Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы

ГЛАВА IV. РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ЗОНДА ДЛЯ ОПТИЧЕСКОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ПРОТЕОЛИЗА В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ PGC

Постановка задачи. Определение локализации биомаркеров в живых системах является одной из важнейших задач неинвазивной диагностики. Биомолекулы, обладающие каталитической активностью (ферменты), с одной стороны, представляют собой важный класс биомаркеров для неинвазивной визуализации, с другой стороны, наличие специфической активности создает уникальные возможности не только для идентификации биомаркера, но и для повышения чувствительности и специфичности неинвазивной детекции. Данная концепция проиллюстрирована на Рис. 6. В отличие т.н. зондов для направленной доставки, которые обычно разрабатываются с целью неинвазивной визуализации рецепторов клеточной поверхности, сенсоры ферментативной активности создаются с целью селективной визуализации продуктов каталитической реакции в живых системах (на уровне ткани или клетки). В случае направленной доставки зондов различить несвязанный (свободный) зонд от связанного зонда, как правило, не представляется возможным. Единственным исключением является т.н. подход с применением «претаргетинга», однако, он неприменим для визуализации каталитической активности. Мы ранее установили, что PGC, как и многие другие долгоциркулирующие молекулы, подвержен захвату в тканях за счет увеличенной проницаемости стенки сосуда (EPR эффект), который типичен для многих патологических процессов, индуцирующих активацию и миграцию выстилающего эндотелия. Как было отмечено выше, структура PGC позволяет «нагрузить» полимерную молекулу различными диагностическими низкомолекулярными веществами с применением как ковалентного, так и нековалентного связывания с полиаминокислотным «скелетом» молекулы. Связывание ДТПК с PGC позволило производить количественные измерения возрастания Т1 взвешенного МРТ сигнала, а также и радиоактивности PGC, если перед насыщением ДТПК катионами Gd с PGC хелатировали катионы радиоактивного изотопа индия [111In]. Мы предположили, что «нагрузка» PGC самозатушенным флуоресцентным красителем, позволит получить нефлуоресцентный, долгоциркулирующий макромолекулярный субстрат протеаз, который расщепляется протеазами в зоне накопления в живой ткани. Следовательно, оптимальный сенсор ферментативной активности должен иметь высокое соотношение специфического сигнала, т.е. прироста интенсивности флуоресценции, высвобождаемого протеазами, к фоновому сигналу. Именно поэтому сенсоры на основе PGC обладают преимуществами по сравнению с другими нефлуоресцентными субстратами ферментов, так как каждая молекула нанополимера «нагружена» десятками самозатушенных молекул флуорохрома. Таким образом, после введения PGC-Cy5.5 в кровоток по результатам изменения флуоресценции в тканях с аномальной проницаемостью можно судить о локальном уровне протеолитической активности.

Рис. 6. Различия между зондами для направленной доставки и зондами-сенсорами. Данные классы КВ различаются уровнем контрастирования (т.е. соотношения интенсивностей специфического сигнала и фона) и времен t1 и t2, за которые эти соотношения достигаются в живых системах. В случае КВ-сенсора, как правило, t2< t1 и соотношение сигнал/фон выше. КВ-сенсор способен обнаруживать внутриклеточные (1) и экстраклеточные (2) маркеры.

Результаты и обсуждение. Детекция фотонов, испускаемых

флуоресцирующими молекулами в живом организме представляет собой сложную проблему, связанную с поглощением и рассеянием фотонов в тканях. Флуоресценция в ближне-инфракрасном диапазоне детектируется с большей достоверностью, поскольку в диапазоне длин волн 690-850 нм поглощение фотонов в тканях и крови минимально.

Рис. 7. Эффект самотушения флуоресценции и детекция протеолитической активности с помощью PGC-Cy5.5 [13,16]

A- протеолитическое расщепление наномолекулярного зонда PGC-Cy5.5 по пептидной связи (стрелка) приводит к фрагментации зонда и разделению пар Cy5.5-Cy5.5, подверженных самотушению; Б- спектры поглощения исходного зонда и продуктов трипсинолиза, которые содержат значительно больше мономеров; В - спектры возбуждения и испускания флуоресценции до и после трипсинолиза; Г- визуализация эффекта трипсинолиза с применением возбуждающего излучения в диапазоне волн 610-650 нм и испускания флуоресценции свыше 700 нм.

Мы использовали ковалентное связывание цианиновых флуорохромов (F), которые образуют димеры и агрегаты в концентрированных растворах (например, карбоцианинового красителя Cy5.5) с образованием нанополимерного зонда PGC-Cy5.5, несущего большое число (n=15-20) молекул F на каждой молекуле PGC. В данном полимерном нано-зонде образование агрегатов Cy5.5 дополнительно индуцируется в результате близкого взаимного расположения F на полилизиновом “скелете” молекулы. Такое близкое расположение F вызывает самотушение флуоресценции (см. Гл. IIA), и измеряемая суммарная интенсивность флуоресценции интактной молекулы PGC при физиологических концентрациях солей и температуре крайне мала (Рис. 7). Добавление модельных ферментов (например, трипсина или катепсина B), которые с высокой эффективностью гидролизуют пептидную связь между остатками лизина, ацилированными по е-аминогруппам, приводило к быстрому возрастанию флуоресценции (эффективная константа скорости реакции псевдопервого порядка К(k1+k-1)app=2.5.10-3±0.5.10-3 сек-1). Возрастание флуоресценции, в данном случае, является следствием расщепления наноконъюгата на фрагменты и увеличения среднего расстояния между молекулами F. Ферментативная специфичность зонда к катепсинам была доказана в экспериментах с применением ингибиторов ферментативной активности. Нами было показано, что катепсины B, Н и L расщепляют полимерный зонд с высвобождением флуоресценции. Благодаря эффекту ферментативного расщепления PGC мы произвели визуализацию активность катепсинов в опухолях с применением постоянного источника возбуждающих фотонов (Рис. 8). Наблюдавшийся эффект является результатом синергизма действия нескольких факторов: 1) накопления полимерного зонда в опухоли в результате высокой проницаемости стенки сосудов; 2) высокого уровня экспрессии катепсинов в клетках стромы опухоли и в собственно раковых клетках; 3) локализации продуктов расщепления полимерного зонда в лизосомах, т.е. внутри клеток; 4) расположения опухоли (подкожная имплантация). Последующий анализ клеточных популяций опухолей, проведенный с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной флуориметрии показал, что именно в клетках стромы опухоли происходит расщепление зонда и высвобождение большей части ближне инфракрасной флуоресценции цианинов (Рис. 8Г).

Рис. 8. Оптическая детекция протеолитической активности в моделях рака у экспериментальных животных [13,19,20]

A- изображение в видимом диапазоне света; Б- флуоресцентная визуализация расщепления PGC-Cy5.5 в ксенотранспланте человеческой карциномы легкого LX-1. На врезке показана покожная опухоль при анатомическом исследовании; В - визуализация расщепления PGC-Cy5.5 в модели аденокарциномы молочной железы человека с различной степенью злокачественности (DU4475 и ВТ20); Г - визуализация подкожной опухоли (9L-GFP) с применением комбинированной двухфотонной и конфокальной микроскопии после введения PGC-Cy5.5. Цветокодировка: EGFP (“зеленый”), Cy5.5 (“красный”). Д- проточная флуориметрия клеток, выделенных из опухоли 9L-GFP. Окно, отмеченное серым цветом, соответствует фракции клеток с высокой интенсивностью флуоресценции Cy5.5 и низким содержанием EGFP (строма опухоли).

Кроме того, путем сравнения нескольких линий клеток, которые приводят к росту опухолей с различной степенью злокачественности, мы установили, что в случае ксенотрансплантированных клеток аденокарциномы молочной железы наблюдалась корреляция между степенью злокачественности раковой опухоли, уровнем экспрессии катепсина B и интенсивностью флуоресценции, измеренной с применением неинвазивной визуализации. Например, через 21 день после ортотопической имплантации в атимусных мышей опухоли недифференцированной аденокарциномы человека линии DU4475 достигали веса 593.8 ±171.0 мг и флуоресцировали со средней интенсивностью 861 ±88, по сравнению с весом 29.5±3.3 мг и интенсивностью флуоресценции 566±36 (p<0.01) в случае дифференцированной и неагрессивной аденокарциномы ВТ20 (Рис. 8В). С помощью полуколичественного блоттинга лизатов клеток опухоли было установлено, что в опухоли DU4475 активность катепсина B была в 1.7 раза выше, чем в аденокарциноме ВТ20. Данные различия указывают на наличие корреляции между уровнем экспрессии протеиназы, которая задействована в обеспечении миграции клеток в экстроцеллюлярном матриксе, а также сигнала, генерируемого при расщеплении самозатушенного флуоресцентного макромолекулярного зонда в тканях животных. Измерения ближне- инфракрасного сигнала с поверхности пораженного органа (например, стенки кишечника), в принципе, дает возможность оценить вероятность быстрого агрессивного роста данного новообразования.

ГЛАВА V. РАЗРАБОТКА СЕНСОРНЫХ ПАРАМАГНИТНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ, ОСНОВАННЫХ НА ЭФФЕКТЕ ФЕРМЕНТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ

Постановка задачи. Разработанные нами подходы к визуализации специфической активации КВ (Глава VI) основаны на эффекте расщепления химических связей гидролазами, и применимы только для данного класса ферментов. Мы поставили задачу разработать альтернативную стратегию, который позволил бы производить визуализацию ферментативной активности, катализирующей или образование олигомеров, или образование конъюгатов с биомакромолекулами в живых системах. Ранее подобные методы не были опробованы для неинвазивной визуализации в живых тканях. Мы разработали методический подход, основанный на принципе фермент-специфической олигомеризации парамагнитных субстратов. Мы предположили, что в результате ферментативного окисления зонды-предшественники могут образовывать промежуточные продукты с высокой реакционной способностью. Эти промежуточные продукты способны к рекомбинации с образованием олигомеров, т.е. молекул с большей массой и, следовательно, с меньшей вращательной свободой парамагнитных катионов, входящих в состав олигомеров. Как было показано в Гл. II.А, корреляционное время фR, описывающее вращательную свободу хелатированного парамагнитного иона, оказывает наибольшее влияние на конечную релаксивность и, как следствие, на эффективность КВ в биологических системах.

Результаты и обсуждение. Вначале наша гипотеза была проверена с применением нового монофункционального производного гадолиниевой соли макроциклического хелата (ДО3А), несущего тирамидную группу (Рис. 9А). Производные тирамина и окситирамина (катехоламина) способны с высокой эффективностью восстанавливать окисленную, т.е. каталитически неактивную форму пероксидаз. Роль пероксидазы в изученных нами процессах заключается в катализе образования реакционоспособных свободных радикалов, которые взаимодействуют с образованием олигомеров (гомоконъюгатов) или с образованием конъюгатов с белками (гетероконъюгатов). Образование олигомеров под воздействием пероксидаз было подтверждено ВЭЖХ и масс-спектрометрией (Рис. 9Б). По данным хроматографии, эффективный гидродинамический диаметр олигомеров соответствовал молекулам со средней массой 7 кДа, причем их профиль элюции не изменялся при десятикратном увеличении начальной концентрации субстрата. Полимеризация сопровождалась быстрым ростом спин-решеточной релаксивности (r1). Слежение за кинетикой реакций по росту релаксивности позволило определить, что полимеризация радикалов гадолиниевой соли монотирамида ДОТА происходит с высокой скоростью (эффективная кинетическая константа реакции псевдопервого порядка К(k1+k-1) app =0.04 с-1). Мы подтвердили данные хроматографии с помощью масс-спектрометрии и показали, что в процессе реакции образуются олигомерные продукты со степенью полимеризации от 2 до 12 мономерных хелатных единиц. Эксперименты с использованием дисперсионных измерений зависимости релаксации от напряженности магнитного поля (NMRD) показали, что возрастание релаксивности в результате реакции, катализируемой пероксидазой, наблюдается во всем диапазоне напряженности магнитного поля (или диапазона Ларморовых частот) вплоть до 1.2Т (50 МГц).

При этом релаксивность особенно сильно возрастала в более высокочастотном диапазоне спектра, в котором производится большинство МРТ-измерений в клинике. Относительное изменение релаксивности было выше при физиологических температурах (37оС). Увеличение релаксивности в диапазоне 10-40 МГц типично для КВ с длинными ротационными корреляционными временами, обычно наблюдаемыми при связывании хелатированного гадолиния с белками. Например, релаксивность (R1) в случае окситирамидного производного гадолиниевой соли ДОТА (ОТ-ДОТА(Gd) возрастала с 3.75 до 11.50 [мМ.с-1] (при напряженности поля 0.47 Т), т.е. примерно в три раза. Моделирование параметров релаксации протонов воды с применением генетического алгоритма в рамках теории Соломона-Блюмбергена-Моргана, с использованием экспериментальных данных, полученных с помощью NMRD, позволило установить, что в результате фермент-опосредованной полимеризации величина фR возрастала с 0,12 до 0,84 нс, т.е. в 7 раз. Таким образом, исследование модельной реакции с участием пероксидазы показало, что олигомеризация низкомолекулярных веществ под воздействием ферментов может приводить к увеличению релаксивности, причем преобладающим фактором является олигомеризация и лимитирование вращательной свободы хелатированного парамагнитного катиона.

Несмотря на наличие физических ограничений, которые влияют на возрастание МРТ-сигнала в присутствии хелатированных парамагнитных катионов, томографическая визуализация позволила различить образцы парамагнитного субстрата, содержащего фермент, и контрольные образцы (Рис. 9Б, врезка). В присутствии пероксидазы и перекиси водорода сигнал МРТ увеличивался на 60% в диапазоне концентраций 50-200 мкМ Gd. Для определения чувствительности данного метода, получившего название МРТ-амплификации, был определен предел обнаружения пероксидазы в растворе, который составил 50 нг фермента /мл, т.е. 1 пМоль. Зависимость МРТ-сигнала от концентрации пероксидазы в присутствии ОТ-ДОТА(Gd) имела типичный сигмоидный характер.

Рис. 9. Принципы и экспериментальное подтверждение эффекта МРТ-амплификации для визуализации активности пероксидазы с применением субстратов Gd [18,27,31,39]

A- схематическое изображение двух путей образования продуктов ферментативной реакции с высокой релаксивностью. В качестве субстратов сенсоров были использованы моно- и бис- тирамиды или триптамиды макроциклических (I) или ациклических хелатов Gd(III) ; Б- увеличение молярной релаксивности и возрастание МРТ Т1-взвешенного сигнала (на врезке, нижний ряд) в присутствии различных концентраций монотирамида (I); В- результаты масс-спектрометрии продуктов фермент-опосредованной гомоолигомеризации монотирамида (I), свидетельствующие об образовании олигомеров со степенью олигомеризации 2-12 ; Г-результаты ЯМР дисперсионных измерений растворов мономеров и олигомеров тирамида (I) при двух значениях температуры.

Подобная зависимость, в целом, напоминала концентрационную кривую колориметрического определения пероксидазы. Для того, чтобы сопоставить чувствительность стандартного колориметрического иммуноферментного анализа модельного антигена и разработанной системы пероксидаза-парамагнитный субстрат, мы использовали систему дигоксигенин-антидигоксигенин с применением МРТ в качестве метода обнаружения фермента. Дигоксигенин-меченый F(ab')2-фрагмент антитела, адсорбированный на полистироле в количестве 1-1000 нг обнаруживали антидигоксигениновыми моноклональными антителами, мечеными пероксидазой, с последующим добавлением 100 мкМ ОТ-ДОТА(Gd). При помощи данного метода, нам удалось обнаружить фрагмент антитела с нижним пределом чувствительности 1-80 нг, причем чувствительность метода была сравнима с обычным иммуноферментным колориметрическим анализом, проведенным в аналогичных условиях.

ГЛАВА VI. ПРИМЕНЕНИЕ СЕНСОРНЫХ ПАРАМАГНИТНЫХ КОНТРАСТИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ВИЗУАЛИЗАЦИИ РЕЦЕПТОРОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

Постановка задачи. Результаты тестирования системы с применением модельного антигена показали, что МРТ-амплификация сигнала обладает достаточной чувствительностью, которая теоретически позволяет визуализировать клетки, экспрессирующие специфические антигены на поверхности. Применение неинвазивной визуализации к детекции антигенов в живых системах ранее было лимитировано низким пространственным разрешением радиоизотопных методов. Применение антител, меченых позитрон-испускающими изотопами, например 18F, дает возможность частично устранить этот недостаток, однако, время жизни изотопов недостаточно для достижения высоких уровней отношения специфического и неспецифического сигналов в ткани. Мы поставили задачу тестирования иммуноферментных конъюгатов и метода МРТ для визуализации рецепторов на поверхности клеток и в живой ткани с применением МРТ-амплификации.

Результаты и обсуждение. Мы использовали модельную систему экспрессии селектина Е на поверхности клеток эндотелия человека, индуцированной интерлейкином-1 (IL-1beta). Данная экспериментальная система важна потому, что она позволяет моделировать процессы, происходящие на ранней стадии ответа сосудистой стенки на воспалительные и проангиогенные сигналы. Способность эндотелиальных клеток экспрессировать селектин Е в ответ на стимуляцию IL-1beta (или фактором некроза опухоли, TNFб) была вначале проверена в эксперименте с использованием флуоресцентный микроскопии (Рис. 10А) и 125I-меченых антител. Эксперимент показал, с одной стороны, высокую аффинность F(ab')2 фрагментов антител с эффективной константой диссоциации KD=8.5 нМ, а с другой стороны, наличие большого количества центров связывания на поверхности клеток (примерно 2 млн молекул селектина Е на клетку). В экспериментах на клеточной культуре было показано, что присутствие селектина Е на поверхности клеток эндотелия человека можно было обнаруживать по увеличению МРТ-сигнала ОТ-ДОТА(Gd), использованного в качестве СКВ, который был специфичен к присутствию пероксидазы (Рис 10А-В). При этом сигнал увеличивался как в супернатанте, т.е. в несвязанном с клетками состоянии, так и в суспензии клеток, снятых с подложки, что подтвердило наличие связывания олигомеризованного продукта реакции, катализируемой пероксидазой.

Рис. 10. Визуализация рецепторов в живых системах при помощи МРТ [18,36,37]

А- иммунофлуоресцентное обнаружение селектина Е (ELAM-1) на поверхности IL-1beta активированных эндотелиальных клеток; Б- контроль; В- Т1-взвешенное МРТ изображение эндотелиальных клеток: 1) положительный контроль (0.25 мкМ ДТПК(Gd); 2) активированные эндотелиальные клетки, инкубированные с антителами к селектину Е и вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой и инкубированными с парамагнитным субстратом (0.25 мМ моноокситирамид DО3А), 3) контроль; 4) активированные клетки, не инкубированные с субстратом; Г, Е- МРТ срезы глиомы Gli36 у атимусных крыс (rnu/rnu) после внутривенного введения парамагнитного субстрата (доза - 0.2 ммоль/кг), Д, Ж- после введения конъюгатов антител против EGFR рецептора и парамагнитного субстрата пероксидаз (0.2 ммоль/кг), З- изменение МРТ сигнала в опухоли, измеренного в течение 1 ч после введения субстрата.

Таким образом, мы показали, что индуцированная экспрессия рецепторов на поверхности клеток может быть обнаружена при помощи МРТ с применением субстратов, которые отвечают на присутствие пероксидазной активности, связанной с клетками. В то время как в системах in vitro задача визуализации рецепторной экспрессии решается достаточно несложно, и определяется лишь разрешающими возможностями МРТ и аффинностью и специфичностью антител, в живых системах задача МРТ-визуализации после направленной доставки антител и их фрагментов значительно осложнена неспецифическими эффектами, связанными с функцией клеток органов ретикулоэндотелиальной системы. Частичным решением проблемы может служить применение т.н. «претаргетинга», для чего сначала системно вводят конъюгаты антител (или других «векторных» молекул), а затем, после того как большая часть коньюгатов покидает кровообращение, вводят СКВ. Другими факторами, влияющими на результаты визуализации при помощи пероксидаз являются : 1) распределение антител, их конъюгатов, а также низкомолекулярных СКВ в организме; 2) зависимость от локального кровоснабжения, т.е. функционального объема крови; 3) местная проницаемость кровеносных сосудов; 4) локальная концентрация центров связывания на поверхности клеток; 5) кинетика удаления коньюгатов из центров накопления; 6) наличие биологического источника перекиси водорода.

Одним из возможных подходов к решению проблемы визуализации рецепторов является использование «бинарных» конъюгатов. В частности, нами было показано, что система пероксидаза-глюкозооксидаза (П-ГО) может быть использована для подобной цели in vivo. Моноклональные антитела против мембранного белка принадлежащего к семейству L6 связывали с пероксидазой и глюкозооксидазой путем конъюгирования с образованием бисароматических ковалентных гидразоновых связей. Белок L6 обычно экспрессирован в высоких концентрациях на поверхности плоскоклеточных карцином человека (например, клеток А431, которые содержат до 2,5.105 рецепторов на клетку). На этих клетках данная система и была вначале опробирована. В качестве СКВ была использована гадолиниевая соль бис-(5-окситриптамидо)диэтилентриаминопентауксусной кислоты, (5ОТ-ДТПА(Gd). Это соединение эффективно восстанавливает окисленные формы пероксидазы и миелопероксидазы (см. ниже). Релаксивность (R1) продуктов реакции 5ОТ-ДТПА(Gd) с пероксидазой возрастала в 2,1-2,5 раза по сравнению с исходным субстратом, причем скорость возрастания R1 была в 3 раза выше, если перекись водорода генерировали непрямым методом, т.е если в качестве источника перекиси водорода использовали ГО в присутствии глюкозы. Этот результат можно объяснить быстрым восстановительным ингибированием пероксидазы с образованием неактивных форм фермента в условиях избытка перекиси водорода. Эксперименты на культуре клеток показали, что в системе с применением П-ГО при помощи МРТ можно производить визуализацию от 0,4 до 0,04 единиц активности (100-10 нг) пероксидазы, связанной с клетками.

В экспериментах с атимусными крысами с имплантированными клетками опухоли глиомы человека (Gli36), экспрессирующей рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), вводили последовательно конъюгаты антител против EGFR, а затем парамагнитный субстрат. Сразу после введения СКВ происходило резкое возрастание интенсивности Т1-взвешенного МРТ-сигнала, за которым следовала медленная фаза выведения контрастного вещества из опухоли. У животных, которым вводили конъюгат антител за несколько часов перед введением СКВ, происходило увеличение сигнала в опухоли примерно в 1.3 раза в течение первого часа после введения СКВ. Этот результат коррелирует с наблюдавшимся in vitro изменением МРТ-сигнала в реакции П-ГО с СКВ, сопровождавшейся образованием продуктов с высокой релаксивностью. Путем полуколичественного анализа МРТ изображений мы продемонстрировали наличие распределения парамагнитного продукта реакции в опухоли, которое коррелирует с местной экстравазацией антител в межклеточное пространство в ткани и связыванием клетками опухоли (Рис. 10Г-З). Таким образом, наблюдавшийся эффект контрастирования тонкой структуры опухоли у животных дает основания заключить, что неинвазивная визуализация распределения антител, направленных к маркерным молекулам в опухолевой ткани, позволяет получать МРТ изображения, применимые для картирования экспрессии рецепторов в обьеме опухоли.

ГЛАВА VII. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ АКТИВНОСТИ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ (МПО) В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРА НЕСТАБИЛЬНОЙ АТЕРОМЫ
Постановка задачи. Сердечно-сосудистые заболевания атеросклеротической природы (инфаркт миокарда, инсульт, заболевания периферических артериальных сосудов) являются главной причиной смертности населения в развитых странах мира. Атерогенез сосудов является сложным, многоэтапным патологическим процессом, который приводит во многих случаях к дестабилизации атеросклеротических бляшек на стенке пораженных сосудов, с развитием окклюзии сосудов и острой ишемической болезни. В последнее время, теория о преимущественно воспалительной природе атерогенеза сосудов привлекает все большее внимание исследователей. Наличие локальной повышенной миелопероксидазной активности в стенке сосуда является одним из важнейших факторов в патогенезе атеросклероза. МПО секретируется нейтрофилами и присутствует в макрофагах, локализованных в сосудистой стенке (интиме). МПО быстро восстанавливает перекись водорода, образующуюся при активации нейтрофильной и эндотелиальной НАДФН оксидазы, и индуцирует окисление метиониновых групп, хлорироваие и нитрозилирование остатков тирозина белков, а также образование хлоргидринов ненасыщенных липидов (Рис. 11).

А- МРТ Т1 субстраты и механизмы их полимеризации. Б- в условиях воспаления миелопероксидаза приводит к олигомеризации и иммобилизации парамагнитных субстратов в матриксе бляшки. В контрольных бляшках этот процесс не наблюдается.

Данные химические процессы вызывают активацию матриксных металлопротеиназ (например, ММП7) и способствуют деградации экстроцеллюлярного матрикса, способствуют окислению липидов липопротеинов низкой плотности, а также аполипопротеина А-I, и активируют вторичные воспалительные процессы, приводящие к накоплению пенистых макрофагов в интиме кровеносных сосудов и к дестабилизации атеросклеротической бляшки. Мы поставили задачу произвести неинвазивную визуализацию миелопероксидазной активности стенки сосудов при помощи МРТ, основанной на эффекте МРТ- амплификации так как благодаря высокому пространственному разрешению МРТ дает возможность с высокой точностью определить локализацию очагов воспаления и потенциальной нестабильности.

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая химические реакции в стенке сосуда, катализируемые миелопероксидазой нейтрофилов (МПО) и механизмы контрастирования атеросклеротической бляшки (атеромы)

Результаты и обсуждение. Мы синтезировали и испытали субстрат бис-(5-окситриптамидо)диэтилентриаминопентауксусной кислоты, (5ОТ-ДТПА(Gd), который обладает МПО чувствительностью. Эффективность и специфичность визуализации миелопероксидазы была исследована с применением двух типов экспериментов: 1) в модельных системах, в которых каталитически МПО либо была имплантирована искусственно, либо индуцирована в искусственно вызванном очаге воспаления (в результате инфильтрации нейтрофилов и макрофагов); 2) в модели спонтанного атеросклероза кроликов с визуализацией атеромы. В первом случае в качестве индуцирующего вещества использовали липополисахарид Е. соli, который вводили в мышцу (модель миозита) или в стенку сосуда под рентгенографическим наблюдением (модель воспалительной аневризмы стенки сосуда мозга). Мы установили, что в отличие от неспецифических КВ (ДТПК(Gd) или бис-тирамида ДТПК(Gd), МПО-специфические бис- или моно 5-окситриптамиды парамагнитных комплексов гадолиния накапливаются как в экспериментальных очагах воспаления, так и в атероме аорты, что позволяет производить измерение локального изменения МРТ сигнала в течение часов после введения КВ в отличие от ДТПК(Gd), который быстро выводится из атеромы (Рис. 12). МРТ изображения стенки аорты кролика были получены с помощью системы МРТ последовательности радиочастотных пульсов, которые включали подготовительные пульсы инверсии-восстановления, позволяющие подавить МРТ сигнал в кровотоке и одновременно усилить контраст между стенкой сосуда и близлежащими тканями. Гистологическое исследование показало, что области атеромы с выраженной анти-МПО реактивностью, обнаруженной при помощи иммуногистохимии, содержат в среднем в 3 раза больше ферментативно-активной МПО, чем нормальная стенка сосуда. Кроме того, мы обнаружили, что данные области реактивности антител совпадают с распределением максимального МРТ сигнала в стенке сосуда, что послужило независимым подтверждением наличия специфичности у сенсорного КВ бис-окситриптамида ДТПК(Gd).

А- временная зависимость усиления и стабилизации МРТ сигнала после введения контрольного (ДТПК(Gd) или МПО специфического контрастирующего вещества (бис-5-ОТ- ДТПК(Gd); Б-изменение МРТ сигнала в атеросклеротической бляшке после введиния контрольного (ДТПКGd, верхний ряд) или бис-5-ОТ- ДТПК(Gd). Стрелками указано усиление интенсивности МРТ сигнала в бляшке стенки сосуда; В-активность МПО в образцах нормального сосуда (аорта) и в сосуде подверженному атеросклерозу; Г- сравнение распределения МРТ сигнала и иммуногистохимического окрашивания МПО на срезе сосуда; Д-корреляция между площадью МПО-положительной области среза и площадью МПО-положительного МРТ сигнала.

Рис. 12. МРТ визуализация МПО активности в модели спонтанного атеросклероза кроликов при помощи активируемых парамагнитных субстратов

Наличие небольших очагов воспалительного ответа на локальную стимуляцию эндотелия, выстилающего стенки сосудов головного мозга, является одним из основных факторов, вносящих вклад в развитие нестабильной аневризмы. Детекция подобных участков является важной задачей при выявлении пациентов, нуждающихся в срочном оперативном лечении аневризмы. Мы использовали принцип МРТ амплификации для визуализации активности МПО в модели аневризмы, полученной при помощи окклюзии основания правой сонной артерии кролика. Использование ангиографического слежения за введением 0.2 мкг липополисахарида E.coli в стенку сосуда через сверхтонкий катетер позволило создавать небольшие локальные очаги воспаления для моделирования последующей визуализации активности МПО. Данная процедура приводила к появлению небольших очагов инфильтрации клеток, положительно реагировавших с анти-МАС387, т.е. кальпротектином гранулоцитов/моноцитов и тканевых макрофагов, а также с анти-МПО антителами. Инфильтрация МПО-положительных клеток приводила к увеличению концентрации МПО в стенке сосуда с 0,12 нг/мг веса ткани до 20,3 нг/мг. При помощи МРТ с применением 5ОТ-ДТПА(Gd) мы показали, что усредненный Т1 взвешенный сигнал в аневризме достоверно увеличивался с 1,16±0,01 до 1,55±0,05 (p<0.02) после введения липополисахарида (Рис.13).

Рис. 13. Визуализация и измерения изменений МРТ сигнала в модели воспалительной аневризме при использовании КВ, специфичного к миелопероксидазе нейтрофилов (МПО) [44]

А, В- Т1-взвешенное МРТ изображение сонных артерий у контрольного животного до (А) и после введения СКВ (В, а-аорта). Б-Г- животное, которому был введен ЛПС в стенку сосуда. Стрелки указывают на аневризму. Изображения были получены с использованием FFE пульсов, т.е. градиент эха). Д- отношение интенсивностей МРТ сигналов после и до введения СКВ. Отношение в аневризме статистически достоверно выше контрольных тканей (р<0.02). Е, Ж- изменение соотношения МРТ сигналов во времени в аневризме и контрольной левой сонной артерии, в которой различий между контрольным КВ и МПО сенсорным КВ не наблюдалось.

Данный эффект контрастирования носил специфический характер, так как измерения изменений соотношения МРТ сигнал/фон в левой сонной артерии, а также измерения после введения контрольного КВ (бис-тирамида ДТПК(Gd) не выявили различий, обнаруженных в экспериментальной группе животных (Рис 13 Ж).

Таким образом, данное МРТ исследование показало, что как в модели хронического воспалительного процесса в атеросклеротической бляшке, так и в модели острого процесса в аневризме стенки сосуда визуализация ферментативной активности МПО может быть произведена с применением неинвазивного МРТ исследования и парамагнитного зонда (сенсора) ферментативной активности.

ВЫВОДЫ

1. Разработан и опробован в экспериментах на животных наномолекулярный биосовместимый контрастирующий зонд PGC-GdDTPA. МРТ с использованием PGC-GdDTPA позволяет визуализировать объем крови в живых моделях различных патологий человека (рак, ишемия головного мозга, локальное воспаление, инсульт).

2. С применением контрастирующего зонда PGC-GdDTPA осуществлена визуализация ангиогенеза раковых опухолей животных. Показано, что зонд PGC-GdDTPA позволяет с помощью МРТ измерять ранние изменения в кровоснабжении опухолей.

3. Получены производные PGC, несущие самозатушенные флуоресцентные красители. Продемонстрирован принцип неинвазивной визуализации ферментативной активности гидролаз в живых системах в ближне- инфракрасном диапазоне флуоресценции. Установлено, что специфическое расщепление опухолевыми катепсинами позволяет производить визуализацию аденокарцином и оценивать скорость их роста (злокачественность).

4. Разработаны активируемые ферментами низкомолекулярные парамагнитные контрастирующие зонды и доказан механизм увеличения релаксивности в присутствии пероксидаз. Продемонстрировано, что данные вещества могут быть использованы в качестве сенсоров пероксидаз при направленной доставке ферментов к рецепторам на поверхности опухолевых клеток.

5. Разработаны миелопероксидазочувствительные парамагнитные контрастирующие зонды, которые были применены для визуализации очагов локального воспаления стенки кровеносных сосудов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

Статьи в научных журналах:

1. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Frank H., Bogdanova A.V., Nossiff N., Schaffer B., Tsai E., Papisov M., Brady T.J. (1993) A new macromolecule as a contrast agent for MR angiography: preparation, properties and animal studies. Radiology. v. 187, pp. 701-706.

2. Frank H., Weissleder R., Bogdanov A.Jr., Brady T.J. (1994) Detection of pulmonary emboli by using MR angiography with MPEG-PL-GdDTPA: an experimental study in rabbits. Amer J Roentgenol. v. 162, pp. 1041-1046.

3. Bogdanov A.A., Jr., Callahan R.J., Wilkinson R.A., Martin C., Cameron J.A., Fishman A.J., Brady T.J., Weissleder R. (1994) A synthetic copolymer kit for radionuclide blood pool imaging. J.Nucl. Med. V. 35, pp. 1880-1886.

4. Gupta H., Weissleder R., Bogdanov A.A. Jr., Brady T.J. (1995) Detection of experimental hemorrhage by contrast enhanced MRI and comparison with scintigraphy. Radiology, v. 196, pp. 239-244.

5. Gupta H., Wilkinson R.A., Bogdanov A.A. Jr, Callahan R.J., Weissleder R. (1995) Inflammation imaging: use of a long circulating graft copolymer (MPEG-PL-DTPA) Radiology v. 197, pp. 665-669.

6. Bogdanov A.A. Jr., Martin C., Bogdanova A.V., Brady T.J., Weissleder R. (1996) An adduct of cis-diamminodichlorplatinum(II) and poly(ethylene glycol)-poly(l-lysine)-succinate: synthesis and cytotoxic properties. Bioconjugate Chem. v. 7, pp. 144-149.

7. Donahue K.M., Weisskoff R.M., Chesler D.A., Kwong K.K., Bogdanov A.A. Jr., Mandeville J.B., Rosen B.R. (1996) Improving MR quantification of regional blood volume with intravascular T1 contrast agents: accuracy, precision, and water exchange. Magn Reson Med. v. 36, pp. 858-867.

8. Bogdanov A. Jr., Wright S.C., Marecos E.M., Bogdanova A., Martin C., Petherick P., Weissleder R. (1997) A long-circulating co-polymer in “passive targeting” to solid tumors. J.Drug Targeting, v. 4, pp. 321-330.

9. Marecos E., Wiessleder R., and Bogdanov A. Jr. (1998) Antibody-mediated versus nontargeted delivery in a human lung carcinoma model. Bioconj. Chem. v. 9, pp. 184-191.

10. Callahan R.J., Bogdanov A. Jr., Fischman A.J., Brady T.J., Weissleder R. (1998) Preclinical evaluation and phase I clinical trial of a 99mTc-labeled synthetic polymer used in blood pool imaging. Amer. J. Roentgenol, v. 171, pp. 137-144.

11. Weissleder R., Cheng H.C., Marecos E., Kwong K., Bogdanov A. Jr. Non-invasive in vivo mapping of tumour vascular and interstitial volume fractions. (1998) Eur. J. Cancer, v.34, pp. 1448-1454.

12. Zaharchuk G., Bogdanov A. Jr., Marota J. J. A., Shimizu-Sasamata M., Weisskoff R.M., Kwong K.K., Jenkins B.G., Weissleder R., Rosen B.R. (1998) Continous assesment of perfusion by tagging including volume and water extraction (CAPTIVE): A steady-state contrast agent technique for measuring blood flow, relative blood volume fraction, and the water extraction fraction. Magn. Res. Med. v. 40, pp. 666-678.

13. Weissleder R., Mahmood U., Tung C., Bogdanov A. Jr. (1999) In vivo imaging of tumors with protease-activated near infrared fluorescent probes. Nature Biotechnology, v. 17, pp. 375-378.

14. Bogdanov A. Jr., Marecos E., Cheng H.-C., Chandrasekaran L., Krutzsch H.C., Roberts D.D., and Weissleder R. (1999) Treatment of experimental brain tumors with thrombospondin-1 derived peptides: an in vivo imaging study. Neoplasia, v. 1, pp. 438-445.

15. Zaharchuk G. , Mandeville J.B., Bogdanov A.Jr., Weissleder R., Rosen B.R., Marota J.J., Iadecola C., Kim S.G. (1999) Cerebrovascular dynamics of autoregulation and hypoperfusion. An MRI study of CBF and changes in total and microvascular cerebral blood volume during hemorrhagic hypotension. Stroke, v. 30, pp. 2197-2204.

16. Mahmood U., Tung C.-H., Bogdanov A.Jr., Weissleder R. (1999) Near-infrared optical imaging of protease activity for tumor detection. Radiology, v. 213, pp. 866-870.

17. Lewin M., Bredow S., Sergeyev N., Marecos E., Bogdanov A. Jr., Weissleder R. (1999) In vivo assessment of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis. Int J Cancer, v. 83, pp. 798-802.

18. Bogdanov A.Jr, Matuszewski L., Bremer C., Petrovsky A., Weissleder R. (2002) Oligomerization of paramagnetic substrates results in signal amplification and can be used for MR imaging of molecular targets. Mol Imaging, v. 1, pp. 16-23.

19. Bogdanov A.Jr., Lin C.P., Matuszewski L., Simonova M., Weissleder R. (2002) Cellular activation of self-quenched fluorescent reporter probe in tumor microenvironment. Neoplasia, v. 4, pp. 3 228-236.

20. Bremer C., Tung C.H., Bogdanov A. Jr., Moore A., Weissleder R. (2002) Imaging of differential protease expression in breast cancers for detection of aggressive tumor phenotypes. Radiology, v. 222, pp. 814-818.

21. Kang H.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2002) Targeting of MPEG-protected polyamino acid carrier to human E-selectin in vitro. Amino Acids, v. 23, pp. 301-308.

22. Kim Y.R., Savellano M.D., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2002) Steady-state and dynamic contrast MR imaging of human prostate cancer xenograft tumors: a comparative study. Techn Cancer Res Treat., v. 1, pp. 1-7.

23. Bremer C., Mustafa M., Bogdanov A. Jr., Ntziachristos V., Petrovsky A., Weissleder R. (2003) Steady-state blood volume measurements in experimental tumors with different angiogenic burdens- a study in mice. Radiology, v. 226, pp. 214-220.

24. Kim Y.R., Savellano M.D., Savellano D., Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2004) Measurement of tumor interstitial volume fraction: method and implication for drug delivery. Magn. Reson.Med. v. 52, pp. 485-494.

25. Metelev V., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2004) Synthesis and properties of fluorescent NF-kB recognizing hairpin oligodeoxynucleotide decoys. Bioconj Chem., v. 15, pp. 1481-1487.

26. Chen J.W., Pham W., Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2004) Human myeloperoxidase: a potential target for molecular MR imaging in atherosclerosis. Magn Reson Med., v. 52, v. 1021-1028.

27. Querol M., Chen J.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) DTPA-bis-amide based MR sensor agents for peroxidase imaging. Org Lett, 17, pp. 1719-1722.

28. Reichardt W., Hu-Lowe D., Torres D., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) Imaging of VEGF receptor kinase inhibitor - induced anti-angiogenic effects in drug-resistant human adenocarcinoma model. Neoplasia, v. 7, pp. 847-853.

29. Kim Y.R., Petrovsky A., Reichardt W., Hu-Lowe D., Kang H.W., Torres D., Weissleder R., Bogdanov A.Jr. (2005) Detection of early anti-angiogenic effects: in vivo changes of tumor blood volume in response to the experimental VEGF-receptor tyrosine kinase inhibitor. Cancer Res. v. 65, pp. 9223-9260.

30. Querol M., Chen J.W., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. (2005) Myeloperoxidase activity imaging using 67-Ga labeled substrate. Molecular Imaging Biol., v. 7, pp. 403-410.

31. Querol M., Chen J.W., Bogdanov A. Jr. (2006) A paramagnetic contrast agent with myeloperoxidase-sensing properties. Org Biomol Chem, v. 4, pp. 1887-1895.

32. Chen J.W., Querol M., Bogdanov A. Jr., Weissleder R. (2006) Imaging myeloperoxidase in mice using novel amplifiable paramagnetic substrates. Radiology, v. 240, pp. 473-481.

33. Runnels J.M., Zamitri P., Spencer J.A., Veilleux I., Wei X., Bogdanov A., Lin C.P. (2006) Imaging molecular expression on vascular endothelial cells by in vivo immunofluorescence microscopy. Mol Imaging, v. 5, pp. 31-40.

34. Bogdanov A.A., Jr., Lin C.P., Kang H.W. (2007) Optical Imaging of the Adoptive Transfer of Human Endothelial Cells in Mice Using Anti-Human CD31 Monoclonal Antibody. Pharm Res, v. 24, pp. 1186-1192.

35. Laguillier C., Hbibi A.T., Baran-Marszak F., Metelev V., Cao A., Cymbalista F., Bogdanov A. Jr., Fagard R. (2007) Cell death in NF-kappaB-dependent tumour cell lines as a result of NF-kappaB trapping by linker-modified hairpin decoy oligonucleotide. FEBS Lett., v. 581, pp. 1143-50.

36. Bogdanov A. Jr., Kang H.W., Querol M., Pretorius P.H., Yudina A. (2007) Synthesis and testing of a binary catalytic system for imaging of signal amplification in vivo. Bioconjug Chem, v. 18, pp. 1123-1130.

37. Querol M., Bennett D.G., Sotak C., Kang H.W., Bogdanov A. Jr. (2007) A paramagnetic contrast agent for detecting tyrosinase activity. ChemBioChem., v. 8, pp. 1637-1641.

38. Medarova Z., Castillo G., Dai G., Bolotin E., Bogdanov A., Moore A. (2007) Non-invasive Magnetic Resonance Imaging of Microvascular Changes in Type 1 Diabetes. Diabetes, v. 56, pp. 2677-2682.

39. Богданов А.А. мл., Куерол М., Чен Д. (2007) Визуализация ферментативной активности в живых системх при помощи активируемых ЯМР контрастных агентов. Биофизика, т. 52, с. 389-400.

40. Tabatadze D., Zamecnik P., Yanachkov I., Wright G., Pierson K., Zhang S., Bogdanov A.Jr., Metelev V. (2008) A novel thymidine phosphoramidite synthon for incorporation of internucleoside phosphate linkers during automated oligodeoxynucleotide synthesis. NN&NA, v. 27, pp. 157-172.

41. Zhang S., Metelev V., Tabatadze D., Zamecnik P., Bogdanov A.A..Jr. (2008) Fluorescence resonance energy transfer in near-infrared fluorescent oligonucleotide probes for detecting protein-DNA interactions. Proc Natl Acad Sci USA, v. 105, pp. 4156-61.

42. Zhang S., Metelev V., Tabatadze D., Zamecnik P., Bogdanov A. Jr. (2008) Near-infrared fluorescent oligodeoxyribonucleotide reporters for sensing NF-kappaB DNA interactions in vitro. Oligonucleotides, v. 18, pp. 235-43.

43. Kim Y.R., Tejima E., Huang S., Atochin D.N., Dai G., Lo E.H., Huang P.L., Bogdanov A. Jr., Rosen B.R. (2008) In vivo quantification of transvascular water exchange during the acute phase of permanent stroke. Magn Reson Med., v. 60, pp. 813-821.

44. Deleo M., Gounis M., Hong B., Wakhloo A., Bogdanov A. Jr. (2009) In vivo мolecular еnzyme-сpecific MR imaging of аctive inflammation in a pilot аnimal мodel of carotid аrtery аneurysm. Radiology, в печати.

Главы и монографии:

1. Bogdanov A.A., Jr., Weissleder R., Brady T.J. Protected angiopolymers and their use in blood pool imaging. In: Torchilin VP, ed. Handbook of Targeted Delivery of Imaging Agents. CRC Press, Boca Raton FL, 1995, pp. 502-522.

2. Bogdanov A. Jr., Petrovsky A., Schellenberger E., Simonova M., Pham W., Josephson L., Weissleder R MRI contrast agents of the future. In: MRI: From current knowledge to new horizons. J. Debatin, H.Hricak, H.P.Niendorf, eds. Experta Medica Int. Amsterdam, 2003, pp. 227-234.

3. Bogdanov A.A. Jr., Chen J.W., Kang H.W., and Weissleder R. Magnetic resonance signal amplification probes. In: Ernst Schering Research Foundation Workshop 49: Molecular Imaging, Bogdanov A.A. Jr., Licha K., Eds., Springer-Verlag GmbH, Heidelberg, 2005 pp. 147-157.

4. Bogdanov A.A. Jr. “Molecular probes, delivery”: in Encyclopedic Reference of Imaging, Baert, A.L., Editor, 2008 Springer-Verlag, Heidelberg, p. 1966.

5. Querol M., Bogdanov A.A. Jr. Environment-sensitive and enzyme-sensitive MR contrast agents. In: “Handbook of Experimental Pharmacology. Molecular Imaging II”W. Semmler and M. Schwaiger, eds. Springer-Verlag, Heidelberg, 2008, pp. 37-56.

6. Bogdanov A.A. Jr. Optical Imaging Probes. In: “Molecular Imaging in Oncology” M.G.Pomper and J.G.Gelovani, Eds. Informa Healthcare, NY,London, 2008, pp. 245-260.

7. Юдина А.Ю., Богданов А.А. мл., Пирогов Ю.А. Магнитно-резонансная томография в изучении ангиогенеза и его молекулярных маркеров. Под ред. Ю.А. Пирогова. Изд. Физического факультета МГУ, Москва, 2008, 143 стр.

Патенты:

1. Bogdanov A.A. Jr., Brady T.J. Medical Compositions. US Patent 5,593,658.

2. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Brady T.J., Callahan R. Blood pool imaging composition and method of its use. US Patent 5,605,672.

3. Bogdanov A.A. Jr., Weissleder R., Brady T.J. Graft copolymer adducts of platinum(II) compounds. US Patent 5,871,710.

4. Bogdanov A.А. Jr., Tung C.-H., Weissleder R. Noninvasive imaging of nucleic acid vectors. US Patent 6,284,220.

5. Weissleder R., Tung C.-H., Mahmood U., Josephson L., Bogdanov A.A. Jr., Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes. US Patent 6,083,486.

6. Bogdanov A.А. Jr., Weissleder R. Imaging of enzymatic activity. US Patent 6,737,247.

7. Weissleder R., Tung C.-H., Mahmood U., Josephson L., Bogdanov A.A. Jr., Intramolecularly-quenched near infrared fluorescent probes. US Patent 6,592,847.

Размещено на Allbest.ru