнитных зондов пероксидазной активности.

6. Зонды пероксидазной активности позволяют производить визуализацию локальных очагов тканевой миелопероксидазы в модельных системах. Визуализация миелопероксидазной активности при помощи разработанных зондов позволяет определять наличие нестабильности в атероме и аневризме сосудистой стенки.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на открытом семинаре Радиологического факультета Университета штата Массачузеттс (февраль 2009 г.). Основные результаты работы были доложены на следующих международных конференциях:

Международном симпозиуме «Современные методы спектроскопии в исследовании структуры и функции биополимеров в биологии и медицине» (Май 2007, Дубна); Международного общества магнитного резонанса в медицине ISMRM: (Берлин, 1992 г.; Нью- Йорк, 1993 г.; Сан Франциско, 1994 г.; Сидней 1998 г.; Гонолулу, 2003 г.; Киото, 2004 г.; Сиаттл, 2006 г.; Берлин, 2007 г.);

Североамериканского радиологического общества RSNA (Чикаго 1992 г., 1997 г., 2003 г.);

Американской ассоциации по изучению рака AACR (Сан Франциско 2002 г.; Вашингтон, 2003 г., 2005 г.; Лос Анджелес 2005 г., Денвер 2009 г.);

Общества ядерной медицины SNM (Торонто, 2001 г.);

Американского химического общества ACS (Филадельфия, 2004 г.);

Academy of Molecular Imaging AMI (Орландо 2002 г., Сан Диего, 2003 г.; 2004 г. (1-e место в категории научных докладов);

The Society of Molecular Imaging SMI (Бостон, 2002 г.; Сан Франциско, 2003 г.; Сант Луис, 2004 г.; Кельн, 2005 г.; Провиденс, 2007 г.; Ницца, 2008 г.);

Гордоновской конференции по доставке лекарств (Блу Скай, Монтана 2004 г.); Международных конференциях по наномедицине и доставке лекарств (Балтимор, 2005 г.; Торонто, 2008 г.);

The Controlled Release Society CRS (Ницца, 1994 г.; Палм Бич, 2007 г.)

На Нобелевском Форуме (Стокгольм, 2007 г.).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных исследований и обработки полученных результатов, а также в проведении теоретических исследований. Основные результаты получены либо лично автором, либо под его непосредственным руководством. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации

Результаты исследования опубликованы в 102 работах, включающих статьи, монографии, тезисы конференций и патенты. Диссертация обобщает данные 44 основных статей.

Структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 220 страницах, содержит 44 рисунка и 12 таблиц. Список литературы включает 350 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА I. ПРИНЦИПЫ НЕИНВАЗИВНОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ

Глава посвящена анализу литературных данных. При анализе использованы обзорные статьи и монографии из различных областей применения комбинированных методов неинвазивной визуализации и направленной доставки диагностических контрастирующих веществ (КВ). В обзоре подробно освещены принципы и основы фермент чувствительной диагностики в живых системах.

ГЛАВА II. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАБОТЫ

II.А МЕТОД МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ И

КОНТРАСТИРУЮЩИЕ ЗОНДЫ

Метод магнитно-резонансной томографии (МРТ) основан на эффекте “пространственной кодировки”, позволяющей наблюдать эффект ядерного магнитного резонанса (ЯМР) только в определяемом исследователем пространственном фрагменте, часто называемым “срезом” объекта. Возможность достижения томографического эффекта при помощи ЯМР была впервые продемонстрирована П. Латербуром в 1973 г. Впоследствии метод МРТ был кардинально модифицирован с применением градиента внешнего магнитного поля, что позволяет достичь определенной резонансной частоты возбуждения ядерного спина строго в определяемым исследователем срезе трехмерного пространства. На этом принципе основаны современные МРТ методы. МРТ позволяет управлять процессами релаксации макроскопической магнетизации (М) в данной единице объема исследуемого объекта. Радиочастотный импульс, отклоняет вектор М от положения равновесия, т.е. от ориентации по внешнему полю Во. После отключения импульса М продолжает вращение около Во с угловой скоростью, соответствующей частоте Лармора (Рис. 1А). Благодаря процессам релаксации вектор М возвращается в положение равновесия. Механизм возвращения Мz компонента М в положение равновесия называется спин-решеточной или Т1-релаксацией, а уменьшение Мxy составляющей до нуля называется Т2- или спин-спиновой релаксацией. Т1-релаксация (т.е. переход на более низкий энергетический уровень ядра) стимулируется любым флуктуирующим магнитным полем с частотой Лармора, т.е. угловой скоростью, необходимой для достижения энергетического перехода. Флуктуирующее магнитное поле, которое создается в результате броуновского движения молекул, вызывает также случайные изменения угловой частоты спинов и «флип-флоп» переходы, которые вызывают потерю фазовой когерентности у вращающихся ядерных спинов. В результате фазовая дисперсия увеличивается и Мxy составляющая уменьшается, чему способствуют негомогенности магнитного поля (Т2-эффекты).

Рис. 1. Релаксация магнетизации и контрастирующие вещества

молекулярный визуализация наноноситель

А- во время возбуждающего радиочастотного импульса (поле В1) вектор магнетизации М отклоняется на флип угол в1 и прецессирует относительно Во с угловой скоростью щ1 (соответсвующей частоте Лармора). Проекция М на ось z' (в Декартовой системе координат х'y'z') со временем возрастает (Т1 релаксация), а проекция М в плоскости х'y' уменьшается до нуля (Т2 релаксация) Б-Схема, иллюстрирующая процессы релаксации протонов молекул воды во внутренней (ВКО) и во внешней координационных оболочках хелатированного Gd(III). фM - время жизни молекулы воды во ВКО. фR - ротационное корреляционное время.

Главной целью использования КВ в МРТ является ускорение процессов релаксации спинов протонов воды в окружающей ткани, т.е. укорачивание спин-решеточного Т1 и спин- спинового Т2 времен релаксации. Первое парамагнитное КВ, т.е. раствор соли Mn(II), было использовано для достижения контраста в МРТ в работах Латербура в конце 1970-х годов. В настоящее время в качестве КВ получили широкое применение соли гадолиния Gd(III), так как катион Gd(III) имеет 7 неспаренных f-электронов, и симметричное S-состояние, что определяет, с одной стороны, большой магнитный момент, а с другой - медленную релаксацию электронов, что необходимо с точки зрения эффективности парамагнитного КВ. Общая теория релаксации в разбавленных растворах парамагнитных веществ была разработана Блюмбергеном, Соломоном и Морганом в 1950-х годах. Согласно этой теории, частота релаксации (релаксивность R(1,2)=1/T(1,2), т.е. величина обратная времени релаксации) в присутствии катиона Gd(III) 1/Т(1,2) =1/Тd(1,2) +1/Tp(1,2)=1/Тd(1,2)+r(1,2)[Gd], где 1/Тd(1,2) диамагнитный терм, описывающий релаксацию в отсутствие КВ; а r - т.н. молярная релаксивность, являющаяся коэффициентом пропорциональности между релаксивностью и [Gd]- концентрацией парамагнитного катиона. Обычно под релаксивностью понимают протонную релаксивность. Парамагнитная релаксация протонов воды происходит из-за диполь-дипольных взаимодействий между ядерными спинами и флуктуирующим локальным магнитным полем КВ, которое создается благодаря наличию спина у неспаренных электронов. Для того, чтобы парамагнитный эффект релаксации влиял на большое число протонов молекул, они должны находиться в непосредственной сфере воздействия поля КВ, так как это поле быстро уменьшается при удалении от парамагнитного атома. Для комплексов парамагнитных металлов подобным специфическим взаимодействием является координационное связывание молекул воды с КВ, т.е. взаимодействие во внутрнней координационной оболочке (Рис.1). Кроме внутреннеоболочечного эффекта существует также внешнеоболочечный, который зависит от стохастической поступательной диффузии протонов вблизи КВ. Кроме того, молекулы воды образуют водородные связи с хелатирующим веществом. Эти молекулы воды во вторичной координационной оболочке вносят вклад во внешнеоболочечный эффект. Таким образом, суммарная релаксивность протонов воды в упрощенном виде равна сумме релаксивностей, где R= RIS+ ROS , IS внутренняя оболочка, а OS внешняя оболочка. Величина обратная времени спин-решеточной релаксации во внутренней координационной оболочке (т.е. релаксивность) записывается в виде: 1/Т1=(([Gd].q)/55.5)(T1m+фm)-1, где q число молекул воды связанных с Gd (число гидратации), T1m время релаксации связанной воды и фm время жизни молекулы воды во внутренней координационной оболочке.

Релаксация связанных с хелатированным парамагнитным катионом протонов воды (T1m) описывается с применением двух формальных механизмов: 1) диполь-дипольного, т.е. описывающего релаксацию под влиянием: а) реориентации вектора взаимодействия ядерного спина и электронного спина, б) изменениями в ориентации электронного спина и в) кинетикой обмена протонов; 2) скалярного, который не зависит от взаимной реориентации молекул, а зависит только от электронной релаксации и скорости обмена протонов воды. Таким образом, 1/T1m = 1/TDD + 1/TSC . В общем случае оба компонента можно записать в виде функций общего вида: 1/TDD =k.f (1/r6GdH, фc2, фc1, щ2S, щ2I ), 1/TSC = k.f (щ2S, фе2), т.е. диполь-дипольный компонент релаксивности обратно пропорциональны шестой степени расстояния между электронным спином катиона металла и протонным спином (rGdH) и сложным образом зависят от времен корреляции и ядерной и электронной частоты Лармора. Время корреляции записывается в виде: 1/фc=1/фR+1/Tе+1/фm, где фR ротационное (спиново-вращательное) корреляционное время, т.е. время реорентации вектора металл-протон, Tе - время релаксации спина электронов иона металла. Поскольку Gd(III) образует ионные связи, а протоны удерживаются координационными связями на большом расстоянии от парамагнитного центра, скалярное спаривание спинов вносит крайне малый вклад в суммарную релаксацию, и, поэтому, релаксация протонов воды под влиянием парамагнитных катионов лантанидов протекает преимущественно по диполь-дипольному механизму.

Релаксация протонов в присутствии хелатированных парамагнитных катионов подвержена воздействию целого комплекса факторов. Если хелатирующее вещество препятствует образованию координационных связей между водой и катионом во внутренней оболочке, число гидратации катиона q<1, а релаксивность хелатированного катиона значительно меньше, чем релаксивность гидратированного катиона. Наиболее часто используемые на практике хелаты Gd(III) и Mn(II) допускают образование координационной связи с q=1. Если выполняется соотношение T1m<<фm, то скорость обмена координированных с КВ молекул воды является единственным определяющим фактором релаксивности. Если же обратное соотношение верно, т.е. фm<<T1m, наблюдаемая релаксивность определяется исключительно скоростью релаксации координированных протонов, т.е. параметром 1/T1m, который, в свою очередь, зависит от скорости обмена протонов воды, спиново-вращательной и электронной релаксаций.

Таким образом, анализ зависимости спин-решеточной релаксивности (1/Т1) от параметра T1m показывает, что при создании новых КВ именно эти два фактора (т.е. скорость обмена протонов координированной воды и вращательная свобода хелатированного парамагнитного иона) оказывают наибольшее влияние на конечную релаксивность и, как следствие, на эффективность КВ в биологических системах. Модуляция релаксивности за счет перехода из свободного в связанное, т.е. иммобилизованное на макромолекуле, состояние парамагнитного КВ было использовано нами при создании полимерного парамагнитного КВ (PGC, см. Гл. IIА), а также при разработке фермент чувствительных сенсоров пероксидаз (см. Гл. V).

II.Б ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ЗОНДОВ ДЛЯ МУЛЬТИКОМПАРТМЕНТНОГО АНАЛИЗА ТКАНИ

Компартментализация различных КВ в живой ткани в применении к МРТ может быть описана с применением упрощенной модели, в которой сосудистый, интерстициальный и внутриклеточный компоненты представляют собой отдельные протонные пулы, находящиеся в состоянии взаимного равновесного обмена протонами воды.

Так как клеточные мембраны интактных клеток во временной шкале МРТ исследования ткани представляют собой в норме практически непроницаемые барьеры для водорастворимых КВ, данную модель можно упростить и рассматривать обмен между кровеносным потоком (сосудистым компонентом) и экстрасосудистым пространством. В условиях, когда изменение магнитной восприимчивости (Дч) после введения КВ невысоко, например, при напряженности поля 0.5-3Т в клинических МРТ системах, влиянием ДТ2* (связанным с уменьшением спин-спинового времени релаксации протонов воды под влиянием микрогетерогенности поля) на релаксацию воды обычно пренебрегают. Вследствие того, что разработанный нами зонд PGC-Gd (см.Гл. Гл. IIА) обладает большим гидродинамическим диаметром (5<Dh<10 нм), экстравазация PGC-Gd протекает крайне медленно. В условиях медленной скорости (низкой частоты) обмена протонов воды между кровотоком и внешнесосудистым объемом, которая близка к трансмембранному обмену молекулами воды в эритроцитах, т.е. 1 Гц, абсолютный объем крови может быть рассчитан как отношение изменений интенсивности МРТ сигнала в ткани и в кровотоке VBABS = ДSIТ/ДSIB. Локальное изменение МРТ сигнала измеряется как разность интенсивностей сигнала до и после введения КВ. В условиях эксперимента измерение ДSIТ производится в ткани, в то время как ДSIB определяют в кровеносном сосуде (вене или артерии), изображение которого получено на том же томографическом срезе. Приведенная выше формула может быть использована только при выполнении следующих условий: 1) концентрация КВ должна быть постоянной в течение МРТ исследования (примерно 45 мин), 2) мембраны эритроцитов непроницаемы для КВ, в то время как протоны воды быстро обмениваются через мембраны эритроцитов, 3) обен молекул воды через эндотелиальные барьеры происходит медленно, 4) время релаксации зависит от концентрации КВ в плазме крови и произведена корректировка с учетом местных различий в уровне гематокрита. Последнее условие можно считать заведомо выполненным в большинстве случаев. Тем не менее, в случае определения объема крови в опухоли гематокрит крови в опухоли может сильно отличаться от гематокрита в основном кровотоке. При использовании градиентной системы МРТ пульсов (объемного построения с применением градиентного эха со спойлером, 3DSPGR) измеряемая интенсивность МРТ сигнала равна:

SIP=М0*sinб*((1-exp(-TR/Т1P)/(1- exp(-TR/Т1P)*cosб)

и 1/ Т1P=(1-л)*(1/Т1PP)+л*(1/Т1RBC),

где 1/Т1PP=(1-л)*( 1/Т10PP) + r[КВ]; М0 - протонная плотность, б- флип угол; TR - время повторения МРТ импульса, Т1P- спин решеточное время релаксации в крови после введения КВ, Т1PP- спин решеточное время релаксации в плазме крови после введения КВ, Т10PP - спин решеточное время релаксации в плазме крови до введения КВ, л- фракция объема крови, занимаемая эритроцитами, r - молярная релаксивность КВ, [КВ] - молярная концентрация КВ.

Оба параметра, т.е. r и [КВ], были определены нами экспериментально с применением плазмаионизационного метода для определения концентрации парамагнитного гадолиния. Величина параметра Т10PP примерно равна величине времени релаксации Т1RBC. Для определения величины Т1P вначале нам было необходимо измерить локальный гематокрит в органах, что было достигнуто путем радиоактивного мечения эритроцитов при помощи восстановления пертехнетата ([99mTc]O4-) в присутствии Sn(II) и определения их биораспределения через 5 мин после внутривенного введения.

II.В САМОТУШЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И КОНТРАСТИРУЮЩИЕ ЗОНДЫ

Флуоресценция, как частный случай люминесценции, наблюдается при испускании фотона при возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное энергетическое состояние молекулы. Энергия испускаемого фотона меньше, чем энергия поглощенного молекулой фотона, за счет внутримолекулярных переходов с более высокого уровня вибрационной энергии в основном состоянии молекулы в состояние термодинамического равновесия. Данные переходы вызывают спектральный эффект Стокса, т.е. сдвиг спектрального максимума флуоресценции в длинноволновую область по сравнению со спектральным максимумом возбуждающего света. Как правило, данный сдвиг невелик, и его величина особенно мала в случае многих полиароматических флуорохромов с высокими коэффициентами экстинкции и со спектральными максимумами поглощения при длинах волн возбуждающего света л>450 нм (т.е. флуоресцеин, родамин, Texas Red, карбоцианиновые красители Cy). Многие из данных флуорохромов традиционно используются для ковалентной модификации макромолекул, применяемых в микроскопии (т.е. флуоресцеин, родамин) и обладают способностью к самотушению флуоресценции. В общем случае, тушение флуоресценции в разбавленных растворах может происходить в результате действия одного или нескольких молекулярных механизмов, которые включают химические реакции в возбужденном состоянии молекул, внутримолекулярные переходы, перенос энергии на другую молекулу, образование комплексов в основном энергетическом состоянии (т.н. статическое тушение) и тушение при столкновении молекул (т.н. динамическое тушение).

При ковалентном связывании с макромолекулами, несущими реакционоспособные группы, с увеличением плотности посадки флуорохромов (Ф) на макромолекуле флуоресценция нелинейным образом зависит от концентрации [Ф], и начинает уменьшаться при достижении определенной локальной концентрации [Ф] на макромолекуле. Данный эффект можно объяснить с точки зрения переноса энергии возбужденного состояния молекулы Ф на другую молекулу Ф (динамическое самотушение по Ферстеру или Декстеру). Вероятность самотушения зависит от расстояния между флуорохромами: W(r)=(1+(r/R0)6))-1, где R0-радиус Ферстера соответствующий 50% вероятности переноса W(r) = 0,5. При ковалентном связывании флуорохромов с полипептидами расстояние между отдельными молекулами Ф с высокой вероятностью меньше 4 нм, т.е. в границах Ферстеровского диапазона расстояний, при которых перенос энергии высоковероятен, т.е. в границах 1,5-6 нм. Тем не менее, несмотря на то, что теория динамического самотушения Ферстера широко используется при трактовании резонансного переноса энергии, она не всегда подходит для описания эффектов самотушения в макромолекулах, содержащих более двух близко расположенных ковалентно связанных флуорохромов. Если бы расстояние Ферстера действительно однозначно определяло эффективность самотушения, то эффект самотушения наблюдался бы для любой пары Ф, находящейся на расстоянии меньше 6 нм друг от друга. Однако, известен пример коммерчески доступного красителя Alexa Fluor 488, который спектрально практически идентичен флуоресцеину, и, тем не менее, не подвержен самотушению при ковалентном связывании с идентичными иммуноглобулинами (Рис.3).

Рис. 3. Зависимость самотушения флуорохромов от структуры молекулы

Структурно различные и спектрально-идентичные Alexa Fluor 488 (A) и флуоресцеин (Б) образуют конъюгаты с антителами (В), в которых флуорохромы гораздо сильнее подвержены самотушению в случае (Б), чем (А). Данный результат подтверждает вклад статических механизмов в эффект самотушения в ковалентных конъюгатах.

Данный пример доказывает, что т.н. статические эффекты самотушения в случае ковалентных макромолекулярных конъюгатов должны преобладать над динамическими. Образование нефлуоресцирующих комплексов вида Ф.Ф в основном состоянии молекул сопровождается поглощением света и возвращением в основное состояние без испускания фотона. В отличие от динамического тушения, статическое тушение уменьшается, а не увеличивается с ростом температуры, т.к. константа ассоциации флуорохромов КS=[Ф.Ф]/Ф*Ф зависит от температуры. Концентрация флуорохрома в растворе в упрощенном случае самотушения димеров: [Ф0] =[Ф]+[Ф.Ф], где [Ф]- концентрация флуоресцентных мономеров, а [Ф.Ф] концентрация нефлуоресцентных димеров. Зависимость соотношения интенсивностей флуоресценции в отсутствие эффекта самотушения F0 и наблюдаемой величины флуоресценции в присутствие эффекта самотушения F по закону Штерна-Фольмера: F0/F=1+ КS *[Ф]. В общем случае, самотушение вызывается суммарным эффектом динамического и статического самотушения и F0/F=1+ Кнабл *[Ф], где наблюдаемая Кнабл=( KD+ КS ) + KD* КS*[Ф], где KD константа тушения Штерна-Фольмера. Данные теоретические соображения распространяются и на флуоресцентные красители с максимумом флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне световых волн. Эти флуорохромы, крайне легко образуют нефлуоресцентные «агрегаты» молекул в крайне близком, т.е. Ферстеровском расстоянии друг от друга. Агрегацию обычно предотвращают путем специальной модификации с образованием ковалентно связанных сульфогрупп для увеличения суммарной полярности молекул. Тем не менее, благодаря небольшому спектральному сдвигу Стокса и наличию неполярных сопряженных метиновых двойных связей данные флуорохромы легко подвергаются самотушению. Данный факт был использован нами при разработке высокомолекулярных наносенсоров для визуализации протеолитической активности (Гл. II ).

ГЛАВА III. МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АГЕНТЫ («НАНО-ЗОНДЫ») ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ

III.А ПОЛИМЕРНЫЙ БИОСОВМЕСТИМЫЙ НОСИТЕЛЬ (PGC) ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕТОК

Постановка задачи. МРТ позволяет достичь высокого пространственного разрешения, приближающегося к одноклеточному (шкала 80-160 мкм); и позволяет получать изображения тканей организма с характерными различиями благодаря высокому уровню контрастирования за счет различий во временах релаксации протонов. Времена релаксации различаются вследствие действия нескольких факторов: 1) концентрации протонов в ткани (спиновой плотности); 2) времен релаксации Т1 и Т2. МРТ позволяет дифференцировать различные компартменты в тканях благодаря различиям во временах протонной релаксации в результате действия следующих факторов: 1) присутствие парамагнитного железа, связанного с апогемоглобином и трансферрином, и, в меньшей степени, марганца супероксид-дисмутазы эритроцитов, 2) благодаря наличию кровотока, т.е. циркуляции протонов воды в крови, В настоящее время известен ряд подходов, основанных на эффекте изменения протонной релаксации, вызываемых компартментализацией либо эндогенных (дезоксигемоглобин), либо экзогенных контраст генерирующих веществ. В качестве экзогенных КВ в данном случае используются либо КВ, содержащие нанокристаллический магнетит Fe3O4, либо парамагнитные хелатированные комплексы Gd(III), введенные в кровоток в виде концентрированного болуса. Данные КВ способны индуцировать дальние (микрометровые) локальные возмущения магнитного поля в объеме сосудов и, следовательно, приводить к возрастанию спин-спиновой релаксивности в кровотоке (?R2*). Возрастание релаксивности в этом случае сильно зависит от изменения магнитной восприимчивости (Дч), и наличие данных изменений позволяет определять гемодинамические параметры (обьем крови). Тканевый обьем крови (т.е. обьем крови в вокселе, регистрируемый с помощью МРТ) измеряется путем интегрирования ?R2* после внутривенного введения КВ (логарифм изменения интенсивности МРТ сигнала пропорционален концентрации КВ в вокселе).

Тем не менее, несмотря на применимость на практике, метод, основанный на изменении магнитной восприимчивости обладает несколькими недостатками: 1) абсолютные значения объема можно определить только после забора образцов крови; 2) низкомолекулярныe КВ, которые представляют собой единственный класс КВ, разрешенных для клинического применения, быстро преодолевают эндотелиальные барьеры, что не позволяет проводить кинетические измерения в кровотоке с помощью МРТ без превышения дозы.

Необходимость неинвазивного мониторинга объема крови в качестве биомаркера ангиогенеза и антиангиогенеза при разработке новых экспериментальных методов терапии рака и воспалительных болезней требовала от нас решения задачи по разработке и применению на практике долгоциркулирующего КВ, которое бы обладало биосовместимостью и позволило бы избежать приведенных выше недостатков.

Результаты и обсуждение. В 1992 г. мы разработали первый биосовместимый синтетический парамагнитный зонд с размерами наночастицы (5-10 нм). Данное КВ, получившее название Protected Graft Copolymer (PGC), было успешно использовано, и мы продемонстрировали его применимость для визуализации сердечно-сосудистой системы при помощи МРТ (Рис. 4А). Мы установили, что PGC обладает высокой стабильностью в отсутствие компонентов плазмы, которые вызывают медленное расщепление PGC, способствующее его выведению из организма (Рис. 4Б-Г). Мы также показали, что PGC можно использовать для доставки контрастных агентов к поверхности эндотелия, а также в областях локально повышенной проницаемости стенки сосудов, и, в конечном итоге, в межтканевое пространство опухолей (Табл. 1).

А-3-мерная схематическое изображение макромолекулярного контрастирующего зонда (PGC); Б- профили биораспределения PGC в модели рака молочной железы R3230 у крыс 6-120 часов после внутривенного введения. Наблюдалось медленное выведение PGC из кровотока, и увеличение накопления в опухоли, почках и селезенке В-гельпроникающая ВЭЖХ образца PGC до и после 24 ч инкубации в нормальном физиологическом растворе, pH 7.4. PGC был мечен изотопом [111In; Г -хроматограмма образца PGC до и после 24 ч инкубации в присутствии 50% плазмы крови человека, стрелка указывает на смещение пика элюции PGC в область макромолекул меньшего диаметра.

Рис. 4. Макромолекулярный нано-зонд, полученный на основе биосовместимого полимера (конъюгата полилизина и полиэтиленгликоля) [1,3,8]

Таблица 1. Физико-химические и фармакокинетические характеристики PGC-Gd [1,3,8].

Свойства PGC приведены в таблице 1. Полученный на основе ковалентной модификации метоксиполиэтиленгликолем е-аминогрупп полилизина графт-сополимер PGC был впоследствии применен в ряде МРТ исследований в различных моделях (Таблица 2). Наиболее часто использовалось производное ковалентной модификации PGC диангидридом диэтилентриаминопентауксусной кислоты (ДТПК) с хелатированным Gd(III).

Таблица 2. МРТ исследования с применением долгоциркулирующего сополимера PGC, меченого катионами лантанидов (Gd или Dy)

III.Б ПРИМЕНЕНИЕ PGC В ВИЗУАЛИЗАЦИИ АНГИОГЕНЕЗА РАКОВОЙ ОПУХОЛИ

Постановка задачи. Изменение объема крови в тканях наблюдается в результате ответа организма на различные патологические процессы (например, локальный воспалительный процесс, ишемия мозга, миокарда или почек), а также при ангиогенезе в раковых опухолях. Быстрое развитие новых методов, направленных на локальное уменьшение кровоснабжения опухоли (т.е. антиангиогенез) при терапии рака требует использования методов неинвазивного измерения кровоснабжения опухолей. Количественная оценка ангиогенеза является важной задачей при определении эффективности ингибиторов ангиогенеза и при определении степени пролиферации эндотелиальных клеток в опухоли. Несмотря на то, что кровоснабжение опухоли можно полуколичественно измерить при помощи биопсии и гистологического исследования, неинвазивные методические подходы к измерению объема крови при карциногенезе полностью отсутствовали. Известно, что ангиогенез в опухоли приводит к росту гетерогенных сосудов с атипичной проницаемостью эндотелиальных барьеров и отсутствием нормального ветвления сосудов, появлению артериовенозных шунтов и аномальной переменной направленности кровотока. Наличие приведенных выше особенностей кровоснабжения создает трудности при использовании как низкомолекулярных КВ, так и КВ, основанных на использовании глобулярных белков в качестве носителей КВ, которые, как правило, дают завышенные значения обьема крови в результате экстравазации за пределы кровеносной системы.

Мы поставили задачу определить неинвазивным путем степень кровоснабжения опухоли с применением долгоциркулирующего зонда PGC-Gd. Мы предположили, что в отличие от гистологического исследования, которое позволяет определять усредненное число кровеносных сосудов на единицу площади среза, визуализация в живых системах с применением PGC-Gd позволит 1) устранить субъективность при полуколичественной гистологической оценке кровоснабжения опухоли; 2) определять функциональный объем крови, т.е. процент общего объема ткани, который перфузируется при кровоснабжении ткани.

Результаты и обсуждение. В отличие от низкомолекулярных парамагнитных хелатов Gd(III), а также парамагнитных конъюгатов белков, внутривенное введение PGC-Gd не сопровождалось быстрым выведением из кровотока экспериментальных животных (Рис. 4Б, Табл.1). Данный результат был подтвержден с применением МРТ исследования на модели аденокарциномы крыс R3230 (Рис. 5 А-Г). Оно показало, что PGC-Gd контрастирует как систему кровоснабжения опухоли, так и области накопления КВ через 24 часа после внутривенного введения, т.к. время его полужизни в кровотоке составляет 36 ч. С целью исследования влияния повышенных уровней экспрессии проангиогенных факторов мы использовали две линии клеток рака молочной железы: аденокарциномы MCF7 и ее генно-инженерного варианта МV165, секретирующего фактор роста сосудов VEGF165. Эти клетки были ортотопически имплантированы в атимусных мышей с целью визуализации объема крови при помощи МРТ (Рис. 5 Д,Е). Данные измерения продемонстрировали следующее: 1) МРТ с применнеием PGC-Gd в качестве КВ, позволила достоверно определить объем крови в обоих типах опухоли, причем средняя фракция объема крови МV165 (8.9±2.1%) достоверно превышала объем крови в ткани аденокарциномы MCF7 (1.7±0.5%, p<0.001); 2) Т1-МРТ, проведенная с высоким разрешением, т.е. с размерами вокселя 0.2х0.1х1.5 мм, продемонстрировала типичную гетерогенность распределения локальной перфузии кровью вокселей в случае опухоли МV165, которая индуцирует крайне высокий уровень локального кровоснабжения за счет интенсивного ангиогенеза, индуцируемого вследствие секреции VEGF165 (Рис. 5Е).

Рис. 5. Визуализация ангиогенеза в моделях рака с применением PGC-Gd [1,17]

A-МРТ проекционное изображение кровоснабжения опухоли R3230 полученное с использованием MIP алгоритма после введения макромолекулярного КВ (PGC, гадолиниевой соли); Б-то же, что и А 24 ч после введения КВ, видно выведение КВ через мочевой пузырь и накопление в тканях опухоли; В, Г-соответствующие МР томографические срезы во фронтальной проекции; Д- профили распределения Т1 взвешенного сигнала МРТ в томографических срезах опухоли MCF7 и MV165, экспрессирующей фактор роста сосудов; Е- МРТ картирование объема крови в опухоли MV165.

Распределение PGC-Gd в кровеносной системе позволяет оценить относительные объемы как крови, так и межклеточного пространства (МП) в раковых опухолях. Мы разработали подход, основанный на последовательном внутривенном введении двух КВ: высокомолекулярного (PGC-Gd) и низкомолекулярного (GdДТПК, гадолиниевой соли диэтилентриаминопентауксусной кислоты). В случае высокой концентрации PGC-Gd дальнейшее введение дополнительного количества КВ и укорачивание спин-решеточного времени релаксации протонов воды не приводит к заметному изменению сигнала в крови, т.е. происходит насыщение Т1 взвешенного МРТ сигнала. Благодаря достижению эффекта насыщения сигнала, наблюдаемого в результате увеличения спин-решеточной релаксации воды (ДR1) при помощи PGC-Gd, мы смогли наблюдать и производить полуколичественный анализ как объема крови, так и объема межтканевого пространства опухоли после внутривенного введения GdДТПК. После введения второго КВ (GdДТПК) МРТ сигнал ткани опухоли складывается из насыщенного Т1 сигнала крови (т.е. величины, не изменяющейся за промежуток времени, необходимый для проведения МРТ) и инкремента Т1 сигнала, являющегося следствием диффузии GdДТПК из сосудов с высокой проницаемостью сосудистой стенки. Измерение МРТ сигнала в модели глиомы мозга у крыс (т.е. стереотаксически имплантированными клетками глиомы линии С6) показало, что фракция объема крови в опухолях составляет 1.50±0.67 (n=28), что соответствует примерно 7.5%/г ткани и достоверно (p<0.05) превышает объем крови скелетной мышцы (5%). Относительная фракция объема МП в глиоме С6 (40%) превышала в 4 раза фракцию МП в нормальной мышце (10%), причем эти данные МРТ были подтверждены результатами гистологии, которая показала, что объем МП равен 37.2±7.7%. В дальнейшем нам удалось установить, что определение фракции крови и МП при помощи МРТ можно производить при ненасыщающих, более физиологичных концентрациях PGC-Gd. МРТ подход в сочетании с терапией рака был применен в следующих моделях: 1) терапии глиомы с применением экспериментальных стабильных ретроинверсных пептидов с триптофан-богатой последовательностью, соответствующей повторам первого типа тромбоспондина-1; 2) терапии аденокарциномы кишечника (MV522) ингибитором VEGF рецепторной киназы (VEGFR2-TKI). При помощи МРТ в клиническом диапазоне напряженностей поля (1.5 и 3Т) мы установили, что ТSP-1 пептиды приводят к стабилизации роста сосудов в С6 глиоме и 9L глиосаркоме и прекращению роста опухолей мозга. Фракция объема крови после терапии оставалась постоянной, в то время как средний объем опухоли в контрольной группе был в 4 раза меньше, чем в опыте. В отличие от ангиостатического эффекта ТSP-1 пептидов, индазол-содержащий ингибитор рецепторной тирозин киназы (VEGFR2-TKI) вызывал быстрое уменьшение объема крови опухоли (с 2.5±1.5% до 1.3±0.3%, p<0.05). Данное уменьшение объема было измерено с применением МРТ метода, описанного в Гл. IIБ, после введения двух доз ингибитора киназы, т.е. через 16 часов после первой дозы. Уменьшение объема крови, сопровождавшееся апоптозом эндотелия сосудов и клеток опухоли, происходило на 7 дней раньше, чем наблюдаемое суммарное изменение объема опухолевой ткани, что говорит о том, что МРТ обладает способностью диагностировать эффективность антиангиогенной терапии на ранней стадии лечения. Практическая значимость наших работ заключается в том, что: 1) гистологически подтвержденная обратная зависимость между плотностью сосудов в опухоли и процентом выживания пациентов после начальной стадии терапии рака может быть определена неинвазивными методами, без необходимости использования биопсии; 2) терапевтический эффект антиангиогенезных препаратов может быть определен количественно на ранней стадии лечения рака.