Генетика микроорганизмов

Итак, генетический анализ рекомбинации у фагов может проводиться также, как и в генетике высших организмов. Анализ разнообразных скрещиваний у фага T4 показал, что все изученные гены фага могут быть расположены в линейном порядке в одной группе сцепления, причем расстояние между генами измеряются частотой рекомбинации их в потомстве. Такие же результаты были получены и для других фагов.

Гибридологический анализ при трансдукции.

Анализ аллельности с использованием абортивной трансдукции был выполнен в отношении различных мутаций у (Salmonella thyphimurium). Обнаружилось, что мутации потребности в триптофане распадаются на 4 группы: tru A, tru B, tru C, tru D, соответствующие 4 генам. При трансдукции между мутантами одной группы не наблюдается появления крошечных колоний. При трансдукции между мутантами разных групп крошечных колоний появляется столько же, как и тогда, когда донором служат бактерии дикого типа.

Поскольку фаг переносит небольшие фрагменты бактериальной хромосомы. То путем трандукции невозможно обнаружить сцепление и провести картирование удаленных друг от друга генов в бактериальной хромосоме. Если же два гена близко располагаются друг к другу, то они могут попадать в один хромосомный фрагмент, переносимый фагом, обнаруживая явление сцепленной трансдукции. Оно оказывается во многом сходным с разбиравшимся ранее явлением сцепленной трансформации. Обозначить его можно так:

АВ х ав

Трансдуктанты аВ, Ав, АВ.

Появление трансдуктантов АВ с двумя маркерами донора может свидетельствовать о тесном сцеплении генов АВ.

Сцепление может быть также обнаружено при трансдукции Ав х аВ, если частота трансдуктантов АВ здесь ниже, чем при трансдукции АВ х аВ.

Действительно, если А и В тесно сцеплены, то в первом случае фаг переносит фрагмент Ав, для образования трансдуктов АВ необходим кроссинговер между А и в, вероятность которого тем меньше, чем ближе располагаются эти гены. Во втором случае перенесенный фрагмент АВ, и трансдуканты АВ образуются, где бы не произошел кроссинговер, включающий это фрагмент в хромосому донора.

Как в действительности сказывается сцепление на частоте трансдуктантов в таких скрещиваниях, показывает таблица 3.

Таблица 3. влияние сцепления на частоту трансдукции.

Примечание. Трансдуктанты дикого типа в скрещивании try D1 х try D10 являются результатом внутригенной рекомбинации, так как эти мутации относятся к одному гену и являются гетероаллельными.

Очевидно, что гены try D и met 15 не сцеплены, так как частота трансдуктантов дикого типа (АВ) не отличается от частоты их при трансдукции.

Дикий тип х try D10

Гены же try D, try В и try С сцеплены, поскольку при трансдукции рекомбинация между ними происходит реже.

Подробные опыты могут дать первое представление о расстоянии между генами. Определение генетических расстояний является здесь, однако, не точным, так как в экспериментах по трансдукции, также как и по трансформации, число рекомбинантов не может быть отнесено к общему числу потомков, рекомбинантных и родительских генотипов. Это происходит потому, что при трансдукции, например,

АВ х ав, трансдуктанты генотипов Ав и аВ (рекомбинантных), а также генотипа АВ (родительского) являются в действительности результатом двойного кроссинговера, включающего трансдуцированный фрагмент в хромосому донора.

14. Понятие о биотехнологии и генной инженерии

Биотехнология (от греческого bios - жизнь, tecen - искусство, logos - наука) - это наука, которая на основе изучения биологических процессов в живых организмах, использует эти процессы и организмы (бактерии, вирусы, грибы и т. д.) для получения ценных для человека продуктов и материалов. Биотехнология тесно связана с производством и с ее помощью в медицине получают антибиотики, витамины, ферменты, алкалоиды, нуклеиновые кислоты, липиды, противогистаминные, противоопухолевые препараты, в ветеринарии - кормовой белок, кормовые антибиотики, витамины, гормоны, вакцины, в химической промышленности - ацетон, этилен, бутанол, в пищевой - аминокислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, кислоты, дрожжи, в энергетике - биогаз, этанол.

Генетика микроорганизмов явилась основой для становления и развития одной из областей биотехнологии - генной инженерии. Генная инженерия связана с конструированием клеток с новыми генетическими свойствами. По своей сущности она сводится к генетической рекомбинации, т. е. получению новых рекомбинантных молекул ДНК с заданной генетической информацией. Процесс получения рекомбинантных ДНК состоит из нескольких последовательных стадий. Первая стадия сводится к выделению необходимой экспериментатору ДНК из клеток интересующего организма. Затем получают рекомбинантную (гибридную) ДНК путем встройки в геном клетки гена или группы генов, кодирующих требуемый белок (гормон, фермент и др.). после этого, рекомбинантную ДНК вводят в живую клетку (животную, растительную, микробную), которая является своего рода биофабрикой, синтезирующей большое количество различных соединений. Наконец, получают клон клеток, обладающих нужными признаками, его размножают, создают условия для максимального проявления синтезирующей способности клонированных клеток и выделяют необходимый продукт.

Опыты по генной инженерии.

Для получения разнообразных белков эукариот и вирусов животных широко применяются бактерии и дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

При этом используются самые разные методы, но наиболее широко те из них, которые описаны ниже.

Прежде всего необходимо изолировать нужный ген. Если ген животного должен экспрессироваться в клетках бактерий или дрожжей, то обычно вначале выделяют соответствующую м-РНК. Как правило, осуществить прямую экспрессию генов животных в бактериальных клетках не удается, поскольку эти гены содержат интроны.

Некоторые гены животных, например, кодирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат интронов и могут прямо экспрессироваться в бактериальных и дрожжевых клетках. Если в качестве исходного объекта приходится использовать м-РНК, то прежде всего следует найти ее источник - ткань, в которой этот продукт образуется в наибольшем количестве. Иногда таким источником служат опухолевые ткани или же клетки в культуре, образующие необходимую м-РНК.

После транскрипции данной м-РНК и получения комплементарной ДНК (к-ДНК) необходимо определить, какие из множества молекул этой к-ДНК ген, подлежащий выделению из экспрессии. На этом этапе работы молекулы к-ДНК обычно вводят в состав плазмид или генома бактериофагов, которые служат векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами к-ДНК переносят в клетки находящихся бактерий-хозяев.

Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы.

Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, который используется для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает Е. coli, плазмидный вектор скорее всего представляет собой производное рВР 322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cereuisiae конструируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосом дрожжей, способных реплицироваться подобно плазмидам. Нередко используются челночные векторы, которые могут реплицироваться в одном или нескольких организмах-хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма перспективным в связи с тем, что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации ДНК удобнее в роли хозяина использовать E. сoli.

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестриктазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантную молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т 4. в случае плазмиды рВР 322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечивать устойчивость.

ДНК-лигазу фага Т 4 можно применять и для сшивания "тупых" концов молекул ДНК, хотя этот процесс осуществляется труднее, чем в случае липких концов.

Експрессия клонированных генов.

С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки - продукты генов животных и их вирусов. Так, были созданы штамы E. сoli, у которых 20% всего белка составляли корковый антиген вируса гепатита В, гормон роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из конструируемых штаммов B. Subtilis, антиген составлял около 1% синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем не просто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транпкрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий уровень экспрессии генов прокариот.

Литература

Браун В. Генетика бактерий. М., 1968

Пехов А.П. Генетика микроорганизмов. М, 1977

Брода Э. Эволюция биоэнергетических процессов. М., 1978

Иванова О.А. Генетика. М., 1974

Дубинин Н.П. Общая генетика. М., 1970

Петухов В.Л., Жигачев АИ., Назарова Г.А..

Ветеринарная генетика с основами вариационной статистики. М., 1985

Малахов А.Г., Вишняков СИ. Биохимия сельскохозяйственных животных. М, 1984

Кемп П., Арме К. Введение в биологию. М., 1988

Льюин Б. Гены. М., 1987

Яблоков А.В., Юсуфов А.Г. Эволюционное учение. М., 1989

Гринн Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. М., 1990

Воробьев А.А., Быков А.С. Микробиология и иммунология. М., 1999

Радчук Н.А., Дунаев Г.В. Ветеринарная микробиология и иммунология. М., 1991

Новиков Д.К., Генералов ИИ. Медицинская

микробиология. Витебск, 2002

Общая микробиология и иммунология. Солонеко А.А., Гласкович А.А. Минск, 2002

Галактионов ВТ. Иммунология. М., 2000

Размещено на Allbest.ru