Физико-химические механизмы переноса ионов в природных и хирально модифицированных модельных каналах

Размещено на http://www.allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора физико-математических наук

Физико-химические механизмы переноса ионов в природных и хирально модифицированных модельных каналах

Специальность 03.00.02 - биофизика

Дмитриев Андрей Викторович

Москва 2008

Работа выполнена на кафедре гуманитарных и естественнонаучных дисциплин Филиала Орловской региональной академии государственной службы в г. Липецке

Научный консультант:

доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник Быстров Владимир Сергеевич

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник Нечипуренко Юрий Дмитриевич

доктор физико-математических наук, профессор Шайтан Константин Вольдемарович

Ведущая организация:

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 501.001.96

доктор биологических наук, профессор Т.Е. Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Одной из важнейших особенностей живой природы на Земле является «хиральная чистота» аминокислот, углеводов, нуклеотидов и многих биологически активных веществ, составляющих все организмы. На атомно-молекулярном уровне организации природной клетки данное свойство проявляется в том, что ее нуклеиновые кислоты включают исключительно D-изомеры (дезокси)рибозы, а синтезируемые в рибосомах белки - L-изомеры аминокислот. Отметим также, что все углеводы включают D-изомеры, а все фосфолипиды являются L-изомерами. Относительно исключений из этого правила речь пойдет ниже. ион аминокислотный матричный синтез

Хиральная асимметрия биосферы непосредственным образом связана с другой фундаментальной асимметрией - ионной асимметрией в содержании важнейших катионов во внутренней среде клеток относительно внешней среды. Существуют близкие значения свободной энергии, необходимой для формирования хирально чистых биополимеров и ионной асимметрии клеток (Твердислов, Яковенко,2003). Возникновение таких асимметрий исходно связано с образованием предшественников живых клеток на неравновесной границе океан-атмосфера, где происходит фракционирование ионов и энантиомеров хиральных соединений. Асимметричное и неравновесное распределение катионов между первичными клетками и средой, а также хиральная асимметрия аминокислот и углеводов, характерные для биологических систем, возникли при спонтанном замыкании липидных пузырьков-везикул в «первичном бульоне» древнего океана в ходе образования аэрозолей, включавших морскую воду поверхностной пленки. В существующих живых системах эта связь опосредована через ион-транспортирующие системы мембран, в частности, ионные каналы и насосы.

Следует отметить, что помимо сахаров и аминокислот другие хиральные компоненты клетки в определенных случаях могут встречаться как в одной, так и в другой изомерной форме. В некоторых бактериях обнаружены L-сахара и D-аминокислоты. D-аминокислоты достаточно широко распространены в живой природе и, более того, входят в состав ряда биологически значимых коротких олигопептидов. Встречаются бактерии, которые содержат D-глютаминовую кислоту и D-Ala в своих клеточных стенках, а в организме человека вырабатывается в качестве нейромедиатора D-Ser. Некоторые пептидные антибиотики, а также плазма крови высших организмов, имеют в своем составе D-аминокислоты. Некоторые термофилы используют высокие концентрации D-Ala в качестве осморегулятора. В нервных клетках высших организмов находят D-Ala, D-Asp и D-Ser, иногда в значительных концентрациях. Поэтому в целом биологический мир не обнаруживает хиральной чистоты, но все, что относится к матричному синтезу полипептидов, характеризуется абсолютной хиральной чистотой.

Рассматривая общие структурные особенности природной клетки, целесообразно выделить два аспекта нарушения зеркальной симметрии живой природы. Во-первых, это эволюционно востребованная необходимость гомохиральности, во-вторых - эволюционно закрепившийся знак хиральности.

Физико-химические и биологические основы гомохиральности биополимеров в последнее время изучены достаточно разносторонне (Аветисов, Гольданский,1996; Чернавский,2000; Твердислов, Яковенко, 1992, 2007). Основы механизмов сопряжения ионной и хиральной асимметрий рассмотрены в работах Твердислова, Яковенко, Дмитриева (1988 - 2007).

Гомохиральность белков и нуклеиновых кислот в первую очередь определяет их стереоспецифичность - необходимое условие матричного синтеза. Существует связь между хиральностью (дезокси)рибозы и требованием комплементарности двойной спирали ДНК. Замена единичного природного D-нуклеотида в двунитевой структуре ДНК на зеркально сопряженный ему L-изомер приводит к образованию структуры с большей энергией, нарушению комплементарности хирально дефектной пары, причем данный дефект не является локальным, а разрушает значительную область двунитевой структуры.

Во-вторых, гомохиральность белков и нуклеиновых кислот обусловливает стабильность их структур, обеспечивающих их функционирование.

В-третьих, для биохимических преобразований гомохиральных соединений требуется гораздо меньший набор ферментов, чем для таких же преобразований гетерохиральных соединений. Так, для катализа двух оптических изомеров необходимы два белка, а для работы с рацемической смесью необходим удвоенный набор белков.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области исследования гомохиральности биополимеров, физико-химическое и биологическое основы того, что белки-ферменты и нуклеиновые кислоты имеют строго определенный знак хиральности, остаются неизвестными. Так, согласно гипотезе спонтанной дерацемизации (Гольданский,Кузьмин,1989), повторение всей совокупности событий, приведших к появлению хиральной чистоты, с равным успехом способно привести к такой биосфере, которая использует D-аминокислоты и L-сахара. К такому же результату приводит гипотеза решающей роли глобального фактора преимущества, усиленная учетом слабых нейтральных токов.

Для объяснения выбора знака хиральности были проведены расчеты (Mason et al,1984), в которых было показано, что вклад слабых взаимодействий во взаимодействие электронов с ядром асимметрического центра хиральной молекулы приводит к относительному сдвигу энергий основных состояний энантиомеров. Несмотря на то, что для достаточно простых молекул (аминокислот и сахаров) величина данного сдвига исключительно мала (составляет 10^-15-10^-17 kT), наиболее важным результатом таких расчетов было то, что энергия основного состояния L-аминокислот и D-сахаров оказалась ниже, чем энергия их зеркальных антиподов. Кроме того, наблюдаются небольшие различия в кинетике реакций с участием L- и D-аминокислот (Фалсом,1982). Различие физико-химических свойств стереоизомеров некоторых аминокислот проявляется не только в кинетике реакций, но и термодинамически. Так, например, для L-Ala температура плавления 315-316С, а для D-Ala - 291-293С (CRC Hanbook of Chem. and Phys., 84 Ed., CRC Press, 2003-2004). Различие температур плавления в силу уравнения Вант-Гоффа приводит к различной зависимости растворимостей от температуры.

Нам представляется наиболее рациональным искать ответ, хотя бы частичный, на вопрос о выборе строго определенного знака хиральности живой природы по результатам:

- исследования структуры и механизмов функционирования хирально модифицированных модельных белков, построенных из D-аминокислот;

- исследования изменений первичной структуры природных белков до получения функционального соответствия их природным антиподам;

- исследования особенностей матричного синтеза неприродных антиподов соответствующих белков.

Вышесказанное объясняет перспективность построения хирально модифицированных модельных белков, включающих D-аминокислоты, а также исследования особенностей их матричного синтеза. Изучение структурно-функциональных свойств хирально модифицированных белков, а также особенностей их матричного синтеза, позволят получить, по крайней мере, частичный ответ на вопрос о выборе строго определенного знака хиральности в ходе предбиологической эволюции.

Очевидно, что при исследовании структуры и механизмов функционирования зеркальных антиподов биомолекул, практически невозможно охватить все их многообразие. Так, в Банке белковых структур представлены более десятка тысяч белковых структур. Поэтому имеет смысл ограничиться исследованием определенного класса белков, в качестве которого мы использовали ионные каналы мембран: потенциал-независимый калиевый канал KcsA, потенциал-зависимый калиевый каналы KvAP, б/в, Kv1.2, а также NMDA-рецептор.

Выбор ионных каналов в качестве объектов исследования не является случайным и обусловлен он тем, что, как ранее отмечалось, существует достоверно установленная сопряженность клеточной ионной и молекулярной хиральной специфичности живых систем, реализуемая через различные ион-транспортирующие системы - насосы, каналы, модификаторы.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось теоретическое исследование физико-химических механизмов переноса ионов в природных и хирально модифицированных модельных каналах с инвариантной и модифицированной аминокислотной последовательностью, а также гипотетических сценариев их матричного синтеза.

Для достижения цели исследования решались следующие задачи:

1) Разработка метода расчета энергетических профилей ионов в мембранных каналах, не требующего значительных затрат расчетного времени и предсказывающего с хорошей точностью функциональные характеристики каналов.

2) Построение хирально модифицированных модельных каналов с первичной структурой, инвариантной природным каналам, а также исследование их структуры и механизмов функционирования.

3) Исследование влияния изомеризации определенных аминокислотных остатков ионных каналов при старении организма на их структурные и функциональные характеристики.

4) Разработка метода построения структуры хирально модифицированных модельных каналов с модифицированной первичной структурой и функциональными характеристиками, адекватными характеристикам природных каналов.

5) Исследование гипотетических особенностей матричного синтеза хирально модифицированных модельных каналов, характеризующихся соответствием их функциональных характеристик аналогичным природным каналам.

Объект и предмет исследования

Объектом исследования являлись:

1) ионные каналы клетки (потенциал-независимый калиевый канал KcsA из Streptomyces lividans, потенциал-зависимый калиевый канал KvAP из Aeropyrum pernix, потенциал-зависимый калиевый канал Kv1.2 из Rattus norvegicus, комплекс б- и в-субъединицы калиевого канала из Homo sapiens);

2) NR1 активный центр NMDA-рецептора из Rattus norvegicus в комплексе с Gly, D-Ser и D-cSer;

3) модельные D-аминокислотные каналы с модифицированной и инвариантной природной первичной структурой.

Четвертичную структуру природных белков брали из Банка белковых структур. Выбор выше указанной группы каналов являлся не случайным, т.к. для них существуют надежные экспериментальные данные по структуре и функциональным характеристикам.

Предметом исследования являлись механизмы функционирования и матричного синтеза гипотетических хирально модифицированных модельных ионных каналов.

Предпосылки и направление исследования

Экспериментально обнаруженная и теоретически изучаемая изомеризация отдельных аминокислотных остатков каналов приведет не к ожидаемой инвариантности их третичной структуры, а к ее нарушению. Последнее обстоятельство является причиной изменения функциональных характеристик каналов. Для построения хирально модифицированных модельных каналов с природной функциональностью необходима модификация их первичной структуры. Рассматривая гипотетический сценарий матричного синтеза, можно предположить, что модификация первичной структуры приведет либо к изменению нуклеотидной последовательности генов ДНК, кодирующих данные каналы, либо к изменению генетического кода. Появление D-аминокислот в ионных каналах в процессе старения организма повлечет изменение их функциональных характеристик и в определенных случаях нарушение механизмов их функционирования.

Методология и методы проведенного научного исследования

В работе использовались как традиционные методы расчета энергетических профилей ионов (молекулярная механика, квантовая химия) и функциональных характеристик каналов (теория абсолютных скоростей реакций Эйринга), так и разработанные нами методы:

1) разделение дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей ионов в поре каналов;

2) «энергетическое выравнивание» третичных структур белков как метод построения хирально модифицированных модельных каналов с измененной первичной структурой, структурно и функционально эквивалентных соответствующим природным каналам.

Научная новизна и значимость полученных результатов

В результате исследований впервые:

1) Предложен расчетный метод, основанный на разделении ближних и дальних взаимодействий, позволяющий получать энергетические профили ионов в мембранных каналах. В данном методе использовано сопряжение квантовохимического расчета ближних взаимодействий и молекулярно-механического - дальних взаимодействий.

2) Использование полученных энергетических профилей дает возможность вычислять функциональные характеристики каналов с хорошей точностью, что показано на примере ионной специфичности калиевых каналов клетки.

3) Построены хирально модифицированные модельные каналы с инвариантной природной аминокислотной последовательностью, которые являются энергетически менее стабильными, чем их природные антиподы с нарушенными механизмами функционирования и функциональными характеристиками.

4) Предложен метод, основанный на вариации первичной структуры и энергетическом выравнивании третичных структур, позволяющий моделировать атомную структуру хирально модифицированного модельного канала с природной функциональностью, а построенные D-аминокислотные каналы являются энергетически эквивалентными соответствующим природным каналам с аналогичными функциональными характеристиками.

5) Предложена простейшая схема гипотетического сценария матричного синтеза D-изомеров каналов, участниками которого являются ДНК и РНК из L-сахаров, а также ферменты матричного синтеза из D-аминокислот. Характерными особенностями данного синтеза являются либо модифицированная нуклеотидная последовательность экзонов, либо дублетная таблица универсального генетического кода (для построения хирально модифицированных модельных ионных каналов с природной функциональностью достаточно десяти D-аминокислот).

6) Появление D-аминокислот в ионных каналах, связанное со старением организма, приводит к нарушению функциональных характеристик каналов и ферментативных свойств NMDA-рецептора.

Практическая значимость полученных результатов

Разработанные подходы позволяют исследовать механизмы функционирования мембранных каналов, моделировать атомные структуры хирально модифицированных модельных белков с природной функциональностью.

Установленные изменения в работе каналов, обусловленные изомеризацией некоторых аминокислот каналов в процессе старения организма или различного рода заболеваниями, позволяют наметить пути поиска эффективных лекарственных препаратов, в качестве активных центров которых служат рецепторы ионных каналов.

Учитывая, что значительное число заболеваний связано с «каналопатологиями» - нарушениями функционирования ионных каналов, полученные результаты и разработанные подходы могут быть использованы при разработке стратегии и средств лечения этих заболеваний. Полученные результаты могут применяться при исследовании биологического отклика организмов на изомеризацию каналов под воздействием антропогенных внешних факторов и для решения общих проблем хиральной безопасности биосферы.

Полученные результаты расширяют представления о физических механизмах происхождения хиральной асимметрии биосферы, функционирования ионных каналов и могут быть использованы в курсах лекций по биофизике, биохимии и физиологии в университетах и вузах медико-биологического профиля.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1) Обоснование метода разделения дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей, с помощью которого установлено, что в клетке с хирально модифицированными калиевыми каналами с природной первичной структурой будут нарушены многие биологические процессы, обусловленные функционированием калиевых ионных каналов (функциональные характеристики таких модельных каналов существенно отличаются от соответствующих характеристик природных каналов клетки), а также появление незначительного количества D-аминокислот в канале, связанное со старением организма, приводит к нарушению функциональных характеристик каналов.

2) Если модельные L-дизоксирибозные ДНК были бы построены из четырех нуклеотидов, то для обеспечения матричного синтеза хирально модифицированных каналов с модифицированной первичной структурой и природной функциональностью была бы достаточна дублетная таблица генетического кода для десяти D-аминокислот: G, A, S, C, D, N, K, H, F, P. Однако оптимальность реально существующего генетического кода и системы биосинтеза обусловлена более широкой вариабельностью структурно-функциональных возможностей белков.

Личный вклад соискателя

Выбор и обоснование научной тематики исследования, получение результатов, приведенных в диссертации, их анализ и интерпретация, как и основные публикации, сделаны при решающем участии соискателя.

Апробация работы

Результаты исследований по теме диссертации представлены на 3-й Региональной научно-технической конференции «Проблемы экологии и экологической безопасности ЦЧ РФ» (Липецк, 1999), 7-й Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование» (Дубна, 2000), 3-м Всероссийском медицинском конгрессе (Ижевск, 2000), 3-м Сибирском конгрессе по прикладной и индустриальной математике (Новосибирск, 1998), 5-й Международной конференции «Физика в системе современного образования» (Санкт-Петербург, 1999), 3-й Всероссийский симпозиум «Математическое моделирование и компьютерные технологии» (Кисловодск, 1999), 4-м Сибирском конгрессе по прикладной и индустриальной математике (Новосибирск, 2000), 5-й Республиканской электронной научной конференции «Современные проблемы информатизации» (Воронеж, 2000), Международной конференции «Математика. Образование. Экология. Гендерные проблемы» (Воронеж, 2000), 4-й Международной научно-технической конференции «Физика и радиоэлектроника в медицине и экологии» (Владимир, 2000), Международной конференции «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000), 2-й Региональной научной конференции по органической химии «Органическая химия на пороге третьего тысячелетия - итоги и перспективы» (Липецк, 2000), 5-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2001), 8-й Международной конференции "Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2001), 2-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001), 3-й Всероссийской научной конференции «Молекулярная физика неравновесных систем» (Иваново, 2001), Международном симпозиуме «Компьютерное обеспечение химических исследований» (Москва, 2001), 7^th Scandinavian Symposium on Chemometrics (Copenhagen, 2001), XVIII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), Школе-семинаре «Введение в многомерный анализ данных (проекционные методы)» (Москва, 2001), 3-й Всероссийской школе-конференции по квантовой и вычислительной химии им. В.А. Фока (Великий Новгород, 2001), Международной школе-конференции «Введение в многомерный анализ данных (проекционные методы)» (Кострома, 2002), 13^th International Congress on Molecular Biology (Toronto, 2002), 8-м Всероссийском симпозиуме «Биоинформатика и компьютерное конструирование лекарств» (Москва, 2002), 6-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002), 3-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2003), 4^th Symposium on Multivariate Data Analysis (Moscow, 2003), 3-м Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), 4-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2005), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2006), 5-м Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, 2006), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы естественных наук и их преподавания» (Липецк, 2006), 5-й Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2007), 3-м Всероссийском съезде фармакологов (Санкт-Петербург, 2007), 5-м Международном семинаре «Компьютерное моделирование электромагнитных процессов в физических, химических и технических системах» (Воронеж, 2007).

Опубликованность результатов

По материалам диссертации опубликовано 72 печатные работы: 24 статьи в рецензируемых научных журналах по списку ВАК, в международных рецензируемых журналах - 3, статьи в других журналах, изданиях и тематических сборниках - 17, в материалах конференций - 28. Список основных работ по теме диссертации приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает введение, основную часть, состоящую из 4 глав, заключение, основные выводы и список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 243 страницах, содержит 59 рисунков и 36 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе рассмотрены возможности и ограничения методов расчета и анализа энергетических профилей ионов в мембранных каналах. Исследованы прогностические способности метода молекулярной механики для их расчета. Предложен, обоснован и тестирован метод расчета энергетических профилей ионов, основанный на разделении и независимом расчете энергии дальних и ближних взаимодействий в системе ион - аминокислотный остаток остова канала.

Движение иона в трансмембранном канале однозначно контролируется функцией его потенциальной энергии, которая в явном виде включена во все уравнения, описывающие ионный транспорт в канале (молекулярной и ланжевеновой динамики, Пуассона-Нернста-Планка). Для оценки функциональных характеристик канала кинетическая теория переходного состояния Эйринга использует профиль свободной энергии Гиббса, одной из составляющих которого является потенциальная энергия иона.

При однорядном прохождении ионов через пору канала потенциальная энергия иона зависит от координаты оси канала (оси аксиальной симметрии) . Традиционно для расчета применяются либо методы молекулярной механики, либо квантовой химии. Методы молекулярной механики в данных расчетах не требуют значительных затрат расчетного времени, но их точность не всегда является удовлетворительной. Большинство расчетных методов квантовой химии лишены последнего недостатка, но требуют значительных затрат расчетного времени.

Вопрос о точности оценки энергетического профиля иона в поре канала является наиболее сложным в исследованиях ионного транспорта, что, прежде всего, обусловлено невозможностью прямого сопоставления расчетного профиля с экспериментальным. В этом случае по полученным энергетическим профилям осуществляется оценка функциональных характеристик канала, которые возможно сопоставить с экспериментальными значениями. К таким характеристикам в первую очередь относятся вольтамперные характеристики, ионные проводимости, отношения коэффициентов проницаемости для различных ионов.

Многообразие расчетных методов приводит к тому, что в работах, посвященных теоретическому исследованию ионного транспорта в каналах, часто встречается совпадение функциональных характеристик каналов, оцененных по (качественно и количественно) различным профилям иона одного и того же канала. Оно, как правило, является следствием физически не обоснованной калибровки энергетических профилей и параметров уравнений для расчета функциональных характеристик каналов.

Предварительно для расчета энергетических профилей мы использовали наиболее распространенные силовые поля молекулярной механики (AMBER, CHARMM, OPLS) и проводили их количественный анализ, применяя теорию переходного состояния для последующего сопоставления расчетных и экспериментальных результатов.

Свободная энергия Гиббса системы ион-вода-канал

, (1)

где, в квазистатическом приближении, - потенциальная энергия комплекса ион-канал, - эффективная диэлектрическая постоянная, зависящая от диаметра поры канала d, , и - потенциальная энергия комплекса вода-вода, вода-канал и ион-вода, соответственно, - энтропия.

Зависимость рассчитывали численным решением уравнения Буза (Conway,1981), величину - по полуэмпирическим формулам Лайо-Торрэ (Laio,Torre,1999), включающих экспериментальные значения свободной энергии Гиббса комплексов, содержащих i молекул воды и катион в газовой фазе.

Величину с хорошей степенью точности можно считать постоянной, не зависящей от локализации иона, для определенного канала. По результатам численного моделирования методом Монте-Карло установлено, что в зависимости от положения иона на оси канала принимает постоянное значение для определенного канала, при этом ошибка составляет не более 2%. Данный результат может быть обоснован статистической природой рассматриваемых взаимодействий и свойствами потенциалов межмолекулярного взаимодействия.

В методах силового поля представляется в виде суммы энергии кулоновского и вандерваальсового взаимодействия атомов канала и иона:

, (2)

где - кулоновский заряд i-го атома канала, - расстояние от i-го атома канала до иона, , - параметры вандерваальсового взаимодействия i-го атома и иона. Практически все традиционные силовые поля, применяемые в исследовании биомолекул, используют представление (2). Отличие наблюдается лишь в выражениях для параметров и . Силовые поля AMBER и CHARMM используют -параметризацию:

, , (3)

где , , , - параметры силового поля. Силовое поле OPLS традиционно использует -параметризацию:

, , (4)

где , , , - параметры силового поля. В случае потенциальной энергии взаимодействия двух одинаковых атомов или ионов параметр соответствует их вандерваальсову радиусу, - их равновесной энергии.

Важно отметить, что в подобных расчетах величины , , являются калибровочными параметрами, прежде всего по соображениям «равновесной геометрии» биомолекулярных систем. Поэтому нами исследована возможность замены параметра кристаллографическими и реальными ионными радиусами для возможного улучшения результатов.

В качестве тестируемого мембранного канала нами выбран потенциал-активируемый бактериальный калиевый канал KcsA из Streptomyces lividans. Данный выбор не является случайным, т.к. для данного канала существуют наиболее достоверные экспериментальные значения его функциональных характеристик. Канал KcsA является тетрамером. На рис. 1 представлен поперечный срез канала, демонстрирующий две из четырех его субъединиц. Пору канала можно условно разделить на три области: селективный фильтр, ответственный за ионную избирательность канала (I), относительно большую центральную полость (II) и нижнюю внутреннюю пору (III).

Профили ионов Cs⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺ и Li⁺, с рассчитанными методом силового поля AMBER , представлены на рис. 2.

Данные профили различаются во всех областях поры канала. Причем наиболее существенное различие энергетических профилей катионов наблюдается в области нижней поры канала. В нижней поре и в селективном фильтре канала KcsA существуют энергетические барьеры, причем их высоты для различных ионов находятся в следующей последовательности Cs⁺>Rb⁺>K⁺>Na⁺>Li⁺. В таком случае канал KcsA имеет расчетный ряд селективности Cs⁺<Rb⁺<K⁺<Na⁺<Li⁺, противоположный экспериментальному (Cs⁺<Rb⁺<K⁺>Na⁺>Li⁺)!

Аналогичные результаты были получены для профилей свободной энергии катионов, рассчитанных методом силового поля OPLS.

Таким образом, профили, рассчитанные методом силового поля, во-первых, не объясняют энергетическую предпочтительность дегидратации K⁺ по сравнению с другими ионами, а, во-вторых, не объясняют прохождение K⁺ через достаточно высокий энергетический барьер (28 ккал/моль) нижней поры канала.

Для получения количественных оценок функциональных характеристик канала использовали уравнения теории абсолютных скоростей реакций Эйринга. В таком случае профиль свободной энергии Гиббса канала может быть представлен в виде последовательности M энергетических барьеров, разделенных M-1 потенциальными ямами.

Вольтамперную характеристику (ВАХ) канала определяли по формуле

. (5)

Находя производную функции по переменной , определяли проводимость одиночного канала . Для объяснения ионной селективности мембранного канала мы использовали теорию Эйринга, которую количественно можно охарактеризовать как отношение проницаемостей для сравниваемых ионов А и В по формуле

, (6)

где М - масса иона. В зависимостях (5) и (6): () - константа скорости перехода из ямы i-1 в яму i (из ямы i в яму i-1), - вероятность того, что ион находится в i-й яме, - вероятность того, что канал не заполнен ионами. Константы скорости перехода определяли по формулам

,

,

где - значение энергии иона в i-м барьере (i-й яме), - электрическое расстояние между i-1 ямой и i-м барьером (между i-й ямой и i-м барьером), - частотный фактор.

Рассчитанные по формуле (5) ВАХ канала в условиях симметричных монокатионных растворов (М) представлены на рис. 3.

Расчет методом AMBER показывает существование линейной зависимости между током и напряжением на участке 0-60 мВ с величиной проводимости одиночного канала для K⁺ 0.016 пСм, для Na⁺ 1.3 пСм, для Li⁺ 0.68 пСм, для Rb⁺ 0.003 пСм, для Cs⁺ 0.001 пСм. Данные значения проводимостей находятся в разногласии с экспериментальными данными, согласно которым значение проводимости для различных типов калиевых каналов для K⁺ меняется от 4 до 270 пСм. Расчетные по формуле (6) значения отношений коэффициентов проницаемости для Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺ и Cs⁺ к коэффициенту проницаемости для K⁺ составляют 41.2, 83.1, 1, 0.2 и 0.07, соответственно. Данные значения не только противоречат экспериментальным данным (<0.09, <0.07, 1.00, 0.25-0.91 и <0.18), но и предсказывают существование селективного ряда, несвойственного калиевым каналам.



Таким образом, профили свободной энергии Гиббса, полученные методом силового поля, не только не позволяют дать количественное объяснение ионной избирательности канала, но и получить правильные качественные оценки его функциональных характеристик.

Данный вывод делает настоятельно необходимым разработать метод расчета профиля свободной энергии Гиббса, не требующий значительных затрат машинного времени и сохраняющий точность квантовохимического расчета. Этот метод может быть получен, если учесть, что специфические квантовомеханические эффекты, возникающие при расчете взаимодействия в системе ион-канал, существенны лишь на небольших расстояниях, т.е. там, где значимо перекрывание электронных оболочек иона и атомов молекул канала.

В таком случае потенциальную энергию системы ион-канал можно представить в виде , где - квантовомеханическая составляющая результирующей энергии, существенная при малых расстояниях ион - атомы канала, - классическая (кулоновская) составляющая, существенная при больших расстояниях ион - атомы канала.

Разделение взаимодействия на дальнее и ближнее может быть обосновано, если учесть, что гамильтониан двух взаимодействующих молекул (или иона и молекулы) имеет вид , где - сумма гамильтонианов изолированных молекул, - оператор их электростатического взаимодействия:

.

Здесь индексы б, в нумеруют ядра, индексы i, j - электроны молекул А и В соответственно.

Для вычисления электростатического взаимодействия молекул целесообразно использовать теорию возмущений. На далеких расстояниях между молекулами оператор можно рассматривать как малое возмущение. В первом приближении теории возмущений энергия электростатического взаимодействия определяется выражением

.

Как правило, для практических расчетов межмолекулярных потенциалов требуются дальнейшие приближения. На больших расстояниях между взаимодействующими молекулами их электронные оболочки не перекрываются, и энергия электростатического взаимодействия с хорошей точностью может быть представлена в виде суммы нескольких первых членов разложения в ряд по степеням . С этой целью используется известное из электростатики мультипольное разложение потенциала в ряд Тейлора.

Если электронные оболочки взаимодействующих молекул перекрываются, то возникают силы дисперсионного и индукционного взаимодействия. Для описания данных сил необходим второй и более высокий порядок теории возмущений.

Энергию взаимодействия молекул во втором порядке теории возмущений можно представить в виде . Первое слагаемое данного выражения, энергия индукционного взаимодействия, соответствует электростатическому взаимодействию зарядов невозмущенной молекулы с электрическим полем, возникающим в результате деформации распределения заряда в другой молекуле. Второе слагаемое соответствует энергии дисперсионного взаимодействия. Дисперсионное взаимодействие не имеет классического аналога, как и индукционная энергия.

На малых расстояниях между взаимодействующими молекулами возникают обменные взаимодействия. Их проявление становится заметным на расстояниях менее , где - радиус Бора взаимодействующих атомов. На близких расстояниях, когда перекрывание электронных оболочек становится существенным, энергия отталкивания, обусловленная обменными взаимодействиями, вносит преобладающий вклад в общую энергию взаимодействующих молекул.

Энергию целесообразно рассчитывать одним из квантовохимических методов для системы ион - ближние к нему аминокислоты, энергию рассчитывать в приближении точечных зарядов на атомах дальних аминокислот по традиционной кулоновской схеме . Причем в качестве зарядов на атомах можно использовать параметры электростатических взаимодействий одного из силовых полей или точечные заряды на атомах, рассчитанные квантовохимически.

Наиболее простым в формальном отношении и одновременно дающим разумные результаты в некоторых случаях является метод Хоффмана или расширенный метод Хюккеля (EHT). Формально уравнения EHT представляются в виде:

, .

Матричные элементы заменяются эмпирическими параметрами или аппроксимируются специально подобранными соотношениями, включающими эти параметры. Так, диагональные матричные элементы полагаются равными потенциалам ионизации соответствующих валентных электронов, взятых с обратным знаком . Для вычисления недиагональных матричных элементов мы использовали параметризацию Вольфсберга-Гельмгольца

, где К= 1.75.

Метод EHT дает адекватные результаты для молекулярных систем, имеющих равномерное распределение заряда по всем атомам или, иначе говоря, для молекул, атомы которых не сильно отличаются по электроотрицательности (обычно принимают различие не более 1.4 по шкале Полинга). Канал KcsA, как и многие другие каналы, формируется атомами C, O, N, S и H, электроотрицательности которых составляют 2.5, 3.6, 3.0, 2.5 и 2.1 соответственно, для катионов Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺ и Cs⁺ - 1.5, 3.3, 2.6, 2.4 и 1.8, соответственно (Бацанов,2000). Таким образом, максимальное значение Дч для атомов канала KcsA составляет 1.5, причем только для не связанных ковалентными связями для Li⁺ и карбонильных кислородов, формирующих пору канала. Следовательно, применение квантовохимического метода Хоффмана для решения поставленных задач представляется вполне обоснованным.

Центральным вопросом расчетов по схеме является вопрос о расстоянии между ионом и атомами поры канала, на котором возможно данное разделение. Применительно к расчету энергии взаимодействия иона и молекулы канала, целесообразно провести такой расчет в приближении точечных зарядов на атомах отдельных аминокислот, а также квантовохимически в системе ион - соответствующая аминокислота. Вид и характер рассчитанных функций потенциальной энергии , где r - расстояние между ионом и аминокислотой, позволит определить координату точки их расхождения. Для определения координат точки разделения двух функций нами проведены квантовохимические и классические расчеты зависимости энергии взаимодействия от взаимного расстояния в системе ион-аминокислота. Подобные расчеты проведены для всех 20 аминокислот и 5 исследуемых ионов. Наши расчеты показывают, что в зависимости от выбора аминокислоты, координаты точки расхождения составляют 3.2-4.2Е. Таким образом, расстояние разделения взаимодействий должно быть не меньше 4.2Е. Для упрощения расчетов нами принято R=5Е.

Для расчета применяли параметры электростатических взаимодействий (заряды на атомах) силового поля AMBER. Данный выбор обусловлен тем, что результаты расчета методом AMBER хорошо сочетаются и согласуются с результатами квантовохимического расчета распределения потенциала в канале.

Профили свободной энергии Гиббса канала KcsA, рассчитанные методом EHT/AMBER, представлены на рис. 4.

Данные профили имеют качественно сходный вид для всех исследуемых ионов и соответствуют пятибарьерной модели канала. При этом наблюдается только количественное расхождение профилей. Величины энергетических барьеров ионов по абсолютной величине находятся в последовательности Li⁺>Na⁺>K⁺~>Rb⁺>Cs⁺. Учитывая, что последовательность энергетических барьеров ионов определяет последовательность ионных токов и рядов селективности, можно обоснованно прогнозировать согласие расчетных функциональных характеристик канала с экспериментальными.

Для проверки данного предположения нами проведен расчет функциональных характеристик канала по формулам (5) и (6), используя профиль, рассчитанный методом EHT/AMBER. Результаты расчета ВАХ канала в условиях симметричных монокатионных растворов (М) представлены на рис. 5.

Полученный результат показывает существование линейной зависимости между током и напряжением на участке 0-60 мВ, с величиной проводимости одиночного канала для K⁺ 26.34 пСм, для Na⁺ 1.72 пСм, для Li⁺ 0.24 пСм, для Rb⁺ 19.42 пСм, для Cs⁺ 0.03 пСм, что соответствует экспериментально получаемым значениям. Расчетные по формуле (7) значения отношений коэффициентов проницаемости для Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺ и Cs⁺ к коэффициенту проницаемости для K⁺ составляют 0.009, 0.065, 1.000, 0.737 и 0.001, соответственно, что хорошо согласуется с экспериментальными данными (<0.09, <0.07, 1.00, 0.25-0.91 и <0.18).

Во второй главе приведены результаты исследования функциональных характеристик потенциал-зависимых калиевых каналов по результатам анализа профилей свободной энергии, рассчитанных методом EHT/AMBER, решением уравнений теории абсолютных скоростей реакций Эйринга.

Движение ионов через биологические мембраны является одним из наиболее важных процессов, происходящих в живых клетках. Оно играет основополагающую роль в таких биофизических процессах, как преобразование энергии, поддержание постоянного химического состава внутренней среды, в регуляции метаболизма и биосинтеза, рецепции, сокращении мышц, генерации и распространении нервного импульса и др.

Центральной проблемой биофизики ионных каналов является установление связи между их структурой и функциями. Методами ядерного магнитного резонанса и рентгеноструктурного анализа установлены атомные структуры более ста макромолекул, которые можно отнести к классу мембранных каналов.

Исследование механизмов функционирования всего многообразия мембранных каналов является, несомненно, более сложной задачей, чем установление их структуры. Это связано с большими материальными затратами на экспериментальные исследования и огромными временными затратами для теоретических исследований.

К потенциал-зависимым калиевым каналам клетки относятся каналы, специфически активируемые деполяризацией клеточной мембраны и ассоциированные с мембранной реполяризацией. Калиевые каналы играют важную роль в процессах возбудимости и проводимости мембран. Практически все каналы суперсемейства потенциал-зависимых калиевых каналов являются аксиально-симметричными белковыми порами, что дает возможность использовать разработанный и апробированный на канале KcsA алгоритм расчета функциональных характеристик каналов.

Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP содержит стандартную K⁺-пору, окруженную сенсорами напряжения. Сенсоры напряжения могут менять конфигурацию за счет изменения разности потенциалов на концах мембраны и открывать пору. Они локализованы около внутриклеточной поверхности канала.

Исследовательской группой Р. Маккинона (2003) определена атомная структура калиевого канала и было высказано предположение о том, что KvAP в зависимости от направления мембранного потенциала, определяющего положение сенсора в пространстве, может находиться в двух конформациях: открытой - пропускающей ионы, и закрытой - не пропускающей ионы. При изменении разности потенциалов на концах мембраны подвижный сенсор напряжения занимает новое положение, что приводит к переходу канала из открытого состояния в закрытое, и наоборот. Модель Р. Маккинона объясняет переход канала из одного состояния в другое, но не дает ответа на вопрос о механизмах калиевой избирательности открытого и отсутствия таковой для закрытого канала KvAP.

Нами проведено теоретическое исследование функциональных характеристик открытого и закрытого канала KvAP. Результаты расчета профилей свободной энергии для ионов Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺ в поре открытого и закрытого канала представлены на рис. 7 и 8, соответственно. Профили в области селективного фильтра и центральной полости открытого и закрытого аналогичны профилям энергии в соответствующих областях потенциал-независимого калиевого канала KcsA, что является следствием гомологичности каналов KvAP и KcsA. Существенное отличие каналов KvAP и KcsA наблюдается только в области нижней поры, что обусловлено наличием дополнительных сенсоров напряжения в канале KvAP. В данной области открытого и закрытого канала KvAP появляются энергетические барьеры для всех видов ионов. Причем в закрытом канале значения энергетических барьеров больше, чем в открытом и в закрытом канале KvAP, а величина диаметра закрытого канала в области нижней поры меньше, чем открытого. Это различие приводит к увеличению стерических ограничений для ион-водного комплекса и, как следствие, к увеличению значения энергии данного комплекса в закрытом канале.

Таким образом, появление больших, по сравнению с открытым каналом, энергетических барьеров в области нижней поры закрытого канала KvAP может быть причиной наблюдаемого отсутствия ионной проводимости канала.

Для количественного обоснования данного утверждения нами проведен анализ полученных профилей решением уравнений (5) и (6). Результаты расчета ВАХ для открытого и закрытого одиночного канала KvAP в условиях симметричных монокатионных растворов (М) представлены на рис. 9 и 10, соответственно. Данные связи показывают существование линейной зависимости между током и напряжением на участке 0-60 мВ с величиной проводимости одиночного открытого канала для K⁺ 12.93 пСм, для Na⁺ 0.32 пСм, для Li⁺ 0.13 пСм, для Rb⁺ 9.6 пСм, для Cs⁺ 0.083 пСм, что соответствует экспериментально получаемым значениям. Проводимости закрытого канала для K⁺, Na⁺, Li⁺, Rb⁺ и Cs⁺ принимают значения 0.10 пСм, 0.007 пСм, 0.002 пСм, 0.066 пСм и 0.001 пСм, соответственно.

Таким образом, появление значительного энергетического барьера в канале KvAP при переходе его из открытого состояния в закрытое при изменении разности потенциалов на концах мембраны является причиной появления малых ионных токов, характерных для закрытого ионного канала.

Расчетные значения отношений коэффициентов проницаемости для Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺ и Cs⁺ к коэффициенту проницаемости для K⁺ составляют 0.010, 0.024, 1.000, 0.701 и 0.006, соответственно, что хорошо согласуется с экспериментальными данными.

Размещено на http://www.allbest.ru

Потенциал-зависимые калиевые каналы обычно экспрессируются вместе с дополнительными в-субъединицами. В работах группы Р. Маккинона была определена с разрешением 2.8Е структура в-субъединицы калиевого канала. При этом структура б-субъединицы канала определена не была.

При построении структуры потенциал-зависимого калиевого канала в виде комплекса б- и в-субъединиц (б/в-канал) мы исходили из совпадения осей аксиальной симметрии б- и в-субъединицы. При этом б-субъединица стыкуется с вогнутой поверхностью в-субъединицы (Рис. 11). В качестве б-субъединицы мы использовали аксиально-симметричный тетрамер потенциал-независимого калиевого канала KcsA, как каноническую пороформирующую субъединицу трансмембранных калиевых каналов клетки.

Результаты расчета профилей открытого канала для ионов Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺, Cs⁺ представлены на рис. 12. Для наглядности профили свободной энергии потенциал-зависимого калиевого б/в-канала представлены для трех последовательных интервалов изменения координаты оси Z: области селективного фильтра и центральной полости б-субъединицы (рис. 12А), области нижней поры б-субъединицы и поры в-субъединицы (рис. 12Б).

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Анализ энергетического профиля показывает, что основными факторами, влияющими на характер транспорта иона через канал, являются: частичная дегидратация иона при входе в пору канала и взаимодействие иона с атомными группами канала. Повышение энергии иона в результате дегидратации оказывается наибольшим у иона Li⁺ и наименьшим у иона K⁺, что обусловлено наибольшими размерами последнего, а значит, меньшими (по модулю) величинами его взаимодействия с молекулами воды в первой гидратной оболочке.

Результаты расчета ВАХ для б/в-канала в условиях симметричных монокатионных растворов (М) представлены на рис. 13. Данная связь показывает существование линейной зависимости между током и напряжением на участке 0-60 мВ с величиной проводимости одиночного канала для K⁺ 17.16 пСм, для Na⁺ 0.68 пСм, для Li⁺ 0.26 пСм, для Rb⁺ 16.63 пСм, для Cs⁺ 0.08 пСм, что соответствует экспериментально получаемым значениям. Проводимость б/в-канала для ионов калия несколько меньше, чем проводимость канала KcsA для соответствующих ионов, что является следствием наличия дополнительной в-субъединицы в б/в-канале. Для ионов лития и натрия наблюдается незначительное расхождение в значениях проводимости каналов б/в и KcsA. Расчетные значения отношений коэффициентов проницаемости для Li⁺, Na⁺, K⁺, Rb⁺ и Cs⁺ к коэффициенту проницаемости для K⁺ составляют 0.079, 0.015, 1.000, 0.905 и 0.005, соответственно, что хорошо согласуется с экспериментальными данными.

Размещено на http://www.allbest.ru

Таким образом, модельная молекулярная структура в виде комплекса б- и в-субъединиц может служить адекватной моделью потенциал-зависимого калиевого б/в-канала в открытом состоянии.

Для построения модели потенциал-зависимого калиевого б/в-канала в закрытом состоянии мы исходили из следующих предположений (рис. 11):

1) потенциал-зависимый калиевый б/в-канал представляет собой потенциал-зависимый фермент с активными участками в в-субъединице, локализованными на расстоянии 30-35 Е от оси канала и содержащие NADP⁺-кофакторы;

2) при связывании фермента с молекулой субстрата происходят конформационные изменения в в-субъединице, что в свою очередь приводит к конформационным изменениям в б-субъединице.

Размещено на http://www.allbest.ru

Изменение конформации канала за счет связывания с молекулой субстрата может быть причиной формирования закрытого для ионов б/в-канала. При этом возможны два не исключающих друг друга случая: «разбухание» молекулы канала и поворот отдельных полярных субъединиц в составе в-субъединицы при изменении разности потенциалов на концах мембраны, что приводит к изменению положения отдельных субъединиц б-субъединицы. Учитывая, что экспериментальные данные по структуре субстрата отсутствуют, нами проведено исследование зависимости ионной проводимости от диаметра б/в-канала. Мы исследовали зависимость , где - отношение диаметра открытого канала к диаметру конформационно модифицированного канала с шагом 0.1Е.

Для расчета ионных токов, отношений коэффициентов проницаемости и проводимости канала мы использовали подход, который применяли для исследования открытого б/в-канала. При этом предполагали, что вследствие малости молекулы субстрата, его поле дает пренебрежимо малый вклад в энергетические профили.

В результате проведенных расчетов установлено, что при , т.е. уменьшении диаметра почти в 2 раза, наблюдается достаточно малое значение тока ионов калия через канал: пА. В табл. 1 представлены значения ионных токов при различных значениях .

...