Микробиология

К облигатным спорообразующим анаэробам относятся клостридии столбняка, ботулизма, анаэробной раневой инфекции; к неспорообразующим анаэробам - бактероиды, пептобактерии, бифидумбактерии. Большинство патогенных бактерий - факультативные (условные) анаэробы, например, энтеробактерии. Они имеют полный набор ферментов и при широком доступе кислорода окисляют глюкозу до конечных продуктов; при низком содержании кислорода они вызывают брожение. Микроаэрофилы размножаются в присутствии небольших количеств кислорода. Например, кампилобактеры могут размножаться при 3-6% кислорода.

25. Методы культивирования облигатных анаэробов: принципы, аппаратура

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В дальнейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания агара в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извлекают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные колонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсснера).



26. Значение определения морфологических и культуральных свойств микробов в микробиологической диагностике (привести конкретные примеры)

Культивирование, то есть выращивание микроорганизмов в лаборатории, применяется для изучения их свойств и для получения биомассы. Бактерии, грибы, актиномицеты, спирохеты и некоторые простейшие культивируются на питательных средах. Хламидии, риккетсии, вирусы и некоторые простейшие способны размножаться только в организме животного или в живых клетках.

Культуральные свойства данного вида микроорганизмов - это: 1) условия, необходимые для размножения, и 2) характер роста на питательных средах. Культуральные свойства - это одна из характеристик, которые учитываются при идентификации (определения вида) микроорганизмов.

27. Ферменты микробов. Классификация по биологической роли и субстратной специфичности; использование для идентификации микробов

Ферменты - белки, участвующие в процессах анаболизма (синтеза) и катаболизма (распада), т.е. в метаболизме. Ферменты распознают соответствующие им метаболиты (субстраты), вступают с ними во взаимодействие и ускоряют химические реакции.

Известно более 2000 ф. Они объеденены в 6 классов:

1-оксидоредуктазы

2-трансферазы

3-гидролазы

4-лиазы

5-изомеразы

6-лигазы.

Ферменты, которые выделяются бактериальной клеткой в окружающую среду и осуществляют внеклеточное переваривание, называются экзоферментами. К экзоферментам относится также беталактамаза, которая разрушает пенициллин и другие бета-лактамные антибиотики, защищая бактерии от их действия.

Эндоферменты участвуют в процессах метаболизма внутри клетки.

Для бактерий, в силу их малых размеров, характерна высокая степень саморегуляции продукции ферментов. В этом отношении ферменты можно разделить на конститутивные и адаптивные. Конститутивные ферменты продуцируются клеткой постоянно. Адаптивные ферменты (индуцибельные)синтезируется бактериальной клеткой только при наличии в среде субстрата данного фермента, в свою очередь, подразделяются на индуцируемые и ингибируемые. Продукция индуцируемых ферментов происходит в присутствии субстрата. Например, ферменты, расщепляющие лактозу, образуются в клетке в только присутствии этого углевода. Продукция ингибируемых ферментов, напротив, подавляется присутствием в среде конечного субстрата в достаточно большой концентрации (например, триптофана).

Многие патогенные бактерии, кроме ферментов обмена, выделяют ферменты, являющиеся факторами вирулентности. Например, такие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, дезоксирибонуклеаза, нейраминидаза способствуют проникновению и распространению патогенного микроба в организме.

Способность бактерий продуцировать определенные ферменты - признак настолько постоянный, что его используют для идентификации, то есть определения вида бактерий. Определяют сахаролитические свойства (ферментацию углеводов) и протеолитические свойства (ферментацию белков и пептона).

Для микробов характерна высокая ферментативная активность. Это используется в промышленности. В медицине находят применение такие лечебные средства, как стрептокиназа (фибринолизин стрептококков), террилитин (протеаза Aspergillus terricola). Ферменты микробного происхождения - липазы и протеазы, входящие в состав моющих средств и стиральных порошков, расщепляют белковые и жировые загрязнения до воднорастворимых веществ, которые легко смываются водой.

28. Методы определения протеолитической и сахаролитической способности микробов: питательные среды, продукты расщепления и способы их выявления

В микробиологической практике изучение ферментативной активности используют для идентификации микроорганизмов, поскольку каждый микробный вид обладает определенным набором ферментов.

Для определения протеолитической активности микробы засевают уколом в столбик желатина и после 3-5 суток инкубирования при комнатной температуре отмечают характер разжижения желатина: в виде воронки, гвоздя, чулка или в виде опрокинутой елки. Протеолитическую активность определяют также по образованию продуктов разложения белка: индола, сероводорода, аммиака. Для их определения засевают микроорганизмы в мясо-пептонный бульон, и между горлышком пробирки и ватной пробкой помещают индикаторные бумажки, исключая их контакт со средой. При образовании индола бумага, пропитанная насыщенным раствором щавелевой кислоты, приобретает розовый цвет; в присутствии сероводорода бумага, пропитанная ацетатом свинца, чернеет; при образовании аммиака красная лакмусовая бумажка синеет.

Для определения сахаролитических свойств микробов применяют дифференциально-диагностические среды такие, как среды Гисса, среда Олькеницкого, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по их способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде - индикатор рН. Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашенными соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина - в черно-синий. Колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, таких как и палочки дизентерии, будут бесцветными.

Среды Гисса (среды "пестрого ряда") готовятся на основе пептонной воды или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой-либо один углевод или многоатомный спирт и индикатор. При росте на среде Гисса микроба, сбраживающего данный субстрат с образованием кислоты и газа, среда изменит цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырек газа в стеклянном поплавке. При сбраживании субстрата только до кислоты происходит лишь изменение цвета среды.

Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого. Одна пробирка этой среды заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой. После стерилизации в расплавленном виде среду в пробирке скашивают так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании лактозы или сахарозы изменяется цвет всей среды, при сбраживании одной глюкозы изменяется цвет только столбика. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. При выделении микробами аммиака цвет среды не меняется. Образование сероводорода проявляется почернением в столбике агара.

Для экспресс-метода определения ферментативной активности бактерий применяются микротестсистемы и система индикаторная бумажная (СИБ)

Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек Ячейки содержат высушенные питательные среды с углеводами и индикаторами рН В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густоты В контрольные ячейки наливают физ раствор Результат учитывают после 3 - 4-хчасовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора

Системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерий представляет собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор В пробирки с физиологическим или буферным раствором вносят исследуемую культуру, затем помещают диски В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят Результат учитывают по изменению цвета индикатора Для определения сероводорода диск помещают на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность

Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный - на следующий день

Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке Результат учитывается через минуту.

29. Дифференциально - диагностические среды: перечислить основные виды, принципиальный состав, назначение и использование в практике

Для отличия одних видов бактерий от других на основании их ферментативной активности применяются дифференциально-диагностические среды. Например, среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среда Олькеницкого. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбраживания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких средах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева -- в красный цвет, на среде Левина -- в черно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или палочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды останется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэтому колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задерживающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут-сульфит агар -- это дифференциально-диагностическая среда, применяемая главным образом при диагностике сальмонеллезов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл окрашиваются в черный цвет. Дифференциально-диагностические среды Гисса («пестрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полужидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде. В пробирку с жидкой средой Гисса помещен стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный углевод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных продуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появятся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде -- пузырек газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежуточных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды, Применяются также комбинированные среды, содержащие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого -- трехсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лактозой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1 %), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит натрия и индикатор. Среду после стерилизации в расправленном виде наливают в пробирку так, чтобы получился столбик и скошенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содержатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров), изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глюкозы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырьков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с образованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом происходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патогенные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бактерий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид черного цвета.

Для экспресс-метода определения ферментативной активности микроорганизмов применяются микротестсистемы и система индикаторных бумажек (СИБ). Микротестсистема представляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек. Ячейки содержат высушенные пит среды с углеводами и индикаторами рн. В каждую ячейку засевают взвесь культуры бактерий определенной густоты. В контрольные ячейки наливают физ. раствор. Результат учитывают после 3-4-часовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора. Системы индикаторных бумажек (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерии представляют собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытой защитной пленкой из поливинилового спирта и содержащей определенный субстрат и индикатор. В пробирке с физиологическим или буферным раствором вносят полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси, затем обожженным пинцетом помещают в диски. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Результат учитывают по изменению цвета индикатора. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновременно определить подвижность. Во всех пробирках учитывают предварительный результат в тот же день и окончательный -- через восемнадцать -- двадцать четыре часа. Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бумажке через 30-60 секунд.

30. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Перечислите принципы и методы получения изолированных колоний аэробов. Методы выделения чистых культур анаэробов. Описать по дням метод Вейнберга

Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий

Для культивирования м.о. необходимы определенные условия: t, аэробные или анаэробные условия.

t должна быть оптимальной для данного вида. Большинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая t, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, естественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной t, для культивирования м.о., в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохимические и другие свойства микробов, необходимо получить чистую культуру. Обычно культурой микробов называют скопление их на питательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) роста или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чистая культура - это культура микробов одного вида, полученная из одной колонии. В лабораториях для различных исследований применяют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в определенное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения активности пенициллина.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего питательного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют оставшуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на третьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наименьшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изолированные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на одной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из первого сектора во второй и таким же образом последовательно в третий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после суточного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непрозрачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отбирают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным питательным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных питательных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные колонии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кружевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми краями, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окислительно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз путем удаления кислорода физическими, химическими или биологическими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно можно заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, углекислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Среда Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами анаэробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

31. Влияние внешней среды на м.о. Влияние физических факторов: температуры, лучистой энергии, высушивания. Метод лиофильного высушивания

Находясь во взаимосвязи с различными объектами окружающей среды, микробы постоянно подвергаются ее воздействию.

На м.о. оказывают влияние факторы внешней среды:

1) физические (температура, высушивание, излучения, ультразвук, осмотическое давление);

2) химические (различные вещества):

3) биологические (другие виды микробов и вирусы).

Температура t. Следует различать 1) температурные условия, при которых м.о. растут и размножаются и 2) температурные границы, при которых микроорганизмы остаются живыми. Понятно, что во втором случае диапазон температур шире.

1) В зависимости от температурных условий, которые требуют мо. для своего роста и размножения, различают три группы: психрофилы, растущие при низкой температуре, мезофилы - при средней, и термофилы - при высокой температуре

Для психрофилов оптимальная t для роста 10-15°С. минимальная 0-5°С, максимальная 25-30°С. Большинство из них свободноживущие и паразиты холоднокровных животных, но есть и патогенные для человека, например, иерсинии, псевдомонады. Они размножаются при t бытового холодильника и более вирулентны при низких температурах.

Мезофилы размножаются преимущественно в организме теплокровных животных и человека. Оптимальная t для их роста 30-37°С, максимальная 43-45°С, минимальная 15-20°С. Большинство патогенных микроорганизмов относятся к мезофилам. В окружающей среде они обычно не размножаются, но могут сохраняться живыми.

Для термофилов оптимальная t для роста 50-60°С, минимальная равна 45°С максимальная 90°С. Термофильные бактерии живут в юрячей воде гейзеров. Они не размножаются в организме человека.

2) Температурные зоны гибели микроорганизмов шире, чем температуры, при которых они могут расти.

Споры бактерий устойчивы к 100°С, например, споры палочек столбняка и ботулизма выдерживают кипячение в течение нескольких часов. Для того, чтобы убить споры, создают температуру сухого жара 160-170°С, пара под давлением 120-134°С. Высокие t применяют при стерилизации - обеспложивании различных материалов.

К низким t м.о. более устойчивы. Многие из них переносят замораживание. Холерный вибрион, сальмонеллы, кишечная палочка могут сохраняться во льду. Особенно устойчивы к низким t споры бактерий и вирусы. В то же время есть виды микробов, не переносящих температуры ниже 20°С: менингококки, гонококки, возбудители коклюша, сифилиса.

Высушивание. Вода необходима для нормальной жизнедеятельности микробов, так как питательные вещества поступают в клетку в растворенном виде. При недостатке воды рост микробов прекращается, хотя некоторые их них остаются живыми в течение какого-то времени. Чувствительны к высушиванию менингококки, гонококки, возбудители сифилиса, коклюша, гриппа; устойчивы стафилококки, возбудитель туберкулеза. Наиболее устойчивы споры бактерий, так как вода в них находится в связанном состоянии. Для сохранения живых м.о. применяют метод лиофилизации - высушивание под вакуумом из замороженного состояния. Лиофилизированные живые культуры м.о., вакцины, биопрепараты в течение ряда лет сохраняются, не изменяя своих свойств.

Действие излучений. Ионизирующая радиация - гамма-излучение радиоактивных веществ и электроны высоких энергий - губительно действуют на м.о., хотя смертельные дозы для них выше, чем для животных и растений. Ионизирующие излучения применяют для стерилизации одноразовых пластиковых шприцев и посуды, питательных сред, лекарственных препаратов.

Неионизирующие излучения - ультрафиолетовые лучи - повреждают м.о. в большей степени, чем животных и растения. УФ-лучи повреждают геном микробных клеток, что приводит их к гибели. Для обеззараживания воздуха в лечебных учреждениях и в микробиологических лабораториях применяются бактерицидные лампы ультрафиолетового излучения.

Ультразвук при определенной частоте вызывает разрушение структуры микробных клеток вследствие образования кавитационных полостей и может применяться как метод обработки пищевых продуктов.

Осмотическое давление, его постоянство, имеет большое значение для жизни микробов. При повышении или понижении осмотического давления происходит разрыв клеточной мембраны и гибель клеток. Повышенные концентрации солей задерживают развитие м.о., особенно гнилостных, что используется для сохранения впрок пищевых продуктов: овощей, грибов, рыбы, мяса. На том же принципе основано применение концентрированных растворов сахара в варенье, сиропах. Концентрированные растворы лекарственных средств растительного происхождения являются более стойкими сравнительно с разведенными растворами.

Высокое атмосферное давление не оказывает значительного действия на микроорганизмы.

Химические вещества, оказывающие антимикробное действие, применяются для дезинфекции - от des (французской приставки, означающей отрицание) и inficere (лат. - заражать). С помощью дезинфекции производится уничтожение возбудителей инфекционных болезней на зараженных объектах внешней среды.

Дезинфицирующие вещества являются общетоксическими ядами, в отличие от химеотерапевтическнх средств и антибиотиков, оказыва-ющих избирательное действие на микроорганизмы. Механизм действия дезинфицирующих веществ в основном заключастся в нарушении физико-химической структуры микробной клетки

Окислители (хлор и его соединения, вещества, содержащие йод, перекись водорода) обладают повышенной способностью окислять органические соединения в микробной клетке, что приводит к ее гибели.

Вещества, свертывающие белок (фенол, крезол, гексахлорофен, лизол, спирты, соли тяжелых металлов, например, сулема), проникая в микробную клетку, вступают в соединение с ее белками, денатурируют их и таким образом нарушают жизненные функции микроорганизма.

Детергенты (поверхностно-активные вещества (ПАВ)) - вещества, обладающие высокой поверхностной активностью, моющим, а многие из них и антимикробным действием - мыла, СМС.

32. Понятие о стерилизации, дезинфекции, асептике, антисептике. Методы стерилизации и их характеристика: аппараты, действующее начало, режим стерилизации, стерилизуемые объекты

Асептика - комплекс мероприятий, направленных на предупреждение попадания микробов в рану, или в пробирку с питательной средой, в ампулу с лекарственным средством и т.д. Антисептика - способ обеззараживания ран, операционного поля, рук хирурга, а также воздействие на инфекцию в организме пациента с помощью химических веществ - антисептиков. Дезинфекция - уничтожение патогенных микробов в окружающей среде и различных объектах с целью прервать путь передачи и распространения инфекционного заболевания. Стерилизация - процесс, направленный на полное уничтожение всех микроорганизмов в каком-либо объекте. Для стерилизации используют физические, химические методы и их сочетание.

Стерилизация высокой температурой Прокаливание на огне. -петли.

Стерилизация сухим жаром. Проводится в печи Пастера (сухожаровый шкаф) при температуре 160-170°С в течение 1-го часа. Этим способом стерилизуют лабораторную стеклянную посуду, пипетки, завернутые в бумагу, пробирки, закрытые ватными пробками.

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование).

Питательные среды, содержащие сахара, нельзя стерилизовать при 1 атм., так как они карамелизуются, поэтому их подвергают дробной стерилизации текучим паром, или автоклавированнию при 0,5 атм.

Для контроля режима стерилизации применяются биологический и физический методы. Биологичесжй метод основан на том, что одновременно со стерилизуемым материалом помещают споры Bacillus stearothermophilus, которые погибают при 121°С за 15 минут. После проведения стерилизации споры не должны дать рост на питательной среде. Физический метод основан на применении веществ, имеющих определенную точку плавления, например, серу (119°С), бензойную кислоту (120°С). Запаянные трубки, содержащие вещество в смеси с сухим красителем (фуксин) помещают в автоклав вместе со стерилизуемым материалом. Если температура в автоклаве достаточна, вещество расплавится и окрасится в цвет красителя.

Для материалов, разрушающихся при 100°С (например, сыворотки, питательные среды, содержащие белок) применяют другой вид дробной стерилизации - тиндализацию. Стерилизуемый материал прогревают на водяной бане при 56-60°С в течение 5-6 дней подряд - в первый день в течение 2 часов, в остальные дни по 1 часу.

Стерилизация облучением

УФ-лучи. Лампы ультрафиолетового излучения используют для обеззараживания воздуха лечебных учреждений, бактериологических боксов и лабораторий, а также для стерилизации жидкостей с помощью особых аппаратов. Стерилизации ионизирующим излучением: лекарственные средства, перевязочные материалы, шелк, хирургические перчатки, одноразовые шприцы, пластмассовые трубки для внутривенного введения и многие другие материалы. Применение ионизирующей радиации имеет ряд преимуществ перед тепловой стерилизацией. При стерилизации с помощью ионизирующего излучения температура стерилизуемого объекта поднимается незначительно, в связи с чем такие методы называют холодной стерилизацией

Химическую стерилизацию применяют для обработки рук хирурга, операционного поля пациента, хирургических инструментов и перчаток, анестезирующих масок. Применяют некоторые дезинфицирующие средства, хлоргексидин и многие другие вещества.

Газовую стерилизацию проводят с помощью таких веществ, как окись этилена, метилбромид, окись пропилена, формальдегид, глютаральдегид, бета-пропиолактан, озон и др. После стерилизации для удаления газа камеры продувают стерильным воздухом, а затем выдерживают стерилизованный материал в течение нескольких суток. Проводится контроль остаточной концентрации газа в материале, так как газы токсичны,

Физико-химические методы - это сочетание физических и химических воздействий на микроорганизмы, например, действие дезинфицирующего вещества и нагревания.

Методы частичного обеспложивания

Кипячение - применяется для обработки шприцев, игл, инструментов. Стерилизацию проводят в течение 30 минут в специальных стерилизаторах для инструментов, в воду для устранения ее жесткости и повышения температуры кипения рекомендуется добавить 1-2% бикарбоната натрия.

Пастеризация._Метод был предложен Пастером для частичного обеспложивания жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры. Применяется для обработки вина, молока, других пищевых продуктов. Споры остаются живыми. Поэтому во избежание их прорастания пастеризованный продукт необходимо хранить в холодильнике.

Холодная стерилизация

33. Действие дезинфецирующих веществ на микробы. Перечислить группы дезинфецирующих веществ по механизму действию, назвать основные вещества каждой группы

Дезинфицирующие вещества являются общетоксическими ядами, в отличие от химеотерапевтическнх средств и антибиотиков, оказыва-ющих избирательное действие на микроорганизмы. Механизм действия дезинфицирующих веществ в основном заключастся в нарушении физико-химической структуры микробной клетки

Окислители (хлор и его соединения, вещества, содержащие йод, перекись водорода) обладают повышенной способностью окислять органические соединения в микробной клетке, что приводит к ее гибели.

Вещества, свертывающие белок (фенол, крезол, гексахлорофен, лизол, спирты, соли тяжелых металлов, например, сулема), проникая в микробную клетку, вступают в соединение с ее белками, денатурируют их и таким образом нарушают жизненные функции микроорганизма.

Детергенты (поверхностно-активные вещества (ПАВ)) - вещества, обладающие высокой поверхностной активностью, моющим, а многие из них и антимикробным действием - мыла, моющие средства. Высокой активностью обладают четвертичные аммониевые основания (ЧАО), вызывающие повреждение клеточной стенки бактерий, не проникая внутрь клетки.

Некоторые металлы в незначительных количествах обладают выраженным антимикробным действием (серебро, медь, золото и другие). Объясняется это тем, что они выделяют в воду ионы. Такое явление называют олигодинамическим действием (греч. oligos - малый). Достаточно ничтожною количества ионов в жидкости, чтобы они концентрировались на поверхности микробов и, изменив ее заряд с "-" на "+", оказывали антимикробное действие.

Выбор способа дезинфекции зависит от биологичсских свойств микроба и от той среды, в которой он находится. Например, сулема мало пригодна для дезинфекции белковых субстратов, таких как гной, кровь, мокрота. Под влиянием сулемы происходит свертывание белков, и свернувшийся белок предохраняет микробов от действия дезин-фектанта. Этиловый спирт используют для обеззараживания рук, различных предметов, для консервации биологических объектом. Наиболее выражено бактерицидное действие 70%-ного спирта, поскольку чистый спирт вызывает свертывание поверхностных белков бактерий и не проникает внутрь клетки.

Значительным бактерицидным действием обладает гексахлорофен, причем грамположительные кокки более чувствительны к нему, чем грамотрицательнве палочки. Гексахлорофен применяется для обеззараживания кожи в виде мыла, содержащею 2-5% этого вещества; для санации полости носа в виде мази, содержащей 1%, для санации носоглотки путем орошения с целью борьбы со стафилококковым носитель-cibom - 0,1%-ный раствор.

34. Микрофлора воды, почвы, воздуха. Санитарно-показательные микроорганизмы. Выживаемость патогенных микробов во внешней среде. Некультивируемые формы бактерий. Значение для медицинской практики

При исследовании объектов внешней среды методами санитарной микробиологии определяются количественные показатели - общее количество микроорганизмов в определенном объеме. Важной задачей исследования является обнаружение патогенных микробов и их токсинов. Однако непосредственное их выявление представляет значительные трудности. Причина в том, что патогенные м.о. встречаются во внешней среде непостоянно, обычно в небольших количествах, их трудно культивировать на питательных средах, некоторые из них вообще не культивируются на искусственных средах. Поэтому возможное загрязнение внешней среды патогенными микробами определяют по косвенному показателю - обнаружению санитарно-показательного микроорганизма.

Микрофлора почвы

Почва является основной средой обитания многих м.о., которые вместе с растениями и животными составляют разнообразные биогеоценозы. Состав микробиоценозов почвы зависит от многих внешних факторов, в том числе от агротехнических мероприятий, таких как вспашка, внесение удобрений, ядохимикатов.

Самый поверхностный тонкий слой почвы содержит мало м.о., так как они погибают под влиянием солнечных лучей и высушивания. Наиболее обильна микрофлора почвы на глубине 10-20 см, а в более глубоких слоях количество микробов уменьшается.

Видовой состав почвенной микрофлоры весьма разнообразен: анаэробные и аэробные бактерии, грибы, простейшие, вирусы.

Это возбудители ботулизма, ак-тиномицеты и грибы - возбудители микозов. Вторая группа - это спо-рообразующие бациллы и клостридии, которые попадают в почву с выделениями человека и животных и могут длительно здесь сохраняться в виде спор. Это бациллы сибирской язвы, клостридии столбняка и газовой анаэробной инфекции.

К третьей группе относятся неспорообразующие бактерии и вирусы, которые попадают в почву с выделениями человека и животных, сохраняются здесь в течение нескольких дней и месяцев. Это бактерии - возбудители брюшного тифа и дизентерии, палочки туберкулеза, лептоспиры, вирусы. Значение почвы как фактора передачи при этих инфекциях относительно невелико.

Микробиологическое исследование почвы имеет значение при строительстве жилищ, детских учреждений, водохранилищ. Пробы почвы берут из глубины. Определяют микробное число - общее количество микроорганизмов в 1 г почвы и наличие санитарно-показательных микроорганизмов. Присутствие в почве Escherichia coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее фекальное загрязнение, бактерий рода

Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, a Clostridium perfringens - на давнее.

Микрофлора воды

Вода открытых водоемов, подобно почве, является естественной средой обитания многих видов бактерий, грибов, вирусов, простейших. В воде обитают также различные виды микробов, принимающих участие в круговороте веществ в природе и способствующих самоочищению воды благодаря разложению органических соединений. Характер микрофлоры воды зависит от многих причин, и в особенности от загрязнения стоками ливневых, фекальных и промышленных нечистот. По мере удаления от населенных пунктов число микробов постепенно уменьшается. Наиболее чистыми являются воды глубоких артезианских скважин и родников.

Вода имеет эпидемиологическое значение как фактор передачи инфекций. Наблюдались водные эпидемии холеры, брюшного тифа, леп-тоспирозов и других инфекционных болезней.

Санитарно-показательными микроорганизмами для воды являются бактерии группы кишечной палочки (БГКП), принадлежащие к разным родам семейства энтеробактерий. Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по следующим показателям:

1) микробное число - общее количество бактерий в 1 мл воды;

2) коли-титр - наименьший объем воды в миллилитрах, в котором обнаруживаются БГКП;

3) коли-индекс - количество БГКП в 1 литре воды;

4) кроме того, в воде определяют наличие патогенных и условнопатогенных микроорганизмов: энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

В соответствии с ГОСТом на питьевую водопроводную воду, микробное число ее должно быть не более 100, коли-титр должен быть не ниже 300, коли-индекс - не более 3.

Микрофлора воздуха

В воздух микробы попадают из почвы с поверхностей растений и животных, а также с промышленными отходами некоторых предприятий. В отличие от воды и почвы, где микробы могут размножаться, в воздухе они только сохраняются в течение некоторого времени, а затем гибнут вследствие высыхания и влияния солнечных лучей. Устойчивые к таким воздействиям микроорганизмы могут долго сохраняться в воздухе. Это споры грибов, споры бактерий, сарцины и другие кокки, образующие пигменты. Больше всего микробов в воздухе промышленных городов, меньше всего - в воздухе лесов и гор. В открытом воздухе количество микробов летом больше, чем зимой, в воздухе закрытых помещений - наоборот.

Воздух может служить фактором передачи патогенных микробов: стафилококков, стрептококков, палочек дифтерии, коклюша, туберкулеза, а также вирусов кори, гриппа. Передача воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем почти всегда происходит в закрытых помещениях и редко - на открытом воздухе.

Показатели санитарно-микробиологического состояния воздуха

закрытых помещений:

- микробное число - количество микробов, обнаруженных в 1 м3

воздуха;

- наличие санитарно-показательных бактерий: Streptococcus haeraolyticus и Staphylococcus aureus.

Чистота воздуха зависит от своевременного проветривания помещения и влажной уборки. Применяется обработка воздуха бактерицидными УФ-лампами. Для уменьшения контаминации воздуха применяют марлевые и ватно-марлевые маски.

35. Бактериологическое исследование воды: показатели, методы их определения и оценка

Санитарно-гюказательными м.о. для воды являются бактерии группы кишечной палочки (БГКП), принадлежащие к разным родам семейства энтеробактерий. Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по следующим показателям:

1) микробное число - общее количество бактерий в 1 мл воды;

2) коли-титр - наименьший объем воды в миллилитрах, в котором обнаруживаются БГКП;

3) коли-индекс - количество БГКП в 1 литре воды;

4) кроме того, в воде определяют наличие патогенных и условнопатогенных микроорганизмов: энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.

В соответствии с ГОСТом на питьевую водопроводную воду, микробное число ее должно быть не более 100, коли-титр должен быть не ниже 300, коли-индекс - не более 3.

Определение микробного числа воды

Водопроводную воду засевают в объеме 1 мл, воду открытых водоемов --в объемах 1,0; 0,1; 0,01 мл. Все пробы вносят в стерильные чашки Петри, после чего их заливают 10--12 мл расплавленным и остуженным до 45--50° С питательным агаром, который тщательно перемешивают с водой. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24--48 ч. Воду из открытых водоемов засевают параллельно на две серии чашек, одну из которых инкубируют при 37°С в течение суток, а другую --2 сут при 20° С. Затем подсчитывают количество выросших на поверхности и в глубине среды колоний и вычисляют микробное число воды -- количество микробов в 1 мл.

Определение коли-титра и коли-индекса воды

Коли-титр воды измеряется минимальным количеством воды (в мл), в котором обнаруживаются БГКП, кол и - индеке-- количеством БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды. Коли-титр воды определяют бродильным методом и методом мембранных фильтров.

Бродильный метод. Воду открытых водоемов в объемах 100; 10; 1 и 0,1 мл засевают в глюкозопептонную среду, причем для посевов больших количеств воды (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую десятикратные количества указанных веществ.

Состав глюкозопептонной среды: 1% пептонная вода, 0,5% глюкозы, 0,5% хлорида натрия, индикатор Андреде и поплавок.

Для исследования водопроводной воды делают посев 4 проб по 100 мл и Ю проб по 10 мл или 3 проб по 100 мл и 3 проб по 10 мл в концентрированную среду и 3 проб по 1 мл в обычную глюкозопептонную среду. Посевы инкубируют в течение суток при 37° С. О брожении судят по наличию пузырьков газа в поплавке. Из забродивших или помутневших проб производят посевы на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Esherichia, Citrobacter и Enterobacter от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonadacae и других оксидазаположительных бактерий, обитающих в воде, С этой целью стеклянной палочкой снимают 2--3 изолированные колонии с поверхности среды и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-п-фенилендиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительном -- она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин.

Грамотрицательные палочки, не образующие оксидазу, вновь исследуют в бродильном тесте --вносят в полужидкий питательный агар с 0,5% глюкозы и инкубируют при 37°С в течение суток. При положительном результате определяют коли-титр и коли-индекс по таблицам ГОСТа 18963-73.

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуум-насосу. Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети Москвы и Ленинграда и воду артезианских скважин фильтруют в объеме 500 мл, воду других городов -- в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100; 10; 1 и 0,1 мл, более загрязненную перед фильтрацией разводят стерильной водой. Затем фильтры помешают на поверхность среды Эндо в чашку Петри и после инкубации при 37°С в течение суток подсчитывают количество выросших колоний, типичных для БГКП. Из 2--3 колоний красного цвета готовят мазки, окрашивают по Граму и ставят оксидазный тест. Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы индикатор окрашивает колонию в синий цвет. Две --три колонии, не изменившие первоначальную окраску, засевают в полужидкую среду с 0,5% глюкозы. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. При наличии газообразования подсчитывают количество красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс, из значения которого вычисляют коли-титр. Например, если коли-индекс равен 5. то коли-титр составит 200 (1000:5 =200).

Общее количество бактерий в 1 мл неразделенной волы, не более 100.

Количество БГКП 3.

При использовании жидких сред накопления коли - титр, не менее 333.

Для определения титра Staph. faecalis готовят десятикратные разведения воды. Цельную воду и ее разведения в объеме 1 мл засевают в одну из жидких элективных сред (КФ, полимик-синовая и др.), инкубируют при 37°С в течение 2 сут, а затем через 24 и 48 ч производят высевы на чашки с плотными элективно-дифференциальными средами: агар КФ, агар ТТХ (среда с трифенилтетразолхлоридом), полимиксинотеллуритный агар. Идентифицируют фекальные стрептококки по виду коло-ний, морфологии клеток и окраске по Граму. На среде с ТТХ Staph. faecalis образует колонии темно-красного цвета, на агаре с теллуритом -- черного цвета.

Состав cред. Среда КФ: 2% питательный агар с 1% дрожжевого экстракта, 2% мальтоны, 0.1% лактозы, 0,4% анида натрия, 0,06% кацбоната натрия, индикатор бромкрезоловый красный. Полимиксиновая среда: питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, полимнксин М 200 ЕД/мл, индикатор бромтимоловый синий. Полимиксинотеллуритный агар: питательный агар, дрожжевой экстракт, 1% глюкозы, кристаллический фиолетовый 1:800 000, полимиксин М 200 ЕД/мл, 0.01% теллурита калия, агар ТТХ: питательный агар, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, кристаллический фиолетовый 1 : 800000, 0,01% ТТХ.

При определении индекса Staph. faecalis пользуются статистическими таблицами, применяемыми при установлении коли-индекса. Кроме того, с этой целью используют метод мембранных фильтров.

36. Взаимоотношение между организмами в ассоциациях: симбиоз, метабиоз, синергизм, антагонизм. Микробы-антагонисты: их использование в производстве антибиотиков и других лечебных препаратов

Симбиоз - обе популяции извлекают для себя пользу - степень зависимости колеблется от слабой (сотрудничество) до полной (мутуализм). Мутуализм - симбионты выполняют разные дополняющие друг друга жизненные функции. Симбиоз наблюдается м/у виатминсинтезирующими мк и чком. Симбиотические взаимоотношения микроорганизмов характеризуются тем, что два или более вида микробов при совместном развитии создают для себя взаимовыгодные условия. Типичным примером такого взаимоотношения является факт, описанный еще в 1863 г. Пастером в отношении совместного развития аэробных и анаэробных микроорганизмов. Развиваясь в аэробных условиях, микробы поглощают кислород и тем самым создают благоприятные условия для развития анаэробов. Имеются и другие примеры, иллюстрирующие это явление. Так, в кефирных зернах одновременно развиваются молочнокислые бактерии и дрожжи, получая при этом взаимовыгодные условия: молочнокислые бактерии, испытывая потребность в витаминах, получают их в результате развития дрожжей; в то же время дрожжи, благодаря подкислению среды молочнокислыми бактериями, получают благоприятные условия для своего развития. Метабиоз -- использование продуктов жизнедеятельности одних микробов другими.

В основном взаимоотношения можно условно подразделить на две большие группы: благоприятные -- синергизм и неблагоприятные -- антагонизм. Антагонизм - такие взаимоотношения между разными видами микробов, при котором один из партнеров наносит вред другому. Это связано с образованием и выделением микробами-антагонистами метаболических продуктов, ингибирующих размножение многих организмов. К таким продуктам относятся органические кислоты (изменяющие рН среды), антибиотики, бактериоцины и др. Так, например, многие актиномицеты являются антагонистами бактерий, а молочнокислые бактерии обладают антагонистическими свойствами в отношении гнилостных бактерий и т.д.

Примеры антагонизма

! отношения молочнокислых и гнилостных бактерий; молочнокислые бактерии подавляют рост грамотрицательных энтеробактерий различных видов, в т. ч. условнопатогенных, населяющих кишечник человека и животных

! активное подавление синегнойной палочкой чумной палочки

! угнетение роста дрожжей актиномицетами, продуцирующих нистатин

! угнетение бацилл сибирской язвы, коринебактерий дифтерии и других гемолитическими стрептококками

! споры головни зерновых культур, попадая в почву, подвергаются воздействию почвенных антагонистов и быстро теряют жизнеспособность

...