Біотехнологія одержання і застосування екзогенної іммобілізованої глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби

У модельних дослідах вивчали стійкість іммобілізованої і нативної глюкоамілази до дії реакції середовища в діапазоні рН від 1,5 до 8,0.

Установлено, що глюкоамілаза, яка іммобілізована на цеоліті в ацетатному бу фері з рН 5,0 і дистильованій воді, зберігає свою каталітичну активність при значеннях рН, критичних для нативної форми - у сильно кислому (рН 1,5) і лужному (рН 8,0) середовищах активність знаходиться відповідно на рівні 45 і 40% та 41,1 і 30%. Нативний фермент при такій реакції середовища повністю інактивується (рис. 1).

Аналогічні результати було одержано і при випробуванні стабільності глюкоамілази, іммобілізованої на аеросилі у буферному розчині з рН 5,0 і дистильованій воді (рис. 2). Іммобілізований фермент зберігає каталітичну активність відповідно на рівні 43,9 і 27,8% та 22,0 і 6,7%, тоді як нативна глюкоамілаза у цих умовах повністю втрачає свою активність.

Порівняння показників стабільності іммобілізованої глюкоамілази свідчить про те, що цеоліт в якості матриці має певну перевагу над аеросилом як при використанні ацетатного буферу, так і дистильованої води у сильно кислому (рН 1,5 - 2,0) та лужному (рН 8,0) середовищах, тоді як аеросил у діапазоні рН 3,6 - 6,0 (рис. 3, 4).

Ці властивості одержаних біокаталізаторів на основі екзогенного ферментного препарату глюкоамілази мають значення при вирішенні питання їх подальшого застосування. Взагалі, використання цеоліту у якості носія дає можливість створити більш універсальний препарат, який зберігає каталітичну активність у широкому діапазоні рН.

Отже, до вибору носія слід підходити диференційовано з урахуванням цільового використання препарату. З огляду на те, що метою наших подальших досліджень було одержання біокаталізатора для його використання у годівлі молодняку великої рогатої худоби, вибір зупинили на цеоліті.

Стан метаболізму в організмі телят при застосуванні іммобілізованої глюкоамілази

Оцінку реакції організму на введення в раціон домішок іммобілізованої глюкоамілази та компонентів, які були вихідними для її одержання (нативний фермент і цеоліт), проводили на організмовому і на тканинному рівнях за показниками продуктивності та біохімічними параметрами, які визначились у крові телят. Досліджували інтенсивність і спрямованість біосинтетичних процесів шляхом визначення окремих показників білкового обміну та активності ферментів (аланін та аспартатамінотрансфераз), вмісту нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), активності оксидоредуктаз і лужної фосфатази та концентрації мікроелементів у крові та волосяному покриві.

У експериментах не встановлено впливу домішок на вміст загального білка, концентрація якого у дослідних і контрольних групах була практично однаковою (табл. 2).

Рівень ДНК (табл. 2) у крові дослідних тварин значною мірою залежить від складу раціонів, на фоні яких використовувались домішки. На зимових раціонах (ІІ дослід) вміст ДНК у крові дослідних тварин був на рівні контрольних, тоді як на літніх раціонах (ІІІ дослід) спостерігалось збільшення концентрації ДНК на 13,3 - 29,5% в усіх дослідних групах (ІІ, ІІІ, ІV), але вірогідним було підвищення вмісту ДНК тільки у групах з домішками іммобілізованої і нативної глюкоамілази.

Вміст РНК (табл. 2) був вірогідно збільшеним в усіх дослідних групах у обох експериментах, за виключенням групи, тварини якої одержували цеоліт. У телят, яким згодовували іммобілізовану глюкоамілазу, кількість РНК у крові як у другому, так і в третьому дослідах була відповідно на 44,3 і 13,4% вища, ніж в контролі і на 4,1% більша, ніж в групі з домішками нативної глюкоамілази.

Таблиця 2 - Вміст білка і нуклеїнових кислот у крові телят, М?m

Примітка: * - різниця вірогідна

Зміни, які спостерігались в концентрації нуклеїнових кислот у крові, свідчать, що під впливом екзогенної глюкоамілази відбувається активація синтезу нуклеїнових кислот у організмі телят, причому найбільш істотна дія характерна для іммобілізованої її форми.

Одним із найбільш інформативних показників білкового обміну є активність аспартат- і аланінамінотрансфераз, які каталізують перенесення аміногруп. Процес трансамінування відбувається на першій стадії катаболізму амінокислот і швидкість накопичення білка в організмі у багатьох випадках визначається активністю даних ферментів. У наших дослідах (табл. 3) вірогідне підвищення активності аспартатамінотрансферази на 32,5% і 28,6% було тільки у крові телят, які одержували домішки іммобілізованого ферменту як до зимових, так і літніх раціонів. При введенні у раціони нативної глюкоамілази та цеоліту активність аспартатамінотрансферази була практично на рівні контролю. Активність аланінамінотрансферази у дослідних групах у обох дослідах була нижча порівняно з контролем на 8,2 - 15,8%, але різниця виявилась не вірогідною. Відмінності в активності ферменту між дослідними групами незначні і рівень абсолютних показників практично однаковий.

Такий стан активності ферментів трансамінування, на нашу думку, є доказом активації біосинтетичних процесів у організмі телят під впливом іммобілізованої глюкоамілази.

До аналогічного висновку за показниками активності амінотрансфераз дійшли Прозора К.І., Матківський Р.І., Величко В.А., Кравців Р.І. (1984) при збагаченні раціонів бичків мікроелементами і вітамінами.

Установлено зниження на різну величину активності лужної фосфатази у телят практично усіх дослідних груп як в другому, так і третьому дослідах, за винятком тварин, які одержували цеоліт (ІV гр.). У них показники активності ферменту були на рівні контролю (табл. 3). Це є свідченням нормального протікання у молодняку великої рогатої худоби процесів мінералізації кісткової тканини при згодовуванні іммобілізованої глюкоамілази.

Вважається, що вміст лужної фосфатази має діагностичне значення і підвищення її активності у крові спостерігається при кісткових захворюваннях та напруженому стані фосфорно-кальцієвого обміну (Фердман Д.Л., 1956; Васильева Е.А.., 1966).

Відомо, що одним із основних показників рівня окислювально-відновних реакцій в організмі є активність каталази. Вірогідне збільшення активності каталази спостерігали у крові телят усіх дослідних груп, причому рівень каталітичної активності ферменту значною мірою залежить як від добавки, що використовується, так і від складу раціонів (табл. 3). Домішки іммобілізованої глюкоамілази до зимових раціонів сприяють підвищенню активності каталази на 21,2%, а до літніх - на 57% (максимальний рівень).

У групах тварин, яким згодовували домішки нативної глюкоамілази (ІІІ гр.) і цеоліту (ІV гр.), збільшення активності становило 47,1 і 53,8% відповідно. Це свідчить про активацію окислювальних процесів у організмі молодняку великої рогатої худоби при введенні до їх раціонів домішок іммобілізованої і нативної глюкоамілази та цеоліту.

У дослідах визначався вплив домішок модифікованого ферментного препарату і його вихідних компонентів на метаболізм мінеральних речовин у організмі тварин. Не встановлено істотного впливу на концентрацію магнію, заліза, цинку і міді домішок різних форм глюкоамілази і цеоліту як на фоні зимових, так і літніх раціонів, за винятком вірогідних зниження вмісту цинку на 11% і підвищення кількості міді на 23% у крові телят, які одержували цеоліт.

Таблиця 3 - Активність ферментів у крові телят, М?m

Примітка: * - різниця вірогідна

Про те, що цеоліт знижує засвоєння у організмі овець цинку, вказується у роботах Макара І.А. і ін. (1985). Але відсутність вірогідного зниження цинку у крові телят, яким згодовували іммобілізовану глюкоамілазу, є свідченням того, що використання цеоліту як носія для іммобілізації не порушує баланс цього елементу.

Підтвердженням коректності висновку є дослідження волосяного покриву телят (табл. 4). Вміст цинку у ньому був практично однаковим у контрольних тварин і телят, яким вводили модифікований фермент до зимових раціонів, тоді як на фоні літніх раціонів спостерігається вірогідне збільшення цинку на 32%. Аналогічна закономірність відмічається і щодо вмісту міді у волосяному покриві. Ці дані є свідченням того, що використання стабілізованої форми глюкоамілази у складі літніх раціонів позитивно впливає на забезпеченість організму телят міддю і цинком.

Таблиця 4 - Вміст мікроелементів у волосяному покриві телят,

мг/кг сухої речовини, М?m

Примітка: * різниця вірогідна

Вплив іммобілізованої глюкоамілази на продуктивність телят

Інтегральним тестовим параметром впливу різних факторів на організм тварин є показники продуктивності. У трьох науково-господарських дослідах, які були проведені відповідно у літньо-осінній, зимовий і літній періоди, вивчали ефективність одержаного біотехнологічним шляхом модифікованого ферменту глюкоамілази, а також компонентів, які були вихідними при конструюванні цього біокаталізатора (нативної глюкоамілази і цеоліту) у годівлі молодняку великої рогатої худоби.

Аналіз одержаних результатів свідчить про позитивний вплив домішок на продуктивність телят (табл. 5). Найбільш високі середньодобові прирости живої маси було одержано в усіх трьох дослідах у телят, яким згодовували іммобілізований фермент. Причому, найбільш ефективною була домішка у складі літніх раціонів, яка сприяла вірогідному підвищенню приростів живої маси на 22,1%; у літньо-осінній період продуктивність збільшилась на 12,8%, а на зимових раціонах - на 10%. При введенні у раціони нативної глюкоамілази підвищення приростів було значно меншим і складало відповідно 5,4 і 8,9%. Найменш ефективними виявились домішки цеоліту, включення якого до літніх раціонів сприяло підвищенню продуктивності телят на 5,8%, що виявилось невірогідним.

Одержані результати щодо активності амінотрансфераз, концентрації РНК у крові та продуктивності свідчать, що в організмі телят під впливом одержаного нами модифікованого амілолітичного ферментного препарату сповільнюються процеси глюконеогенезу та активуються біосинтез рибонуклеїнових кислот і білка, внаслідок чого продуктивність тварин збільшується.

Таблиця 5 - Показники продуктивності телят, М?m

Примітка: * різниця вірогідна

Економічна оцінка ефективності використання іммобілізованої глюкоамілази

Економічну ефективність визначали за вартістю додаткової продукції та за витратами на придбання ферменту. Результати аналізу свідчать, що за період проведення І, ІІ та ІІІ дослідів було одержано додаткової продукції у розрахунку на одну голову відповідно на суму 8,4; 5,8 та 12,4 грн. при витратах ферменту на 1 коп.

Додатковий прибуток за рік на 100 умовних голів складатиме у залежності від раціону годівлі 2070- 4870 грн.

Для підвищення ефективності використання екзогенної глюкоамілази Г20х вітчизняного виробництва та збільшення продуктивності молодняку великої рогатої худоби при вирощуванні рекомендується додавати до раціонів зазначений іммобілізований ферментний препарат у дозі: телятам живою масою до 150 кг - 5 од/гол/добу, а від 150 кг і вище - 9 од/гол/добу, що буде становити відповідно 398 та 717 мг препарату на 1 гол/добу.

Розроблену технологію іммобілізації екзогенної глюкоамілази включити до розділу “Інженерна ензимологія” робочої програми проведення лабораторно-практичних занять з біотехнології на зооінженерному факультеті та факультеті ветеринарної медицини закладів освіти України ІІІ - ІV рівнів акредитації.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ПО ТЕМІ ДИСЕРТАЦІЇ

Злочевський М.В. Біотехнологія одержання і застосування екзогенної іммобілізованої глюкоамілази у годівлі молодняку великої рогатої худоби. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20. - біотехнологія. Державний аграрний університет, Біла Церква, 1999.

Розроблено спосіб одержання стабілізованої форми ферментного препарату амілолітичного спектру дії глюкоамілази Г20х шляхом іммобілізації на носії аеросилі, а також модифіковано метод іммобілізації цього ферменту на цеоліті шляхом заміни у рідкій фазі ацетатного буферу з рН 5,0 на дистильовану воду, що покращує технологічність і здешевлює процес одержання препарату.

Іммобілізована глюкоамілаза стійка у діапазоні рН 1,5 - 8,0 і зберігає каталітичну активність як у сильно кислому (рН 1,5), так і лужному (рН 8,0) середовищах; в цих умовах нативний фермент повністю інактивується.

Збагачення раціонів молодняку великої рогатої худоби іммобілізованою на цеоліті глюкоамілазою активує біосинтетичні процеси у організмі телят (збільшується концентрація РНК, підвищується активність Ас Ат та каталази), що сприяє підвищенню продуктивності тварин на 10,0 - 22,1%.

Ключові слова: ферменти, носії, іммобілізація, модельні досліди, велика рогата худоба, продуктивність, науково-господарські досліди, біохімічні показники, мікроелементи, ефективність.