Молекулярні механізми імунного розпізнавання дифтерійного токсину

ДТ також негативно впливає на функціональну активність фагоцитів мишей. Так, здатність фагоцитів мишей поглинати спори бактерій Bacillus cereus при інкубації з ДТ зменшувалась в 3,6 рази.

Отже, отримані результати свідчать, що ДТ може проникати у фагоцити і специфічні до нього В-лімфоцити й викликати загибель цих клітин навіть у нечутливих до нього видів тварин. Існує ймовірність протікання таких процесів у людини під час розвитку інфекційного процесу. Це означає, що ДТ може перешкоджати розвитку специфічної до нього гуморальної імунної відповіді і пригнічувати фагоцитоз коринебактерій, що його продукують. Отже, отримані дані можуть стати одним із пояснень того, чому токсигенність коринебактерій дозволяє їм уникати фагоцитарної ланки місцевого імунітету. Нейтралізація токсину антитілами хазяїна або антитілами з терапевтичної антитоксичної сироватки призводить до відновлення фагоцитарних функцій і звільнення організму від патогенних бактерій.

Дослідження процесів імунного розпізнавання ДТ та розвитку інфекції за допомогою методів математичного моделювання. Отримані результати щодо впливу ДТ на місцеві фагоцитарні клітини лягли в основу створення математичної моделі дифтерійної інфекції. Моделювання зазначених механізмів реалізації патогенного впливу ДТ на організм дозволяє оцінити їх реалістичність.

Наведені вище теоретичні положення можна представити у вигляді системи з 5 диференційних рівнянь першого порядку, що описують динаміку кількості коринебактерій, ДТ, антитоксичних антитіл, макрофагів і В-лімфоцитів, по аналогії з системою рівнянь Лотки-Вольтерра, яка була запропонована в екології для опису взаємовідносин популяцій за типом хижак-жертва (паразит-хазяїн). Наприклад, зміну кількості макрофагів в зоні запалення dМ(t)/dt можна виразити як функцію від кількості коринебактерій С(t) і дифтерійного токсину D(t):

Перший член у правій частині рівняння описує міграцію фагоцитів у зону запалення, що залежить від кількості бактерій (a1 - коефіцієнт міграції). Другий член описує загибель фагоцитів від ДТ, де k1 - коефіцієнт ймовірності такої зустрічі. Третій член відображає природну загибель або еміграцію фагоцитів з осередку запалення (m - коефіцієнт еміграції, а Мo - постійний рівень резидентних фагоцитів).

Рівняння, що входять в систему, є нелінійними диференційними рівняннями першого порядку, які можна розв'язати за допомогою чисельного методу Рунге-Кутта. Чисельний розв'язок системи рівнянь дозволив проаналізувати динаміку всього інфекційного процесу, при цьому були отримані різні варіанти розв'язку, що відповідають різним формам протікання інфекції: гостра інфекція, одужання організму, хронічний процес і летальний випадок. Зокрема, хронічний процес або довготривале носійство можна розглядати як стаціонарний розв'язок системи рівнянь. За допомогою цієї системи рівнянь можливо також провести моделювання ефекту введення антитоксичної ПДС коня та проаналізувати, який вплив на динаміку інфекційного процесу здійснює введення в той чи інший момент часу визначеної кількості антитоксичних антитіл. Дослідження поведінки математичної моделі дозволило також змоделювати початкові етапи дифтерійної інфекції та визначити мінімальну дозу C. diphtheriae, здатну викликати інфекційний процес, в залежності від стану антитоксичного імунітету хазяїна.

Запропонована математична модель дозволила також відтворити експерименти, що стосуються тестування токсигенності дифтерійних бактерій in vivo на морських свинках. Відомо, що при введенні цим тваринам підшкірно 0,2 мл суспензії, що містить 20 мільйонів токсигенних дифтерійних бактерій морські свинки вмирають після зараження. Це означає, що кількість ДТ досягає летальної дози у перші дні зараження. Доза ПДС 1000 МО, введена до зараження, цілком блокує розмноження дифтерійних бактерій, а доза 125 МО - рятує тварин від смерті, але не від розвитку інфекції. На рисунку 19 зображені всі три варіанти динаміки росту бактерій за різних умов зараження морських свинок, розраховані за допомогою моделі.

Отже, моделювання інфекційного процесу при дифтерії математичними методами реалістично відображає динаміку основних показників імунітету з урахуванням індивідуальних особливостей хворого та моделює всі основні можливі стани взаємовідносин збудник-хазяїн (одужання, хронічний процес, летальний випадок), що є додатковим свідченням на користь висунутої нами гіпотези щодо імунотропної цитотоксичної активності ДТ.

Розробка тестів для виявлення циркулюючого ДТ і оцінки антитоксичного імунітету. Розробка та впровадження нових методів молекулярної діагностики дифтерії мають бути спрямовані на збільшення специфічності, чутливості та швидкості встановлення діагнозу. Особливо важливими є тести для виявлення активного ДТ та для оцінки кількості, специфічності та протективних властивостей антитоксичних антитіл. Так, розробка методів експресного визначення вмісту ДТ в біологічних рідинах (в крові, слині, змивах з горла) та в культуральних середовищах коринебактерій дозволить набагато швидше у порівнянні з традиційними методами визначення токсигенності встановлювати діагноз при дифтерії, а також приймати рішення щодо доцільності проведення антитоксичної терапії. Найважливішим з практичної точки зору завданням цієї частини роботи була розробка методу виявлення вільного функціонально активного токсину, що циркулює у крові хворих, оскільки саме ця інформація є важливою для передбачення розвитку ускладнень і для призначення хворому антитоксичної терапії.

Нами було оцінено чутливість таких методів визначення ДТ: класичного сандвіч-ІФА з використанням антитоксичних антитіл коня як нижнього (захоплюючого) і верхнього (детектувального) шару (а); сандвіч-ІФА з використанням рекомбінантної гібридної молекули, що складається з одноланцюгового антитіла проти ДТ та білка А стафілококу (ScFv-SpA), як детектувального шару (б); і ліганд-рецепторного сандвіч-ІФА, в якому замість антитіл нижнього шару для уловлювання антигену був використаний рекомбінантний аналог sHB-EGF - розчинної форми рецептору ДТ (в) (рис. 20).

Порівняння запропонованих методів виявлення ДТ показало, що вони мають різну граничну чутливість виявлення ДТ. Так, метод 1 (рис. 20 а) з використанням полімерної пероксидази, кон'югованої зі стрептавідином, характеризувався найбільшою чутливістю детекції ДТ - 1 нг/мл, що дозволило застосувати його з діагностичною метою.

Для створення злитої конструкції scFv-SpА використовували ДНК-послідовності специфічних до ДТ scFv, які були відібрані з імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші, та послідовність ДНК, що кодує функціональний фрагмент білка А стафілококу. Дизайн такої гібридної конструкції дозволяє використовувати для її детекції будь-які комерційно-доступні кон'югати імуноглобулінів з пероксидазою хрону (рис. 20 б). У разі використання послідовності scFv30 у складі злитої конструкції scFv-SpА гранична чутливість аналізу була найвищою і складала біля 8 нг/мл.

При розробці ліганд-рецепторного сандвіч-ІФА замість антитіл нижнього шару використовували рекомбінантний аналог sHB-EGF, а замість антитіл верхнього шару для детекції комплексу sHB-EGF з ДТ або SubB використовували біотинильовані F(ab)'2-фрагменти антитіл коня та стрептавідин, кон'югований з полімерною пероксидазою хрону (рис. 20 в).

Рис. 20. Три методи сандвіч-ІФА для виявлення ДТ з використанням F(ab')2-фрагментів поліклональних антитіл коня: а - класичний сандвіч-ІФА; б - сандвіч-ІФА з використанням рекомбінантної гібридної молекули ScFv-SpA в якості детектувального шару; в - ліганд-рецепторний сандвіч-ІФА з використанням рекомбінантного аналогу sHB-EGF для уловлювання ДТ

Рівень сигналу в ліганд-рецепторному сандвіч-ІФА був достовірним за концентрації ДТ 1,9 нг/мл (рис. 21). Використання гепарину для стабілізації молекули sHB-EGF не призвело до суттєвого підвищення чутливості методу. Незважаючи на те, що запропонований ліганд-рецепторний метод визначення ДТ виявив нижчу чутливість у порівнянні з класичним сандвіч-ІФА, він мав суттєву перевагу, оскільки дозволяв виявляти лише функціонально активні молекули токсину, які здатні зв'язуватися з рецептором і проникати в клітину-мішень.

Для оцінки рівня антитоксичних антитіл використовували класичний непрямий ІФА з використанням у якості антигенів природного ДТ, нетоксичного токсоїду рДТ або рекомбінантних субодиниць А і В ДТ.

Результати визначення титру антитіл в ІФА порівнювали з результатами РПГА. На рисунку 22 наведено діаграму, що відображає рівні сигналу в ІФА до нативного ДТ для 57 сироваток донорів з різними титрами антитіл згідно РПГА.

Відповідно до інструкцій МОЗ України сироватки, які мають у РПГА титр 1:40, вважаються такими, що володіють захисним титром. У деяких сироватках, що мали за результатами РПГА титри 1:40 і навіть 1:80, за результатами ІФА були виявлені дуже низькі титри антитоксичних антитіл (рис. 22). Отримані за допомогою ІФА дані про рівні антитіл можна розглядати як більш коректні, оскільки РПГА має ряд істотних недоліків у порівнянні з ІФА. Так, найбільшими аглютинуючими властивостями в РПГА володіють антитіла класу М, які не можуть проявляти достатньої антитоксичної дії і характеризувати довготривалу імунну відповідь. Крім того, еритроцитарний діагностикум більш чутливий до впливу неспецифічних факторів (наприклад, поліреактивних антитіл).

Отже, твердофазні імуноферментні тест-системи з використанням природного ДТ або його рекомбінантних субодиниць можна запропонувати замість РПГА для проведення скринінгових досліджень напруженості антитоксичного колективного імунітету серед здорового населення. Такі дослідження необхідні для моніторингу стану захищеності населення від дифтерії та прогнозування епідеміологічної ситуації.

Нами також було розроблено прототипи імунохімічних твердофазних тест-систем з використанням рекомбінантних аналогів субодиниць А і В ДТ, які дають можливість визначати наявність антитіл до окремих субодиниць ДТ в сироватках крові. Оскільки клоновані нами рекомбінантні аналоги субодиниць ДТ зберігають антигенні властивості природного токсину, вони можуть бути застосовані для оцінки рівня антитоксичних антитіл в ІФА. Диференційне вимірювання рівня антитоксичних антитіл до окремих субодиниць токсину важливе для діагностики дифтерії і для контролю за перебігом хвороби, а також для оцінки рівня імунітету у здорових людей в популяції з профілактичною метою, наприклад, для контролю за ефективністю вакцинації.

Окрім тест-систем на основі ІФА для визначення антитіл проти токсину було запропоновано також швидкі тести, засновані на принципі латеральної протокової імунохроматографії. Принцип дії таких тестів заснований на візуалізації комплексів антиген-антитіло за допомогою наномітки, наприклад, колоїдного золота. Застосування таких тестів виправдане у випадках, коли необхідно максимально скоротити час проведення аналізу, наприклад, в амбулаторних умовах.

Для синтезу наночасток колоїдного золота використовували натрій-цитратний метод, заснований на відновленні цитратом натрію золотохлористоводневої кислоти за наявності танінової кислоти та карбонату калію. Всього було досліджено сім схем синтезу, що відрізнялися за вмістом окремих компонентів реакційної суміші. Кон'югацію наночасток золота з рекомбінантним стафілококовим білком А (SpA) проводили шляхом сорбції з наступним блокуванням вільної поверхні наночасток функціонально-інертним білком (наприклад, знежиреним молоком). Аналіз зразків колоїду методами електронної мікроскопії дозволяв визначити відмінності між пробами наночасток золота, синтезованого за різними схемами, а також його кон'югатами з SpA (рис. 23).

Рис. 23. Електронні мікрофотографії різних проб колоїдного золота 1-7(-) та кон'югатів проб колоїдного золота з білком А 1-7(+) відповідно. На гістограмі 8 подано результати розрахунків середніх значень розміру частинок колоїдного золота в кожній пробі за даними електронної мікроскопії

За результатами імунохроматографічного тесту всі кон'югати володіли здатністю розпізнавати імуноглобуліни, нанесені на тестову смугу (рис. 24), проте з різною ефективністю. Крім того, деякі кон'югати утворювали помітне фонове забарвлення нітроцелюлозних смуг, що заважало ефективному проведенню аналізу. Найкращими властивостями щодо ефективності виявлення імуноглобулінів і рухливості у товщі мембрани володів кон'югат SpA з колоїдним золотом з проби №7, яка синтезувалася за наступним прописом реакційної суміші (50 мкл 1% HAuCl4+ 200 мкл 1% Na3C6H5O7 + 50 мкл 1% К2СО3 + 7,5 мкл 0,03% C76H52O46 + Н2О до 1 мл), де Na3C6H5O7 - цитрат натрію, а C76H52O46 - танінова кислота. Саме цей кон'югат було використано в подальших дослідженнях для розробки імунохроматографічних тест-систем для виявлення антитіл проти SubB ДТ.

Результати імунохроматографічного аналізу вмісту антитоксичних антитіл оцінювали візуально по трибальній шкалі (-), (+) і (++). Порівняння результатів імунохроматографії та ІФА показує (рис. 25), що серед сироваток з високим сигналом у ІФА (рівень сигналу > 0,2 за розведення 1:80) тільки одна сироватка дала хибно-негативну реакцію в імунохроматографічному тесті (результат оцінки реакції був (-)). Водночас серед сироваток з результатом оцінки імунохроматографічної реакції (++) тільки одна сироватка мала рівень сигналу <0,2 за розведення 1:80 в ІФА. Проте серед сироваток з сумнівною оцінкою результатів імунохроматографії (результат оцінки реакції - (+)) біля 60% відносилися до сироваток з високим рівнем сигналу, а біля 40% - до сироваток з низьким рівнем сигналу згідно даних ІФА.

Отже, подальше вдосконалення цієї методики потребує розробки системи апаратної візуалізації сигналу, наприклад за допомогою сканувального пристрою, щоб уникнути суб'єктивності в оцінці сумнівних результатів.

Для оцінки токсин-нейтралізуючих властивостей антитіл in vitro нами запропоновано новий підхід, що базується на оцінці зв'язування В-субодиниці з поверхнею клітин, преінкубованих з EGFP-SubB, за допомогою проточної цитофлуориметрії. У разі присутності у сироватці крові імунізованих тварин токсин-нейтралізуючих антитіл попередня інкубація сироватки з EGFP-SubB має призводити до зменшення інтенсивності флуоресценції клітин, що буде свідчити про блокування взаємодії субодиниці В із рецептором на поверхні клітин.

Титрування антитоксичних сироваток показало, що зі збільшенням кількості сироватки спостерігається дозозалежне зменшення сигналу. Для ПДС коня в межах використаних розведень ефект інгібування був максимальним, оскільки вміст антитоксичних антитіл в ній був дуже високим (100 МО/мл). Крім того, специфічне блокування взаємодії EGFP-SubB із рецептором було показано також у разі використання сироватки, отриманої від імунізованого SubВ кроля (рис. 26), на відміну від сироваток неімунної або імунізованої SubА тварин. У разі передінкубації EGFP-SubB з сироваткою кроля, імунізованого субодиницею А, та з контрольною сироваткою, спостерігалось незначне зниження сигналу, обумовлене впливом неспецифічних факторів.

Рис. 26. Інтенсивність флуоресценції клітин, забарвлених EGFP-SubB, за присутності антитоксичних антитіл (сироваток). За 100% брали інтенсивність флуоресценції клітин, забарвлених EGFP-SubB за відсутності антитіл у пробі:

1 - сироватка у розведенні 1:33; 2 - сироватка у розведенні 1:67

Одержані результати підтверджують здатність сироваткових антитіл проти субодиниці В ДТ специфічно блокувати взаємодію EGFP-SubB із клітинами лінії Vero. Таким чином, тест інгібування зв'язування флуоресцентно-міченої субодиниці В токсину можна використовувати для оцінки токсин-нейтралізуючих властивостей антитіл.

Особливості розвитку імунної відповіді до ДТ в залежності від форми перебігу інфекційного процесу. Дослідження вмісту ДТ проводили за допомогою розробленого методу сандвіч-ІФА в сироватках крові хворих на дифтерію, носіїв токсигенних і нетоксигенних дифтерійних бактерій, хворих на інші захворювання верхніх дихальних шляхів та здорових донорів, імунізованих вакциною АКДП. Переважна більшість сироваток, в яких було виявлено ДТ, належали хворим на дифтерію, що пояснюється потраплянням значної кількості ДТ в циркуляцію. Частота виявлення ДТ в групі хворих на дифтерію становила 51,4%, як видно з даних, наведених в табл. 2. У решти хворих на дифтерію токсин не виявлявся запропонованим методом, який мав чутливість 1 нг/мл. Також ДТ було виявлено в сироватках крові 5 носіїв токсигенних дифтерійних бактерій. Несподіваним виявився факт виявлення токсину в крові 2 носіїв «нетоксигенних» бактерій, що дозволило припустити можливість помилки при постановці діагнозу.

Низькі титри антитіл проти ДТ (1/300 і менше) були виявлені у здорових і хворих на інші захворювання дихальних шляхів (85,7%), а також у 50% носіїв нетоксигенних дифтерійних бактерій.

Таблиця 2.

Титр антитоксичних антитіл і наявність циркулюючого ДТ в сироватці крові пацієнтів різних діагностичних груп

Примітка. * tox+ - циркулюючий токсин був виявлений в крові,

tox- - циркулюючий токсин не був виявлений в крові.

Високі титри антитіл проти ДТ (1/8100 і більше) найчастіше було виявлено у носіїв токсигенних коринебактерій дифтерії (72,2%) і у хворих на дифтерію (56,8%). Це свідчило про те, що у пацієнтів обох цих груп ДТ потрапляв в кровоток та індукував імунну відповідь. При цьому розвиток гуморальної імунної відповіді міг відбуватися як за вторинним типом (у вакцинованих пацієнтів), так і за первинним (у разі відсутності попереднього контакту організму з антигеном). Зрозуміло, що в першому випадку розвиток імунних реакцій був інтенсивнішим, що, ймовірно, призводило до швидкого збільшення кількості антитоксичних антитіл і нейтралізації ДТ. Така ситуація, в більшості випадків, призводила до розвитку носійства токсигенних C.diphtheriae, що можна було спостерігати, як за симптомами (відсутність ускладнень з боку серцево-судинної та інших систем організму), так і за результатами лабораторних показників. У носіїв токсигенних бактерій вільний ДТ в крові за допомогою застосованих методів виявлявся досить рідко (табл. 2), що свідчило про його нейтралізацію антитілами, а частота виявлення високих титрів антитоксичних антитіл була достатньо високою. В той же час, у хворих на дифтерію токсин виявлявся набагато частіше, що свідчило про недостатню кількість антитіл для повної нейтралізації токсину. З іншого боку, у хворих на дифтерію достатньо часто зустрічався низький рівень антитіл до ДТ, що, на нашу думку, могло бути причиною розвитку хвороби.

Особливої уваги заслуговує категорія пацієнтів з носійством нетоксигенних дифтерійних паличок. Несподівано часто в цій групі реєструвались високі рівні антитіл проти токсину (в 50%), крім того, в двох випадках ми виявили за допомогою ІФА наявність токсину в крові пацієнтів. Також у декількох пацієнтів з цієї групи спостерігалось збільшення титрів антитіл в динаміці перебування в стаціонарі (дані не наведено). Все це свідчить про те, що, явище токсигенності, швидше за все, носить популяційний характер, і різні ізоляти збудника можуть мати різну частоту прояву цієї ознаки в популяції. Отже, методи бактеріологічного визначення токсигенності можуть давати хибно-негативні результати при низькому рівні представленості цієї ознаки в популяції.

Важлива інформація щодо молекулярних механізмів прояву «нетоксигенного» фенотипу бактерій була отримана у дослідженнях, які проводились Національним медичним інститутом ім. О.О.Богомольця та Центральною СЕС за нашої участі. Як показали ці дослідження, серед 1867 нетоксигенних штамів C.diphtheriae, виділених на території різних регіонів України у 1993-2000 роках від осіб хворих на дифтерію, ангінозних хворих та осіб без клінічних проявів (носіїв), виявлено 9,4% штамів, що мають tox-ген. Причиною нездатності цих штамів до токсинопродукції можуть бути мутації, виявлені у регуляторному гені dtxR, які, ймовірно, збільшують силу репресії tox-гену, внаслідок чого токсин не синтезується або синтезується у кількостях, які неможливо детектувати за допомогою реакції імунопреципітації в гелі. Як показали ці дослідження, у всіх фенотипово нетоксигенних коринебактерій, які містили повноцінний tox-ген, токсин був відсутній в культуральному середовищі, в якому вони вирощувалися. Проте аналіз вмісту білків самих бактерійних клітин за допомогою імуноблотингу з протидифтерійною сироваткою коня виявив наявність двох білків, що мали розмір приблизно 37 та 32 кДа та реагували з антитоксичними антитілами. Проте, такі перехресно реагуючі білки за невідомими причинами (ймовірно, через дефекти у системі секреції) не потрапляли за межі бактеріальних клітин.

Ці результати свідчать про існування на території України популяцій коринебактерій дифтерії, які мають tox-ген, але не продукують токсин за межі мікробної клітини. Принаймні, це спостерігається при культивуванні бактерій in vitro. Проте, токсин чи його фрагменти з таких бактерій можуть виходити за межі клітини у разі загибелі цих бактерій, наприклад, під дією факторів захисту хазяїна, зокрема, під дією комплементу. В такому випадку in vivo можна спостерігати вихід білкового продукту з клітин через порушення клітинної стінки і мембрани клітин. Зокрема, такі неактивні гомологи ДТ, що потрапляли в кров носіїв нетоксигенних бактерій, можливо, і визначалися нами як циркулюючий ДТ у пацієнтів цієї групи.

Можливим поясненням різного перебігу інфекційного процесу у хворих і носіїв може бути те, що антитіла проти ДТ, які синтезуються у хворих і носіїв, відрізняються за своїми якісними характеристиками, наприклад, за специфічністю, внаслідок чого вони мають різні протективні властивості. Для перевірки цієї гіпотези у пацієнтів з різними формами дифтерійної інфекції була досліджена специфічність антитіл до фрагментів молекули ДТ.

З метою дослідження особливостей імунного розпізнавання різних ділянок молекули ДТ була вивчена специфічність антитоксичних антитіл до окремих субодиниць ДТ у пацієнтів з різними формами дифтерійної інфекції, а також у здорових і хворих на інші захворювання дихальних шляхів.

Визначення специфічності антитіл, що утворюються до різних фрагментів молекули токсину, у пацієнтів з різними формами перебігу інфекції дозволяє проаналізувати антигенні властивості цієї молекули і розширити уявлення про механізми її імунного розпізнавання. Для оцінки специфічності сироваткових антитіл до субодиниць ДТ був використаний метод імуноблотингу. Для цього ДТ розщеплювали за допомогою обмеженого гідролізу трипсином на дві субодиниці (А і В), після чого їх розділяли за допомогою електрофорезу та переносили на нітроцелюлозну мембрану. Результати денситометричного аналізу специфічності антитоксичних антитіл показали, що у здорових імунізованих вакциною АКДП донорів завжди переважали антитіла до субодиниці В, а у хворих на дифтерію в 59% випадків переважали антитіла до субодиниці А. Всі інші діагностичні групи за частотою переважання антитіл до тієї або іншої субодиниці займали проміжне положення між здоровими і хворими в такій послідовності: хворі на інші захворювання дихальних шляхів; носії нетоксигенних дифтерійних бактерій; носії токсигенних дифтерійних бактерій (табл. 3).

Таблиця 3.

Частка людей, у яких переважали антитіла до певної субодиниці ДТ у різних діагностичних групах

Мінімальне середнє значення співвідношення антитіл проти субодиниці В до антитіл проти субодиниці А на блотограмі (коефіцієнта В/А) було отримано для хворих на дифтерію (В/А=2,32), а максимальне - для хворих на інші інфекційні захворювання (В/А=15,98) і здорових (В/А=16,75) донорів. Різниця між першою групою і будь якою з двох останніх була статистично достовірною. Таким чином, утворення антитіл до SubА характерно, в більшості випадків, саме для хворих на дифтерію, тобто може вказувати на контакт імунної системи з активним ДТ.

У носіїв дифтерійних бактерій частіше зустрічається переважання антитіл до субодиниці В над антитілами до субодиниці А, ніж у хворих на дифтерію. Можливо, саме наявність високопротективних антитіл до субодиниці В ДТ робить носіїв дифтерійних паличок несприйнятливими до тяжких форм перебігу інфекції. На нашу думку, відмінності у кількості і специфічності антитіл у хворих і носіїв можуть бути причиною різного перебігу інфекційного процесу при носійстві та захворюванні. Отже, аналіз рівня антитіл до різних фрагментів молекули ДТ може мати самостійне діагностичне значення і може бути рекомендований як додатковий тест для оцінки прогнозу перебігу захворювання, а також для оцінки напруженості колективного імунітету.

Отже, на підставі виявлених закономірностей розвитку імунної відповіді до ДТ та молекулярних механізмів його розпізнавання запропоновано низку тестів для поліпшення діагностики дифтерії. Такі тести, як виявлення циркулюючого ДТ та титру антитоксичних антитіл, важливі для швидкого встановлення діагнозу та передбачення тяжкості перебігу інфекції. Наявність антитіл до субодиниці А в крові хворого може бути додатковим самостійним діагностичним критерієм для підтвердження діагнозу дифтерія, а також може ретроспективно вказувати на контакт організму людини зі збудником.

Таким чином, в дисертаційній роботі досліджено молекулярні механізми імунного розпізнавання ДТ шляхом використанню методів молекулярної біології для створення нових інструментів дослідження та розробки відповідних експериментальних моделей in vitro. Це дозволило продемонструвати здатність ДТ активно впливати на розвиток імунних реакцій і визначати особливості власного імунного розпізнавання, які полягають у пригніченні утворення протективних антитіл до субодиниці В та індукуванні антитіл до субодиниці А. В практичному аспекті це дозволило розробити нові методи для диференційної оцінки імунної відповіді при дифтерії та для популяційного моніторингу стану протидифтерійного імунітету.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі дано нове вирішення наукової проблеми з'ясування молекулярних механізмів імунного розпізнавання ДТ шляхом використання рекомбінантних аналогів та флуоресцентних похідних функціональних фрагментів цієї молекули для дослідження особливостей розвитку антитоксичної імунної відповіді та рецепції ДТ різними типами клітин. Це дозволило виявити суттєві особливості розвитку антитоксичної імунної відповіді, які обумовлені цитотоксичним впливом ДТ на клітини імунної системи, а також запропонувати нові підходи для вдосконалення діагностики дифтерії.

Підтверджено, що антигенні властивості одержаних рекомбінантних аналогів субодиниць А і В ДТ є аналогічними до антигенних властивостей субодиниць природного токсину. Протективні властивості специфічних антитіл, одержаних до рекомбінантної субодиниці В, були виражені сильніше, ніж антитіл до субодиниці А.

Одержано рекомбінантні флуоресцентні похідні субодиниці В ДТ, які здатні специфічно зв'язуватися з рецепторами на поверхні клітин-мішеней, що дозволило візуалізувати процес взаємодії токсину з його рецептором та внутрішньоклітинне транспортування утвореного комплексу токсин-рецептор.

Доведено здатність флуоресцентно-міченої субодиниці В ДТ взаємодіяти з клітинами як чутливих, так і нечутливих до ДТ тварин, що вказує на важливу роль процесів, які відбуваються після зв'язування токсину з рецептором, у забезпеченні резистентності відповідних клітин до дії токсину.

З бібліотек імуноглобулінових генів, одержаних від імунізованих і неімунних мишей, відібрано клони одноланцюгових фрагментів антитіл (scFv-антитіл), які розпізнавали субодиницю В ДТ та володіли токсин-нейтралізуючими властивостями.

Виявлено цитотоксичну дію ДТ на В-лімфоцити, які мають специфічні до нього антиген-розпізнавальні рецептори, та на фагоцити. Математичне моделювання розвитку інфекції та антитоксичної імунної відповіді при дифтерії дозволило відтворити різні можливі форми перебігу захворювання.

Особливості імунного розпізнавання ДТ та формування антитоксичної імунної відповіді полягають у тому, що контакт імунної системи з нативним ДТ під час дифтерійної інфекції призводить до утворення значної кількості антитіл до субодиниці А, а імунізація дифтерійним анатоксином викликає утворення антитіл переважно до субодиниці В.

Запропоновані нові імунохімічні тест-системи для виявлення ДТ і антитіл проти нього в сироватці крові людини можуть бути рекомендовані для вдосконалення діагностики дифтерії, а тест на інгібування зв'язування флуоресцентного похідного субодиниці В з чутливими клітинами лінії Vero може бути використаний для скринінгу та оцінки токсин-нейтралізуючих антитіл.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Порівняння нетоксигенних та токсинпродукуючих штамів C.diphtheriae за послідовностями tox-гену та регуляторного dtxR-гену / Н. М. Жеребко, Л. В. Копаниця, С. І. Романюк, Д. В. Колибо, В. П. Широбоков // Журнал Академії Медичних Наук. - 2005. - № 3. - С. 592-601. (Особистий внесок здобувача - керівництво розділом роботи, що стосувалась виявлення фрагментів білкового продукту tox-гену в екстрактах і культуральному середовищі досліджуваних штамів коринебактерій).

Токсиннейтралізуючі властивості антитіл до рекомбінантних субодиниць А і В дифтерійного токсину та новий метод їхньої оцінки / А. А. Кабернюк, О. С. Олійник, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Українській біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81, № 3 - С. 92-101. (Особистий внесок здобувача - керівництво роботою, аналіз та узагальнення отриманих даних).

Клонування генів рекомбінантних субодиниць дифтерійного токсину Corynebacterium diphtheriae та їх експресія в клітинах Esherichia coli / А. А. Кабернюк, О. С. Олійник, Т. А. Редчук, С. І. Романюк, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Доповіді Національної академії наук України. - 2008. - № 3. - С. 160-166. (Особистий внесок здобувача - керівництво роботою по клонуванню генів рекомбінантних субодиниць дифтерійного токсину Corynebacterium diphtheriae та їх експресії в клітинах E. сoli).

Розробка імунохімічних тест-систем для контролю протидифтерійного імунітету в популяції людей / А. А. Кабернюк, О. С. Олійник, Т. А. Редчук, С. І. Романюк, Д. В. Колибо, В. В. Євтушенко, О. В. Головач, С. О. Крамарєв, С. В. Комісаренко // Наука і інновація. - 2008. - Т.4, № 3. - С. 22-31. (Особистий внесок здобувача - керівництво роботою щодо розробки імунохімічних тест-систем для контролю протидифтерійного імунітету в популяції людей).

Флуоресцентні похідні субодиниці В дифтерійного токсину та взаємодія їх із клітинами лінії Vero / А. А. Кабернюк, А. Ю. Лабинцев, Д. В. Колибо, О. С. Олійник, Т. А. Редчук, Н. В. Короткевич, В. Ф. Горчев, С. О. Карахім, С. В. Комісаренко // Українській біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81, № 1. - С. 67-77. (Особистий внесок здобувача - керівництво роботою по отриманню флуоресцентних похідних субодиниці В ДТ та дослідженню їх взаємодії з клітинами лінії Vero, аналіз та узагальнення отриманих даних).

Колибо Д. В. Математическая модель инфекционного процесса при дифтерии. Подходы к определению терапевтической дозы антитоксической противодифтерийной сыворотки / Д. В. Колибо, С. И. Романюк // Украинский биохимический журнал. -2001. - № 2. - С. 144-151. (Особистий внесок здобувача - розробив математичну модель дифтерійної інфекції, реалізував її числове рішення, здійснював підготовку публікації до друку).

Влияние дифтерийного токсина на фагоциты и В-лимфоциты чувствительных и нечувствительных к нему животных / Д. В. Колибо, С. И. Романюк, Ю. Л. Радавский, С. В. Комиссаренко // Український біохімічний журнал. - 2002. - Т. 74, № 2. - С. 30-36. (Особистий внесок здобувача - був автором основної ідеї досліджень, проводив аналіз і узагальнення результатів по вивченню дії ДТ на фагоцити та В-лімфоцити чутливих і нечутливих тварин, розробив теорію про імуносупресивну роль ДТ в патогенезі дифтерійної інфекції, працював над рукописом публікації).

Отримання рекомбінантного аналога секреторної форми HB-EGF людини та оцінка перспектив його застосування в біотехнології / Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо, А. Ю. Лабинцев, С. І. Романюк, С. В. Комісаренко // Біотехнологія. - 2010. - Т. 3, №.4. - С. 44-54. (Особистий внесок здобувача - був автором ідеї про можливість використання HB-EGF людини для створення відповідних тест-ситстем, здійснював безпосереднє керівництво роботою по отриманню рекомбінантного аналога секреторної форми HB-EGF людини, проводив підготовку та редагування рукопису публікації).

Цитотоксичність субодиниці В дифтерійного токсину на клітини гістоцитної лімфоми людини U937 / Н. В. Короткевич, А. Ю. Лабинцев, А. А. Кабернюк, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Українській біохімічний журнал. - 2009. - Т.81, №. 4. - С. 69-80. (Особистий внесок здобувача - керівництво роботою по дослідженню цитотоксичних властивостей субодиниці В ДТ, проводив аналіз та узагальнення отриманих даних).

Значение обнаружения токсина в крови при дифтерийной инфекции у детей / С. А. Крамарев, Н. Г. Литвиненко, А. Р. Буц, Э. М. Кавун, Д. В. Колибо, С. И. Романюк, Г. Г. Джеджула, Ю. Л. Радавский, С. В. Комиссаренко // Лабораторная диагностика. - 1998. - №3. - С. 21-24. (Особистий внесок здобувача - розробляв імуноферментні методи виявлення ДТ в сироватках крові, проводив статистичний аналіз і узагальнення результатів щодо вмісту ДТ в сироватках крові дітей з різними формами дифтерійної інфекції).

Взаємодія субодиниці В дифтерійного токсину з клітинами чутливих та нечутливих до токсину видів ссавців / А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, А. А. Кабернюк, С. І. Романюк, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Українській біохімічний журнал. - Т.82, №6. - С. 65-75. (Особистий внесок здобувача - був автором ідеї досліджень щодо з'ясування причин нечутливості клітин деяких видів ссавців до дії ДТ, здійснював керівництво роботою по дослідженню взаємодії субодиниці В ДТ з клітинами чутливих та нечутливих до токсину видів ссавців, проводив аналіз та узагальнення отриманих даних, підготовку та редагування рукопису публікації).

Оцінка гуморального антитоксичного імунітету при дифтерії у дітей / Н. Г. Литвиненко, О. Р. Буц, В. О. Дорошенко, О. В. Головач, І. Г. Бадакіна, Ю. Л. Радавський, Е. М. Кавун, Д. В. Колибо, С. І. Романюк // Дитячі інфекції. - 2001. - № 28. - С. 16-22. (Особистий внесок здобувача - був автором ідеї щодо ролі гуморального імунітету у формуванні носійства коринебактерій, розробляв імуноферментні методи виявлення антитіл проти ДТ в сироватках крові, проводив статистичний аналіз і узагальнення результатів щодо рівня антитоксичних антитіл в сироватках крові дітей з різними формами дифтерійної інфекції).

Значення виявлення токсину та антитоксину в крові при дифтерійній інфекції у дітей / Н. Г. Литвиненко, О. Р. Буц, Ю. Л. Радавський, Е. М. Кавун, Д. В. Колибо, С. І. Романюк, Л. О. Михалський, І. М. Фуртат // Дитячі інфекції. -1999. - № 25. - С. 47-54. (Особистий внесок здобувача - розробляв імуноферментні методи виявлення ДТ та антитіл проти нього в сироватках крові, проводив статистичний аналіз і узагальнення результатів щодо вмісту ДТ та антитіл проти нього в сироватках крові дітей з різними формами дифтерійної інфекції).

Получение рекомбинантных scFv-антител против дифтерийного токсина методом фагового дисплея / Е. С. Олейник, А. А. Кабернюк, Д. А. Буркалева, С. И. Романюк, Д. В. Колибо, А. О. Шепеляковская, А. Г. Ламан, С. В. Комисаренко // Українській біохімічний журнал. - 2007. - Т. 79, № 5. - С. 91-97. (Особистий внесок здобувача - здійснював керівництво роботою по отриманню scFv-антитіл проти ДТ та їх характеристиці, проводив аналіз та узагальнення отриманих даних).

Одержання біфункціональних молекул, специфічних до антигену та Fc-фрагменту антитіл, методом злиття scFv-антитіл із стафілококковим білком А / О. С. Олійник, А. А. Кабернюк, Т. А. Редчук, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Біополімери і клітина. - 2009. - Т. 25, № 3 - С. 1-5. (Особистий внесок здобувача - здійснював керівництво роботою по злиттю scFv-антитіл із стафілококовим білком A).

Дослідження токсин-нейтралізуючих властивостей рекомбінантних одноланцюгових варіабельних фрагментів антитіл проти В субодиниці дифтерійного токсину / О. С. Олійник, Ю. А. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Біополімери і клітина. - 2009. - Т. 25, № 4 - С. 1-4. (Особистий внесок здобувача - керівництво роботою по дослідженню токсин-нейтралізуючих властивостей рекомбінантних scFv-антитіл проти субодиниці В ДТ, проводив аналіз та узагальнення отриманих даних).

Створення імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір одноланцюгових Fv-антитіл, специфічних до В-субодиниці дифтерійного токсину / О. С. Олійник, А. А. Кабернюк, Т. А. Редчук, Н. В. Короткевич, А. Ю. Лабинцев, С. І. Романюк, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Українській біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81, № 2 - С. 68-79. (Особистий внесок здобувача - здійснював керівництво роботою по створенню імунної бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбору scFv-антитіл, специфічних до В субодиниці ДТ, проводив аналіз та узагальнення отриманих даних).

Олійник О. С. Характеристика scFv-антитіл проти дифтерійного токсину, виділених з імунної та наївної імуноглобулінових бібліотек / О. С. Олійник, Д. В. Колибо, С. В. Комісаренко // Біотехнологія. - 2009. - Т. 2, № 3. - C. 55-63. (Особистий внесок здобувача - здійснював безпосереднє керівництво роботою по характеристиці scFv-антитіл проти ДТ, проводив аналіз та узагальнення отриманих даних).

Оптимізація умов синтезу кон'югатів протеїну А з колоїдним золотом та розробка підходів для їх характеристики / А. Ю. Лабинцев, О. С. Олійник, А. А. Кабернюк, О. Ю. Чуніхін, В. Ф. Горчев, Т. О. Курченко, В. І. Чернишов, Д. В. Колибо // Біотехнологія. - 2009. - Т. 2, № 2. - C. 76-83. (Особистий внесок здобувача - здійснював керівництво роботою, проводив аналіз отриманих даних).

Клонування та експресія функціонально активного фрагменту D-E-A-A* протеїну А Staphylococcus aureus / О. С. Олійник, Д. В Колибо, А. А. Кабернюк, А. Ю. Лабинцев, Т. А. Редчук, Н. В.Короткевич, С. І. Романюк, С. В. Комісаренко // Біотехнологія. - 2009. - Т. 2, № 1. - C. 59-68. (Особистий внесок здобувача - запропонував основну ідею досліджень, проводив порівняння амінокислотних послідовностей рекомбінантного і природного білків А, здійснював керівництво роботою по отриманню рекомбінантного білка А та дослідженню його властивостей).

Структура і біологічна активність бактеріальних біополімерів / [В. К. Позур, Д. В. Колибо, В. А. Борисов та ін.] // - К. : Видавничо-поліграфічний центр “Київський університет”, 2003. - 360 с. (Особистий внесок здобувача - працював над текстом рукопису, був співавтором розділу «Бактеріальні білкові екзотоксини»).

Специфичность антител к субъединицам дифтерийного токсина у детей с различным диагнозом / С. И. Романюк, Д. В. Колибо, Э. М. Кавун, Ю. Л. Радавский, Т. Ю. Ткаченко, С. А. Крамарев, С. В. Комиссаренко // Український біохімічний журнал. - 2001. - Т. 73, № 6. - С. 73-76. (Особистий внесок здобувача - був автором основної ідеї досліджень про те, що специфічність антитіл до субодиниць токсину може визначати перебіг захворювання, розробив алгоритм денситометричної програми для кількісної оцінки результатів імуноблотингу, а також проводив аналіз та узагальнення отриманих результатів).

Пат. 84357 Україна. Штамм Escherichia coli K12 “INV” sbB - продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці В дифтерійного токсину Corynebacterium diphtheriae, гібридизованої з полігистидиновий тагом / Комісаренко С.В., Колибо Д.В., Романюк С.І., Кабернюк А.А., Олійник О.С., Редчук Т.А.; заявник і власник патенту Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. - № 84357 заявл. 02.02.2007, опубліков. 10.10.08, Бюл. № 19. - 8 с. (Особистий внесок здобувача - здійснював керівництво роботою по отриманню штаму-продуценту рекомбінантної субодиниці В ДТ, брав участь в оформленні патентної документації).

Пат. 84356 Україна. Штамм Escherichia coli K12 “INV” sbА - продуцент рекомбінантної неактивної субодиниці А дифтерійного токсину Corynebacterium diphtheriae, гібридизованої з полігистидиновий тагом / Комісаренко С.В., Колибо Д.В., Романюк С.І., Кабернюк А.А., Олійник О.С., Редчук Т.А.; заявник і власник патенту Інститут біохімії ім.О.В. Палладіна НАН України. - № 84356 заявл. 02.02.2007, опубліков. 10.10.08, Бюл. №19. - 8 с. (Особистий внесок здобувача - здійснював керівництво роботою по отриманню штаму-продуценту рекомбінантної субодиниці В ДТ, брав участь в оформленні патентної документації).

Specificity of Serum Antibodies to Subunits of Diphtheria Toxin in Children with various Diagnostic Categories / S. I. Romanyuk, V. V. Vovk, D. V. Kolibo, E. M. Kavun, Yu. L. Radavsky, S. A. Kramarev // Fourth John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. - Pushchino, 14-18 September 1998. - Р. 67.

Вивчення рівня дифтерійного токсину при дифтерійній інфекції в дітей / С. О. Крамарєв, Н. Г. Литвиненко, О. Р. Буц, Е. М. Кавун, Д. В. Колібо, С. І. Романюк // Актуальні питання клінічної інфектології : Матеріали П'ятого з'їзду інфекціоністів України. - Тернопіль, 7-9 жовтня 1998. - С. 244-246.

Визначення токсину та антитоксину в крові при дифтерійній інфекції у дітей / С. О. Крамарєв, Н. Г. Литвиненко, О. Р. Буц, Ю. Л. Радавський, Е. М. Кавун, Д. В. Колибо, С. І. Романюк, Л. О. Михалський, І. М. Фуртат // Педіатрія, акушерство та гінекологія. - 1999. - №4. - С. 42-43.

Kolibo D. V. Determination of diphtheria toxin and antitoxin in serum and specificity of antibodies to toxin subunits in children / D. V. Kolibo, S. I. Romanyuk // International Training Course for Young Scientists organized by the Hungarian Society for Microbiology and the Unesco-Hebrew University of Jerusalem International School for Molecular Biology and Microbiology. - Hungary. - Keszthely, 23-27 August 2000. - P. 30.

Романюк С. І. Вивчення шляхів проникнення дифтерійного токсину у клітини імунної системи мишей і морських свинок / С. І. Романюк, Д. В. Колибо // Український біохімічний журнал. -2002. - № 4. - С. 162.

Kolibo D. V. Influence of diphtheria toxin on the phagocytes and B-lymphocytes of susceptible and resistant animals / D. V. Kolibo, S. I. Romanyuk // Sixth John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. - Pushchino, 15-22 September 2002. - Р. 60.

Розробка методу експресного виявлення дифтерійного токсину на основі імунохроматографії з колоїдним золотом / Г. А. Аль-Махмуд, С. І. Романюк, В. І. Чернишов, Д. В. Колибо // Український біохімічний журнал. - 2003. - Т. 75, № 5. - С. 72-73.

Diphtheria immunity assessment: Do we need one or two antigens? / A. A. Kaberniuk, O. S. Oliinyk, T. A. Redchuk, S. I. Romaniuk, D. V. Kolibo // Bridges in Life Sciences: I Annual Scientific Meeting: Abstracts of the International Conference. - Hungary. - Pecs, 5.10.2007. - P. 40.

Створення бібліотеки імуноглобулінових генів миші та відбір одноланцюгових scFv-антитіл, специфічних до В субодиниці дифтерійного токусину / О. С. Олійник, А. А. Кабернюк, Т. А. Редчук, А. Ю. Лабинцев, Н. В. Короткевич, Д.В. Колибо // Український біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81, № 4. - С. 135.

Construction and screening of phage display single chain antibody library against diphtheria toxin / O. S. Oliinyk, A. A. Kaberniuk, T. A. Redchuk, N. V. Korotkevich, A. J. Labyntsev, S. I. Romaniuk, D. V. Kolibo // Bridges in Life Sciences. Scientific Review: Abstracts of the International Conference. - Hungary. - Pecs, 2009. - V. 4, № 1. - P. 152.

Constructing and using of fluorescent probes based on diphtheria toxin's subunit B / A. Kaberniuk, A. Labyntsev, E. Babitska, D. Kolibo // Український біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81, № 4 (спеціальний випуск). - С. 297.

Development of sandwich-ELISA with scFv-protein a fusions for detection of diphtheria toxin / O. Oliinyk, A. Kaberniuk, T. Redchuk, N. Korotkevych, A. Labyntsev, S. Romaniuk, D. Kolibo // Український біохімічний журнал. - 2009. - Т. 81, № 4 (спеціальний випуск). - С. 306.

Рекомбінантні аналоги розчинної форми HB-EGF людини та їх застосування / Н. В. Короткевич, А. М. Гончаренко, А. Ю. Лабинцев, Д. В. Колибо, С. І. Романюк, С. В. Комісаренко // Український біохімічний журнал. - 2010. - Т. 82, № 4 (спеціальний випуск, додаток 1). - С. 81.

АНОТАЦІЯ

Колибо Д.В. Молекулярні механізми імунного розпізнавання дифтерійного токсину. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України.

Робота присвячена дослідженню молекулярних механізмів імунного розпізнавання дифтерійного токсину (ДТ), які визначаються його біологічними властивостями, що є важливим для розробки нових засобів діагностики дифтерії. Рекомбінантні похідні функціональних фрагментів ДТ було використано для дослідження механізмів його імунного розпізнавання та аналізу антитоксичної імунної відповіді. Показано, що відмінності у чутливості клітин мишей і приматів до ДТ можуть бути обумовлені не лише різною спорідненістю токсину до їх рецепторів, але й процесами, що відбуваються після проникнення токсину всередину клітини. Показано роль ДТ у пригніченні антитоксичної імунної відповіді. Імуносупресивний ефект ДТ доведено також математичною моделлю, яка наближено до реальності описує різні форми перебігу захворювання. Розроблені імуноферментні та імунохроматографічні тести для виявлення ДТ та антитіл проти субодиниць ДТ можуть бути використані для вдосконалення діагностики дифтерії.

Ключові слова: дифтерійний токсин, імунне розпізнавання, молекулярні механізми, рекомбінантні антигени та антитіла.

АННОТАЦИЯ

Колибо Д.В. Молекулярные механизмы иммунного распознавания дифтерийного токсина. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины.

Работа посвящена исследованию молекулярных механизмов иммунного распознавания дифтерийного токсина (ДТ) и особенностей формирования антитоксического иммунитета, которые определяются биологическими свойствами ДТ. Полученные данные являются важными для понимания биологической роли антитоксического иммунного ответа во взаимоотношениях коринебактерий с организмом хозяина и для разработки современных дифтерийных диагностикумов.

Для анализа механизмов иммунного распознавания ДТ использованы рекомбинантные производные его функциональных фрагментов, что позволило предложить новые подходы для исследования антитоксического иммунного ответа. С помощью рекомбинантных флуоресцентных производных субъединицы В (SubB) был визуализирован процесс связывания ДТ с поверхностью разных клеток и его внутриклеточный трафик. Впервые визуализована in vitro способность SubB ДТ взаимодействовать с рецепторами как чувствительных к ДТ клеток обезьяны, так и нечувствительных клеток мыши. Обнаруженная способность ДТ взаимодействовать с рецепторами как чувствительных, так и нечувствительных клеток указывает на то, что отличия в чувствительности клеток мышей и приматов к ДТ могут быть обусловлены не только различным сродством токсина к рецепторам соответствующих клеток, но и процессами, происходящими после проникновения токсина внутрь этих клеток. Эти данные важны для понимания молекулярных механизмов реализации цитотоксического действия ДТ.

Показано, что В-клетки, имеющие антиген-распознающие рецепторы, специфичные к ДТ, являются важной мишенью цитотоксического действия ДТ. Продемонстрировано также на модели in vitro цитотоксическое влияние ДТ на фагоцитарные клетки. Эти данные указывают на роль ДТ в угнетении гуморального и клеточного иммунного ответа, направленного против него, что, по нашему мнению, является необходимым условием для колонизации эпителия слизистых дифтерийными бактериями. Гипотеза иммуносупрессорного влияния ДТ была обоснована также математической моделью, численное решение которой позволило описать различные возможные формы протекания заболевания с приближенной к реальности динамикой.

Анализ особенностей иммунного распознавания ДТ при разных формах дифтерийной инфекции по сравнению с распознаванием дифтерийного анатоксина позволил обнаружить, что контакт иммунной системы с нативным ДТ сопровождается появлением значительного количества антител к субъединице А, в то время, как в результате вакцинации образуются, преимущественно, антитела к субъединице В. Высокие титры антитоксических антител чаще всего были обнаружены нами у носителей дифтерийных бактерий, что является важным не только для понимания патогенеза заболевания, но и для разработки новых методов дифференциальной диагностики дифтерии.