Біотехнологія одержання і застосування екзогенної іммобілізованої глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

29

Міністерство агропромислового комплексу України

Білоцерківський державний аграрний університет

Злочевський Михайло Володимирович

УДК 636.2.035/.087.7]:573.6

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

Біла Церква - 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Науково-дослідному інституті екології і біотехнології у тваринництві Білоцерківського державного аграрного університету та Інституті розведення і генетики тварин УААН

Науковий керівник: - доктор біологічних наук, професор,

член-кореспондент УААН, заслужений діяч науки і техніки України Герасименко Віктор Григорович, Білоцерківський державний аграрний університет, проректор з навчальної роботи

Офіційні опоненти: - доктор ветеринарних наук, професор Нікітенко Анатолій Мефодійович, Білоцерківський державний аграрний університет, завідувач кафедри зоогігієни та основ ветеринарії

- доктор сільськогосподарських наук, професор Мазуренко Микола Олександрович, Вінницький державний сільскогосподарський інститут, завідувач кафедри технології виробництва продуктів тваринництва

Провідна установа: Державний науково-дослідний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок,

м. Львів

Захист дисертації відбудеться “27” квітня 1999 року о 14-00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д27.821.01 в Білоцерківському державному аграрному університеті за адресою: 256400, м.Біла Церква, Соборна площа 8/1, в ауд. 11.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Білоцерківського державного аграрного університету.

Автореферат розісланий “ 26 ” березня 1999 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Розпутній О.І.

Актуальність теми. У комплексі заходів по виробництву конкурен то спроможної продукції тваринництва важливою ланкою є підвищення ефективності використання поживних речовин кормів. У практиці годівлі з цією метою використовують мінеральні речовини, ферментні пре парати та інші біологічно активні сполуки, які інтенси фі кують процеси роз щеп лення поживних речовин раціону у шлунково-кишковому тракті, підвищують їх перетравність та засвоєння продуктів гідролізу і сприяють підвищенню продуктивності тварин (Богданов Г.О., 1981; Герасименко В.Г., 1981; Грабовенський І.І., Калачнюк Г.І., 1984; Бабійчук М.Г., Юрченко Х.Ф., Колодій Т.І. і ін., 1987; Мазуренко М.О., 1987; Мельник І.І., Нікітенко А.М., 1988; Чумаченко В.Ю. та ін., 1989; Кравців Р.І., 1992; Засуха Т.В., Кулик М.Ф., 1993, 1997). Однак досвід використання ферментних пре паратів у тварин ництві свідчить про великі розбіжності щодо їх ефектив ності. Пояс ню єть ся це значною мірою тим, що у шлунково-кишковому тракті екзо генні ферменти зазнають руйнування через невідповідність рН вмістимого оптимуму дії ферментів, а також через вплив інгібіторів та протеаз.

Для підвищення стійкості ферментів до впливу різних факторів використовують метод їхньої іммобілізації, тобто зв'язування ферментів з водонерозчинним носієм. Іммобілізація дозволяє цілеспрямовано змінювати властивості ферментів, у тому числі їх специфічність, залежність активності від рН середовища і, що особливо важливо, його стабільність щодо різних денатуруючих впливів середовища (Березін І.В. та ін., 1987, 1988, 1990; Тривен М., 1984; Дж. Вудворд, 1988).

Шляхом іммобілізації і модифікації одержано нові форми препаратів біологічно активних речовин з пролонгованою дією, але майже всі вони використовуються для потреб виробництва біотехнологічної продукції. Лише незначна кількість досліджень спрямована на створення пролонгованих форм екзогенних ферментів, адаптованих до потреб тваринництва (Герасименко В.Г. та ін. 1991; Зубець М.В., Герасименко В.Г. та ін., 1998).

З огляду на вищесказане, перспективним напрямом досліджень є розробка способів підвищення стабільності екзогенних ферментних препаратів, які використовуються у тваринництві, та наукових основ застосування їхніх іммобілізованих форм у годівлі тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом наукових досліджень теми 082 “Досліди ти динаміку важких металів в ланках харчового ланцюга, впрова дити ре комендації по одержанню екологічно чистої продукції, а також вивчити хі міко-біологічні основи і розробити методи конструювання пре паратів біологічно активних речовин”, № держреєстрації 0193U042483, що вико нується за замовленням Управління координації, освоєння НТП та зв'язків з УААН Міністерства агропромислового комплексу України Науково-дос лідним інститутом екології і біотехнології у тваринництві Білоцерківського державного аграрного університету та розділом теми 03.09 “Розробити ефективну систему відтворення, інтенсивного вирощування та підготовки до лактації високопродуктивних корів”, яка виконувалась в Інституті розведення і генетики тварин УААН впродовж 1993-1995 років.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є розробка способу підвищення стабільності екзогенного ферментного препарату глюкоамілази Г20х, яка використовується у тваринництві для підвищення продуктивності, шляхом її іммобілізації на мінеральних носіях - цеоліті та аеросилі, а також вивчення ефективності застосування одержаного біоката лізатора пролонгованої дії у годівлі молодняку великої рогатої худоби.

Для досягнення цієї мети були визначені такі завдання:

висвітлити теоретичні принципи одержання біокаталізаторів пролонгованої дії шляхом іммобілізації і модифікації біологічно активних речовин;

виявити вплив різних факторів (природи носія, рН і іонної сили розчину, концентрації ферменту, складу рідкої фази) на процес іммобілізації;

визначити оптимальні параметри іммобілізації глюкоамілази Г20х на різних носіях (цеоліті, аеросилі);

вивчити стійкість іммобілізованого на цих носіях ферменту in vitro при різних значеннях рН середовища, порівняно з його нативною формою;

зробити порівняльну характеристику властивостей нативного та іммобілізованого на різних носіях ферменту в умовах in vitro;

дослідити інтенсивність і спрямованість біосинтетичних процесів у організмі телят під впливом іммобілізованої глюкоамілази;

вивчити вплив одержаного модифікованого препарату амілолітичної дії на продуктивність молодняку великої рогатої худоби;

на основі одержаних результатів зробити висновки і дати пропозиції виробництву.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше шляхом іммобілізації глюкоамілази Г20х на носії аеросилі одержано модифікований екзогенний ферментний препарат пролонгованої дії та визначено оптимальні умови для адсорбції ферменту на матриці.

Проведено вдосконалення технології іммобілізації глюкоамілази Г20х на носії цеоліті шляхом заміни в рідкій фазі ацетатного буферного розчину з рН 5,0 на дистильовану воду, що підвищує технологічність і здешевлює процес одержання біокаталізатора без суттєвого зниження його стабільності і каталітичної активності.

Доведено, що іммобілізована форма ферменту зберігає досить високу ферментативну активність і є більш стійкою до денатуруючого впливу рН середовища. Це забезпечує гідролітичну здатність біокаталізатора на протязі усього шлунково-кишкового тракту тварин.

Вперше проведено вивчення ефективності використання іммобілізованої глюкоамілази на молодняку великої рогатої худоби. Виявлено, що застосування модифікованого ферменту сприяє інтенсифікації обмінних процесів в організмі тварин і підвищує їхню продуктивність.

Практичне значення одержаних результатів. Проведеними дослід женнями доведена можливість і доцільність використання біотехнологічних прийомів у вирішенні практичних завдань тваринництва.

Розроблено простий, доступний і дешевий спосіб модифікації екзогенного ферментного препарату амілолітичного спектру дії, який застосовується у тваринництві.

Заміна ацетатного буферного розчину з рН 5,0 на дистильовану воду у рідкій фазі при проведенні іммобілізації покращує технологічність і здешевлює процес одержання біокаталізатора.

Оцінка продуктивної дії одержаного препарату в науково-господарських дослідах дозволила рекомендувати модифіковану глюкоамілазу Г20х як ефективну домішку до раціонів молодняку великої рогатої худоби з метою підвищення продуктивності тварин.

На основі одержаних результатів розроблено рекомендації щодо одержання та використання екзогенної глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби та методичні вказівки для проведення лабораторно-практичних занять з біотехнології іммобілізації ферментів для студентів зооінженерного факультету і факультету ветеринарної медицини.

Особистий внесок здобувача. Участь здобувача в отриманні наукових результатів, які покладено в основу дисертації, становить 80%. Автором особисто виконані експериментальні дослідження in vitro по одержанню біокаталізатора пролонгованої дії з використанням екзоген ного ферментного препарату глюкоамілази Г20х, а також здійснено орга нізацію і проведення науково-господарських дослідів на молодняку великої рогатої худоби, біохімічні дослідження крові, статистичну обробку та аналіз одержаних результатів, обгрунтування і висновки. Наукова гіпотеза про підвищення стабільності екзогенних ферментних препаратів шляхом їх іммобілізації і можливість використання отриманих біокаталізаторів при інтенсивному вирощуванні молодняку великої рогатої худоби з метою повнішої реалізації генетичного потенціалу порід належить науковому керівнику член-кор. УААН Герасименку В.Г.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на засіданнях вченої ради зооінженерного факультету і факультету ветеринарної медицини Білоцерківського державного аграрного університету (1992-1997) та Інституту розведення і генетики тварин УААН (1993-1995), секції ветеринарної медицини Науково-технічної ради Мінагропрому України (1994-1997), республіканській науково-практичній конференції “Проблеми підвищення продуктивності тварин та ефективності їх лікування” (м. Дніпропетровськ, 1994), науково-практичній конференції “Вчені державного сільськогосподарського інституту - виробництву” (м. Біла Церква, 1994), Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (м. Львів, 1994), а також на спільному розширеному засіданні кафедр годівлі сільськогосподарських тварин і біотехнології, анатомії і гістології, зоогі гієни та основ ветеринарії, мікробіології і вірусології, фізіології і патфізіо логії, органічної і біологічної хімії, хірургії, розведення і генетики тварин Білоцерківського державного аграрного університету 3 червня 1998 року.

Одержані результати використовуються у навчальному процесі при вивченні біотехнології на зооінженерному і факультеті ветеринарної медицини Білоцерківського державного аграрного університету.

Публікації. Основні положення і результати досліджень опубліковані у п'яти друкованих працях у вигляді наукових статей та рекомендаціях виробництву.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, експериментальної частини з результатами роботи, аналізу і узагальнення результатів дос ліджень, висновків та пропозицій виробництву, списку використаної літе ратури. Текст викладений на 125 сторінках машинопису, містить 14 таб лиць, 5 рисунків. Список літератури включає 312 джерел, у тому числі 71 - іноземних авторів.

Матеріали і методи досліджень

Робота виконувалась упродовж 1990-1998 рр. у проблемній науково-дослідній еколого-біотехнологічній лабораторії Білоцерківського державного аграрного університету і у лабораторії систем ведення тваринництва в Київській області Інституту розведення і генетики тварин УААН, а також у племзаводі “Терезине”.

З теми дисертації проведено модельні експерименти і три науково-господарські досліди на молодняку великої рогатої худоби.

Для іммобілізації використовували глюкоамілазу Г20х з активністю 1000 од/ г, що виробляється у промисловому масштабі на Україні Ладижинським заводом “Ензим”. Як носії використовували цеоліт тонкого подрібнення сортів А Сокирницького родовища Закарпатської області та аеросил (пірогенний кремнезем).

Іммобілізацію глюкоамілази проводили методом адсорбції на цеоліті і аеросилі у ацетатному буфері з рН 5,0 та дистильованій воді при постійному перемішуванні упродовж 2 год. з послідучим відмиванням неадсорбованого ферменту шляхом центрифугування.

У науково-господарських дослідах в умовах виробництва іммобілізували глюкоамілазу на цеоліті, суспензованому у водному розчині ферменту із розрахунку на групу тварин, шляхом періодичного перемішування упродовж 4 год.

У модельних дослідах in vitro визначали оптимальні параметри іммобілізації глюкоамілази на цеоліті та аеросилі, а також вплив денатуруючих факторів на іммобілізований фермент. Оптимальне співвідношення фермент: носій: рідина встановлювали експериментально шляхом підбору різних концентрацій компонентів, при яких зберігалась найвища активність ферменту.

Залежність каталітичної активності глюкоамілази від рН середовища визначали після інкубації наважки ферменту упродовж 20 хв. при 37⁰ у солянокислому розчині, ацетатному та фосфатному буферах у діапазоні рН 1,5 - 8,0. Величину рН використовуваних розчинів вимірювали на потенціометрі рН - 340.

Каталітичну активність глюкоамілази вивчали за її амілолітичною активністю, яку визначали за кількістю розщепленого крохмалю згідно ГОСТу 20264.- 4-89.

Властивості іммобілізованого ферменту оцінювали шляхом порівняння його активності з активністю нативної глюкоамілази.

У науково-господарських дослідах вивчали вплив іммобілізованої глюкоамілази на біохімічні показники та продуктивність молодняку великої рогатої худоби.

Для проведення науково-господарських дослідів були підібрані за принципом зоотехнічних аналогів телята чорно-рябої породи у віці 2-3-х місяців на початок експерименту з урахуванням віку, статі, живої маси та енергії росту. Досліди проводились методом збалансованих груп - аналогів з додержанням усіх методичних вимог постановки зоотехнічних експериментів (Овсянніков А.І., 1976) згідно схем (таблиця 1).

Кожному досліду передував підготовчий період тривалістю 20-30 днів, під час якого перевірялась однорідність підібраних тварин. Тривалість основного періоду складала відповідно для І досліду - 88 днів, ІІ - 102 і ІІІ - 93 дні.

Годівлю тварин здійснювали згідно норм ВАСГНІЛ (1985). При балансуванні раціонів за вмістом мікроелементів, використовувались дані власних досліджень кормів господарства.

Домішки нативної та іммобілізованої глюкоамілази, солей мікроелементів, яких не вистачало до норми, попередньо розчинені у воді, а цеоліт у сипучому вигляді вводили одноразово у концентровані корми при їх перемішуванні безпосередньо перед згодовуванням. Глюкоамілазу додавали в дозах, рекомендованих заводом-виробником із врахуванням її фактичної активності. Каталітичні активності нативного та іммобілізованого ферменту при додаванні їх до раціону були однаковими.

Таблиця 1 - Схема дослідів

У основний період дослідів визначали динаміку живої маси тварин шляхом їх індивідуального зважування один раз на місяць.

З метою визначення спрямованості метаболічних процесів у організмі телят під дією домішок у кінці другого і третього дослідів було взято кров від шести голів з кожної групи і визначено деякі біохімічні показники.

Сироватку крові одержували центрифугуванням при 2000 об/ хв., а цільну кров стабілізували гепарином.

У сироватці крові визначали вміст загального білка за Lowry O.H. et al. (1951), активність амінотрансфераз за Пасхіною Т.С. (Покровський О.О., 1969), лужної фосфатази - методом Bodansky A. (Покровський О.О., 1969), каталази - методом Баха і Зубкової (Збарський Б.І. та ін., 1954).

У цільній крові знаходили концентрацію нуклеїнових кислот (ДНК і РНК) - за Цаневим Р.Г. та Марковим Г.Г. у модифікації Климова Н.М., Коромислова Г.Ф. (1970).

У крові, волосяному покриві і кормах досліджували вміст макро- та мікроелементів методом атомно-адсорбційної спектрофотометрії на спектрофотометрі С-302. Зразки попередньо висушували, потім озолювали у муфельній печі, поступово доводячи температуру до 450⁰ С (Хавезов І., Цалев Д., 1983).

Одержаний цифровий матеріал піддавали біометричній обробці методом Монцевічюте-Ерингене В.М. (1964).

Результати досліджень

Вивчення параметрів іммобілізації глюкоамілази Г20х

У модельних дослідах in vitro визначені оптимальні умови іммобі лі за ції екзогенного ферментного препарату амілолітичного спектру дії -глюкоамілази Г20х. Обрані для цієї мети носії цеоліт і аеросил відповідають усім вимогам, які висуваються до цієї групи речовин, та що особливо важливо, вже знайшли застосування у годівлі сільськогосподарських тварин і виготовленні лікарських засобів.

При проведенні іммобілізації глюкоамілази на цеоліті було встановлено оптимальну кількість ферменту, здатного адсорбуватись на поверхні носія - 2 мг/мл розчину. При зменшенні концентрації спостерігали зниження активності іммобілізованої глюкоамілази; збільшення кількості ферменту призводить до того, що значна його кількість залишається у розчині і не використовується за призначенням.

Найвищу ємкість носія (цеоліту) було досягнуто, коли співвідношення фермент : носій (цеоліт) : рідка фаза складало відповідно 20 мг : 1 г : 10 мл при перемішуванні упродовж 2 годин.

Герасименком В.Г. і Бітюцьким В.С. (1991) було встановлено, що оптимальним для проведення іммобілізації глюкоамілази Г20х на цеоліті є ацетатний буфер з рН 5,0. З метою спрощення і здешевлення технології одержання іммобілізованого препарату нами було проведено порівняльне вивчення ефективності процесу іммобілізації на ацетатному буфері з рН 5,0 і дистильованій воді.

Дослідами доведено збереження високої каталітичної активності ферменту при іммобілізації його у воді (64%); при застосуванні буферного розчину вихід каталітичної активності досягає 65,9%.

Нами в модельних дослідах також вивчалась можливість використання для іммобілізації глюкоамілизи аеросилу. Іммобілізацію проводили адсорбційним методом за схемою, яку було використано в експериментах з цеолітом.

Установлено, що оптимальною є концентрація ферменту 1 мг / мл роз чину, яка при співвідношенні фермент : носій : розчин відповідно 10 мг : 0,5 г : 10 мл забезпечує найвищий вихід ферментативної активності у дистильованій воді і ацетатному буфері з рН 5,0 відповідно 67,7 та 68,2% у порівнянні з активністю нативної глюкоамілази. Істотної різниці у каталітичній активності іммобілізованого препарату при заміні буферного розчину на дистильовану воду не виявлено (68,2 проти 67,7%).

Час контакту ферменту з носієм при перемішуванні становить 2 години.

Вивчення стабільності іммобілізованої глюкоамілази in vitro

Експериментально підтверджено, що головною перевагою іммобілізованих ферментів над нативними формами є їх висока технологічність, яка проявляється більш високою стабільністю до денатуруючих чинників. При одержанні модифікованих ферментів, адаптованих до потреб тваринництва, важливим денатуруючим фактором є рН вмістимого шлунково-кишкового тракту.