Механізми дії позаклітинного льодоутворення та пов’язаних з ним явищ на біологічні об’єкти

Ключові слова: льодоутворення, кріопротектори, клітини, гіпертонія, кріостійкість, регідратація, глікокалікс, трансмембранний масоперенос, модуль пружності, оптимальні швидкості охолодження.

АННОТАЦИЯ

Кулешова Л.Г. Механизмы действия внеклеточного льдообразования и связанных с ним явлений на биологические объекты. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.19 -- криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков - 2011.

В работе установлены механизмы нуклеации и роста внеклеточных кристаллов льда в модельных биологических растворах, а также выявлены особенности реакций широкого спектра биологических объектов на физико-химические явления, сопровождающие фазовые переходы на этапах замораживания и отогрева.

Впервые количественно доказано, что процесс нуклеации льда в биологических растворах практически полностью протекает по гетерогенному механизму. Установлено, что независимо от вида криопротектора, его концентрации и величины переохлаждения рост внеклеточных кристаллов льда в растворах происходит одновременно по нормальному и дислокационному механизмам роста реальных кристаллов. Криопротекторы ингибируют обе составляющие роста, причем дислокационная составляющая является более чувствительной. Ингибирующая активность криопротекторов в отношении нормальной составляющей падает в ряду: ЭГ > ПЭГ-1500 > ДМСО > ПВП-12000, а дислокационной - ЭГ > ДМСО > ПВП-12000 > ПЭГ-1500. Установлено, что в механизме формирования в биологических растворах структуры льда различной дисперсности также участвуют нормальная и дислокационная составляющие роста. Выявлено, что существуют критические концентрации криопротекторов в растворе, при достижении которых меняется механизм ингибирования кинетических процессов, определяющих дисперсность кристаллической структуры льда: если С Скрит., то превалирует ингибирование скорости роста грани кристалла, если С Скрит. - ингибирование скорости образования центров роста. Установлено, что наиболее эффективным способом управления скоростью роста и дисперсностью кристаллической структуры льда является условия теплоотвода от кристаллизуемой системы. Рентгенографически показано, что замораживание биологических растворов сопровождается формированием в структуре льда дефектов различного типа, обусловливающих упругие напряжения в местах их локализации.

Установлено, что повреждение сперматозоидов человека при медленном замораживании (1°С/мин) обусловлено механическим фактором, связанным с рекристаллизацией внеклеточной структуры льда. Показано, что, наиболее надежным способом ингибирования вне- и внутриклеточного льдообразования при медленных скоростях замораживания эмбрионов мыши ранних стадий развития (5°С/мин) является сочетание поэтапной предварительной дегидратации и насыщения клеток поникающим криопротектором. Установлено, что в исследованном ряду Н-спиртов существует корреляция между коэффициентом распределения их молекул Q в системе “клетка-среда” и формой эритроцитов. Если Q1 (этанол, 1,2-пропандиол, глицерин), то трансформация эритроцитов сопровождается кренированием и сферуляцией, если Q0,5 (ПЭГ-400, ПЭГ-600, ПЭГ-1500) - образованием инвагинированных форм. Показано, что эритроциты пуповинной крови человека теряют устойчивость к гиперосмотическому воздействию в 2,3 М водном растворе NaCl после 7 мин экспозиции. Повышенную чувствительность к охлаждению эритроциты пуповинной крови приобретают при гипертоничности среды NaCl выше 0,85 М. Выявлено, что в области умеренной гипертонии до 1,28 М NaCl изменение рельефа клеточной поверхности эритроцитов при дегидратации сопровождается частичной деструкцией внешних примембранных слоев мембраны, которая может быть одной из причин криогемолиза. Показано, что кинетика накопления предгемолитических форм эритроцитов в гипотермических условиях может служить диагностическим тестом оценки степени развития патологического процесса в организме.

Установлено, что постгипертонический лизис гепатоцитов крыс после их насыщения ДМСО различной концентрации осуществляется или порционным выбросом части внутриклеточного содержимого, или путем непрерывного его оттока во внеклеточную среду через флуктуационно сформировавшуюся пору в липидном бислое. Оценены некоторые биофизические характеристики плазматических мембран гепатоцитов крыс. Установлено, что модуль изотропного растяжения мембран гепатоцитов имеет аномально низкое значение 8,0Ч103 Н/м, что свидетельствует о способности данных клеток испытывать значительные трансмембранные перепады осмотического давления. Получены численные значения коэффициентов проницаемости плазматических мембран гепатоцитов для молекул воды Lp и ДМСО kp. Установлено, что в присутствии ДМСО гидравлическая проницаемость Lp падает на три порядка.

Экспериментально доказана адекватность термодинамической модели, описывающей изменение объема клеток и концентрации растворенных внутриклеточных веществ в процессе непрерывного внеклеточного льдообразования, для определения транспортных характеристик плазматических мембран клеток при субнулевых температурах. На основе этой модели на примере клеток почек сирийского хомячка разработан алгоритм прогнозирования оптимальных скоростей охлаждения клеточных суспензий.

Ключевые слова: льдообразование, криопротекторы, клетки, гипертония, криоустойчивость, регидратация, гликокаликс, трансмембранный массоперенос, модуль упругости, оптимальные скорости охлаждения.

ANNOTATION

Kuleshova L.G. The mechanisms of effects of extracellular ice formation and related phenomena on biological objects. - A manuscript.

Dissertation for the doctor of biological science degree in specialty 03.00.19 - Cryobiology. - Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov. - 2011.

The mechanisms of extracellular ice crystal nucleation and growth in model biological solutions as well as the peculiarities of wide variety of biological objects reactions in response to physical and chemical phenomena, accompanying the phase transitions at the stages of freezing and thawing have been determined. The process of ice nucleation in biological solutions has been shown to proceed quite completely by heterogeneous mechanism. It has been established that the normal and dislocation growth components of real crystals simultaneously participate in the mechanisms of growth of extracellular ice crystals and formation of extracellular ice structure of different dispersivity. The existence of critical concentrations of cryoprotective agents, at which the mechanisms of their inhibiting effects on kinetic parameters of ice formation, has been revealed to change. X-ray study has shown that freezing of biological solutions is accompanied by the formation of defects in ice structure. The impairment of human spermatozoa under slow freezing (1єC/min) has been found to be stipulated by re-crystallization of extracellular ice structure. It has been demonstrated that the most efficient way to inhibit extra- and intracellular ice formation at slow cooling rates (5єC/min) of murine embryos at early developmental stages is a combination of preliminary stage-by-stage dehydration and saturation of cells with a penetrating cryoprotective agent. It has been discovered that in the studied row of H-alcohols there is a correlation between the shape of erythrocytes and the distribution coefficient of alcohols between extra- and intracellular medium. It has been established that in the range of moderate hypertonia up to 1.28 M NaCl the change of erythrocyte cellular surface relief upon dehydration is accompanied by a partial glycocalix destruction. The mechanism of post-hypertonic lysis of rats' hepatocytes has been noted to be related to fluctuation formation of a lipid pore. The modulus of isotropic extension of hepatocyte membranes has been found to be of the abnormally low value of 8.0x103 N/m. The numeric findings for the permeation coefficients of rats' hepatocyte plasma membranes for water molecules Lp and dimethyl sulfoxide kp have been obtained. The algorithm of forecasting the optimal cooling rates for cell suspensions has been designed for the Syrian hamster kidney cells.

Key words: ice formation, cryoprotective agents, hypertonia, cryoresistance, rehydration, glycocalix, transmembrane mass transfer, elasticity modulus, optimal cooling rates.

Відповідальний за випуск академік НАН України Гольцев А.М.

Размещено на Allbest.ru