Механізми дії позаклітинного льодоутворення та пов’язаних з ним явищ на біологічні об’єкти

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

НАН УКРАЇНИ

МЕХАНІЗМИ ДІЇ ПОЗАКЛІТИННОГО ЛЬОДОУТВОРЕННЯ ТА ПОВ'ЯЗАНИХ З НИМ ЯВИЩ НА БІОЛОГІЧНІ ОБ'ЄКТИ

03.00.19 - кріобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

КУЛЄШОВА ЛАРИСА ГЕОРГІЇВНА

УДК 57.043:532.785:577.352.4:576.3/7

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини

НАН України

Науковий консультант:

доктор біологічних наук, професор Гордієнко Євген Олександрович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач

відділу низькотемпературного консервування, м. Харків

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Бондаренко Тетяна Петрівна,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач

відділу кріобіохімії та фармакології НГС, м. Харків.

доктор біологічних наук, професор Кнігавко Володимир Гілярієвич,

Харківський національний медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри медичної та біологічної фізики і медичної інформатики, м. Харків.

доктор фізико-математичних наук, старший науковий співробітник

Косєвич Марина Вадимівна, Фізико-технічний інститут низьких

температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, провідний науковий

співробітник відділу молекулярної біофізики, м. Харків.

Захист відбудеться “24” травня 2011 року о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розіслано “14” квітня 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01

доктор біологічних наук, професор Розанов Л.Ф.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На даний час доцільність і ефективність довгострокової консервації біологічних об'єктів з використанням низьких температур не викликає сумніву.

Проте, незважаючи на накопичений досвід, значний експериментальний матеріал і всебічне його теоретичне узагальнення, успіхи, досягнуті в розумінні можливих механізмів кріопошкождення клітин і шляхів їх кріозахисту [Гордиенко Е. А., Пушкарь Н. С., 1994; Gao D, Critser J. K., 2000; Фуллер Б., Грин К., Грищенко В. И., 2003; Pegg D. E., 2002, 2007], підхід до розробки методів кріоконсервування різних біологічних об'єктів як і раніше носить в основному емпіричний характер. Це обумовлено, перш за все, різноманіттям і складністю фізико-хімічних явищ, що супроводжують етапи технологічного процесу кріоконсервування, і неможливістю однозначного прогнозування їх взаємного впливу на клітини.

Як відомо, основні чинники, що викликають пошкодження клітин при низькотемпературній консервації, безпосередньо або побічно пов'язані зі зміною агрегатного стану кріобіологічної системи. Залежно від умов охолодження клітинної суспензії при фазовому переході в ній формуються кристали позаклітинного льоду різної морфології, що обумовлює певний характер розподілу клітин в кристалічній структурі. Це у свою чергу впливає на особливості масообміну між клітиною і середовищем при порушенні термодинамічної рівноваги в системі, і, врешті решт, - на результат кріоконсервування.

Фазовий перехід “вода-лід” є взаємозв'язаним багатостадійним процесом. Досить обширні дані, що є в літературі, про виникнення первинних кристалічних структур, про вплив на них умов тепловідведення, кріопротекторів, різних модифікаторів носять в основному описовий характер [Пушкарь Н. С., Белоус А. М. и др., 1977]. В кріобіології відсутні вичерпний теоретичний аналіз, а також достатньо надійні кількісні експериментальні дані про механізми зародження і росту позаклітинних кристалів льоду в складних кріобіологічних системах. Дослідження цих механізмів є принциповою задачею, оскільки їх розкриття дозволить більш адекватно регулювати процеси зародкоутворення, росту і, як наслідок, розміри і форму кристалів льоду, а отже, і характер взаємодії клітин з кристалічною структурою.

Здатність клітин адаптуватися до стресових дій на різних етапах кріоконсервування залежить від транспортних і механічних характеристик їх плазматичних мембран, оскільки саме мембрани є первинною мішенню таких дій. У зв'язку з цим дослідження стійкості клітин в стресових умовах, що моделюють різні кріобіологічні ситуації, а також визначення комплексу біофізичних параметрів клітинних мембран, є принципово необхідним для успішної оптимізації методів кріоконсервування. Складність отримання таких даних вимагає залучення спеціальних методичних підходів, що поєднують у собі фізико-математичне і експериментальне моделювання поведінки клітин у неізотонічних середовищах при різних температурах.

Таким чином, подальше кількісне вивчення фізико-хімічних явищ, що супроводжують низькотемпературну консервацію на етапі фазового переходу, і особливостей температурно-осмотичних реакцій клітин, а також пошук ефективних шляхів управління цими процесами є актуальними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана в рамках науково-дослідних бюджетних робіт відділу низькотемпературного консервування біологічних об'єктів Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України на замовлення Академії Наук України за темами: “Вивчення ролі фізико-хімічних факторів в розвитку кріопошкоджень і кріозахисту біологічних об'єктів. Оптимізація етапів технологічного процесу кріоконсервування клітин і тканин” (№ держреєстрації 01870065544, 1986-1990рр.); “Вивчення механізмів кріопошкодження і кріозахисту біооб'єктів на основі синтезу мембранної і фазової теорій побудови клітини” (№ держреєстрації 01944005303, 1991-1995 рр.); “Побудова та експериментальна перевірка кількісної теорії кріоконсервування біооб'єктів” (№ держреєстрації 0100U004235, 1996-2000рр.); “Експериментальне вивчення та кількісне моделювання процесів, які відбуваються в мембранах клітин при кріоконсервуванні біологічних об'єктів” (№ держреєстрації 0100U003479, 2001-2005 рр.); “Теоретичний аналіз і експериментальне дослідження специфічних механізмів кріопошкодження та кріозахисту клітин, зумовлених особливостями їх функціонування” (№ держреєстрації 0106U002164, 2006-2010 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - встановити механізми зародження і росту позаклітинних кристалів льоду в біологічних системах, що кріоконсервуються, та механізми дії на клітини фізико-хімічних чинників, пов'язаних з фазовим переходом “рідина-кристал”.

Задачі дослідження:

1. З'ясувати механізм утворення зародків кристалів льоду в переохолоджених розчинах ліофілізованої плазми крові людини.

2. З'ясувати механізми росту позаклітинних кристалів льоду та формування морфологічної структури різної дисперсності в модельних розчинах кріопротекторів (етиленгліколь, диметилсульфоксид, поліетиленгліколь з м.м. 1500, полівінілпіролідон з м.м. 12000) залежно від їх переохолодження і концентрації.

3. Оцінити ефективність впливу початкового переохолодження, початкової концентрації кріопротекторів і поверхнево-активних речовин на кінетичні характеристики льодоутворення в модельних біологічних розчинах.

4. Вивчити вплив позаклітинного льодоутворення на збереження сперматозоїдів людини і ембріонів мишей ранніх стадій розвитку та виявити можливі способи запобігання або зниження кріопошкоджуючої дії цього чинника.

5. Встановити взаємозв'язок між особливостями трансформації еритроцитів людини в розчинах ряду насичених Н-спиртів і коефіцієнтом розподілу цих неелектролітів між клітиною і середовищем, що її оточує.

6. Визначити осмотичну стійкість і кріорезистентність еритроцитів пуповинної крові людини до дії гіпертонічних розчинів хлориду натрію.

7. Оцінити стан глікокалікса еритроцитів людини в розчинах хлориду натрію помірної гіпертонії.

8. З'ясувати механізм постгіпертонічної регуляції клітинного об'єму гепатоцитів щурів при їх регідратації і оцінити деформаційні (модуль пружності) і транспортні (коефіцієнти проникності для молекул води і диметилсульфоксиду) характеристики плазматичних мембран цих клітин.

9. Обґрунтувати адекватність фізико-математичної моделі для визначення біофізичних параметрів клітин при безперервному позаклітинному льодоутворенні.

10. Розробити алгоритм теоретичного прогнозування оптимальних швидкостей охолодження при заморожуванні-відтаванні ядерних клітин.

Об'єкт дослідження - процес позаклітинного льодоутворення і реакції клітин людини (еритроцити дорослих донорів, еритроцити пуповинної крові, сперматозоїди) і тварин (гепатоцити щурів, ембріони мишей, культура клітин нирок сірійського хом'яка, що перевивається) на дію фізико-хімічних чинників, що виникають внаслідок фазового переходу при кріоконсервуванні.

Предмет дослідження - механізми утворення і росту позаклітинних кристалів льоду і механізми пошкодження біологічних об'єктів явищами, що супроводжують зміну агрегатного стану середовища на етапі заморожування і відігрівання.

Методи дослідження. В роботі використано експериментальні і теоретичні методи досліджень: кріомікроскопія, низькотемпературна рентгенографія, осмометрія, світлова і фазовоконтрастна мікроскопія, волюмометрія, спектрофотометрія, 1Н-ЯМР-спектроскопія, метод дрібних крапель, фізико-математичне моделювання з використанням рівнянь нерівноважної термодинаміки, математичний апарат теорії пружності тонких оболонок, математичні методи планування і статистичної обробки експериментальних результатів багаточинних експериментів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше кількісно вивчено процес первинного зародкоутворення кристалів льоду в модельних біологічних розчинах і доведено, що основним механізмом виникнення твердої фази є гетерогенна нуклеація. Вперше одержано аналітичні залежності лінійної швидкості росту кристалів льоду в біологічних розчинах від їх переохолодження і встановлено, що в механізми росту позаклітинних кристалів льоду і формування його морфологічної структури різної дисперсності одночасно вносять вклад як нормальна, так дислокаційна складові росту кристалів. В порівняльному аспекті вивчено вплив переохолодження, кріопротекторів і поверхнево-активних речовин (ПАР) на кінетичні характеристики позаклітинного льодоутворення і встановлено, що найефективнішим способом управління швидкістю росту і розміром кристалів льоду, що утворюються, є інтенсивність тепловідведення. Показано, що кріозахисне середовище на основі 5,37 М етиленгліколю і 0,7 М сахарози пригнічує поза- і внутрішньоклітинне льодоутворення при повільних швидкостях заморожування (5°С/хв) ембріонів мишей ранніх стадій розвитку. Вперше вивчено особливості трансформації еритроцитів людини в різних кріозахисних середовищах і встановлено взаємозв'язок між морфологічною відповіддю клітин і характером перерозподілу проникаючих і непроникаючих речовин в системі “клітина-оточуюче середовище”. Вперше вивчено чутливість еритроцитів пуповинної крові людини до гіпертонічної дії NaCl і охолодження і визначено межі стійкості цих клітин до вказаних чинників. Оцінено стан глікокалікса еритроцитів людини в помірно гіпертонічних розчинах NaCl і встановлено, що одним з пускових механізмів кріогемолізу може бути часткова деструкція примембранних шарів. Вперше кількісно оцінено коефіцієнти проникності плазматичних мембран гепатоцитів щурів для молекул води і диметилсульфоксиду, чисельне значення модуля ізотропного розтягування мембран і встановлено механізм постгіпертонічного лізису цих клітин в умовах регідратації. Вперше визначено транспортні характеристики плазматичних мембран клітин нирок сірійського хом'яка для молекул води і гліцерину в умовах безперервного позаклітинного льодоутворення і на прикладі цих клітин розроблено алгоритм прогнозування оптимальних швидкостей заморожування клітинних суспензій.

Практичне значення. Теоретично обґрунтовано новий метод визначення модуля ізотропного розтягування мембран гепатоцитів щурів. Аномальне низьке значення модуля пружності мембран гепатоцитів щурів, яке свідчить про високу резистентність цих клітин до постгіпертонічного лізису, дозволяє рекомендувати використовувати в технології їх кріоконсервування повільні режими заморожування. Для кріоконсервування ембріонів мишей ранніх стадій розвитку обґрунтована ефективність використання високоосмотичного етиленгліколь-сахарозного середовища на основі 5,37 М етиленгліколю і 0,7 М сахарози. Розроблено алгоритми визначення транспортних характеристик мембран клітин в умовах позаклітинного льодоутворення і прогнозування оптимальних швидкостей заморожування. Ці алгоритми можуть бути використані при експрес пошуку оптимальних умов кріоконсервування різних клітинних суспензій. Запропоновано спосіб ранньої діагностики стадій вібраційної хвороби за кінетикою накопичення передгемолітичних форм еритроцитів в умовах гіпотермії.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням. Автору дисертаційної роботи належить вибір теми, визначення мети і задач досліджень. Запропоновано ідеї і методичні підходи для постановки і проведення експериментів. Претендентом самостійно одержано експериментальні дані у всіх розділах досліджень, проведено їх статистичну обробку, узагальнення, аналітичний аналіз і сформульовано основні висновки. У спільних наукових публікаціях співавтори брали участь у підготовці біологічного матеріалу до досліджень, постановці окремих експериментів і обговоренні результатів. Алгоритми аналітичних розрахунків біофізичних характеристик плазматичних мембран клітин на основі одержаних експериментальних даних були розроблені при безпосередній участі наукового консультанта доктора біологічних наук, професора Гордієнка Є.О. і кандидата біологічних наук, старшого наукового співробітника Коваленка І. Ф. В опублікованих із співавторами публікаціях особистий внесок претендента полягає в наступному: у роботі [31] - у розробці і випробуваннях пристрою для кріомікроскопічних досліджень; у роботах [1, 5, 25, 26, 28, 45, 54, 56, 58, 60, 61] - у постановці експериментів, безпосередньому проведенні кріомікроскопічних і низькотемпературних рентгенографічних досліджень, обробці, аналізі, інтерпретації і узагальненні експериментальних результатів; у роботах [3, 4, 8, 18, 37, 44] - у постановці експериментів, безпосередньому проведенні кріомікроскопічних досліджень, обробці, аналізі, інтерпретації і узагальненні експериментальних результатів; у роботах [10, 11, 19, 22, 27, 48, 57] - у розробці методологічного підходу і безпосередньому проведенні мікроскопічних досліджень, обробці, аналізі і узагальненні експериментальних результатів; у роботах [2, 6, 7, 30, 46] - у методології постановки експериментів, безпосередньому проведенні мікроскопічних досліджень, обробці, аналізі, інтерпретації і узагальненні експериментальних результатів; у роботах [12, 17, 33-36, 40, 42, 53] - у ідеї і методології постановки експериментів, безпосередньому проведенні мікроскопічних досліджень, обробці, аналізі і узагальненні експериментальних результатів; у роботах [24, 29] - у ідеї і методології постановки експериментів, безпосередньому проведенні кріомікроскопічних досліджень, обробці, аналізі, інтерпретації і узагальненні експериментальних результатів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на: II Всесоюзній конференції з теоретичних і прикладних питань кріобіології “Механізми кріопошкодження і кріозахисту біологічних об'єктів” (Харків, 1984); Міжнародній конференції “Досягнення і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини” (Харків, 1988); Науково-практичній конференції “Нові застосування морфометріі і математичного моделювання в медико-біологічних дослідженнях” (Харків, 1990); Науково-практичній конференції “Структурно-функціональні одиниці і їх компоненти в органах вісцелярних систем в нормі і патології” (Харків, 1991); II Міжнародній конференції ЮНЕСКО “Успіхи сучасної кріобіології” (Харків, 1992); 29, 31, 33 щорічних нарадах Міжнародного товариства кріобіології (Ітака, Нью Йорк, США, 1992; Кіото, Японія, 1994; Індіанаполіс, Індіана, США, 1996); I, III, IV З'їздах Українського біофізичного товариства (Київ, 1994; Львів, 2002, Донецьк, 2006); Нараді товариства Низькотемпературної біології (Леон, Бельгія, 1994); I З'їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995); II З'їзді біофізиків Росії (Москва, Росія, 1999); Нараді “Кріобіомол - 2003” (Коімбра, Португалія, 2003); IY Міжнародному симпозіумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (Київ, 2004); I Українській науковій конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004); Міжнародній конференції “Збереження генетичних ресурсів” (Санкт-Петербург, Росія, 2004); Конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурних клітин в умовах дії низьких температур” (Харків, 2005); Всеукраїнській науково-технічній конференції “Актуальні питання теоретичної і прикладної фізики і біофізики “Фізика. Біофізика-2006” (Севастополь, 2006); II Міжнародній конференції з електроніки і прикладної фізики“ (Kиїв, 2006); 14, 16 конгресі Європейської асоціації дослідження червоних клітин (Роскофф, Франція, 2003; Оксфорд, Великобританія, 2007); Конференції “Фізика низьких температур” (КМУ-ФТН-2007) (Харків, 2007); Межнародній науковій конференції “Біофізичні механізми функціонування живих систем“ (Львів, 2008); Конференції “Кріоконсервація як спосіб збереження генетичних ресурсів” (Пущино, Росія, 2008); 4 Міжнародній конференції “Фізика рідких станів: сучасні проблеми” (Kиїв, 2008); Міжнародній конференції “Структура і динаміка Н-зв'язаних систем” (Мірамаре, Трієст, Італія, 2009).

Публікації. Результати дисертації відображені в 61 публікації: 25 статей в наукових фахових журналах (з них 8 без співавторів), 4 - в іноземних наукових журналах, 4 статті у збірках праць (з них 1 без співавторів), 2 патенти, 26 тез доповідей на конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, 8 розділів оригінальних досліджень, висновків, списку використаних джерел. Вона містить 385 сторінок із них 304 сторінки основного тексту, 27 рис., 51 фото, 24 табл., 4 схеми, з яких 11 рис., 9 фото, 8 табл., 1 схема на окремих 24 сторінках, список використаних джерел з 543 найменувань на 57 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність теми, зв'язок роботи з науковими програмами і темами, сформульовано мету і задачі дослідження, показано новизну і практичну значимість одержаних результатів та особистий внесок здобувача в опублікованих із співавторами роботах, наведено відомості про апробацію результатів.

У розділі 1 представлено аналітичний огляд експериментальних і теоретичних даних літератури, що стосуються сучасних уявлень про механізми пошкодження біологічних об'єктів фізико-хімічними чинниками, що супроводжують фазові переходи суспензійного середовища на етапі заморожування і відігрівання.

У розділі 2 подана загальна характеристика об'єктів, методів і матеріалів досліджень. Для адекватного вирішення конкретних задач у роботі використано спектр біологічних об'єктів: еритроцити дорослих донорів, еритроцити пуповинної крові людини, сперматозоїди людини, ембріони мишей лінії СВА ранніх стадій розвитку, гепатоцити білих лабораторних щурів, культура нирок сірійського хом'яка (ВНК-21), що перевивається, модель позаклітинного середовища на основі розчину ліофілізованої плазми крові людини групи 0(1).

Еритроцити дорослих донорів виділяли з цільної донорської крові групи А(II), яку одержували на Харківській обласній станції переливання крові. Еритроцити пуповинної крові виділяли з цільної пуповинної крові, яку одержували при нормальних пологах у здорових породіль пологового будинку №5 м. Харкова. Як консервант в обох випадках використовували стандартний консервуючий розчин “Глюгицир”. Сперму людини одержували на базі пологового будинку №5 м. Харкова. Кров і сперма були надані з письмової проінформованої згоди донорів. Ембріони мишей лінії СВА одержували методом суперовуляції [Манк М., 1990]. Гепатоцити виділяли з печінки щурів неферментативним методом [Кравченко Л.П. и др., 1989]. Клітини ВНК-21 суспендували в середовищі Ігла, що містить 10% бичачої сироватки. Експериментальні дослідження з використанням матеріалу тваринного походження виконували відповідно до “Загальних принципів експериментів на тваринах”, схвалених I-III Національними конгресами з біоетики (Київ, 2001-2007 рр.) і узгоджених з положеннями “Європейської Конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985 р.).

Особливості реакцій біологічних об'єктів (сперматозоїди людини, ембріони мишей, клітини ВНК-21) на етапах кристалізації і відігрівання клітинних суспензій, морфологічні особливості позаклітинної кристалічної структури, що формується, а також механізми первинного зародкоутворення і росту кристалів льоду досліджено методом кріомікроскопії. Кріомікроскопічний комплекс для кріобіологічних досліджень виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України створено на базі світлового мікроскопа МБІ-15-У4.2 (ЛОМО, Ленінград). Дисперсність кристалічної структури льоду оцінювали методом випадкових січних [Вейнберг Ф., 1973] і методом рентгеноструктурного аналізу [Горелик С.С., 1970]. При вивченні механізму первинного зародкоутворення льоду в позаклітинному середовищі використано метод дрібних крапель [Turnbull D., 1950]. В постановці досліджень впливу низки чинників на кінетичні характеристики позаклітинного льодоутворення використано методи оптимального планування і аналізу багаточинних експериментів [Саутин С.Н., 1975]. Особливості процесів кристалізації в кріозахисних розчинах залежно від складу середовища і режимів заморожування вивчено методом Дебая-Шеррера для полікристалічних зразків [Уманский Я.С., 1969] на установці для низькотемпературної рентгенографії (джерело CuК- випромінювання гострофокусний рентгенівський апарат УРС-0,02). Осмолярність розчинів реагентів контролювали кріоскопічним методом з використанням мікроосмометра ОМКА-Ц-01 (Медлабортехніка, Одеса). Трансформація еритроцитів людини у присутності різних класів речовин вивчена в “живій краплі” методом світлової і фазовоконтрастної мікроскопії безпосередньо на предметному столику мікроскопа МБІ-15-У4.2 або МБІ-13 (ЛОМО, Ленінград). Осмотична поведінка гепатоцитів щурів в неізотонічних середовищах також досліджена безпосередньо на предметному столику мікроскопа в спеціально сконструйованій камері. Вивчення перерозподілу кріозахисних речовин в системі “еритроцит - позаклітинне середовище” проведено методом світлової мікроскопії і методом 1Н-ЯМР - спектроскопії на спектрометрі “Tesla BS 597A”(Чехословакія) [Зинченко В.Д. и др., 1991]. Для визначення чисельних значень коефіцієнта фільтрації і коефіцієнта проникності для кріопротекторів плазматичних мембран клітин використана фізико-математична модель Kedem-Katchalsky [Kedem O., Katchalsky А., 1958, 1961], модифікована у застосуванні до кріобіологічних задач [Гордиенко Е.А., 1994]. Експериментальні кінетичні криві зміни клітинного об'єму в неізотонічних середовищах залежно від часу (гепатоцити щурів) або від температури при позаклітинному льодоутворенні (ВНК-21) одержано методом волюмометрії [McGrath J.J., 1983, 1997; Diller K.R., 1987]. Заморожування еритроцитів пуповинної крові проводили в пластикових контейнерах об'ємом 10 мл в камері програмного заморожувача УОП-6 виробництва СКТБ з ДВ ІПКіК НАН України. Стан зовнішніх примембранных шарів еритроцитів при дії помірної гіпертонії оцінювали за інтенсивністю сорбції клітинами прижиттєвого барвника альціанового синього (АС) [Крыленков В.А., 1979]. Рівень вільного гемоглобіну і АС в супернатантах визначали на спектрофотометрі СФ-26 (ЛОМО, Ленінград) відповідно в області 410-420 нм (смуга Сорі) і в області 617 нм (смуга максимального поглинання АС). Пружні властивості плазматичної мембрани ізольованих гепатоцитів щурів оцінено з використанням математичного апарату теорії пружності тонких оболонок [Ивенс И., Скейлак Р.,1982].

Як кріозахисні речовини а також реагенти, що впливають на біологічні об'єкти, були використані: оксиди (диметилсульфоксид (“ДиаэМ”, “Реахим”)); поліетиленоксиди (поліетиленгліколі) м.м. 400, 600, 1500, 3000 (“Merck”, “Реахим”); одноатомні спирти (етанол (“Реахим”)); багатоатомні спирти (гліцерин (“Реахим”), оксиетильований гліцерин (оксиетильована похідна гліцерину n=5 синтезована і ідентифікована в ІПКіК НАНУ), етиленгліколь (“Sigma”, “Реахим”), 1,2-пропандіол (“Реахим”)); представник полімерних піролідонів (полівінілпіролідон м.м. 12000 (“Merck”)); солі (хлористий натрій (“Реахим”)); вуглеводи (сахароза (“Реахим”)); полімерні і мономерні поверхнево-активні речовини (ПАР) (гідролізований поліакрілонітрил, карбоксиметилцелюлоза, поліакриламід, поліоксиацетиленсорбітоллаурат, полівініловий спирт, гексаметафосфат натрію, алкілоламід, ОС-20, СВ-33, ОП-10, тетрамон, триамон (“Реахим”)); представники катіонних амфіфільних сполук (хлорпромазин м.м. 355,3 (“Serva”)), цвіттеріонних (3-цетилдиметиламоній-1-пропансульфонат м.м. 307,4 (“Calbiochem”)), неіонних (додецил-,D-мальтозид м.м. 510,6 (“Calbiochem”)), аніонних (децилсульфат натрію м.м 260,0 (НДІПАР)); прижиттєві барвники (трипановий синій м.м. 960,82 (“Chemapol”), високомолекулярний барвник фталоціанінової групи Alcian Blue 8GS м.м. 1300 (“Serva”)). Всі реагенти кваліфікації ”х.ч.” або ”ч.д.а.”

При обробці експериментальних результатів використано методи багатовимірного статистичного аналізу [Адлер Ю.П., 1976; Стьюпер Е., 1982; Дрейпер Н., 1986]. Статистичну вірогідність результатів оцінювали методом Стьюдента-Фішера [Закс Л., 1976]. У розрахунках використано пакет комп'ютерного статистичного аналізу даних програми Exel-2003.

У розділі 3 наведено результати дослідження механізмів позаклітинної нуклеації і росту кристалів льоду, а також дані про вплив кріопротекторів і режимів заморожування на особливості протікання процесів кристалізації в біологічних розчинах.

Механізм первинного позаклітинного зародкоутворення льоду в біологічних розчинах встановлено на основі вивчення впливу швидкості охолодження і переохолодження на кінетику процесу кристалізації в емульсійній системі дрібних крапель. В першому випадку модельну систему охолоджували з різними швидкостями до однієї і тієї ж температури з подальшою експозицією при цій температурі, в другому - з постійною швидкістю до різних температур з подальшою експозицією при цих температурах. Кількісною характеристикою процесу первинного зародкоутворення була частка (, %) крапель емульсії, що кристалізувалися залежно від часу експозиції. Експериментальні дані оброблено з використанням рівняння, що описує процес зародкоутворення в краплях емульсії [Мелихов И.В., 1979]. В краплях певної розмірної фракції це рівняння має вигляд:

, (1)

де V - відносний розмір краплі (відношення кубів фактичного розміру краплі r до найімовірного r0; m - середнє число твердих домішок в краплі характеристичного розміру (; - характеристичний об'єм краплі, n - питома концентрація твердих домішок); Ik - частота гетерогенного зародкоутворення; Iv - частота гомогенного (флуктуаційного) зародкоутворення; Is - частота гетерофазного зародкоутворення; - час. Якщо гетерофазний механізм нуклеації не реалізується (Is = 0), то

(2)

В табл. 1 і 2 наведено кількісні оцінки параметрів, що фігурують в рівняннях (1) і (2), які були одержані методом нелінійного оцінювання [Marquardt D.W., 1963]. Порівняння значень частот гетерогенного і флуктуаційно-гетерофазного, а також значень частот гетерогенного і флуктуаційного зародкоутворення (табл. 1) показує, що в середньому внесок в первинне зародкоутворення гетерогенного механізму складає 98,7%. Встановлено, що кількість активних твердих домішок і їх активність, яка характеризується частотою гетерогенного зародкоутворення на одній домішковій частинці, росте із збільшенням як переохолодження (табл. 1), так і швидкості охолодження (табл. 2).

Механізм росту позаклітинних кристалів льоду і механізм формування кристалічної структури льоду різної дисперсності встановлено на підставі одержаної нами залежності лінійної швидкості росту v від переохолодження Т розчинів ліофілізованої плазми крові людини, що містили кріопротектори етиленгліколь (ЕГ), диметилсульфоксид (ДМСО), поліетиленгліколь м.м. 1500 (ПЕГ-1500) та полівінілпіролідон м.м. 12000 (ПВП-12000) в концентрації 0-40 мас %. Аналітична залежність лінійної швидкості росту грані кристала від переохолодження системи була одержана методом багатовимірного статистичного аналізу в діапазоні швидкостей росту від 0 до 100 мкм/с (табл. 3). Встановлено, що незалежно від виду кріопротектора, його концентрації і величини переохолодження модельного позаклітинного розчину лінійна швидкість росту кристалів льоду переважно представлена двома доданками, що свідчить про реалізацію в системі одночасно двох механізмів росту: нормального (залежність вигляду vT) і дислокаційного (залежність вигляду vT2).

Аналіз рівнянь регресії (табл. 3) показав, що збільшення концентрації кріопротектора в розчині приводить до пригнічення як нормальної, так і дислокаційної складових росту. При цьому дислокаційна складова є більш чутливою до наявності кріопротекторів у розчині, ніж нормальна. За ступенем пригнічення нормальної складової росту кріопротектори розташовуються в ряд ЕГ > ПЕГ-1500 > ДМСО > ПВП-12000, а дислокаційної складової - в ряд ЕГ > ДМСО> ПВП-12000 > ПЕГ-1500.

Оцінено величини критичних переохолоджень ДТк, при яких внесок в лінійну швидкість росту кристалів льоду обох механізмів однаковий, і визначено ті області переохолоджень, де превалює один з них. Як випливає з даних, що наведено в табл. 4, при збільшенні концентрації кріопротекторів ЕГ, ДМСО і ПЕГ-1500, значення критичних переохолоджень збільшуються. Для ПВП-12000 відмічається зниження критичних переохолоджень включаючи 30%, що свідчить про збільшення в даній концентраційній зоні ймовірності дислокаційного механізму росту.

Таблиця 1

Оцінка параметрів рівнянь (1) і (2) за впливом температури експозиції (величини переохолодження Т) на кінетику первинного зародкоутворення в плазмі крові людини

Таблиця 2

Оцінка параметрів рівняння (2) за впливом швидкості охолодження на кінетику первинного зародкоутворення в плазмі крові людини

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблиця 3

Аналітична залежність швидкості росту грані кристала льоду (v = k0Т3 + k1Т2 + k2Т) від об'ємного переохолодження системи (Т)

Таблиця 4

Критичні переохолодження (ДТк,°С), при яких внесок в лінійну швидкість росту кристалів льоду (н) нормального і дислокаційного механізмів однаковий

Примітка : при ДТ ДТк переважає внесок дислокаційного механізму ростy, при ДТ < ДТк переважає внесок нормального механізму росту (ДТ - поточне переохолодження).

Показано, що морфологічний характер структури льоду, що формується в розчинах ліофілізованої плазми крові людини, змінюється відповідно до встановленої аналітичної залежності лінійної швидкості росту від переохолодження. У відсутності кріопротекторів рост кристалів льоду в розчині відбувається тільки за дислокаційним механізмом (табл. 3). В цьому випадку у всьому дослідженому діапазоні переохолоджень при фазовому переході утворюються розгалужені дендритні структури льоду, що мають осі вищих порядків. При спільній реалізації обох механізмів росту протяжні лінійні структури, які характерні для нормального механізму росту, чергуються з великими дендритними гілками. Перевага того або іншого механізму формування позаклітинної морфологічної структури льоду впливає на збереження біологічних об'єктів. Оскільки при дислокаційному механізмі лінійна швидкість росту кристалів більша, ніж при нормальному, швидке збільшення градієнта осмотичного тиску на мембрані, що обумовлено виморожуванням позаклітинної води, може привести до загибелі клітин вже в температурній зоні формування первинної кристалічної структури. Звідси випливає доцільність максимального пригнічення цієї складової росту, що, як встановлено, найбільш ефективно досягається при вмісті в позаклітинному середовищі етиленгліколю.

Для тих же моделей позаклітинного середовища одержана аналітична залежність ступеня дисперсності кристалів льоду 1/? від переохолодження системи ДТ вигляду 1/?=k1ДТ2+ k2ДТ (табл. 5). Аналіз цієї залежності дозволяє стверджувати, що у формуванні структури льоду різної дисперсності також беруть участь обидві складові механізму росту реальних кристалів.

Таблиця 5

Аналітична залежність ступеня дисперсності кристалів льоду 1/? (1/? = k1Т2 + k2Т ) від об'ємного переохолодження системи (Т)

Дисперсність кристалічної структури є функцією двох конкуруючих кінетичних процесів: швидкості росту грані кристала v і швидкості утворення на ній центрів росту Iц. Розрахунки показали (табл. 6), що при підвищенні концентрації в розчині ЕГ, ДМСО і ПЕГ-1500 спостерігається зниження швидкості утворення центрів росту Iц.

Таблиця 6

Розрахункова залежність швидкості утворення центрів росту (Iц) на грані кристала від концентрації кріопротектора при переохолодженні Т=1°С

В розчинах ПВП-12000 при концентрації 5 і 10% швидкість утворення центрів росту спочатку зростає, а потім знижується, що вказує на існування різних механізмів впливу кріопротекторів на швидкість утворення центрів росту. Досліджені кріопротектори є класом модифікаторів процесу кристалізації, які добре розчиняються в рідкій фазі і не розчиняються в кристалічному зародку. Тому їх вплив на кінетичні характеристики кристалізації виявляється, в основному, внаслідок зміни складу межі поділу “кристал-розчин”. Пригнічення швидкості утворення центрів росту, можливо, пояснюється тим, що молекули кріопротектора міцно зв'язують молекули води поблизу межі поділу фаз, а активація - адсорбцією молекул кріопротектора на грані кристала, яка росте, що приводить до зменшення поверхневої енергії межі поділу “кристал-розчин” і, як наслідок цього, до збільшення швидкості зародкоутворення. В порівнянні з іншими дослідженими кріопротекторами ПВП-12000 має високу адсорбційну активність (g=159,010-3 Н/м моль), в'язкість (з=5,21 103 Па.с при 0°С ) і здатність міцно зв'язувати воду [Новиков А.Н., 1990], що пояснює особливості процесу зародкоутворення в його присутності. На підставі аналізу рівнянь регресії виявлено характер впливу концентрації кріопротекторів на дисперсність структури льоду при заданому переохолодженні (Т=0,5°С). Встановлено, що збільшення концентрації ЕГ в розчині до 48,6%, ДМСО - до 59,0%, ПЕГ-1500 - до 56,9% і ПВП-12000 - до 53,8% приводить до збільшення дисперсності кристалів льоду. При подальшому підвищенні концентрації кріопротекторів дисперсність зменшується. Існування критичних концентрацій вказує на зміну механізму впливу кріопротекторів на кінетичні процеси, які визначають дисперсність кристалів льоду: якщо С Скрит., то превалює пригнічення швидкості росту грані кристала, якщо С Скрит., - превалює пригнічення швидкості утворення центрів росту.

Показано, що присутність в розчині як мономерних, так і полімерних ПАР знижує швидкість росту кристалів льоду і збільшує їх розміри. З досліджених ПАР, що пригнічують швидкість утворення центрів росту і швидкість росту грані кристала льоду, найбільш виражений вплив має карбоксиметилцелюлоза.

За допомогою оптимальних методів статистичного планування і обробки результатів багаточинних експериментів проведено порівняльний аналіз впливу переохолодження модельного позаклітинного середовища х1 (рівні варіювання 0,2-0,5°С), концентрації кріопротектора етиленгліколю х2 (2,0-5,0 мас%) і концентрації карбоксиметилцелюлози х3 (0,25-1,0 мас%) на швидкість росту v і розмір кристалів льоду ?, що утворюються. Аналіз рівнянь регресій (3) і (4) свідчить про складний взаємний вплив досліджених чинників на кінетичні характеристики росту кристалів льоду, і що найефективнішим способом управління швидкістю росту і розміром позаклітинних кристалів льоду, що утворюються, є переохолодження, а вплив концентрації ЕГ і ПАР є менш вираженим:

v = 35,1 + 21,6х1 - 11,6х2 - 2,6х3 - 7,1х1х2 - 4,6х1х3 + 4,6х2х3 (3)

? = 227,2 - 86,8х1 - 66,2х2 + 26,2х3 +39,7х1х2 - 12,8х1х3 - 15,2х2х3 (4)

Рентгенографічно вивчено вплив режимів заморожування на структурні особливості льодоутворення у водних розчинах гліцерину, оксиетильованого гліцерину (ОЕГn=5), сахарози, поліетиленоксидів (ПЕО) м.м. 400 і 3000 в діапазоні концентрацій 0-100 мас%. Охолодження розчинів від 24°С до -140°С здійснювали: двохетапно зі швидкістю 1°С/хв до температури фазового переходу з витримкою на плато кристалізації до завершення процесу виділення теплоти кристалізації і далі зі швидкістю 100°С/хв; одноэтапно повільно зі швидкістю 1°С/хв і одноэтапно зі швидкістю 100°С/хв. При заморожуванні розчинів, що містять від 5 до 15% кріопротекторів, за двохетапною і повільною одноетапною програмами середні лінійні розміри кристалів льоду дорівнюють 28,9 і 15,4 мкм відповідно. Якісні особливості рентгенограм (розширення рефлексів у радіальному напрямку, що вказуює на виникнення усередині зерен неоднорідних мікронапруг; наявність достатньо крупних, яскравих рефлексів від кристалів з малою разорієнтацією, що злилися; розщеплення рефлексів, що характерне для субструктури; нерівномірний розподіл рефлексів уздовж дебаєвських кілець, що вказує на виникнення переважних кристалографічних орієнтацій) свідчать про значну дефектність кристалів льоду. Одноетапне охолодження розчинів кріопротекторів із швидкістю 100°С/хв в області концентрацій до 15% приводить до нерівномірного розподілу рефлексів у дебаєвських кільцях від крупних кристалічних утворень, що вказує на анізотропію росту кристалів льоду, обумовлену значними концентраційними і температурними градієнтами, які виникають при великих швидкостях охолодження.

Вплив швидкостей охолодження на структуру заморожених водних розчинів кріопротекторів в області високих концентрацій проаналізовано на прикладі 45% розчинів ПЕО-400. При повільному одноетапному охолодженні (1°С/хв) рефлекси від кристалічних зерен дискретні, рівномірно і дуже щільно розташовуються в дебаєвських кільцях, що вказує на рівноважні умови росту кристалів льоду у всьому об'ємі (10 ? 15 мкм). Збільшення швидкості охолодження на другому етапі до 100°С/хв обумовлює формування широких суцільних дебаєвських кілець рівномірної інтенсивності (? 10 мкм). Для швидкого одноетапного охолодження (100°С/хв) характерне формування тонких суцільних дебаєвських кілець (1 ? 10 мкм) нерівномірної інтенсивності, що вказує на виникнення текстур, які свідчать про наявність в кристалах льоду значних деформацій.

Таким чином, присутність кріопротекторів у розчинах обумовлює виникнення в кристалічній структурі льоду дефектів різного типу (вакансії, дислокації, межзеренні межі), які в місцях їх локалізації є джерелами пружних напруг. Релаксація цих пружних напруг у вигляді утворень тріщин може бути однією з причин механічного пошкодження клітин в зоні низьких температур.

У розділі 4 представлено результати аналізу впливу позаклітинного льодоутворення на збереження сперміїв людини і ембріонів мишей ранніх стадій розвитку.

Спермії людини були заморожені в 1,37 М розчині гліцерину за чотирма програмами: охолодження від 24°С із швидкістю 1°С/хв до температурної зупинки при 5°С (30 хв) і далі - зі швидкістю 20-25°С/хв до -140°С (програма 1); охолодження зі швидкістю 20-25°С/хв до -140°С (програма 2); охолодження зі швидкістю 1°С/хв до температурної зупинки при -15°С (30 хв) і далі - зі швидкістю 20-25°С/хв до -140°С (програма 3); охолодження зі швидкістю 1°С/хв до -140°С (програма 4). Швидкість відігрівання становила 10°С/хв. Встановлено, що при зниженні температури активна хаотична рухливість сперміїв істотно зменшується і при 5°С носить в основному коливальний характер, а при 2°С повністю припиняється. У разі сприятливого результату циклу заморожування-відігрівання рухливість клітин відновлюється в температурній зоні 2-5°С і при 24°С має активно-поступальний характер. При всіх програмах охолодження фазовий перехід в суспензії клітин супроводжується утворенням первинної дрібнокристалічної структури льоду. У разі подальшого повільного охолодження така структура рекристалізується. Температурна зупинка на етапі охолодження при -15°С створює умови для максимального укрупнення кристалів льоду. Після відігрівання рухливість сперміїв у цьому випадку не відновлюється, спостерігається набухання головок сперміїв, основна маса клітин фрагментована. Збільшення швидкості охолодження суспензії клітин в зоні фазового переходу до 20-25°С/хв пригнічує процеси рекристалізації і знижує кількість пошкоджених сперміїв. Таким чином, при повільному охолодженні клітинної суспензії активні процеси рекристалізації можуть бути механічним чинником пошкодження сперміїв. Встановлено, що найефективнішою програмою заморожування сперміїв людини під захистом 1,37 М гліцерину є програма 1, перевагою якої є повільне охолодження еякулятів в області позитивних температур, що виключає холодовий шок сперміїв, і температурна зупинка при 5°С, що сприяє поступовому припиненню рухової активності сперміїв і адаптації клітин до гіпотермічних умов. Після заморожування за даною програмою і відігрівання кількість рухомих сперміїв при 24°С становить 47,3±2,5% (при початковій рухливості сперміїв в еякуляті 65,9 ± 3,25%). Рух сперміїв має активно-поступальний характер.

Як один з можливих способів підготовки клітин до дії несприятливих чинників, що пов'язані з позаклітинним льодоутворенням, вивчено вплив попередньої дегідратації клітин і їх насичення високою концентрацією проникаючого кріопротектора на ймовірність внутрішньоклітинної кристалізації в ембріонах мишей лінії СВА ранніх стадій розвитку. Дегідратацію клітин при 22°С досягали експозицією ембріонів протягом 10 хв в 0,5 або 1,0 М розчинах сахарози або NaCI, що готували на середовищі Дюльбекко. Суспензію клітин охолоджували зі швидкістю 5°С/хв до -30°С в спеціальній комірці в робочій камері кріомікроскопа. Швидкість відігрівання становила 5°С/хв. Встановлено, що попередня дегідратація зигот і 2-клітинних ембріонів в 0,5 і 1,0 М розчинах NaCl і сахарози не виключає ймовірність внутрішньоклітинної кристалізації, яка приводить до деструктивних змін клітин, що поширюються на цитоматрикс і клітинну мембрану. При заморожуванні не зневоднених клітин і попередньо зневоднених в 0,5 М і 1,0 М розчинах NaCl внутрішньоклітинна кристалізація виникає одночасно з позаклітинним льодоутворенням. Пошкодження клітин, що обумовлені як дією позаклітинних кристалів льоду (розриви і тріщини zona реllucida), так і внутрішньоклітинними кристалами льоду (розриви плазматичних мембран зигот, втрата межі між бластомерами, вихід з клітин внутрішньоклітинного вмісту), спостерігаються в зоні інтенсивного плавлення. Заморожування зигот і 2-клітинних ембріонів в 0,5 і 1,0 М сахарозі супроводжується переохолодженням цитоплазми і пониженням температури внутрішньоклітинного льодоутворення щодо температури фазового переходу в позаклітинному середовищі. Виявлено, що внутрішньоклітинна кристалізація в 2-клітинних ембріонах мишей відбувається ініціацією льодоутворення в місцях контакту клітин із бластомера, в якому кристалізація вже відбулася.

Можливість виключення внутрішньоклітинного льодоутворення при заморожуванні ембріонів мишей ранніх стадій розвитку встановлено в умовах поєднаної дії двох чинників: одночасного зневоднення і насичення клітин проникаючим кріопротектором етиленгліколем. Ембріони витримували 10 хв в 1,8 М розчині ЕГ, потім на 1,5 хв переносили в середовище заморожування, що було сумішшю 5,37 М ЕГ і 0,7 М сахарози. Показано, що в цьому випадку при заморожуванні до -100°С бластомери зберігають початкову оптичну густину, а кріозахисна суміш залишається оптично прозорою, що свідчить про відсутність внутрішньоклітинної кристалізації і здатності етиленгліколь-сахарозного середовища даного складу до склування навіть при повільних швидкостях охолодження (5°С/хв). На етапі відігрівання в області температур 62…60°С в позаклітинному середовищі реєструється зародкоутворення кристалів льоду у вигляді невеликої кількості дендритних розеток, які при подальшому підвищенні температури швидко плавляться, що виключає ймовірність пошкодження клітин внаслідок кристалоутворення. Внутрішньоклітинна девітрифікація відсутня. Після відігрівання ембріонів зберігається чітка межа між бластомерами, плазматична мембрана і zona pellucida не мають розривів.

Таким чином, для надійного запобігання внутрішньоклітинного льодоутворення обов'язковою умовою є не тільки вилучання частини внутрішньоклітинної води, але і присутність усередині клітин проникаючого кріопротектора.

У розділі 5 представлено результати дослідження морфологічних змін еритроцитів людини в розчинах представників різних класів амфіфільних сполук, а також вивчено взаємозв'язок між трансформацією еритроцитів у присутності неелектролітів ряду Н-спиртів і особливостями розподілу їх молекул в системі “клітина - позаклітинне середовище” при підготовці клітинних суспензій до кріоконсервування.

Проведені нами дослідження показали, що морфологічні зміни клітин можуть бути якісним тестом характеру взаємодії вказаних реагентів з мембраною. Так, обробка еритроцитів людини неіонною сполукою додецил-в,D-мальтозидом, цвіттеріонною сполукою 3-цетилдиметиламоній-1-пропансульфонатом, аніонною сполукою децилсульфатом натрію супроводжується трансформацією клітин в ехіноцити і сфероехіноцити, що свідчить про вбудовування молекул цих речовин в зовнішній моношар ліпідного бішару [Sheetz M., Singer S., 1974; 1976]. Стоматоцитоз еритроцитів за наявності в середовищі катіонної амфіфільної сполуки хлорпромазина є наслідком проникнення його молекул у внутрішній моношар. Мікроскопічно вивчено явище трансформації нормоцитів в стоматоцити-III (сферостоматоцити) при підвищенні концентрації хлорпромазину в позаклітинному розчині.

Взаємозв'язок між трансформацією еритроцитів людини в гіпертонічних розчинах (750 50 мОсм/л) низькомолекулярних (етанол, 1,2-пропандіол, гліцерин) і високомолекулярних (поліетиленгліколі м. м. 400, 600, 1500) Н-спиртів і особливостями розподілу цих речовин між клітиною і середовищем вивчено при 25°С. Розчини кріопротекторів готували на 0,015 М фосфатному буфері, що містить 0,15 М NaCI (рН 7,4). В табл. 7 подано значення коефіцієнтів розподілу (Q) досліджених неелектролітів між клітиною і середовищем, що були одержані методом 1Н-ЯМР, і дані про трансформацію еритроцитів у відповідних розчинах. Для низькомолекулярних спиртів значення Q близькі до 1 і спостерігається тенденція до їх зменшення у ряді етанол 1,2-пропандіол гліцерин. У цьому випадку в стаціонарних умовах термодинамічна рівновага в системі встановлюється шляхом проникнення даних речовин у клітини. В морфоеритрограмах простежується сферуляція клітин із формуванням як спікул на поверхні мембран - сфероехіноцитоз (гліцерин), так і згладжених форм - сферостоматоцитоз (етанол, 1,2-пропандіол). Для високомолекулярних спиртів значення коефіцієнтів розподілу Q близькі до 0,5 і також є тенденція до їх зниження із збільшенням кількості оксиетильних груп в молекулах ПЕГ, що свідчить про зменшення ймовірності проникнення даних сполук в клітини.

Таблиця 7

Коефіцієнти розподілу Q неелектролітів ряду Н-спиртів у системі ”клітина-позаклітинне середовище”

Примітки: 2,3; 4,5; 5,6 - відмінності між значеннями статистично невірогідні (Р<0,95); решта варіацій порівняння значень Q у ряду низькомолекулярних і у ряді високомолекулярних Н-спиртів вірогідні (Р0,95).

Трансформація еритроцитів у цьому випадку супроводжується планоцитозом, обумовленим зневодненням, що підтверджує переважну локалізацію даних сполу...