Механізми дії позаклітинного льодоутворення та пов’язаних з ним явищ на біологічні об’єкти

Таким чином, в дослідженому ряду неелектролітів існує кореляція між коефіцієнтом їх розподілу Q в системі “клітина-позаклітинне середовище” і формою еритроцитів.

У розділі 6 представлено результати дослідження осмотичної стійкості і кріорезистентності еритроцитів пуповинної крові людини в гіпертонічних розчинах NaCl, оцінено стан зовнішніх примембранних шарів еритроцитів людини в умовах дії помірної сольової гіпертонії, продемонстрована можливість використання гіпотермічної стійкості форми еритроцитів для аналізу ступеня вираженості патологічного процесу в організмі хворих.

Гіпертонічна стійкість еритроцитів пуповинної крові досліджена у водних розчинах NaCI в концентраційному ряду 0,15 - 3,42 М. Еритромасу з гематокритом 0,99 змішували в об'ємному співвідношенні 1:10 з розчинами NaCI. Після 5, 10, 15, 30 і 60 хв експозиції при 20°С одержували супернатанти для спектрофотометрії. Критерієм чутливості еритроцитів пуповинної крові до гіпертонічної дії або охолодження служив коефіцієнт К=(Ггіперт.(охол.) - Гк)/Гкрит., де Ггіперт.(охол.) - рівень вільного гемоглобіну в супернатанті після гіпертонічної дії або циклу “охолодження-відігрівання”; Гк - рівень вільного гемоглобіну в супернатантах відповідних контрольних зразків; Гкрит. - критичний рівень вільного гемоглобіну в супернатанті кріоконсервованої донорської крові людини після відмивання від гліцерину, що допускається при трансфузії і рівний 200 мг %. Встановлено, що критичний рівень вільного гемоглобіну Гкр досягається через 7 хв експозиції еритроцитів пуповинної крові в 2,3 М розчині NaCI, осмотичний тиск якого в 15 разів перевищує ізоосмотичний (рис. 1, б). Через 60 хв ізотермічної експозиції в 2,3 М розчині NaCI гемоліз досягає значення 570 15 мг % (17,8%). У 3,42 М розчині NaCI кількість вільного гемоглобіну практично в 10 разів перевищує критичний вже після 5 хв дії на клітини реагенту і після 15 хв реакції спостерігається 90% гемоліз.

Рис. 1. Кінетика накопичення вільного гемоглобіну в супернатанті при експозиції еритроцитів пуповинної крові людини в гіпертонічних розчинах NaCl: а: - контроль 0,15 М; - 0,45 М; б - 2,3 М.

Динаміка накопичення вільного гемоглобіну в супернатантах свідчить про наявність швидкої і повільної фази гіпертонічного гемолізу, що вказує на гетерогенність суспензії еритроцитів пуповинної крові, в якій клітини виявляють різну стійкість до гіпертонічної дії. Еритроцити пуповинної крові характеризуються вираженим анізоцитозом (об'єм клітин варіює від 80 мкм3 до 120 мкм3 [Шт. Берчану, 1985; Торубарова Н.А. и др. 1993]). Тому критичний мінімальний об'єм внаслідок зневоднення, що приводить до гіпертонічного гемолізу, в популяції клітин досягається не одночасно. Відомо, що найстійкішими є молоді еритроцитарні клітини, до яких відносяться ретикулоцити. В пуповинній крові в нормі ретикулоцитів міститься до 7% [Торубарова Н.А. и др., 1993] які, можливо, і визначають підвищену гіпертонічну стійкість в електролітному середовищі.

Дослідження чутливості еритроцитів пуповинної крові до подальшого охолодження проведено після попередньої експозиції клітин у водних розчинах NaCI з концентрацією 0,45 - 1,4 М (840 - 2600 мОсм/л), в яких еритроцити пуповинної крові виявляють стійкість до гіпертонічної дії. Еритромасу змішували з розчинами NaCI як описано вище. Після 5, 10, 15 хв експозиції при температурі 24°С зразки охолоджували зі швидкістю 3°С/хв до температури -1,5°С в камері заморожувача УОП-6, відразу відігрівали зі швидкістю 3°С/хв і одержували супернатанти. В контролі клітини експонували в досліджуваних розчинах з урахуванням часу, відповідного тривалості циклу “охолодження - відігрівання”. Встановлено, що підвищену чутливість до охолодження еритроцити пуповинної крові починають виявляти при гіпертонічності середовища вище 0,85 М NaCI (1550 мОсм/л) (рис. 2, б). Гіпертонічний кріогемоліз (К = 1,67) перевищує критичний після 5 хв попередньої експозиції клітин в 1,2 М NaCI і порівняний з гіпертонічним гемолізом (К = 1,60) при експозиції еритроцитів пуповинної крові в 2,3 М NaCI протягом 15 хв (рис. 2, а, крива 3). Таким чином, еритроцити пуповинної крові людини, як і еритроцити дорослих донорів [Green F.A., 1977], набувають чутливості до подальшого охолодження після попередньої експозиції клітин в гіпертонічних розчинах NaCI.

Рис. 2. Залежність коефіцієнтів чутливості (К) еритроцитів пуповинної крові людини від концентрації NaCI у суспензії: а - при 20°С, час експозиції, хв: 1 - 5; 2 - 10; 3 - 15; 4 - 30; 5 - 60; б - після охолодження, час попередньої експозиції, хв: 1 - 5; 2 - 10; 3 - 15. Критичні концентрації Скрит.(К=1): а - при відповідних часах експозиції 2,35, 2,22, 2,20, 2,13 і 1,86 М; б - при відповідних часах попередньої експозиції 1,07, 1,00 і 0,93 М.

Нижній поріг, при якому еритроцити пуповинної крові людини стають чутливими до охолодження, лежить вище 840 мОсм/л (0,45 М) (рис. 2, б) і перевершує нижній поріг чутливості для еритроцитів дорослих донорів 750 мОсм/л (0,36 М) [Morris G.J. et al, 1983], що може бути також обумовлено більш високим вмістом в пуповинній крові молодих еритроцитарних форм. Порівняння критичних концентрацій NaCI, при яких еритроцити пуповинної крові втрачають гіпертонічну стійкість (рис. 2, а) з критичними концентраціями NaCI, при яких спостерігається втрата їх кріостійкості (рис. 2, б) свідчить про те, що охолодження приводить до зниження критичних концентрацій втрати гіпертонічної стійкості більш ніж в два рази. Таким чином, при позаклітинній кристалізації клітини пошкоджуються при досягненні набагато більш низьких концентрацій NaCI, ніж при гіпертонічній дії в області позитивних температур.

Розвиток гіпертонічного гемолізу індивідуальних еритроцитів людини досліджено в “живій краплі” цільної донорської крові у водних розчинах з концентрацією 0,34 - 3,42 М NaCI. Встановлено, що в 0,34 М розчині NaCI розвивається дискоехіноцитоз еритроцитів. Реакція еритроцитів на введення 0,85 і 1,28 М розчинів NaCI супроводжується деформацією клітин при зневодненні, в результаті якої клітинна поверхня втрачає регулярність. Проте після 55 хв реакції кількість клітин в передгемолітичній формі (сфероцити) а також тіней невелика. Взаємодія еритроцитів з 1,4 і 2,3 М розчинами NaCl характеризується стабілізацією зневодненого стану деформованих клітин і подальшим відповідно незначним і наростаючим гіпертонічним гемолізом. Механізм гіпертонічного гемолізу проаналізовано в 3,42 М розчині NaCl. Встановлено, що вже через 8 с реакції деформовані внаслідок зневоднення еритроцити стрибкоподібно трансформуються в стоматоцити II - III ступеня. Потім настає сферуляція клітин, знезбарвлення сфероцитів, обумовлене виходом гемоглобіну, і утворення тіней. Найстійкіші еритроцити знаходяться в деформованому стані до 1,5 хв. Кількісний підрахунок тіней в морфоеритрограмах показав, що в 3,42 М розчині NaCl 50% гемоліз спостерігається через 3 хв контакту еритроцитів з ним. Таким чином, морфологічна відповідь еритроцитів людини на гіпертонічну дію солі залежить від її концентрації в розчині і часу контакту клітин з нею. При експозиції клітин в середовищі, що містить NaCl до 1,28 М (2512 мОсм/л), еритроцити практично не руйнуються. Проте трансформація еритроцитів з істотною зміною рельєфу клітинної поверхні, що спостерігається в цьому випадку може ініціювати структурні порушення мембран клітин.

Методом прижиттєвого забарвлення суспензії еритроцитів дорослих донорів альціановим синім (АС) оцінено стан глікокалікса еритроцитів після гіпертонічної дії NаCl в діапазоні концентрації 0,15 - 1,28 М при кімнатній температурі. Концентрацію клітин в експериментах підтримували постійною (108 кл/мл), змішуючи еритромасу (гематокрит 0,99) в співвідношенні 1:1 з розчинами NаCl.

Рис. 3. Залежність концентрації АС у супернатантах від концентрації NaCI у суспензії еритроцитів людини.

Час експозиції клітин у розчинах солі складав 15 хв. Після цього суспензію клітин забарвлювали протягом 10 хв 0,01% розчином АС, який готували на 0,15 М NаCl. Встановлено, що в контролі сорбція АС клітинами максимальна: в супернатанті реєструється мінімальна концентрація АС (рис. 3). При підвищенні гіпертонічності середовища концентрація АС в супернатантах зростає і особливо різко вище 0,85 М NаСl. Як показав паралельний контроль, рівень гемолізу в області дії помірної гіпертонії (до 1,28 М) становить менш 1%. Відсутність в суспензії значної кількості зруйнованих клітин, з фрагментами яких міг би зв'язуватися АС, дозволяє вважати, що зміна концентрації барвника в супернатантах обумовлена саме зниженням його сорбції клітинною поверхнею. Оскільки серед речовин білкової природи АС зв'язується тільки з глікопротеїнами [Крыленков В.А. и др., 1979; Арцишевская Р.А. и др., 1983], зниження сорбції АС поверхнею еритроцитів може бути наслідком часткового руйнування їх глікокалікса і елімінацією в позаклітинне середовище його компонентів. Часткове руйнування глікокалікса еритроцитів на етапі експозиції клітин при кімнатній температурі в розчинах з концентрацією NaCI 0,85 М і вище слід розглядати як один з первинних пускових механізмів гіпертонічного кріогемолізу.

Вивчена чутливість форми еритроцитів до патологічного процесу, обумовленого вібраційною хворобою. Встановлено, що в морфоеритрограмах периферичної крові хворих на вібраційну хворобу кількість дискоїдних клітин знижується, і у міру розвитку патологічного процесу збільшується кількість стоматоцитів. В умовах гіпотермічного зберігання крові протягом 11 діб при 4°С достовірно помітні I і II стадії захворювання в порівнянні з контролем: якщо швидкість накопичення (С,% за добу) передгемолітичних форм еритроцитів лежить в інтервалі 3,5 С 5,0 діагностується I стадія хвороби, якщо ж С 5,0 - II. Таким чином, стійкість форми еритроцитів в умовах зберігання периферичної крові хворих при 4°С може бути діагностичним тестом ступеня розвитку патологічного процесу в організмі.

У розділі 7 представлено результати дослідження механізму постгіпертонічного лізису ізольованих гепатоцитів щурів, кількісно оцінено транспортні і механічні властивості їх плазматичних мембран, проаналізовано можливі механізми прояву морфологічних пошкоджень цих клітин.

Вивчена реакція ізольованих гепатоцитів щурів при 24°С в умовах послідовної зміни осмолярності позаклітинного середовища, що моделює дегідратацію і регідратацію клітин на етапах росту і плавлення позаклітинних кристалів льоду. В якості гіпертонічних реагентів використані розчини ДМСО в інтервалі концентрацій 0,28 - 2,8 M (осмолярність 580 - 2890 мОсм/л), які готували на середовищі суспендування гепатоцитів. Після 30 хв експозиції гепатоцитів у розчинах з різними концентраціями ДМСО тонічність середовища знижували до ізотонічної шляхом дозованого ступінчастого додавання до суспензії клітин дистильованої води. Виявлено, що загальною морфологічною реакцією гепатоцитів на регідратацію є масове формування на поверхні клітин мембранних міхурів (блебів), а характер постгіпертонічної реакції визначається рівнем попереднього насичення гепатоцитів кріопротектором і ступенем ізотропного розтягування плазматичної мембрани в стані досягнення осмотичної рівноваги системи при ступінчастій регідратації. На рис. 4, а і б наведено графіки зміни спостережуваної під мікроскопом відносної площі гепатоцитів щурів, насичених 2,1 M ДМСО, при одно- і двократному розведенні. Встановлено, що при регідратації після скидання мембранної напруги в обох випадках клітини залишаються осмотично активними при повторних осмотичних навантаженнях. Максимально можливе обводнення гепатоцитів, насичених 2,1 M ДМСО, спостерігається при трикратному ступінчастому розведенні суспензії (рис. 4, в). У цьому випадку осмотичне набухання клітин супроводжується повним відшаруванням плазматичної мембрани від цитроматрикса, її сферуляцією і розривом.

Рис. 4. Кінетика зміни відносної площі гепатоцитів при регідратації після гіпертонічної дії 2,1 M розчина ДМСО.

а - однократне розведення: СD - регідратація; DE - Lag-фаза (17 хв); EF - скидання мембранної напруги (15 с); FG - повторна дегідратація (2,8 M ДМСО); GH - повторна регідратація; б - двократне розведення: CD - регідратація; DE - Lag-фаза (45 с); EF - стрибкоподібне скидання мембранної напруги; FG - безперевний відтік внутрішньоклітинного вмісту; GH - стабілізація стану; HI - повторна дегідратація (2,1 M ДМСО); IJ - стабілізація зневодненого стану; JK - повторна регідратація ; в - трикратне ступінчасте розведення: СD - регідратація.

Критична відносна площа клітин при цьому досягає біля 5,6. При насиченні гепатоцитів 2,8 M розчином ДМСО трикратне зниження тонічності позаклітинного середовища супроводжується швидким збільшенням відносної площі клітин, після чого відразу настає різке скидання (15 с) мембранної напруги.

Таким чином, регідратація гепатоцитів щурів початково насичених ДМСО у різних концентраціях приводить до виникнення трансмембранного перепаду осмотичного тиску, в результаті якого клітини обводнюються так, що їх об'єм значно збільшується. При достатньо великому ізотропному розтягуванні мембрани гепатоцита в результаті флуктуаційного утворення макроскопічної пори з клітини стрибкоподібно викидається частина внутрішньоклітинного вмісту, що супроводжується зменшенням площі плазматичної мембрани клітини і її об'єму. В процесі постгіпертонічного лізису пора довільно “заліковується”, а плазматична мембрана гепатоцитів зберігає властивість вибіркової проникності, про що свідчить збереження осмотичної активності клітин при циклічній зміні тонічності позаклітинного середовища (рис. 4. а, FG і GH; рис. 4. б, HI и JK).

Фізичний аналіз вказаного процесу із залученням теорії деформації біологічних мембран дозволили, використовуючи експериментально виміряні морфометрічні параметри мембранних міхурів при їх утворенні і розриві, оцінити модуль ізотропного розтягування клітинної мембрани гепатоцитів Гi :

, (5)

де R0 - радіус гепатоцита в початковому стані; R - універсальна газова стала; Т - температура; y1, y2 - відносний об'єм клітини відповідно в гіпертонічному розчині і після регідратації; і - площі поверхні мембрани в області i-го міхура при регідратації і відповідно в недеформованому стані при утворенні локального розриву; ai, hi і , радіус основи і висота і-го міхура у відповідних станах; і приведені концентрації (- концентрація не проникаючих через клітинну мембрану речовин усередині клітини в початковій клітинній суспензії; np і ns - концентрація непроникаючого і проникаючого розчинених речовин в гіпертонічному розчині, який змішується з клітинною суспензією); g0 - відношення сумарного об'єму клітин до сумарного об'єму клітинної суспензії; - об'ємна частка осмотично неактивних внутрішньоклітинних речовин в початковій клітинній суспензії; Ф0 - відношення об'єму клітинної суспензії до об'єму гіпертонічного розчину; Q - коефіцієнт розведення дистильовоною водою клітинної суспензії з гіпертонічним розчином.

Оцінки показали, що при ізотропному розтягуванні мембрани гепатоцитів щурів до моменту виникнення в ній макроскопічного розриву площа її поверхні збільшується на 100 і більше відсотків. Середнє значення модуля ізотропного розтягування мембрани гепатоцитів щурів Гi становить 0,008 Н/м, що в 50 разів менше модуля ізотропного розтягування мембрани еритроцита людини (Г=0,4 Н/м). Аномально низьке значення модуля пружності мембран гепатоцитів щурів свідчить про здатність даних клітин витримувати значні трансмембранні перепади осмотичного тиску і деформації при ендоцитозі без пошкодження мембран, що обумовлено їх специфічним функціональним призначенням.

Значення транспортних характеристик (Lp, kp) плазматичних мембран гепатоцитів щурів одержані методом чисельного моделювання, в основі якого лежить поєднання фізико-математичного [Kedem O., Katchalsky A., 1958; 1961; Гордиенко Е.А., 1994] і експериментального аналізу зміни клітинного об'єму в ідентичних умовах. Експериментальні криві зміни об'єму гепатоцитів щурів визначені при 24°С в гіпертонічних розчинах NаСl в інтервалі концентрацій 0,34 - 3,42 M (осмолярність 1087-6636 мОсм/л), які готували на середовищі суспендування клітин. Морфологія гепатоцитів після гіпертонічної дії розчинів солі характеризується розпушуванням, грануляцією, фрагментацією цитоматрикса, контрастуванням ядер, обумовленим проясненням цитоплазми навкруги ядра, після чого відбувається відшаровування мембрани від цитоматрикса, формування численних локальних міхурів (блебов) і їх коалесценція. Відсутність активної осмотичної реакції гепатоцитів при повторних гіпертонічних діях 3,42 M розчином NaCl свідчить про втрату властивості вибіркової проникності їх плазматичних мембран при первинній гіпертонічній дії сольового розчину. В табл. 8 наведено експериментальні (Sc/t) і аналітично розраховані (Lp, ) значення клітинних параметрів при заданій осмолярності позаклітинного розчину. Отримані нами значення Lp свідчать про високу проникність плазматичних мембран гепатоцитів щурів для молекул води, що може бути обумовлено існуванням в їх мембранах крупних водних пор з ефективним діаметром 8-12 Е [Аlpini G. et al., 1986].

Таблиця 8

Характеристики гепатоцитів щурів у розчинах NaCl різної осмолярності

Примітка: відмінності між значеннями швидкості зміни площі клітини статистично вірогідні (Р0,95); 1,2 - відмінності між значеннями Lp статистично невірогідні (Р<0,95), відмінності між іншими варіаціями порівняння значень статистично вірогідні (Р0,999); відмінності між значеннями статистично вірогідні (Р0,99).

Для визначення коефіцієнта проникності kp мембран гепатоцитів щурів для молекул ДМСО використані кінетичні криві зміни об'єму клітин при їх контакті з гіпертонічними розчинами цього кріопротектора. Дані, що наведено в табл. 9, свідчать про збільшення значень коефіцієнтів фільтрації Lp і проникності kp при зростанні осмотичного тиску позаклітинного розчину. Порівняння коефіцієнтів фільтрації Lp в умовах близьких позаклітинних осмотичних навантажень, викликаних NаСl (2246 мОсм/л, табл. 8) і ДМСО (2250 мОсм/л, табл. 9) показує, що коефіцієнт фільтрації у присутності ДМСО на три порядки нижче, ніж у сольовому розчині. Ймовірною причиною цього може бути існування зв'язаних потоків води і кріопротектора вже на етапі дегідратації [Котык А., Яначек К., 1980]. Коефіцієнт проникності kp мембран гепатоцитів щурів для молекул ДМСО має достатньо високе значення, що може бути обумовлено існуванням одночасно двох шляхів його проникнення в клітину. У зв'язку з підвищеною гідрофобністю ДМСО [Шевченко Н.А. и др., 2004] можлива його дифузія крізь ліпідний бішар.

Таблиця 9

Транспортні характеристики плазматичних мембран гепатоцитів щурів у розчинах ДМСО різної осмолярності.

Примітка: 1,2 и 3,4 - - відмінності між значеннями в стовпцях статистично невірогідні (P<0,95); відмінності між іншими варіаціями порівняння значень в стовпцях статистично вірогідні (P0,999).

Існування ж великих гідрофільних пор в плазматичних мембранах гепатоцитів щурів, сумірних з геометричними параметрами молекули ДМСО [Линник Т.П., 2003], дозволяє проникати йому також і через ці пори.

У розділі 8 представлено результати експериментального обґрунтування адекватності фізико-математичної моделі [Гордиенко Е.А., 1994], розробленої для визначення транспортних характеристик плазматичних мембран клітин при субнульових температурах, а також на її основі запропоновано алгоритм теоретичного прогнозування оптимальних швидкостей охолодження клітинних суспензій на прикладі культури клітин нирок сірійського хом'яка (ВНК-21).

Експериментальні криві зміни клітинного об'єму залежно від субнульових температур були одержані при заморожуванні суспензій клітин ВНК-21, що містили 0,34, 0,68 і 1,37 M гліцерин, до температури -25°С. Для забезпечення різних умов трансмембранного перенесення речовин у процесі зростання позаклітинних кристалів льоду клітини охолоджували за двома режимами: одноетапно зі швидкістю 1°С/хв або двохетапно зі швидкістю 1°С/хв до температури початку позаклітинної кристалізації і далі зі швидкістю 5°С/хв Швидкість відігрівання становила 3°С/хв. Систему диференціальних рівнянь термодинамічної моделі, що описує кінетику зміни відносного об'єму клітин і концентрацій проникаючого і непроникаючого крізь плазматичну мембрану речовин усередину клітин в процесі безперервної позаклітинної кристалізації, вирішували чисельно методом Рунге-Кутта 4-го порядку. Кінетику зміни концентрації позаклітинного розчину в процесі заморожування задавали при розрахунках аналітично апроксимацією фазової діаграми плавлення водного розчину гліцерину. Чисельні значення коефіцієнтів проникності плазматичних мембран клітин ВНК-21 для молекул води Lpg і гліцерину kpg, що фігурують в рівняннях термодинамічної моделі, визначали з умови найкращого збігу теоретичної і експериментальної залежності зміни клітинного об'єму від субнульової температури, розрахованої і одержаної в ідентичних умовах. Оцінка ступеня розбіжностей між експериментальними і теоретичними кривими (рис. 5, криві наведено тільки для 0,34 M розчину гліцерину), яка була проведена за швидкістю зміни відносних клітинних об'ємів v=d(V/V0)/dT, склала менш 10%, що при урахуванні прийнятих в теоретичній моделі наближень можна вважати цілком задовільним.

Рис. 5. Залежність відносного об'єму клітин нирок сірійського хом'яка від субнульової температури при заморожуванні клітинної суспензії за одноетапною програмою (а) і двохетапною програмою (б) у присутності 0,34 M гліцерину; о - експериментальні дані, суцільна лінія - теоретичний розрахунок.

Зсув експериментальної кривої відносно теоретичної у бік нижчих температур обумовлений схильністю системи до переохолодження, яке не враховується моделлю. Встановлено, що ефективні коефіцієнти плазматичних мембран клітин ВНК-21 Lpg і kpg зменшуються зі збільшенням початкової концентрації кріопротектора в суспензії (табл. 10). Зменшення коефіцієнта проникності мембран для молекул гліцерину kpg зі збільшенням початкової концентрації розчинів може бути обумовлено (відповідно до закону Ареніуса) пониженням температури кристалізації позаклітинного розчину при зростанні концентрації кріопротектора в початковому кріозахисному середовищі. Не виключено також, що причиною зменшення Lpg і kpg можуть бути дифузійні обмеження в примембранних шарах рідини, які пов'язані зі збільшенням в'язкості концентрованого розчину при виморожуванні позаклітинної води.

Таблиця 10

Транспортні характеристики плазматичних мембран клітин нирок сірійського хом'яка в різних умовах заморожування

Примітка: відмінності між значеннями статистично вірогідні (P>0,999).

Найбільш адекватно поведінку біологічної системи в умовах заморожування описують транспортні характеристики, що визначені при найбільшій швидкості охолодження, при якій домінуючою відповіддю клітин є їх зневоднення. Використовуючи параметри проникності Lpg і kpg,, що були експериментально виміряні при 5°С/хв, методом чисельного моделювання одержанo теоретичні кінетичні криві зміни об'єму клітин ВНК-21 (рис. 6. а, б) при швидкостях охолождення суспензії в інтервалі 5 - 100°С/хв у присутності гліцерину з концентраціями 0,34 і 0,68 M, які дозволили спрогнозувати найбільш ймовірні оптимальні швидкості охолодження даного типу клітин.

Рис. 6. Кінетичні криві зміни відносного об'єму клітин ВНК-21 при різних швидкостях охолодження у присутності гліцерину в середовищі : а - 0,34 M; б - 0,68 M (суцільні лінії - розрахункові дані, о - експериментальні дані).

Рис. 7. Прогнозований вміст води в клітинах ВНК-21 при -30°С в залежності від швидкості охолодження і концентрації гліцерину в середовищі: о - 0,34 M, - 0,68 M.

Критерієм оцінки оптимальної швидкості охолодження був максимально допустимий безпечний рівень зневоднення, при якому в клітині залишається не більш 5% початкового об'єму води і лід усередині клітин не утворюється (Thirumala S. et al., 2005). Граничною температурою, до досягнення якої теоретично можливе зневоднення клітин, була вибрана температура -30°С, нижче за яку висока ймовірність внутрішньоклітинного льодоутворення в результаті гомогенної нуклеації. Відсоток внутрішньоклітинної води при -30°С оцінено з відношення:

Ч100%,

де V - об'єм клітини при -30°С; Vb - осмотично неактивний об'єм; V0 - початковий об'єм клітини. Прогнозовані оптимальні швидкості охолодження були визначені графічно (рис. 7) і при концентрації гліцерину в суспензійному середовищі 0,34 і 0,68 M становили не більш 11°С/хв і 12°С/хв відповідно. Реально внутрішньоклітинний лід може виникнути за гетерогенним механізмом при температурах набагато вищих -30°С, звичайно в інтервалі -5...-20°С. У цьому випадку потенційно в клітинах залишається значно більше води, ніж за результатами проведеної оцінки. Тому прогнозовані оптимальні швидкості охолодження можуть бути дещо завищеними. Проте доцільність їх визначення полягає в тому, що вони дозволяють істотно обмежити інтервал експериментального уточнення швидкостей охолодження, які максимально оптимізують процес кріоконсервування.

ВИСНОВКИ

У роботі на основі поєднання теоретичного і експериментального моделювання вирішено наукову проблему пов'язану з встановленням механізмів нуклеації і росту позаклітинних кристалів льоду, механізмів впливу кріопротекторів на кінетичні характеристики процесу льодоутворення, а також механізмів пошкодження ряду біологічних об'єктів фізико-хімічними чинниками, які виникають і діють при зміні агрегатного стану в кріоконсервованих зразках. Теоретично обґрунтовано і експериментально апробовано способи визначення чисельних значень біофізичних параметрів плазматичних мембран клітин, які необхідні для контролю умов трансмембранного масопереносу речовин в широкому температурному діапазоні при визначенні оптимальних режимів кріоконсервування.

1. Вперше доведено, що процес нуклеації льоду в моделі позаклітинного середовища на основі ліофілізованої плазми крові людини практично повністю протікає за гетерогенним механізмом в дослідженому діапазоні переохолоджень і швидкостей охолодження, причому внесок гетерогенної нуклеації становить 98,7%.

2. Вперше встановлено, що в біологічних розчинах механізм росту позаклітинних кристалів льоду і механізм формування позаклітинної морфологічної структури льоду різної дисперсності обумовлений як нормальною, так і дислокаційною складовими зростання реальних кристалів. Обидва механізми росту кристалів льоду пригнічуються при збільшенні концентрації кріопротекторів в матковому розчині, але дислокаційна складова пригнічується сильніше, ніж нормальна. За пригнічуючою активністю нормальної складової досліджені кріопротектори розташовуються в ряд: ЕГ> ПЕГ-1500 > ДМСО > ПВП-12000, а дислокаційної - ЕГ> ДМСО > ПВП-12000 > ПЕГ-1500.

3. Виявлено, що збільшення концентрації ЕГ, ДМСО і ПЕГ-1500 в розчині знижує швидкість утворення центрів росту кристалів льоду. ПВП-12000 при низьких концентраціях здатний активувати процес зародкоутворення шляхом зниження поверхневої енергії на межі поділу фаз в результаті адсорбції його молекул на грані кристала, що росте, а при високих концентраціях - пригнічувати процес за рахунок міцного зв'язування молекул води і збільшення в'язкості розчину в приграничному шарі на межі поділу твердої і рідкої фаз.

4. Встановлено, що при кристалізації біологічних розчинів переохолодження є найсильнішим чинником, що впливає на швидкість росту і розмір позаклітинних кристалів льоду. При заданому переохолодженні існують критичні концентрації кріопротекторів, при досягненні яких змінюється механізм їх пригнічуючого впливу на дисперсність кристалічної фази. При концентрації кріопротекторів нижчу за критичну превалює пригнічення швидкості росту грані кристала, при концентрації вище .критичної - пригнічення швидкості утворення центрів росту.

5. Методом низькотемпературної рентгенографії встановлено, що при заморожуванні біологічних розчинів у кристалічній структурі льоду утворюються дефекти різного типу, які є джерелами деформаційних напруг, і релаксація яких може бути джерелом механічного пошкодження клітин в зоні низьких температур.

6. Показано, що найімовірнішим чинником пошкодження сперміїв людини при охолодженні зі швидкістю 1°С/хв є рекристалізація позаклітинного льоду. Кріомікроскопічно обґрунтована найефективніша двохетапна програма заморожування сперміїв людини під захистом 1,37 М гліцерину.

7. Встановлено, що найефективнішим способом пригнічення поза- і внутрішньоклітинного льодоутворення при повільних швидкостях заморожування (5°С/хв) ембріонів мишей ранніх стадій розвитку є поєднання попередньої поетапної дегідратації і насичення клітин проникаючим кріопротектором. Кріозахисне середовище, що є сумішшю 5,37 М ЕГ і 0,7 М сахарози, може бути використано для кріоконсервування ембріонів мишей ранніх стадій розвитку, оскільки здатне склуватися навіть при повільних швидкостях заморожування.

8. З'ясовано, що в розчинах низькомолекулярних неелектролітів (етанол, 1,2-ПД, гліцерин), що характеризуються високим значенням коефіцієнта розподілу Q1, переважають явища кренування і сферуляції еритроцитів, а в розчинах високомолекулярних неелектролітів (ПЕГ-400, 600, 1500), для яких Q0,5, трансформація еритроцитів супроводжується планоцитозом і утворенням інвагінованих форм. Коефіцієнт розподілу Q між поза- і внутрішньоклітинним середовищем для низькомолекулярних спиртів убуває в ряду етанол 1,2-пропандіол гліцерин.

9. Визначено, що еритроцити пуповинної крові людини втрачають стійкість до гіперосмотичної дії в 2,3 М водному розчині NaCl після 7 хв експозиції. Підвищену чутливість до охолодження еритроцити пуповинної крові набувають при концентрації NaCl вище 0,85 М. Охолодження знижує критичні концентрації втрати стійкості клітин до гіпертонії більш ніж у два рази.

10. Встановлено, що в області концентрацій 0,85 - 1,28 М NaCl (1550 - 2512 мОсм/л), трансформація еритроцитів людини при зневодненні супроводжується істотною зміною рельєфу клітинної поверхні і елімінацією в позаклітинне середовище глікопротеїнів в результаті часткової деструкції глікокалікса, що є пусковим механізмом кріогемолізу.

11 Показано, що розвиток патологічного процесу при вібраційній хворобі супроводжується прогресивним збільшенням в периферичній крові хворих кількості стоматоцитів і що зниження гіпотермічної стійкості форми еритроцитів може бути діагностичним тестом ступеню вираженості патологічного процесу.

12. Встановлено, що постгіпертонічний лізис гепатоцитів щурів обумовлений флуктуаційним утворенням макроскопічної ліпідної пори в плазматичній мембрані, яка здатна до “самозаліковування”, що підтверджується збереженням мембраною властивості вибіркової проникності при значному розтягуванні і після скидання мембранної напруги.

13. На підставі теорії деформації біологічних мембран одержано рівняння, яке з урахуванням експериментально вимірюваних морфометричних параметрів будь-якого типу клітин дозволяє визначити модуль пружності ізотропного розтягування їх мембран. Встановлено, що мембрани гепатоцитов щурів здатні витримувати аномально велике (понад 100%) розтягування без утворення макроскопічного розриву. Модуль ізотропного розтягування мембрани гепатоцитів щура становить приблизно 8,0Ч103 Н/м.

14. Визначено коефіцієнти проникності плазматичних мембран гепатоцитів щурів для молекул води і ДМСО. Встановлено, що при однакових осмотичних навантаженнях (2246 - 2250 мОсм/л) у присутності проникаючого кріопротектора ДМСО коефіцієнт фільтрації Lp на три порядки нижче ((4,45±0,04)1014м3/Нс), ніж у присутності непроникаючого хлориду натрію ((2,25±0,25)1011м3/Нс).

15. Обґрунтовано метод визначення коефіцієнта фільтрації Lpg і коефіцієнта проникності kpg плазматичних мембран будь-якого типу клітин при субнульових температурах, розроблено і експериментально підтверджено алгоритм теоретичного прогнозування оптимальної швидкості охолодження клітин.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Кулешова Л.Г. Кристаллизация водных растворов некоторых криопротекторов / Л.Г. Кулешова, В.А. Моисеев, Ю.А. Иткин // Криобиология и криомедицина. - 1976. - вып. 2. - С. 27-31.

2. Кулешова Л.Г. Изучение кинетики взаимодействия эритроцитов человека с криопротекторами и солями / Л.Г. Кулешова, Л.Ф. Розанов // Криобиология и криомедицина. - 1980. - вып. 7. - С. 40-44.

3. Пушкарь Н.С. Физико-химические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий / Н.С. Пушкарь, Е.А., Гордиенко, Л.Г. Кулешова, О.И. Гордиенко, Л.Ф. Розанов, Г.С. Ишков // Криобиология. - 1985. - № 1. - С. 23-29.

4. Паращук Ю.С. Влияние процессов замораживания - оттаивания на морфофункциональные показатели спермиев человека / Ю.С. Паращук, Е.А. Гордиенко, Л.Г. Кулешова // Криобиология. - 1988. - № 2. - С. 19-21.

5. Новиков А.Н. Механизм роста кристаллов льда в сложных биологических системах / А.Н. Новиков, Л.Г. Кулешова, Т.П. Линник // Биофизика. - 1991. - Т. 36, №1. - С. 122-127.

6. Проницаемость мембран эритроцитов Citellus Undulatus в условиях гипотермического хранения / В.И. Загнойко, О.А. Нардид, Л.Г. Кулешова, А.К. Гулевский, В.А. Моисеев // Биофизика. - 1993. - Т. 38, № 4. - С. 687-692.

7. Кулешова Л.Г. Сравнительная оценка устойчивости формы эритроцитов гетеротермных животных / Л.Г. Кулешова, В.И. Загнойко // Пробл. криобиологии. - 1994. -№ 2. - С. 25-28.

8. Пушкарь Н.С. Исследование физических процессов в биологических объектах при глубоком охлаждении / Н.С. Пушкарь, Е.А. Гордиенко, А.И. Осецкий, О.И. Гордиенко, Л.Г. Кулешова // Пробл. криобиологии. - 1995. - № 3. - С. 30-37.

9. Кулешова Л.Г. Трансформация эритроцитов человека в растворах неэлектролитов ряда Н-спиртов. Часть 1. Морфологический аспект взаимодействия / Л.Г. Кулешова // Пробл. криобиологии - 1999. - № 1. - С. 9-13.

10. Кулешова Л.Г. Трансформация эритроцитов человека в растворах неэлектролитов ряда Н-спиртов. Часть 2. Перераспределение неэлектролитов в системе “клетка - среда” / Л.Г. Кулешова, Ю.В. Кучеренко // Пробл. криобиологии - 1999. - № 2. - С. 12-16.

11. Кулешова Л.Г. Антигемолитическая и трансформирующая активность амфифильных соединений / Л.Г. Кулешова, Н.В. Орлова, Н.М. Шпакова // Пробл. криобиологии. - 2001. - № 1. - С. 8-14.

12. Кулешова Л.Г. Проницаемость плазматических мембран гепатоцитов крысы для молекул воды в неизотонической среде электролита / Л.Г. Кулешова, Е.А. Гордиенко, И.Ф. Коваленко // Вісник ХДУ. Біофіз. вісник. - 2002. - вип. 2(11). - С. 39-42.

13. Кулешова Л.Г. Оценка состояния поверхности эритроцитов в гипертонической среде электролита. 1. Морфологический аспект / Л.Г. Кулешова // Вісник ХДУ. Біофіз. вісник. - 2002. - вип. 2(11). - С. 54-56.

14. Кулешова Л.Г. Оценка состояния поверхности эритроцитов человека в гипертонической среде электролита. 2. Состояние внешних примембранных слоев / Л.Г. Кулешова // Вісник ХДУ. Біофіз. вісник. - 2003. - вип. 1(12). - С. 89-91.

15. Кулешова Л.Г. Гипертоническая устойчивость фетальных эритроцитов человека в электролитной среде / Л.Г. Кулешова // Пробл. криобиологии. - 2003. - № 4. - С. 20-27.

16. Кулешова Л.Г. Криогемолиз фетальных эритроцитов в гипертонической среде электролита / Л.Г. Кулешова // Пробл. криобиологии. - 2004. - № 2. - С. 36-41.

17. Тимофеева Е.В. Теоретическое обоснование способа оценки модуля изотропного растяжения клеточной мембраны гепатоцитов крысы / Е.В. Тимофеева, Л.Г. Кулешова // Вісник ХДУ. Біофіз. вісник. - 2004 - вип. 1-2(14). - С. 85-87.

18. Кулешова Л.Г. Криомикроскопический анализ замораживания эмбрионов мыши ранних стадий развития / Л.Г. Кулешова, О.В. Пишко // Пробл. криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 2. - С. 119-128.

19. Денисова О.Н. Трансформация эритроцитов животных после криоконсервирования / О.Н. Денисова, Л.Г. Кулешова, Н.Г. Землянских, Г.Ф. Жегунов // Вісник проблем біології і медицини. - 2005. - вип. 4. - С. 41-44.

20. Кулєшова Л.Г. Морфологічні зміни еритроцитів людини за умов охолодження / Л.Г. Кулєшова // Фізіологічний журнал. - 2005. - Т. 51, № 3. - С. 73-77.

21. Кулешова Л.Г. Механизм внеклеточной нуклеации льда в криобиологических системах / Л.Г. Кулешова // Біофіз. вісник. - 2006. - вип. 17 (1). - С. 65-70.

22. Коваленко С.Є. Можливі механізми антигемолітичної дії хлорпромазину / С.Є. Коваленко, Л.І. Алексєєва, Л.Г. Кулєшова, І.Ф. Коваленко, В.С. Холодний, Є.О. Гордієнко, О.І. Гордієнко // Пробл. криобиологии. - 2006. - Т. 16, № 2. - С. 137-146.

23. Кулешова Л.Г. Механизм постгипертонического лизиса изолированных гепатоцитов крысы при регидратации / Л.Г. Кулешова // Пробл. криобиологии. - 2006. - Т. 16, № 4. - С. 351-362 .

24. Кулешова Л.Г. Определение транспортных характеристик плазматических мембран клеток в условиях внеклеточной кристаллизации / Л.Г. Кулешова, И.Ф. Коваленко // Пробл. криобиологии. - 2006. - Т. 16, № 1. - С. 3-12.

25. Животова Е.Н. Исследование физических состояний бинарных систем вода-оксиэтилированный глицерин со степенью полимеризации n =5 и 25 при температурах ниже 273К методом криомикроскопии / Е.Н Животова, Л.Г. Кулешова, А.В. Зинченко, В.В Чеканова // Доповіді НАН України. - 2007. - № 4. - С. 78-84.

26. Zhivotova E.N. Physical states of aqueous solutions of oxyethylated glycerol with polymerization degree of n=30 at temperatures lower than 283 K / E.N. Zhivotova, A.V. Zinchenko, L.G. Kuleshova, V.V. Chekanova, A.M. Kompaniets // Cryo-Letters. - 2007. - V. 28, № 4. - P. 261-270.

27. Денисова О.Н. Морфологические изменения эритроцитов животных после криоконсервирования / О.Н. Денисова, Л.Г. Кулешова, Н.Г. Землянских, Л.А Бабийчук, Г.Ф. Жегунов // Пробл. криобиологии. - 2007. - Т. 17, № 2. - С. 113-214.

28. Zhivotova E .N. Low-temperature phase behaviour of the binary system water-oxyethylated glycerol of polymerization degree n=5 and intermolecular interactions in the system / E.N. Zhivotova, A.V. Zinchenko, L.G. Kuleshova, E.V. Dukhopelnykov, V.V. Chekanova // Molecular Physics. - 2008. - V. 106, № 14. - P. 1751-1759.

29. Кулешова Л.Г. Теоретическое прогнозирование оптимальных скоростей охлаждения клеточных суспензий / Л.Г. Кулешова, И.Ф. Коваленко // Біофіз. вісник - 2008. -вип. 20 (1) -С. 56-64.

30. Пат. 14814 (Україна) МПК5 А61В 10/00. Спосіб визначення ступеню тяжкості вібраційної хвороби / Кулєшова Л.Г., Костюк І.Ф., Капусник В.А.; заявник та патентовласник Харківський державний медичний університет. - № 96062539; заявл. 26.06.96 ; надр. 30.06.97, Б.И. №3. - с. 3.1.21.

31. Пат. 13671 Україна, МПК4 G 02 B 21/28. Пристрій для кріомікроскопічних досліджень / Новіков О.М., Кулєшова Л.Г., Блохін С.В., Олійник С.Т.; заявник та патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - №3704855/SU ; заявл. 24.02.1984 ; надрук. 25.04.1997, Бюл. № 2. - С. 3.1.309.

32. Кулешова Л.Г. Исследование структурных особенностей замороженных водных растворов ПЭО-400 / Л.Г. Кулешова // Современные вопросы криобиологии : [cб. науч. трудов / отв. ред. Н.С. Пушкарь]. - Киев : Наук. думка, 1976. - С. 11-13.

33. Некоз И.А. Особенности гемолиза эритроцитов в водных растворах глицерина / И.А. Некоз, Е.А. Гордиенко, Л.Г. Кулешова, Л.Ф. Розанов // Криоконсервирование клеток и тканей : [cб. науч. трудов / отв. ред. Н.С. Пушкарь]. - Харьков, 1989. - С. 54-61.

34. Розанов Л.Ф. Неспецифические реакции клеток на физико-химические факторы криоконсервирования / Л.Ф. Розанов, Е.А. Гордиенко, Л.Г. Кулешова // Биохимические аспекты криоповреждения и криозащиты клеточных систем: [cб. науч. трудов / отв. ред. А.М. Белоус]. - Харьков, 1989. - С. 48-52.

35. Розанов Л.Ф. Фазовая теория строения клеток как основа для новой концепции криоповреждения и криозащиты клеточных структур / Л.Ф. Розанов, Е.А. Гордиенко, О.И. Гордиенко, Л.Г. Кулешова, Е.И. Смольянинова // Физико-химические процессы в криобиологических системах: [cб. науч. трудов / отв. ред. В.А. Моисеев]. - Харьков, 1991. - С. 134-140.

36. Панков Е.Я. Дискомпартаментность - неспецифическое морфологическое проявление криоповреждения / Е.Я. Панков, Э.И. Обозная, Л.Г. Кулешова, Т.П. Говоруха // Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических объектов : Вторая всесоюзная конференция, 9 - 11 октября 1984 г. : тезисы докладов. - Харьков : Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР, 1984. - Т. 1. - С. 66.

37. Пушкарь Н.С. Физико-химические основы и перспективы развития технологии низкотемпературного консервирования биологических объектов / Н.С. Пушкарь, О.И. Гордиенко, Л.Г. Кулешова, Г.С. Ишков // Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины : международная конф., 10-12 февраля 1988 г. : тезисы докл. - Харьков, 1988. - С. 79.

38. Кулешова Л.Г. Морфометрический анализ реакций клеток на физико-химические факторы криоконсервирования / Л.Г Кулешова // Новые приложения морфометрии и математическое моделирование в медико-биологических исследованиях: научно-практическая конференция, 9-11 октября 1990 г. : тезисы докладов. - Харьков : Харьковский научно-исследовательский институт терапии, 1990. - С. 113.

39. Кулешова Л.Г. Реакция мембран структурно-функциональных единиц печени (гепатоцитов) на неблагоприятные условия криоконсервирования / Л.Г. Кулешова // Структурно-функциональные единицы и их компоненты в органах висцеральных систем в норме и патологии: научно-практическая конференция, 1-3 октября 1991 г. : тезисы докладов - Харьков : Харьковский медицинский институт, 1991. - С. 130.

40. Gordienko E.A. Cell membrane bubbling phenomenon in nonisotonic solutions / E.A. Gordienko, L.F. Rosanov, L.G. Kulechova, E.I. Smolyaninova // CRYO'92 : 29th Annual Meeting of the Society for Cryobiology, June 14-19, 1992 : Abstracts. - Ithaca, New York // Cryobiology. - 1992. - V. 29, № 6. - P. 787

41. Кулєшова Л.Г. Гіпертонічний шок гепатоцитів щура в умовах сольового впливу / Л.Г. Кулєшова // I з'їзд Українського біофізичного товариства, 20-24 червня 1994 р. : матеріали з'їзду. - Київ : Київський університет ім. Тараса Шевченка, 1994. - С. 139-140.

42. Кuleshova L.G. Permeability factor of rat hepatocyte membranes for water molecules in electrolyte hypertonic medium / L.G. Кuleshova, E.A. Gordienko // The Society for Low Temperature Biology: International Meeting University of Leuven, July 19-23, 1994 : abstracts. - Leuven (Belgium). - 1994. - P. 23.

43. Кулєшова Л.Г. Постгіпертонічний лізис гепатоцитів щура / Л.Г. Кулєшова // I з'їзд Українського біофізичного товариства, 20-24 червня 1994 р. : матеріали з'їзду. - Київ : Київський університет ім. Т. Шевченка, 1994. - С. 138-139.

44. Pushkar N.S. Role of osmotic factors in cell injury during freeze-thawing of cell suspensions / N.S. Pushkar, L.F., Rozanov, E.A. Gordienko, L.G. Kuleshova // The Society for Low Temperature Biology: International Meeting University of Leuven, July 19-23, 1994: Proceedings. - Leuven (Belgium). - 1994. - P. 22.

45. Kuleshova L.G. Mechanism of the intercellular ice crystal growth in composite cryobiological system / L.G. Kuleshova, A.N. Novikov // Society for cryobiology “Cryo'94” : 31st Annual meeting, August 21-26, 1994: Abstracts. - Kyoto (Japan). - 1994. - № 23.

46. Кулешова Л.Г. Оценка устойчивости формы эритроцитов больных вибрационной болезнью в условиях гипотермического хранения / Л.Г. Кулешова, В.А. Капусник // I з'їзд Українського товариства кріобіології і кріомедицини, 18-20 жовтня 1995 р. : тези доповідей. - Харків : Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 1995. - С. 134.

47. Кулешова Л.Г. Особенности реакций клеток на факторы криоконсервирования / Л.Г. Кулешова // II съезд биофизиков России, 23-27 августа 1999 г. : тезисы докладов - Москва : Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 1999. - Т. 1. - С. 248.

48. Зинченко В.Д. Форма эритроцитов и характер распределения неэлектролитов ряда Н-спиртов между клеткой и средой / В.Д. Зинченко, Л.Г. Кулешова, Ю.В. Кучеренко, М.И. Щетинский // II съезд биофизиков России, 23-27 августа 1999 г. : тезисы докладов - Москва : Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 1999. - Т. II. - С. 506.

49. Кулєшова Л.Г. Постгіпертонічний кріогемоліз фетальних еритроцитів людини в електролітному середовищі / Л.Г. Кулєшова // III з'їзд Українського біофізичного товариства, 8-11 жовтня 2002 р. : тези доповідей. - Львів : Львівський національний університет імені Івана Франка, 2002. - С. 229.

50. Kuleshova L.G. Regulation of rat's hepatocyte cell volume undes non-isotonic conditions / L.G. Kuleshova // Low Temperature Biology “Cryobiomol - 2003”: International Conference, September 14-18, 2003 : book of abstracts - Coimbra (Portugal), 2003. - P. 152.

51. Kuleshova L.G. Erythrocytes' shape as indicator of peculiarities of redistribution of substances in the “cell-medium” system / L.G. Kuleshova // 14th Meeting of the European Association for Red Cell Research, April 24-28, 2003 : - Thesises. - Roscoff (France), 2003. - Р. 41-42.

52. Кулешова Л.Г. Криомикроскопический комплекс для криобиологических исследований / Л.Г. Кулешова // Сохранение генетических ресурсов : международная конференция, Санкт-Петербург, 19-22 октября 2004 г. : материалы конф. - Цитология. - 2004. - Т. 46, № 9. - С. 809-810.

53. Гордиенко Е.А. Модуль упругости плазматической мембраны изолированных гепатоцитов крысы / Е.А. Гордиенко, Л.Г. Кулешова, Е.В. Тимофеева // Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і морфофункціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур : міжнародна конференція, 22-24 листопада 2005 р. : тези доповідей. - Пробл. криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 3. - С. 279.

54. Животова Е.Н. Исследование физических состояний оксиэтилированных производных глицерина методом ДСК и криомикроскопии / Е.Н. Животова, Л.Г. Кулешова, А.В. Зинченко // Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики «Физика. Биофизика - 2006»: Вторая всеукраинская научно-техническая конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, 17-22 апреля 2006 г. : материалы конф. - Севастополь: Севастопольский национальный технический университет, 2006. - С. 23-26.

55. Кулешова Л.Г. Влияние переохлаждения и ряда криопротекторов на дисперсность кристаллов льда в биологических системах / Л.Г. Кулешова // IV з'їзд Українського біофізичного товариства, Донецьк, 19-21 грудня 2006 р. : тези доповідей. - Донецьк: Донецький національний університет, 2006. - С. 395-396.

56. Zhivotova E.N. Physical states of a binary system water-oxyethylated glycerol (polymerization degree is n=5) at temperatures lower than 273 K / E.N. Zhivotova, A.V. Zinchenko, L.G. Kuleshova, E.V. Dukhopelnykov // Фізика низьких температур (КМУ - ФТН - 2007): Конференція молодих учених, 5-7 червня 2007 р. : тези доповідей. - Х.: Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, 2007. - С. 21.

57. Gordiyenko O.I. Possible mechanisms of chlorpromazine antihemolitical effect / O.I. Gordiyenko, S.E. Kovalenko, L.G. Kuleshova // 16th Meeting of the European Association for Red Cell Research, March 16-19, 2007 : Thesises. - Oxford (Great Britain), 2007. - PC11.

58. Zhivotova E .N. Phase behaviour of a system water-oxyethylated glycerol of polymerization degree n=25 / E.N. Zhivotova, A.V. Zinchenko, L.G. Kuleshova, E.V. Dukhopelnykov // Physics of liquid matter: Modern problems: 4th International Conference, May 23-26, 2008: Abstracts. - Kyiv: Taras Shevchenko Kyiv National University, 2008. - P. 179.

59. Кулєшова Л.Г. Порівняльний аналіз впливу низки чинників на кінетичні характеристики позаклітинного льодоутворення / Л.Г. Кулєшова // Біофізичні механізми функціонування живих систем: Міжнародна конференція присвячена 70-річчю від дня народження проф. Гойди О.А., Львів, 16-18 жовтня 2008 р. : тези доповідей. - Львів : Львівський національний університет ім. Івана Франка, 2008. - С. 18-19.

60. Животова Е.Н. Фазовые переходы и стеклование в водных растворах оксиэтилированного глицерина при температурах ниже 273 К / Е.Н. Животова, А.В. Зинченко, Л.Г. Кулешова, Е.В. Духопельников, В.В. Чеканова, А.М. Компаниец // Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия: конференция, Пущино, 28-30 октября 2008 г. : материалы конф. - Биофизика живой клетки. - 2008. - Т. 9. - С. 52-53.

61. Zhivotova E .N. Phase behaviour of the binary system water+oxyethylated glycerol of polymerization degree n=25 / E. Zhivotova, A. Zinchenko, L. Kuleshova, E. Dukhopelnykov, V. Chekanova, A. Kompaniets // Structure and Dynamics of Hydrogen-Bonded Systems: International Conference, October 26-27, 2009: Book of Abstracts. - Miramare, Trieste (Italy): International Centre for Theoretical Physics, 2009. - P.45.

АНОТАЦІЯ

нуклеація кристал заморожування позаклітинний

Кулєшова Л.Г. Механізми дії позаклітинного льодоутворення та пов'язаних з ним явищ на біологічні об'єкти. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків. - 2011.

В роботі встановлено механізми нуклеації і росту позаклітинних кристалів льоду в модельних біологічних розчинах, а також виявлено особливості реакцій широкого спектру біологічних об'єктів на фізико-хімічні явища, які супроводжують фазові переходи на етапах заморожування і відігрівання. Показано, що процес нуклеації льоду в біологічних розчинах практично повністю протікає за гетерогенним механізмом. Встановлено, що в механізмі росту позаклітинних кристалів льоду і в механізмі формування позаклітинної кристалічної структури льоду різної дисперсності одночасно беруть участь нормальна і дислокаційна складові росту реальних кристалів. Виявлено існування критичних концентрацій кріопротекторів, при досягненні яких змінюється механізм, що пригнічує кінетичні характеристики льодоутворення. Рентгенографічно показано, що заморожування біологічних розчинів супроводжується формуванням дефектів в структурі льоду. Встановлено, що пошкодження сперматозоїдів людини при повільному заморожуванні (1°С/хв) обумовлено рекристалізацією позаклітинної структури льоду. Показано, що найефективнішим засобом, що пригнічує поза- і внутрішньоклітинне льодоутворення при повільних швидкостях заморожування (5°С/хв) ембріонів миші ранніх стадій розвитку є поєднання попередньої поетапної дегідратації і насичення клітин проникаючим кріопротектором. Встановлено, що для дослідженої низки Н-спиртів існує кореляція між коефіцієнтом розподілу їх молекул між поза- і внутрішньоклітинним середовищем і формою еритроцитів. Виявлено, що в області помірної гіпертонії до 1,28 М NaCl зміна рельєфу клітинної поверхні еритроцитів при дегідратації супроводжується частковою деструкцією глікокалікса. Встановлено, що механізм постгіпертонічного лізису гепатоцитів щура пов'язаний з флуктуаційним утворенням ліпідної пори. Встановлено, що модуль ізотропного розтягування мембран гепатоцитів має аномально низьке значення 8,0103 Н/м. Одержані чисельні значення коефіцієнтів проникності плазматичних мембран гепатоцитів щура для молекул води Lp і діметилсульфоксиду kp. На прикладі клітин нирок сірійського хом'яка розроблено алгоритм прогнозування оптимальних швидкостей охолодження клітинних суспензій.