Молекулярні механізми імунного розпізнавання дифтерійного токсину

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

03.00.03 - Молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Молекулярні механізми імунного розпізнавання дифтерійного токсину

Колибо Денис Володимирович

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

доктор біологічних наук, професор,

академік НАН і НАМН України

КОМІСАРЕНКО Сергій Васильович

Науковий консультант

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, директор, завідувач відділу молекулярної імунології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

ФІЛОНЕНКО Валерій Вікторович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач відділу сигнальних систем клітини;

доктор біологічних наук, професор

МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна

Національний університет ім. Тараса Шевченка, професор кафедри біохімії навчально-наукового центру «Інститут біології»;

доктор медичних наук, професор

БУТЕНКО Геннадій Михайлович

академік HАМН України, чл.-кор. НАНУ та РАМН, директор Інституту генетичної та регенеративної медицини АМН України.

Захист відбудеться __________2011 року о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, Київ, вул. Акад. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Київ, вул. Акад. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано _____________ 2011 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук І.В. Крупська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Дифтерійний токсин (ДТ) є головним фактором патогенності збудника дифтерійної інфекції Corynebacterium diphtheriae, з цитотоксичною дією якого пов'язані більшість патологічних процесів при дифтерії. Крім того, ДТ є важливим фактором для колонізації бактеріями слизових оболонок (Pappenheimer A.M., Gill D.M., 1973; Hadfield T.L. et al., 2000; Vitek C.R., 2006).

Молекула ДТ складається з двох субодиниць: А (від англ. active) і В (від англ. binding) (далі SubA та SubВ). SubВ відповідає за взаємодію токсину з рецептором на поверхні клітини-мішені та за транспортування SubA в цитозоль, а SubA модифікує еукаріотичний фактор елонгації трансляції eEF2, що призводить до загибелі клітини внаслідок зупинки в ній синтезу білка (Collier R.J., 1975). Рецептором токсину на поверхні чутливих клітин є трансмембранний попередник ростового фактору HB-EGF - proHB-EGF (від англ. heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor) (Besner G. et al., 1990; Naglich J.G. et al., 1992).

Відомо, що експресію ДТ зупиняє специфічний репресор DtxR (від англ. diphtheria toxin repressor), що активується іонами заліза крові, яка надходить до місця колонізації через уражений епітелій (Boyd J., 1990). Ймовірно, ДТ можна розглядати як молекулярний інструмент, за допомогою якого бактерії ушкоджують епітелій, щоб отримати порцію крові для формування захисного шару фібринових плівок в місті колонізації. Проте, високий рівень експресії рецептора для ДТ характерний не тільки для епітеліальних клітин, але також для фібробластів, деяких лейкоцитів, клітин нирок, міокарду, печінки, легень і нервової системи (Vaughan T.J. et al., 1992; Raab G., 1997; Scuderi R. et al., 2008). На сьогодні залишається нез'ясованим біологічний сенс потрапляння ДТ у кров під час інфекції та значення ураження ним різних типів клітин та багатьох внутрішніх органів.

Вважають, що саме набуття токсигенних властивостей внаслідок лізогенізації помірним бактеріофагом вtox+ або деякими іншими коринефагами, геном яких містить ген активного ДТ, перетворює бактерію C. diphtheriae на збудника дифтерії (Freeman V.J. et al., 1990; Mokrousov I., 2009). Важливо відмітити, що саме антитоксична гуморальна імунна відповідь забезпечує захист організму від збудника дифтерії, а пасивна імунізація антитоксичними антитілами залишається головним засобом специфічного лікування дифтерії (Audibert F. et al., 1981; Wagner K.S. et al., 2009). Проте, незрозуміло, чому антитіла проти позаклітинного антигену, яким є дифтерійний екзотоксин, сприяють звільненню організму від бактерій, які його продукують. Також на сьогодні немає теорії, яка б пояснювала роль антитоксичної гуморальної імунної відповіді за різних форм інфекції та у формуванні носійства дифтерійних паличок.

Розвиток імунної відповіді на токсичні речовини, до яких відноситься і ДТ, має характерні особливості, які обумовлені токсичним впливом цих речовин на імунну систему і, безпосередньо, на клітини, які забезпечують розвиток імунних реакцій. Проте, для ДТ такі особливості залишаються нез'ясованими. Все це окреслює наукову проблему з'ясування молекулярних механізмів імунного розпізнавання ДТ у прояві його антигенних та імунобіологічних властивостей, вирішення якої сприятиме розумінню ролі антитоксичної імунної відповіді у взаємовідносинах коринебактерій з організмом хазяїна.

Вивчення молекулярних механізмів розпізнавання токсину імунною системою є важливим не тільки для поглиблення фундаментальних знань стосовно патогенезу дифтерії, але й для розробки новітніх діагностикумів, засобів профілактики та терапії дифтерії. Отже, тема роботи є актуальною як в фундаментальному, так і практичному аспектах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності до тематичного плану Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, до якого входили наступні теми НДР: базова бюджетна тема №9 “Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів” (номер державної реєстрації 0199V000273, 1999-2003 рр.) (відповідальний виконавець, керівник підрозділу теми), тема НДР №11 „Створення оптичних імуносенсорів на основі поверхневого плазмонного резонансу для імунодіагностики дифтерії, кашлюку та стану системи зсідання крові” (номер державної реєстрації 0104V003282, 2001-2003 рр.) (відповідальний виконавець), тема №9 “Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів” (номер державної реєстрації 0104V003280, 2004-2008 рр.) (відповідальний виконавець, керівник підрозділу теми), тема №15 “Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики та лікування” (номер державної реєстрації 0102V006218, 2002-2006 рр.) (відповідальний виконавець), інноваційна тема №24 “Розробка імунохімічних тест-систем для контролю протидифтерійного імунітету в популяції та при захворюванні на дифтерію” (номер державної реєстрації 0106V006446, 2006 р.) (відповідальний виконавець), тема №27 „Використання рекомбінантних антигенів для розробки тест-систем на дифтерію та туберкульоз” (номер державної реєстрації 0108V004439, 2008 р.) (керівник теми), тема НДР №31 „Створення гібридних наночастинок як надчутливих флуоресцентних сенсорів нового покоління, модифікація їх поверхні та розробка біоспецифічних наночастинок колоїдального золота для імунохімічного аналізу” (номер державної реєстрації 0107V010968, 2007-2009 рр.), тема №15 “Структурно-функціональний аналіз білків за норми та деяких патологій” (номер державної реєстрації 0107V007187, 2007-2011 рр.) (відповідальний виконавець, керівник підрозділу теми) та тема №9 “Вивчення структури і функції білків і пептидів і їх використання для біомедицини” (номер державної реєстрації 0109V002778, 2009-2013 рр.) (відповідальний виконавець, керівник підрозділу теми).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - встановити молекулярні механізми імунного розпізнавання ДТ та особливості формування антитоксичного імунітету, які визначаються біологічними властивостями ДТ, а також запропонувати підходи до вдосконалення діагностики дифтерії.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

1. Дослідити антигенні, імуногенні та протективні властивості нетоксичних рекомбінантних фрагментів ДТ.

2. Створити рекомбінантні флуоресцентні білки на основі рецептор-зв'язувальних фрагментів ДТ для дослідження процесу рецепції ДТ.

3. Дослідити особливості процесу взаємодії токсину з чутливими і нечутливими до токсину клітинами in vitro з використанням рекомбінантних флуоресцентних похідних ДТ, що здатні специфічно зв'язуватися з рецепторами клітин. розпізнавання дифтерійний токсин імунний

4. Створити панель специфічних до ДТ рекомбінантних одноланцюгових scFv-антитіл (від англ. scFv - single chain fragment variable) та дослідити їх здатність розпізнавати та нейтралізувати ДТ.

5. Виявити закономірності прояву цитотоксичної дії ДТ на клітини імунної системи; змоделювати процес імунного розпізнавання ДТ та розвитку інфекції за допомогою математичних методів.

6. Запропонувати нові тести для виявлення циркулюючого ДТ, рівня антитоксичних антитіл та їх специфічності до субодиниць ДТ; а також для оцінки токсин-нейтралізуючих властивостей антитіл in vitro.

7. Виявити особливості імунного розпізнавання ДТ та розвитку імунної відповіді до нього в залежності від форми перебігу інфекційного процесу та після вакцинації.

Об'єкт дослідження - особливості рецепції, інтерналізації та імунного розпізнавання ДТ, його фрагментів та рекомбінантних похідних.

Предмет дослідження - ДТ, його рекомбінантні фрагменти та похідні, рецептор ДТ, антитоксичні антитіла.

Методи дослідження. В роботі були використані сучасні експериментальні методи молекулярної біології та білкової інженерії, мікробіології, клітинної біології, імунохімії, біохімії білків, конфокальної мікроскопії та цитофлуориметрії, а також методи математичного моделювання і статистичної обробки результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. Результати роботи принципово доповнюють існуючі уявлення про молекулярні механізми імунного розпізнавання та рецепції ДТ різними клітинами, розкривають імунобіологічні та імунотропні властивості токсину. Вперше для аналізу механізмів імунного розпізнавання ДТ використано рекомбінантні похідні і аналоги його функціональних фрагментів, що дозволило запропонувати нові підходи для дослідження імунної відповіді проти нього.

За допомогою рекомбінантних флуоресцентних похідних окремих фрагментів токсину вперше було візуалізовано процес зв'язування ДТ з поверхнею різних клітин і його внутрішньоклітинний трафік. Вперше виявлено здатність субодиниці В ДТ взаємодіяти in vitro з рецепторами як чутливих до ДТ клітин мавпи, так і нечутливих клітин миші. Ця здатність вказує на те, що відмінності у чутливості клітин мишей і приматів до ДТ можуть бути обумовлені не лише різною спорідненістю токсину до їх рецепторів, але й процесами, що відбуваються після проникнення токсину всередину клітини, що важливо для розуміння молекулярних механізмів реалізації цитотоксичної дії ДТ.

На підставі отриманих даних про те, що виділені in vitro В-клітини зі специфічними до ДТ рецепторами є більш чутливими до дії токсину, ніж В-клітини з рецепторами іншої специфічності, вперше запропоновано гіпотезу імунотропного цитотоксичного впливу ДТ. На моделі in vitro також продемонстровано цитотоксичний вплив ДТ на фагоцитарні клітини. Запропоновану гіпотезу щодо імунотропного впливу ДТ було покладено в основу математичної моделі, чисельне рішення якої дозволило описати різні форми перебігу захворювання з наближеною до реальності динамікою.

Аналіз особливостей імунного розпізнавання ДТ за різних форм дифтерійної інфекції в порівнянні з розпізнаванням дифтерійного анатоксину дозволив вперше виявити, що контакт імунної системи з нативним ДТ супроводжується появою значної кількості антитіл до субодиниці А, тоді як внаслідок вакцинації утворюються переважно антитіла до субодиниці В. Ці дані є важливими не тільки для розуміння патогенезу захворювання, але й для розробки нових методів диференційної діагностики дифтерії.

Практичне значення одержаних результатів. Вперше одержано низку важливих інструментів для дослідження ДТ та його рецептора: флуоресцентні похідні фрагментів токсину, рекомбінантні scFv-антитіла проти ДТ. Вперше отримано scFv-антитіла проти ДТ з токсин-нейтралізуючими властивостями.

Отримано низку інших важливих для практичного використання рекомбінантних білків: рекомбінантні аналоги SubА і SubВ ДТ, химерні флуоресцентні похідні субодиниці В, розчинну форму рецептору ДТ, функціональний фрагмент білка А золотистого стафілококу (SpA). Продуценти рекомбінантних субодиниць ДТ, які були отримані на основі штамів Escherichia coli, захищено патентами України.

Відповідність антигенних властивостей рекомбінантних аналогів субодиниць ДТ природному антигену обґрунтовує можливість їх використання для диференційної оцінки рівня антитіл в імунохроматографічному та імуноферментному аналізах, а також як імуногенів для отримання антитіл з протективними властивостями.

Показано принципову можливість використання флуоресцентних зондів на основі SubВ ДТ для оцінки експресії рецепторів HB-EGF на клітинах, а також для дослідження особливостей взаємодії ДТ з рецептором і внутрішньоклітинного трафіку цього комплексу. Розроблено новий метод для визначення токсин-нейтралізуючих антитіл в сироватці крові, який полягає в інгібуванні зв'язування флуоресцентного похідного SubВ ДТ з чутливими до ДТ клітинами in vitro.

Розроблені методики для виявлення ДТ і антитоксичних антитіл в сироватках крові людей, а також для диференційної оцінки рівня антитіл до різних субодиниць ДТ можуть бути застосовані для створення відповідних діагностичних тест-систем. Тест-системи для оцінки антитоксичних антитіл можуть бути використані не тільки для діагностики дифтерії, але й для дослідження напруженості популяційного імунітету до дифтерії серед здорового населення, яке згідно наказу МОЗ України № 545 від 24.11.2003 „Про стан імунітету населення України до дифтерії та правцю” повинно проводитись на певних вибірках людей щорічно.

Розроблені тест-системи для діагностики дифтерії повністю готові до впровадження у випадку погіршення в Україні епідеміологічного стану щодо захворюваності на дифтерію. Виробництво розроблених тест-систем планується на Науково-виробничому об'єднанні АТЗТ «ДіапрофМед», що засвідчено договором про наміри між Інститутом біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України та зазначеною організацією (2006 р.). Розроблені тест-системи мають потенціальну можливість виходу на світові ринки, що було продемонстровано маркетинговими дослідженнями, які проводились консалтинговою фірмою «Nerac» (США) на замовлення Українського науково-технічного центру STCU (2009 р.).

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота спланована і підготована автором особисто. Результати роботи, які викладено в дисертації, одержані під керівництвом автора та за його безпосередньої участі. Планування експериментальної роботи, гіпотези, що були покладені в основу цієї роботи, а також наукові концепції, висунуті при аналізі експериментального матеріалу, були запропоновані дисертантом. Автор висловлює щиру подяку всьому колективу співробітників лабораторії: с.н.с. к.б.н. С.І. Романюк, н.с. к.б.н. А.А. Кабернюку, н.с. к.б.н. О.С. Олійник, м.н.с. Т.А. Редчуку, аспіранту А.Ю. Лабинцеву та пров. інж. Н.В. Короткевич, а також всім співавторам друкованих праць за їх участь у проведенні експериментальних досліджень, цінні ідеї та гіпотези, а також творчий підхід до аналізу результатів. Особливу вдячність автор висловлює науковому консультанту д.б.н., академіку НАН та НАМН України С.В. Комісаренку за допомогу у розробці стратегії наукового пошуку, цінні рекомендації, змістовний аналіз результатів, а також за створення сприятливої атмосфери для проведення наукових досліджень.

Автор глибоко вшановує пам'ять д.б.н., професора Юрія Леонідовича Радавського, який започаткував вивчення антигенних та імунобіологічних властивостей ДТ і, фактично, був ініціатором цього напрямку досліджень.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені більше ніж на двадцяти вітчизняних і міжнародних конференціях, симпозіумах, з'їздах та семінарах. Серед них: Х Український біохімічний з'їзд, м. Одеса, 2010 р.; Міжнародна наукова конференція "Bridges in Life Sciences, I Annual Scientific Meeting", м. Пейч, Угорщина, 2007 р.; IV Літня програма Джона Хамфрі з імунології (Fourth John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology), м. Пущино, Росія, 1998 р.; V З'їзд інфекціоністів України, м. Тернопіль, 1998 р.; X З'їзд педіатрів України, м. Київ, 1999 р.; Міжнародні курси з молекулярної біології та мікробіології для молодих вчених, організовані Угорським Мікробіологічним товариством та Міжнародною школою з молекулярної біології та мікробіології університету Unesco-Hebrew міста Єрусалим (Ізраїль) (International Training Course for Young Scientists organized by the Hungarian Society for Microbiology and the Unesco-Hebrew University of Jerusalem International School for Molecular Biology and Microbiology), м. Кестхей, Угорщина, 2000 р.; конференції молодих вчених “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії”, м. Київ, 2000 р. та 2002 р.; Наукова конференція в рамках спільного засідання відділень молекулярної біології, біохімії, експериментальної та клінічної фізіології і загальної біології НАН України та Вченої ради біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, м. Київ, Україна, 2001 р.; доповідь на Президії НАН України, м. Київ, Україна, 2007 р. Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на засіданнях Вченої ради та наукових семінарах відділу молекулярної імунології Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Публікації. За результатами роботи опубліковано 22 роботи у фахових журналах, в тому числі одна колективна монографія, отримано 2 патенти України на винаходи та надруковано тези 13 доповідей у збірках матеріалів українських і міжнародних наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження, які викладено у 6 розділах, аналізу та узагальнення результатів, висновків, списку використаних джерел (350 найменувань). Роботу викладено на 256 сторінках друкованого тексту та проілюстровано 95 рисунками та 4 таблицями.

Перелік умовних скорочень. АТ - антитіла; ДТ - дифтерійний токсин; рДТ - рекомбінантний дифтерійний токсоїд; DtxR - diphtheria toxin repressor (репресор дифтерійного токсину); SubA - субодиниця А ДТ; SubB - субодиниця В ДТ; ScFv - single chain fragment variable (одноланцюгові варіабельні фрагменти антитіл); ІФА - імуноферментний аналіз; ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція; РПГА - реакція пасивної гемаглютинації; МО - міжнародні одиниці кількості антитіл; Ова - овальбумін; ПДС - протидифтерійна сироватка коня; еEF-2 - eukaryotic elongation factor 2 (фактор елонгації 2 еукаріотів); EGFP - enhanced green fluorescent protein (підсилений зелений флуоресцентний білок); EGFP-SubB - химерний білок, що складається з послідовності EGFP, злитої з субодиницею В ДТ; HB-EGF - heparin binding growth factor like epidermal growth factor (гепарин-зв'язувальний фактор росту, подібний до епідермального фактору росту); proHB-EGF - мембранний попередник HB-EGF, sHB-EGF - soluble HB-EGF (розчинна секреторна форма HB-EGF).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури наведено дані стосовно молекулярно-біологічних властивостей збудника та молекулярних механізмів патогенезу дифтерійної інфекції; описано основні молекулярні фактори вірулентності та патогенності; детально розглянуто структуру та механізм дії ДТ, а також особливості протидифтерійної імунної відповіді; наведено сучасні методи молекулярної діагностики інфекції; проаналізовано молекулярно-епідеміологічні особливості інфекційного процесу, зокрема, причини виникнення епідемії дифтерії на території колишнього СРСР в середині 90-х років минулого сторіччя. Завершується розділ обговоренням перспектив практичного застосування ДТ та його рекомбінантних похідних в молекулярній біотехнології.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У роботі використовували маркери для білкового та ДНК-електрофорезу, набір для виділення ДНК (DNA Extraction Kit), праймери oligo(dT)18, вільну від нуклеаз воду, інгібітор РНКаз (RiboLockTM), полімеразу Taq (Taq-DNA Polymerase), фосфатазу з кишечника теляти, Т4 ДНК лігазу, ендонуклеази рестрикції SfiI, NotI, NcoI, MvaI та інші ферменти для маніпуляцій з ДНК (“Fermentas”, Литва), сефадекс G-25, феніл-сефарозу ("Pharmacia", Швеція), DEAE-целюлозу ("Whatman", Великобританія), білок А стафілококу, кон'югати екстравідину з пероксидазою і стрептавідину з полімерною пероксидазою, кон'югати антитіл кози проти імуноглобулінів людини та миші з пероксидазою, кон'югат антитіл миші проти імуноглобулінів людини класу G з пероксидазою, кон'югат антитіл миші проти полігистидинового тагу з пероксидазою, повний та неповний ад'юванти Фрейнда, діамінобензидин тетрагідрохлорид, 4-хлор-1-нафтол, сироватковий альбумін бика, овальбумін, трипсин, пероксидазу хрону, Ni2+-NTA-агарозу, Hepes, культуральне середовище RPMI-1640, ембріональну сироватку теляти, цефалотин, розчин антибіотику-антимікотику, флуоресцеїну ізотіоционат (FITC), пропідію йодид (PI), N-оксисукцинімідний ефір біотину (“Sigma”, США), бакто-агар (“Helicon”, Россія), нітроцелюлозу, IPTG, кон'югат антитіл миші проти Е-тагу з пероксидазою (HRP/Anti-E Tag Conjugate), набір “Expression Modul Recombinant Phage Antibody System”, набір “RPAS Purification Module”, гуанідину тіоціанат, дезоксірибонуклеотидтрифосфати (“Amersham”, США), дріжджовий екстракт (“Difco Laboratories”, США), протидифтерійну сироватку (ПДС) коня (“НПО Микроген”, Росія), діагностикум еритроцитарний дифтерійний антигенний рідкий (“ОАО Биомед”, Россія), планшети для ІФА, чашки Петрі (“Spektar”, Сербія), канаміцин, хлорамфенікол (“Дарниця”, Україна), триптон (“Fluka”, Франція).

Дослідження проводили з використанням такого обладнання: планшетний спектрофотометр ELx800 (“BIO-TEK”, США), конфокальний мікроскоп Carl Zeiss LSM 510 (“Carl Zeiss”, ФРН), цитофлуориметр Coulter Epics XL (“Beckman Coulter”, США), прилад для напівсухого переносу Hoefer TE 77 (“Amersham”, США), прилад для вертикального електрофорезу Mini-Protein II Electrophoretic Cell (“Bio-Rad”, США), прилад для горизонтального електрофорезу (“Helicon”, Россія), термоциклер AB2720 (“Applied Biosystems”, США), прилад для електротрансформації Electroporator 2510 (“Eppendorf”, ФРН), трансілюмінатор “Vilber Lourmat” TFX - 20.LM та кабінет для гель-документації “Vilber Lourmat” DP - 001.FDC (“Vilber Lourmat”, Франція), ультразвуковий дезінтегратор LabsonicM (“Sartorius”, ФРН), центрифугу MLW T23D (“ELMI”, ФРН) та інше обладнання.

ДТ був люб'язно наданий професором Ю.Л. Радавським, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (м. Київ), дифтерійний токсоїд - к.б.н. В.Г. Пилипенком, АТЗТ НВП „ДіапрофМед” (м. Київ), неімунна бібліотека імуноглобулінових генів миші - к.х.н. О.Г. Ламаном, Пущінський філіал Інституту біоорганічної хімії ім. М.М. Шемякіна та Ю.А. Овчіннікова РАН (м. Пущіно, Росія).

Клітинні лінії Vero, U937 та 3Т3 були отримані з банку клітинних ліній Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

В роботі використано морських свинок (самиці віком 8 місяців), кролів (самці віком 6 місяців) і мишей лінії Balb/c (самиці віком 4 місяці). Проаналізовано 100 сироваток крові, отриманих з Національного медичного університету ім. О.О.Богомольця, серед яких за діагнозом, встановленим на момент госпіталізації, 37 - належали хворим на дифтерію, 29 - носіям токсигенних і 16 - носіям нетоксигенних дифтерійних бактерій, 18 - хворим на інші захворювання верхніх дихальних шляхів та здоровим імунізованим вакциною АКДП. Також було проаналізовано сироватки 57 здорових донорів.

У роботі було використано сучасні експериментальні методи, зокрема: методи молекулярної біології - для створення нетоксичних рекомбінантних аналогів фрагментів ДТ, клонування та аналізу нуклеотидної послідовності їх генів; методи білкової інженерії - для створення рекомбінантних похідних досліджуваних антигенів зі зміненими функціями, наприклад, для одержання флуоресцентних похідних субодиниці В токсину та рекомбінантних scFv-антитіл; методи мікробіології - для одержання рекомбінантних білків в прокаріотичних системах експресії та для селекції рекомбінантних антитіл з фагових бібліотек; методи роботи з культурою еукаріотичних клітин - для вивчення біологічної дії досліджуваних білків на моделі клітин-мішеней in vitro; імунохімічні методи - для аналізу специфічності антитоксичної імунної відповіді та для встановлення антигенної структури досліджуваних антигенів; методи біохімії білків - для очищення препаратів білків та одержання їх функціональних фрагментів; методи конфокальної мікроскопії та цитофлуориметричні методи дослідження - для вивчення та оцінки взаємодії отриманих флуоресцентних похідних ДТ з клітинами, а також методи математичного моделювання і статистичної обробки результатів.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Імунобіологічні властивості рекомбінантних фрагментів ДТ. Вивчення процесів імунного розпізнавання ДТ, а також його взаємодії з клітинами-мішенями потребувало створення нових експериментальних моделей з використанням рекомбінантних аналогів і похідних фрагментів токсину як молекулярних зондів з певними функціями. За допомогою молекулярно-біологічних методів ми одержали низку нетоксичних фрагментів ДТ: його субодиниці А і В та R-домен, які було використано для аналізу імунної відповіді, а також для отримання антитіл заданої специфічності. Крім того, ми створили мічені флуоресцентними білками рецептор-зв'язувальні фрагменти ДТ - субодиницю В та R-домен, що дозволило моделювати та візуалізувати процес взаємодії токсину з клітинами.

Фрагменти генів, що кодують субодиниці ДТ, було отримані з геномної ДНК C. diphtheriae штаму NCTC 10648 (наданий Центральною санітарно-епідеміологічною станцією м. Києва) шляхом ампліфікації з відповідними праймерами, що фланкують їх послідовності.

Клоновані у структурі експресувального плазмідного вектора рЕТ-24а(+) фрагменти ДНК були таких розмірів: 582 п.н. (фрагмент 78-660 гену ДТ) для субодиниці А, що кодує поліпептид, який відповідає N-кінцевому фрагменту зрілого ДТ без сигнального пептиду; та 1019 п.н. (фрагмент 661-1680 гену ДТ) для субодиниці В, що кодує поліпептид, який відповідає С-кінцевому фрагменту молекули ДТ, але містить заміну цистеїну у положенні 202 на гліцин. Секвенування отриманих нами експресувальних векторів було проведено Українською лабораторією якості і безпеки продукції АПК (протокол № 152Л від 21.06.06). Продуцентів досліджуваних білків одержували на основі клітин E.coli штаму Rosetta (DE3). Аналіз експресії показав, що цільові продукти синтезувалися, переважно, у складі тілець включення (рис.1).

	Рис. 1. Електрофоретичний аналіз клітинних фракцій штамів-продуцентів рекомбінантної SubА (а) та рекомбінантної SubВ (б): 1 - тільця включення, 2 - розчинна фракція, 3 - тотальний клітинний лізат штаму-продуценту

Препарати рекомбінантних білків, очищених методом металоафінної хроматографії на агарозі Ni2+-NTA за денатурувальних умов з наступною ренатурацією, мали високу чистоту (рис. 2). Загальний вихід продукту склав 15 мг для SubA та 10 мг для SubB на 1 л клітинної суспензії відповідно.

	Рис. 2. Електрофоретичний аналіз препаратів очищеної рекомбінантної SubА (а) та очищеної рекомбінантної SubВ (б), які було виділено методом металоафінної хроматографії: 1 - препарат очищеного цільового продукту; 2 - білкові маркери молекулярної маси

Відповідність антигенних властивостей рекомбінантних аналогів природному білку є головною умовою, яка дозволяє їх використовувати для аналізу імунної відповіді і моделювання процесів імунного розпізнавання. Вестерн-блот аналіз розпізнавання рекомбінантних субодиниць ДТ протидифтерійною сироваткою коня (рис. 3) показав, що рекомбінантні субодиниці володіють антигенними властивостями, притаманними природному ДТ. Як видно з рисунка, антитоксичні антитіла коня ефективно взаємодіяли як з цілою молекулою ДТ, так і з її субодиницями, утвореними шляхом обмеженого протеолізу нативного токсину, або з їх рекомбінантними аналогами. При цьому ефективність розпізнавання природної і рекомбінантної SubА була значно меншою, ніж природної і рекомбінантної SubВ.

	Рис. 3. Вестерн-блот аналіз розпізнавання рекомбінантних субодиниць та ДТ антитоксичними антитілами коня: 1 - рекомбінантна SubА (1 мкг); 2 - рекомбінантна SubВ (1 мкг); 3 - білкові маркери молекулярної маси; 4 - природний ДТ (1 мкг), частково розщеплений трипсином

Порівняння антигенних властивостей рекомбінантних субодиниць та природного ДТ проводили також в ІФА на масиві сироваток донорів, що мали різні титри антитіл до токсину внаслідок вакцинації згідно національного календаря щеплень. Рівень антитіл до субодиниці В в таких сироватках значно перевищував рівень антитіл до субодиниці А, що дозволило порівняти його з рівнем антитіл до всієї молекули токсину. На рисунку 4 наведено порівняння рівнів сигналу в ІФА для кожної сироватки у розведенні 1:40 до двох антигенів: нативного ДТ та рекомбінантної SubВ. Згідно статистичної обробки результатів кореляція між масивами даних, що характеризували рівень сигналу до цих антигенів, була достатньо високою (рис. 4).

	Рис. 4. Порівняння сигналів в ІФА, що характеризують ефективність розпізнавання природного ДТ та рекомбінантної SubВ антитілами сироваток крові здорових донорів

Cума величин сигналів, отриманих в ІФА при розпізнаванні сироватками субодиниці А та субодиниці В, ще більше наближалась до величини сигналу розпізнавання нативного ДТ. Це є додатковим доказом подібності антигенних властивостей рекомбінантних субодиниць та відповідних ділянок у структурі цілої молекули нативного токсину. На рисунку 5 наведено залежність коефіцієнта достовірності апроксимації R2 між рівнем сигналу до ДТ і сумою сигналів до обох субодиниць при різних розведеннях сироваток. Як видно з діаграми, найбільша кореляція цих показників спостерігалася за розведення сироваток 1/160.

	Рис. 5. Залежність коефіцієнта достовірності апроксимації R2 між рівнем сигналу до ДТ і сумою сигналів до SubА i SubВ в залежності від використаного розведення сироваток

Отже, високий коефіцієнт кореляції між показниками розпізнавання сироватковими антитілами цих антигенів свідчить про те, що антигенні властивості отриманих рекомбінантних субодиниць та природного ДТ є подібними.

Імуногенні властивості рекомбінантних субодиниць ДТ вивчали на чутливих до токсину тваринах - морських свинках і кролях, та нечутливих - мишах. Імунізацію тварин проводили за стандартною схемою: три імунізації з перервами між імунізаціями у 14 днів; антиген вводили в задню частину стегна. Титри антитіл визначали методом непрямого ІФА. Для всіх досліджуваних тварин імуногенність рекомбінантної субодиниці В виявилась значно вищою, ніж субодиниці А, що може бути пов'язано з більшими розмірами цієї субодиниці.

Ефективність формування протективного імунітету оцінювали за здатністю антитіл нейтралізувати мінімальну реактивну дозу токсину у шкірній пробі. Для оцінки антитоксичних властивостей антитіл сироватку крові імунізованих тварин вводили внутрішньошкірно інтактній морській свинці разом із мінімальною реактивною дозою ДТ. Розведені сироватки тварин попередньо інкубували з токсином протягом 1 год. при 37 0С. Для позитивного контролю тваринам було введено таку саму дозу токсину без додавання сироваток. Показано, що сироватки тварин, імунізованих SubВ, виявляли виражені протективні властивості і в розведенні 1:1000 майже повністю нейтралізували мінімальну реактивну дозу токсину. У той же час сироватки тварин, імунізованих SubА, таких властивостей не виявляли, і розмір еритем суттєво не відрізнявся від розміру еритем у контрольній пробі (рис. 6).

	Рис. 6. Розмір еритем у шкірному тесті на морських свинках із введенням ДТ, що був попередньо інкубований із сироватками імунізованих тварин. Токсин вводили в мінімальній реактивній дозі (1/80 від летальної дози LD)

Крім того, напруженість протективного імунітету оцінювали шляхом порівняння результатів шкірного тесту на імунізованих різними субодиницями ДТ та інтактних тваринах. Було показано, що у разі введення кролям, імунізованим SubВ, мінімальної реактивної дози ДТ, еритема не проявлялась або мала незначний розмір. На тваринах, імунізованих SubА, та у інтактної тварини утворювалися значні за розмірами еритеми (рис. 7).

	Рис. 7. Розмір еритем у шкірному тесті на кролях, імунізованих рекомбінантними субодиницями ДТ. K - контроль

Отже, подібність антигенних властивостей рекомбінантних субодиниць та відповідних ділянок природного токсину дозволила використати рекомбінантні антигени для дослідження процесів імунного розпізнавання ДТ, а також для створення відповідних діагностичних тест-систем з оцінки рівня антитоксичного імунітету. Оскільки антитіла, що з'являються при імунізації рекомбінантною субодиницею В, здатні нейтралізувати токсичну дію ДТ, запропоновано використання цієї субодиниці як безпечнішої порівняно з природним ДТ для розробки новітніх вакцинних препаратів.

Дослідження взаємодії токсину з клітинами за допомогою флуоресцентних похідних фрагментів ДТ. Для дослідження процесів взаємодії ДТ з поверхнею клітин та поглинання клітиною комплексу токсин-рецептор було створено флуоресцентні похідні В-субодиниці ДТ та її R-домену, а також визначено їх здатність специфічно взаємодіяти з рецепторами клітин. Флуоресцентні похідні було одержано шляхом об'єднання нуклеотидної послідовності, що кодує відповідний фрагмент ДТ, з геном, що кодує підсилений зелений флуоресцентний білок EGFP.

На рисунку 8 наведено схему експресійного вектора на основі плазміди pET-24a(+), що був створений для одержання злитого білка EGFP-SubB. За своєю структурою злитий білок відповідає ДТ, в якому замість субодиниці А до N-кінця субодиниці В приєднано EGFP. Секвенування отриманої послідовності ДНК проводилось в Українській лабораторії якості і безпеки продукції АПК (протокол № 0107 від 25.06.08).

Загальний вихід розчинного рекомбінантного білка EGFP-SubB складав 20 мг на 1 л клітинної суспензії.

	Рис. 8. Будова експресуваль-ного вектора pET-24а-EGFP-SubB: EGFP та SubB - фрагменти відповідних генів, BamHI, AatII та XhoI - сайти гідролізу для відповідних рестриктаз, T7 promoter - промотор фагу T7, 6xHis Tag - послідовність гексагістидинової мітки

Для визначення здатності одержаного флуоресцентного похідного SubВ ДТ специфічно взаємодіяти з рецептором HB-EGF на поверхні клітин методом протокової цитофлуориметрії було проведено дослідження флуоресценції чутливих до ДТ клітин лінії Vero, забарвлених цим флуоресцентним похідним (рис. 9).

Клітинна лінія Vero, що походить з епітелію нирки африканської зеленої мавпи Cercopithecus aethiops, завдяки високому рівню експресії рецептора ДТ proHB-EGF (1-2*105 рецепторів/клітину) є класичною моделлю чутливих до ДТ клітин, що зазвичай використовують для оцінки функціональної активності токсину та вивчення особливостей його рецепції.

	Рис. 9. Порівняльна гісто-грама розподілу за інтенсивністю флуоресценції клітин лінії Vero, забарвлених EGFP-SubB, вільним EGFP та незабарвлених (контроль) у протоковій цитофлуориметрії

Конкурентний аналіз підтвердив специфічність зв'язування флуоресцентних похідних з клітинами, оскільки у разі додавання неміченої субодиниці В спостерігалося зниження інтенсивності флуоресценції, яка залежала від кількості конкурентного інгібітору.

Специфічність взаємодії клітин лінії Vero з флуоресцентними похідними субодиниці В підтверджено також за допомогою конфокальної мікроскопії (рис. 10).

	Рис. 10. Конфокальні знімки клітин лінії Vero, забарвлених різними флуоресцентними білками у концентрації 385 нM: а - EGFP (контроль); б - EGFP-SubB. Ядра клітин контрастовані йодидом пропідію (РІ)

За умов конкурентного інгібування зв'язування EGFP-SubB із клітинами лінії Vero при додаванні вільної рекомбінантної субодиниці В спостерігалось дозозалежне візуальне зменшення флуоресценції клітин (рис. 11).

	Рис. 11. Конкурентне інгібування флуоресценції клітин лінії Vero, забарвлених EGFP-SubB (а) при додаванні вільної SubB (б) у співвідношенні 1:2. (EGFP-SubB - 385 нM, SubB - 770 нМ)

Для дослідження процесів поглинання EGFP-SubB після зв'язування з рецепторами на чутливих до ДТ клітинах лінії Vero методом конфокальної мікроскопії був використаний інгібітор ендоцитозу - феніларсеноксид, який у концентрації 10 мкМ здатен повністю пригнічувати ендоцитоз в клітинах, зокрема, за клатрин-залежним механізмом, без значного впливу на інші внутрішньоклітинні процеси протягом 20 хв. Було показано, що феніларсеноксид в такій концентрації пригнічував входження EGFP-SubB всередину клітини, при цьому мітка залишалася зв'язаною з поверхнею клітини (рис. 12). Це свідчило про те, що ендоцитоз флуоресцентно-міченої субодиниці В, як і природного токсину, відбувався після специфічного зв'язування з рецептором на мембрані клітини, ймовірно, за клатрин-залежним механізмом.

	Рис. 12. Конфокальні знімки клітин лінії Vero, забарвлених EGFP-SubB у концентрації 145,4 нМ без додавання (а) та з додаванням (б) 10 мкМ феніларсеноксиду

Отже, білок EGFP-SubB є нетоксичним похідним ДТ, що дозволяє використовувати його як молекулярний інструмент для досліджень процесів взаємодії токсину з клітинами. На нашу думку, EGFP-SubB може бути використаний у протоковій цитофлуометрії для порівняння рівня експресії рецепторів proHB-EGF на клітинах, а також для дослідження особливостей рецепції токсину резистентними клітинами. Ми застосували цей білок для оцінки антитоксичних властивостей антитіл (в тому числі і рекомбінантних scFv-антитіл), що здатні блокувати зв'язування токсину з рецепторами.

Клітини більшості ссавців є високочутливими до ДТ, але клітини деяких видів ссавців (мишей та щурів) виявляють резистентність до його дії. Проте, механізми резистентності клітин гризунів до дії ДТ залишаються нез'ясованими. Для дослідження особливостей взаємодії ДТ з чутливими і резистентними клітинами було застосоване флуоресцентне похідне EGFP-SubB. Як модельні об'єкти ми використали лінії клітин чутливих (мавпячі клітини лінії Vero) та нечутливих (мишачі клітини лінії 3Т3) до ДТ видів ссавців. Виявилось, що EGFP-SubB у концентрації 290,8 нМ не тільки зв'язувався з поверхнею клітин, але через 20 хв. проникав всередину як клітин лінії Vero (рис. 13 а), так і клітин лінії 3Т3 (рис. 13 б).

	Рис. 13. Конфокальні знімки клітин лінії Vero (а) та 3Т3 (б), забарвлених EGFP-SubB. Ядра клітин лінії Vero контрастовані йодидом пропідію (РІ), а 3Т3 - барвником Hoechst 33342

Зв'язування флуоресцентної SubB з поверхнею клітин та поглинання утвореного комплексу відбувалося в клітинах обох ліній, хоча вони відрізняються за чутливістю до ДТ більше ніж в 1000 разів. Отже, резистентність до дії ДТ клітин деяких видів ссавців, зокрема мишей, обумовлена не тим, що токсин не здатний зв'язуватись з поверхнею або проникати всередину цих клітин, а, ймовірно, іншими факторами, наприклад, високою активністю ендосомальних протеїназ в клітинах гризунів, відсутністю необхідних для перенесення каталітичної субодиниці корецепторних молекул тощо.

Одержання специфічних до ДТ scFv-антитіл та дослідження їх здатності нейтралізувати його токсичну дію. Для селекції scFv-антитіл проти ДТ було використано як наївну бібліотеку імуноглобулінових генів миші, сконструйовану у Пущінському філіалі інституту біоорганічної хімії ім. М.М. Шемякіна та Ю.А. Овчіннікова РАН (м. Пущіно, Росія), так і імунну бібліотеку, одержану нами в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. При цьому ми ставили за мету порівняти ефективність процесу одержання токсин-специфічних антитіл з обох бібліотек та дослідити їх властивості.

З наївної бібліотеки після селекції фагових частинок на дифтерійному токсоїді було відібрано 52 позитивні колонії, але для подальшої роботи було відібрано тільки один із клонів, названий scFv II-15, периплазматичний екстракт якого давав найвищій сигнал в ІФА. При використанні вектору pCANTAB-5Е для експресії цільового білка загальний вихід продукту, виділеного з периплазматичного екстракту і культурального середовища (рис. 14), складав близько 690 мкг/л.

Виділені scFv реагували в ІФА з дифтерійним токсоїдом і не реагували з контрольним антигеном (знежиреним молоком). Вони зберігали свою антиген-зв'язувальну активність протягом принаймні 6 місяців зберігання.

Було встановлено, що scFv II-15 здатні зв'язуватися з природним ДТ та є специфічними до його рецепторзв'язувальної субодиниці В. Константа афінності scFv клону II-15 до ДТ склала 1,13*107 М-1. Оскільки антитіла саме до субодиниці В володіють найбільшими протективними властивостями, можна було очікувати наявність токсин-нейтралізуючих властивостей у отриманих scFv-антитіл.

	Рис. 14. Електрофоретичний аналіз афінно-очищених scFv ІІ-15. 1 - периплазматичний екстракт, 2 - цільовий білок, виділений з периплазматич-ного екстракту, 3 - білок, виділений із середовища культивування, 4 - імуноблот-аналіз препарату scFv, М - маркери молекулярної маси

Для забезпечення можливості отримання scFv-антитіл у великих кількостях було створено продуцент на основі штаму E. coli Rosetta та вектору pET-22b, що містить сигнал транспортування рекомбінантного білка до периплазми та гістидиновий таг для очищення на Ni-NTA агарозі. З використанням ІФА було показано, що виділені scFv після рефолдингу специфічно розпізнавали SubB токсину та не зв'язувались з контрольним антигеном (знежиреним молоком). Сумарний вихід цільового білка після рефолдингу склав близько 6 мг/л, що майже в 10 разів більше, ніж при використанні вектору pCANTAB-5Е.

Для створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів використовували РНК, виділену з селезінок мишей, попередньо імунізованих рекомбінантними субодиницями А та В ДТ. Фрагменти генів, що кодують VH- та VL-домени антитіл, ампліфікували окремо, продукти ампліфікації змішували у еквімолярних співвідношеннях та об'єднували методом SOE-PCR (SOE-PCR - від англ. Splicing by Overlapping Extension PCR - ПЛР за „кінцями, що перекриваються”) (рис. 15).

	Рис. 15. Ампліфікація ДНК послідовностей імуноглобулінових VH- та VL-доменів (а) та їх об'єднання у scFv-антитіла методом SOE-PCR (б). 1, 2, 3 ? VH; М ? маркери; 4, 5, 6 ? VL; 7 ? scFv

В результаті селекції фагів з імунної бібліотеки було відібрано близько 20 клонів-продуцентів scFv, периплазматичні екстракти яких реагували з субодиницею В ДТ в ІФА. Для подальшої роботи було обрано вісім найбільш активних клонів, а саме клони 14, 30, 42, 51, 56, 61, 94, 120. Для спрощення процедури виділення та очищення ДНК-послідовності відібраних scFv субклонували у експресійному векторі рЕТ-22b.

Аналіз клітинних екстрактів отриманих продуцентів методом електрофорезу показав, що scFv містилися переважно у нерозчинній фракції білків. Очищення проводили за денатурувальних умов з подальшим рефолдингом виділених білків, в результаті нами було виділено scFv у розчинній формі.

Теоретичне різноманіття отриманої імунної до ДТ бібліотеки scFv складало приблизно 106 клонів. Рестриктний аналіз ендонуклеазою MvaI восьми клонів scFv, відібраних із імунної бібліотеки, показав наявність різних за розміром рестриктних фрагментів для кожної ДНК-послідовності, що свідчило про відсутність тотожних копій серед відібраних клонів (рис. 16).

Всі отримані клони scFv реагували в ІФА з рекомбінантною субодиницею В, та не реагували з БСА та іншими контрольними антигенами (овальбуміном, знежиреним молоком). Здатність виділених scFv-антитіл проти рекомбінантної SubВ розпізнавати цільову послідовність субодиниці В була підтверджена також з використанням SubВ, отриманої з використанням іншого вектора pGEX-4T-1, що кодує альтернативний таг (GST-таг).

	Рис. 16. Рестриктний аналіз гетерогенності ДНК-послідовностей scFv, відібраних із імунної бібліотеки: 1 - scFv14; 2 - scFv30; 3 - scFv42; 4 - scFv51; 5 - scFv56; 6 - scFv61; 7 - scFv94; 8 - scFv120; М - маркери

Для відбору scFv, що володіють токсин-нейтралізуючою активністю було перевірено здатність кожного із них перешкоджати зв'язуванню злитого білка EGFP-SubB з поверхнею чутливих клітин лінії Vero. Для визначення токсин-нейтралізуючих властивостей scFv-антитіл EGFP-SubB перед забарвленням клітин інкубували протягом години у присутності відповідних scFv. Як позитивний контроль використовували пробу з EGFP-SubB без scFv-антитіл. Негативним контролем були проби без додавання EGFP-SubB та scFv-антитіл. Із дев'яти досліджених клонів, чотири scFv-антитіла (scFv II-15, scFv30, scFv42 та scFv120) повністю перешкоджали зв'язуванню токсину із поверхнею клітин, які мають відповідний рецептор.

Здатність цих scFv нейтралізувати цитотоксичну активність ДТ було оцінено за допомогою МТТ-тесту. Для цього використовували чутливі до токсину клітини лінії Vero. При досліджені нейтралізуючих властивостей scFv-антитіл клітини культивували протягом 5 діб за температури 37 0С у присутності ДТ та різних розведень scFv-антитіл. Було показано, що додавання токсин-нейтралізуючих scFv в 20 кратному молярному надлишку до ДТ в середньому на 20-30 % підвищувало рівень виживання клітин. Клони, які були виділені з імунної бібліотеки, продукували більш афінні scFv, ніж отриманий з наївної бібліотеки клон ІІ-15. Порівняння властивостей отриманих scFv наведено в таблиці 1.

Таблиця 1.

Афінність до ДТ та токсин-нейтралізуючі властивості деяких клонів scFv, відібраних з наївної та імунної бібліотек

	З наївної бібліотеки	З імунної бібліотеки
Клони scFv, не здатні нейтралізувати токсин	Назва клону	Ка, М-1	Назва клону	Ка, М-1
			scFv14	1,63·108
			scFv51	3,98·108
			scFv56	1,12·109
			scFv61	5,08·107
			scFv94	2,08·108
Токсин-нейтралізуючі клони scFv	scFvІІ-15	1,13·107	scFv30	5,42·108
			scFv42	6,7·107
			scFv120	1,1·108

Отже, нами було відібрано чотири scFv антитіла, що проявляли здатність нейтралізувати цитотоксичну активність ДТ. Всі вони розпізнавали субодиницю В токсину. Один з клонів-продуцентів таких антитіл був відібраний з наївної бібліотеки, а 3 - з імунної. Токсин-нейтралізуючі scFv-антитіла можуть виявитись перспективними претендентами на роль новітніх імунотерапевтичних препаратів для лікування дифтерії.

Цитотоксичний вплив ДТ на клітини імунної системи. Роль ДТ у пригніченні імунної системи хазяїна здається очевидною, про що можуть свідчити дані клінічних спостережень за показниками імунітету у хворих і носіїв, проте конкретні мішені впливу ДТ на імунну систему та механізми його розпізнавання клітинами-мішенями залишаються недостататньо вивченими. Це питання є особливо важливим для з'ясування загальної картини патогенезу дифтерійної інфекції, оскільки ДТ розглядають не тільки як фактор, що призводить до токсичного ураження організму, але й як фактор, що сприяє утворенню первинного вогнища інфекції та розвитку інфекційного процесу. Непрямим доказом останнього є імперичне спостереження, що антитіла проти ДТ здатні захищати організм від інфекції.

Взаємодія чужорідних антигенів з клітинами імунної системи, наприклад, під час презентації антигенів, супроводжується поглинанням антигенів фагоцитами або В-лімфоцитами, що зв'язали антиген внаслідок розпізнавання імуноглобуліновими рецепторами. Цей процес призводить до потрапляння молекули білка в ендосому з кислим середовищем, необхідним для його активації. Нами була висунута гіпотеза, згідно якої ДТ може проникати в В-лімфоцити, що несуть на своїй поверхні специфічні до нього імуноглобулінові рецептори, чи в фагоцити, які здатні до неспецифічного поглинання ДТ.

Для перевірки цієї гіпотези були проведені порівняльні дослідження цитотоксичної дії ДТ на клітини імунної системи нечутливих до ДТ мишей, у яких зв'язування токсину з рецептором proHB-EGF не призводить до загибелі клітин, і чутливих до ДТ морських свинок. Якщо ДТ здатний проникати в клітину через специфічні до нього імуноглобулінові рецептори, то В-клітини, специфічні до ДТ, повинні бути більш чутливими до токсину, ніж В-клітини, специфічні до контрольного антигену, наприклад, овальбуміну. В-клітини різної специфічності з чистотою біля 80% одержували від імунізованих відповідними антигенами морських свинок і мишей за допомогою афінного виділення на пластиковій поверхні з сорбованим антигеном. Виявилось, що майже половина В-клітин мишей, що мали специфічні до нього імуноглобулінові рецептори, гинули при інкубації з токсином, в той час як життєздатність В-клітин мишей, специфічних до овальбуміну, при інкубації з токсином майже не змінювалася в порівнянні з контролем (рис. 17). У морських свинок життєздатність В-клітин, специфічних до ДТ, зменшувалася вдвічі більше у порівнянні з В-клітинами, специфічними до овальбуміну.

	Рис. 17. Виживання В-клітин різної специфічності при дії ДТ (10 нг/мл). а - В-клітини миші, б - В-клітини морської свинки. б-Ова - В-клітини, специфічні до овальбуміну, б-ДТ - В-клітини, специфічні до рДТ. Примітка. * - статистично достовірні за критерієм Стьюдента відмінності від контролю, р<0,001

Отже, специфічний до антигену рецептор В клітин може виступати у ролі рецептора ДТ на цих клітинах. Рецепція токсину в такий спосіб призводить до загибелі частини В-лімфоцитів, які могли б перетворитися на плазмитичні клітини, здатні синтезувати антитоксичні антитіла. А це означає, що ДТ повинен пригнічувати гуморальну імунну відповідь, спрямовану проти себе. Однак, під час перебігу дифтерійної інфекції завжди спостерігається поступове підвищення титрів антитоксичних антитіл. Отже, реалізація цієї функції не є повною, і, можливо, залежить від специфічності рецепторів В-лімфоцитів до певних ділянок молекули токсину, а також, від ефективності попередньої імунізації організму. Також ймовірно, що ДТ в крові хворого здатний розщеплюватися під дією протеїназ, що призводить до вивільнення неактивних фрагментів токсину, кожний з яких самостійно виступає в ролі незалежного імуногену та індукує появу антитіл до себе.

Нами також вивчено вплив ДТ у різних концентраціях (від 0,1 нг/мл до 10 нг/мл) на життєздатність адгезивних фагоцитів, виділених з селезінки мишей і морських свинок, до яких, насамперед, належать макрофаги. При дослідженні чутливості до ДТ фагоцитів мишей і морських свинок виявилося, що ДТ знижував життєздатність фагоцитів і мишей (приблизно 50% клітин загинули за концентрації ДТ 10 нг/мл), проте його цитотоксична дія на фагоцити морських свинок була сильнішою (приблизно 80% клітин, які загинули від тієї ж концентрації ДТ) (рис. 18). Це, можливо, пояснюється тим, що ДТ, який неспецифічно поглинається клітинами шляхом фагоцитозу або макропіноцитозу, може призводити до їх загибелі.

...