Клітинні механізми формування радіаційних ефектів в імунній системі у віддаленому періоді Чорнобильської аварії (клініко-експериментальне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "НАУКОВИЙ ЦЕНТР РАДІАЦIЙНОЇ МЕДИЦИНИ АМН УКРАЇНИ"

УДК 577.117:612.017:612.014.48

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

КЛІТИННІ МЕХАНІЗМИ ФОРМУВАННЯ РАДІАЦІЙНИХ ЕФЕКТІВ В ІМУННІЙ СИСТЕМІ У ВІДДАЛЕНОМУ ПЕРІОДІ ЧОРНОБИЛЬСЬКОЇ АВАРІЇ (КЛІНІКО-ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

03.00.01- радіобіологія

БЄЛЯЄВА НАДIЯ ВОЛОДИМИРIВНА

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті клінічної радіології ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України".

Наукові консультанти:

Бебешко Володимир Григорович, доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України", генеральний директор;

Базика Димитрій Анатолійович, доктор медичних наук, професор Інститут клінічної радіології ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України", завідувач відділу клінічної імунології.

Офіційні опоненти:

Талько Вікторія Василівна, доктор медичних наук, професор Інститут експериментальної радіології ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України", директор;

Мечов Дмитро Сергійович, доктор медичних наук, професор Національна медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, завідувач кафедрою радіології;

Самбур Марина Борисівна, доктор медичних наук, Інститут отоларингології ім. професора О.С. Коломійченка АМН України, головний науковий співробітник лабораторії патофізіології та імунології.

Захист відбудеться 13.10. 2009 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.562.01 ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України" за адресою: 03115, м. Київ, пр. Перемоги, 119/121.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України" за адресою: 04050, м. Київ, вул. Мельникова, 53.

Автореферат розісланий 12.09. 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Л.О. Ляшенко.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Чорнобильська катастрофа призвела до значних порушень імунної системи постраждалих. Незважаючи на тенденції до відновлення параметрів імунітету, повної нормалізації не відбулось. У віддаленому періоді після опромінення реєструються дисбаланс клітинної та гуморальної ланок, ознаки старіння імунної системи, активації окремих її компонентів [Талько, 2001; А.А. Иванов и соавт., 2001; Н.С. Сединина, 2003, 2007; Д.А. Базика і співавт., 2004, 2007; А.Б. Карпов и соавт., 2005; И.В. Орадовская, 2006]. Дотепер існує певна невизначеність у трактовці отриманих результатів досліджень у постраждалих внаслідок Чорнобильської аварії та, відповідно, й їх недооцінка. Значні розбіжності мають місце у розумінні механізмів запуску каскаду радіоіндукованих порушень, механізмів адаптації, ефекту "свідка" та інших немішенних феноменів [Ярилин, 1999; С. Б. Mossman, 2001; Shu-Zheng, 2003; Prasad et al., 2004; С.Б. Мельнов, 2004; Anderson et al., 2006; А.А. Чумак і співавт., 2006; Sakai, 2006; Georgieva et al., 2007].

Уже сьогоднє очевидною складність патогенезу постчорнобильських розладів імунітету, що зачіпає усі функції, механізми імунної системи та її міжсистемні зв'язки [Чумак і співавт., 2000, 2004, 2005; М.І. Лісяний, Л.Д. Любич, 2000, 2001; Д.А. Базика і співавт., 2000, 2003, 2006; В.Г. Бебешко і співавт., 2006; Ю.Г. Антипкін і співавт., 2006]. Відповідь імунної системи на опромінення тісно пов`язана з кровотворенням у кістковому мозку, котрий є джерелом регенерації імунокомпетентних клітин. Кровотворні стовбурові клітини, ранні попередники гемопоезу та імунокомпетентні клітини виконують особливу роль у підтримці гомеостазу організму в умовах опромінення [Бебешко і співавт., 1992; Н. М. Бiлько, 1996; Е.Д. Гольдберг и соавт., 2001; С.П. Ярмоненко, А.А. Вайнсон, 2004; Popa et al., 2006; Pevny et al., 2006; Wright, 2006, 2007; В. Ю. Соловьев и соавт., 2007; Е.И. Домарацкая и соавт., 2007].

Однак дотепер не розкрита важлива проблема взаємовідносин клітинної ланки імунітету і функціонування компартменту кровотворних стовбурових клітин в осіб, які зазнали впливу іонізуючого випромінювання. У доступній літературі не наведено переконливих доказів щодо ролі тривалої хронічної дії іонізуючого випромінювання в діапазоні низьких доз у виникненні розладів у стовбуровоклітинному відділі кровотворення у постраждалих внаслідок Чорнобильської катастрофи. Враховуючи вищезазначене, з огляду на значущість цієї проблеми в радіобіології та радіаційній медицині важливим напрямком є систематизація і перегляд даних, отриманих у динаміці 20-річного спостереження за опроміненими з уточненням закономірностей і дозових залежностей відновлення імунної системи з вивченням клітинних реакцій на опромінення, які є базовими для формування фенотипових проявів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є самостійним, завершеним, комплексним науковим дослідженням, яке виконане у відділі клінічної імунології Інституту клінічної радіології (ІКР) ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України" (НЦРМ). Дослідження виконані в рамках науково-дослідних робіт ДУ "НЦРМ АМН України": "Вивчення модифікуючого впливу на імунну систему носійства вірусів гепатиту В, С, цитомегалії у віддалені строки після Чорнобильської катастрофи", № держреєстрації 0199U003595 (1998-2001 рр.), відповідальний виконавець; "Вивчення механізмів алергічного запалення при формуванні імунозалежної соматичної патології у учасників ліквідації наслідків Чорнобильської аварії", № держреєстрації 0101U001451 (2001-2003 рр.), відповідальний виконавець; "Вивчення порушень диференціювання ранніх попередників імунопоезу у ліквідаторів Чорнобильської аварії у віддаленому періоді після опромінення", № держреєстрації 0104U003632 (2004-2006 рр.), відповідальний виконавець; "Вивчення зв'язку процесів апоптозу та довжини теломерів мононуклеарів периферичної крові при формуванні клітинних ефектів дії іонізуючого випромінення", № держреєстрації 0107U000926 (2007-2009 рр.), відповідальний виконавець. Експериментальні дослідження були виконані у рамках українсько-японського проекту "Health effects at cellular level" (Чорнобильський центр з проблем ядерної безпеки, радіоактивних відходів та радіоекології, Київ, Україна; Nuclear Safety Research Association, Tokyo, Japan; ДУ "НЦРМ АМН України"; МНТЦ "Об`єкт Укриття", Чорнобиль; Nagasaki University, Nagasaki, Japan), (2002-2004 рр.); відповідальний виконавець.

Мета дослідження. Визначити закономірності розвитку радіаційного ефекту в імунній системі при аварійному опроміненні із встановленням функціонально-структурних особливостей статусу клітинної ланки імунітету та розробити концепцію методичного забезпечення оптимізованого контролю за розвитком пізніх ефектів опромінення в імунній системі у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС.

Завдання дослідження

1. Вивчити в експерименті in vitro довгострокові ефекти дії г-випромінювання Чорнобильського спектра при потужності доз від 0,2 Гр/рік до 1,0 Гр/рік на нормальні іморталізовані (hTERT-BJ1) і пухлинні (HeLa) клітини людини.

2. Дослідити клітинний склад, функціональний статус і кількісні характеристики циркулюючого пулу CD34⁺-клітин в осіб, які зазнали впливу іонізуючого випромінювання, залежно від дози та часу після опромінення.

3. Дослідити in vitro феномен інактивації несингенних стовбурових клітин та оцінити його імунобіологічну значущість при дії іонізуючої радіації.

4. Дослідити рівень генних соматичних мутацій за частотою TCR-мутантних лімфоцитів в осіб, які зазнали впливу іонізуючого випромінювання.

5. Визначити характер змін кількісних параметрів субпопуляційного складу лімфоцитів, мітоген (антиген)-залежних реакцій і проліферативної активності лімфоцитів периферичної крові у учасників ліквідації наслідків аварії (УЛНА) на ЧАЕС із найбільш розповсюдженими нозологічними формами соматичної патології у віддаленому періоді після опромінення.

6. Оцінити рівень апоптозу в клітинних популяціях периферичної крові в осіб, які зазнали впливу іонізуючого випромінювання.

7. Розробити математичну модель лімфоцитарного контролю розміру пулу кровотворних стовбурових клітин і ранніх попередників та визначити можливості моделювання процесу генерації стовбурових клітин і ефективності імунологічного нагляду.

8. Сформулювати концепцію методичного забезпечення оптимізованого контролю формування пізніх ефектів опромінення в імунній системі у постраждалих від аварійного радіаційного впливу.

Об'єкт дослідження. Адаптивні, генетичні, проліферативні, активаційні реакції клітин людини різного типу (нормальні іморталізовані, пухлинні, циркулюючі гемопоетичні та імунокомпетентні) на дію іонізуючої радіації.

Предмет дослідження. Ефекти дії радіаційного фактора аварії на ЧАЕС, асоційовані з клітинними проявами в антигенно-структурному, імунному гомеостазі у УЛНА у віддаленому періоді після опромінення; ефекти впливу іонізуючого випромінювання рівня та спектра, що мали місце у випадку Чорнобильської аварії, на клітини людини різного типу in vitro у часі.

Методи дослідження: клініко-імунологічні, лабораторно-імунологічні, протокова цитометрія, імунофенотипування, культуральні, цитогенетичні, статистичні, математичне моделювання.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше експериментально in vitro на акумуляційній hTERT-BJ1 клітинній моделі при потужності доз г-випромінювання реакторного спектра від 0,2 Гр/рік до 1,0 Гр/рік і кумулятивних дозах від 14 мЗв до 1,16 Зв отримано докази впливу тривалого (впродовж 78 тижнів) безперервного г-опромінення у діапазоні доз, близьких до тих, що мали місце у випадку Чорнобильської аварії, на геном і життєздатність кровотворних стовбурових клітин людини з формуванням адаптивної дозозалежної відповіді у часі та продемонстровано кількісні параметри залежності "доза - ефект".

Вперше встановлено закономірності формування радіаційного ефекту в імунній системі у УЛНА із поглинутими дозами від 0,11 до 5,7 Зв у віддаленому періоді після опромінення та функціонально-структурні особливості статусу клітинної ланки імунітету.

Вперше з`ясовано механізм реалізації клітинних реакцій на опромінення в імунній системі в радіаційно-зумовлену імунну недостатність через дестабілізацію компартменту кровотворних стовбурових клітин з розвитком адаптивної дозозалежної відповіді у часі і неспецифічне пригнічення імунних регуляторних функцій, що забезпечується незбалансованістю кооперації спеціалізованих субпопуляцій лімфоцитів. Встановлено фенотипові прояви цього механізму у УЛНА на ЧАЕС.

Вперше розроблено математичну модель лімфоцитарного контролю розміру пулу кровотворних стовбурових клітин і визначено її можливості для оцінки процесу генерації стовбурових клітин і ефективності функції нагляду в імунній системі.

Практичне значення одержаних результатів. Науково обґрунтована і експериментально доведена необхідність внесення змін до діагностики радіоіндукованих розладів у системі імунітету у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС у віддалений період. Визначено інформативність імунофенотипових показників статусу клітинної ланки імунітету для оцінки негативного впливу іонізуючого випромінювання у УЛНА на ЧАЕС у віддалений період, а також у інших осіб, які зазнали радіаційної дії. Запропонована концепція методичного забезпечення оптимізованого контролю формування пізніх ефектів опромінення в імунній системі у постраждалих від аварійного радіаційного впливу. Запропонована математична модель, котра дає змогу оцінювати лімфоцитарне регулювання розміру пулу кровотворних стовбурових клітин у динаміці. Модель може бути застосована з діагностичною метою, для оцінки ефективності лікування онкогематологічних захворювань, для контролю при проведенні імунотерапії, імунокорекції. Запропоновано та впроваджено модифікацію протоколу ідентифікаціі CD34-позитивних клітин і визначення клітинного складу циркулюючого CD34⁺-пулу.

Дані дослідження захищені 2 патентами, котрі впроваджені в роботу відділу клінічної імунології ІКР ДУ "НЦРМ АМН України": "Спосіб діагностики стану імунної системи" (пат. № 74321; Україна, МПК 7G01N33/53; опубл. 15.11.05, Бюл. № 11/2005); "Спосіб біологічної індикації дії низьких рівнів іонізуючої радіації" (пат. № 17209; Україна; МПК 7G01N33/53; опубл. 15.09.06, Бюл. № 9/2006). Зазначені науково-практичні результати дисертаційної роботи відображені у 3 методичних рекомендаціях: "Технології оцінки стану органів і систем персоналу, зайнятого на роботах по здійсненню плану організаційних заходів на об'єкті "Укриття" (Київ, 2002), "Методологія оцінки результатів медичного контролю стану здоров'я і професійної працездатності персоналу об'єкта "Укриття" (Київ, 2002), "Визначення кровотворних стовбурових клітин в радіаційній медицині" (Київ, 2007).

Особистий внесок здобувача. Дисертанткою особисто сформульовано концепцію дисертаційної роботи, проведено інформаційний пошук, аналіз літературних даних, визначено ступінь вирішеності проблеми, обґрунтовано актуальність дослідження, сформульовано мету та завдання дослідження. Особисто розроблені дизайн, методичні підходи, структура бази даних, відібрані методи і протоколи дослідження, сформовані групи обстеження, контролю та порівняння. Самостійно проведені культуральні і цитогенетичні дослідження в експедиційних і лабораторних умовах, аналіз первинних цитофлюориметричних даних з використанням програмного пакета WinMDI 2.8 (BD, США), експериментальні дослідження in vitro із формуванням короткочасових культур клітин, заповнена база даних з проведенням статистичної обробки, аналізу, узагальнення отриманих результатів, їх співставлення з даними літератури. Особисто написані всі розділи дисертації, створені ілюстрації, таблиці, додатки, сформульовані висновки, наукова новизна і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на міжнародних і національних наукових форумах: 3-й Міжнародній конференції "Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи: підсумки 15-річних досліджень" (Київ, 18-20 квітня 2001); Міжнародній конференції "П`ятнадцять років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання" (Київ, 18-20 квітня 2001); Міжнародному симпозіумі "Мониторинг здоровья и окружающей среды. Технологии и информационные базы данных" (Греция, Крит; 29 апреля-6 мая 2001); The 12^th Annual Congress of European Resp. Society (ERS) (Стокгольм, Швеція; 14-18 вересня 2002); Науково-практичній конференції з нагоди 15-річчя створення відділу клінічної імунології ІКР ДУ "НЦРМ АМН України" (Київ, травень 2002); The 8^th Annual Meeting of EHA Assoсiation (Lion, France; червень 2003); Школі-семінарі Інституту клінічної радіології ДУ "НЦРМ АМН України" та Інституту патології крові та трансфузійної медицини АМН України "Актуальные вопросы проточной цитометрии" (Київ, 8 жовтня 2003); "The 46^th Meeting The Japan Radiation Research Society (JRRS) (Токіо, Японія; 1-4 лютого 2004); Науково-практичній конференції "Екологічні проблеми у фтизіатрії і пульмонології", присвяченій 70-річчю утворення кафедри фтизіатрії з курсом пульмонології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (Київ, 1 жовтня 2004); Міжнародному симпозіумі "Информационные технологии и общество" (Італія, 16-23 травня 2005); Міжнародній конференції "Двадцять років Чорнобильської катастрофи. Погляд на майбутнє" (Київ, 2006); Науково-практичній конференції до 20-річчя гематологічного відділення ІКР ДУ "НЦРМ АМН України" "Радіаційна гематологія: етапи становлення, основні досягнення та перспективи розвитку" (Київ, 2007); Conference "Death, Danger& Immunity" (Institute Pasteur, Paris, France; 8-9 березня 2007); Міжнародній науково-практичній конференції з вирішення питань соціального захисту громадян, які постраждали внаслідок Чорнобильської катастрофи (Київ, 24-25 квітня 2008).

Публікації. Результати дисертації представлені у 65 друкованих працях, з них: 4 - у колективних монографіях, 25 статей у провідних наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 33 - у матеріалах доповідей на міжнародних і національних наукових форумах, методичних рекомендаціях 3 найменувань. Отримано патентів - 2.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 286 сторінках друкованого тексту, містить 49 таблиці і 43 рисунка. Складається із вступу, 6 розділів власних досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку літератури із 536 джерел (96 кирилицею, 440 латиницею) та 2 додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал і методи дослідження. Експериментальне дослідження виконано на культурах клітин ліній hTERT-BJ1 (основна) і HeLa (порівняльна). Іморталізована клітинна лінія hTERT-BJ1 є пулом нормальних фібробластів людини з трансфікованим теломеразним hTERT-геном (TERT технологія, Clontech Laboratory, Geron Corporation, США). Протокол експериментального дослідження включав побудову акумуляційних клітинних моделей, культивування, кількісну оцінку життєздатності клітин, проведення мікроядерного тесту. Клітини ліній hTERT-BJ1 і HeLa підлягли культивуванню із щотижневим пасажем та зовнішньому опромінюванню впродовж 78 тижнів в умовах 4 термостатів. Один із термостатів був розміщений у об`єкті "Укриття" поблизу головного насоса, два інші - в лабораторії МНТЦ "Укриття", місто Чорнобиль. Термостат з контрольними культурами клітин знаходився в лабораторії Інституту клінічної радіології ДУ "НЦРМ АМН України". Ґрунт із Рудого лісу, що був відібраний та розміщений у спеціальних мішках на дні термостата, використовували як плескате джерело г-випромінювання (потужність доз опромінювання 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 Гр/рік). Клітинну відповідь на дію іонізуючої радіації оцінювали за загальноприйнятими показниками життєздатності (щотижня) клітин і формування мікроядер (після кожних 3 тижнів). Зазначені показники в контрольних (інтактних) і дослідних культурах клітин визначали паралельно. Частоту мікроядер оцінювали на 1000 двоядерних клітин. Експериментальні дані обробляли методами описової статистики та аналізували за допомогою пакета STATISTICA 6.0. Розподіл частоти мікроядер у часі, співвідношення між частотою мікроядер та кумулятивною дозою здійснювали за допомогою Пірсонівського програмного продукту моментального кореляційного коефіцієнта та регресійних моделей.

У дисертації узагальнені результати клініко-імунологічних досліджень осіб, які зазнали впливу іонізуючої радіації. Загальна кількість обстежених осіб - 631: 265 УЛНА на ЧАЕС (дози опромінення від 0,11 до 0,99 Зв), у т.ч. реконвалесцентів гострої проміневої хвороби (ГПХ) - 88 осіб (дози опромінення від 1,1 до 5,7 Зв); 127 робітників зони ЧАЕС, які дотепер працюють в умовах підвищеного радіаційного фону та ризику інкорпорації трансуранових елементів із ефективними дозами від 0,31 до 28,9 мЗв; 29 кадрових співробітників ЧАЕС (категорії А, Б) із кумулятивними дозами від 11,8 до 214 мЗв. До груп порівняння та контрольних увійшли особи, які не зазнавали впливу іонізуючого випромінювання, що перевищує рівень природного радіаційного фону: 127 пацієнтів із хронічними соматичними захворюваннями (дисциркуляторна енцефалопатія, хронічний обструктивний бронхіт, хронічний гепатит) та 83 практично здорових чоловіків і донорів.

Субпопуляційний склад лімфоцитів, ідентифікацію CD34-позитивних клітин, кількість Bcl-2 позитивних гранулоцитів, лімфоцитів, TCR-мутантних лімфоцитів, клітинний склад циркулюючої CD34⁺ субпопуляції та експресію поверхневих антигенів визначали методом протокової цитофлюориметрії у прямому імунофлюоресцентному тесті з допомогою моноклональних антитіл серії Leu та лазерного протокового цитофлюориметру FACScan (BD, США). Імунологічну реактивність оцінювали in vitro за активаційною та проліферативною відповідями лімфоцитів на мітогени (антигени) різної природи (Кон А, стафілококовий анатоксин, тканинні антигени) з цитофлюориметричним визначенням вмісту клітин за фазами мітотичного циклу. Аналіз та інтерпретація ДНК-гістограм були виконані за допомогою пакета ModFitLT^TM (США).

Для оцінки ефекторної функції лімфоцитів досліджували in vitro феномен інактивації несингенних стовбурових клітин із одночасним імунофенотипуванням мішаної клітинної культури та реакцію гіперчутливості сповільненого типу методом В.П. Лозового і В.С. Кожевникова (1990). Оцінку процесу апоптозу в популяціях лімфоцитів, гранулоцитів периферичної крові у УЛНА в віддалені строки після опромінення та цитофлюориметричних проявів реалізації програмованої загибелі цих клітин здійснювали з допомогою набору реактивів Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit, моноклональних антитіл до Fas/APO-1 антигену (BD, США) та до внутрішньоклітинних білків-регуляторів апоптозу Bcl-2 (DakoCytomation, Данія) у фізіологічних умовах та in vitro при індукції верапамілом.

Для аналізу первинних цитофлюориметричних даних використовували програмні продукти PC-LYSIS-ІІ та WinMDI 2.8 (BD, США). Статистичний аналіз отриманих цифрових результатів проводили методом варіаційної статистики з використанням параметричного t-критерію Стьюдента, пакетів STATISTICA 6.0, Excel 5.0 у середовищі Microsoft. Для розробки моделі лімфоцитарного контролю розміру пулу кровотворних стовбурових клітин застосовували метод математичного моделювання з допомогою системи диференціальних рівнянь, для розвитку моделі використовували пакет MATLAB R2008А (США).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Експериментальне вивчення ефектів тривалого впливу іонізуючого випромінювання. Теоретичну основу експериментального дослідження склали такі припущення: а) іонізуюче випромінювання у діапазоні низьких доз впливає на кровотворення [Suzuki et al., 2001; Ojima et al., 2001; Reya et al., 2001; Broome et al., 2002; Sasaki, 2003; Meng et al., 2003; Li et al., 2004; Trosko et al., 2005]; б) за біологічними характеристиками (каріотип, клітинний цикл, експресія поверхневих маркерів раннього гемопоезу людини та ін.) клітини hTERT-BJ1 є подібними до кровотворних стовбурових клітин людини [Kawano et al., 2003; Masutomi et al., 2003; Yamada et al., 2003; Nisato et al., 2004; Qiu et al., 2005]; в) нормальні і трансфіковані стовбурові клітини кісткового мозку людини in vitro мають повністю порівнянні показники росту для 20 поділів; приблизно з 32-го покоління нормальні клітини показують ознаки старіння, тоді як hTERT-позитивні клітини продовжують рости далі до 80 подвоєнь і більше без зміни характеру кінетики росту та біологічних характеристик [Shi et al., 2002; Lloyd, 2002]; г) 52 подвоєнь кровотворних стовбурових клітин є достатнім (4,10¹⁵ клітин за життя людини) для забезпечення вмісту адекватної кількості зрілих клітин крові [Lansdorp, 1997; Rufer, 1999].

Життєздатність клітин ліній hTERT-BJ1 і HeLa в умовах тривалого цілодобового впливу г-випромінювання Чорнобильського спектра при потужності доз від 0,2 до 1,0 Гр/рік. В цих умовах ефект г-випромінювання на життєздатність нормальних фібробластів із трансфікованим теломеразним геном hTERT і пухлинних клітин лінії HeLa характеризувався у часі відновленням їх генерації у вигляді підвищення кількості життєздатних клітин у культурах після певного порогового рівня клітинних пошкоджень за біологічними властивостями (рис. 1).

Рис. 1. Зміни життєздатності клітин лінії hTERT-BJ1 (a) і HeLa (б) протягом експерименту.

В контрольних культурах інтактні клітини обох ліній зберігали стабільну проліферативну активність упродовж всього експерименту. Показники життєздатності інтактних клітин hTERT-BJ1 та HeLa були рівнозначними: 87-90,5 % та 88-90,1 %, відповідно.

Аналіз кривих розподілу значень показника життєздатності клітин hTERT-BJ1, HeLa у часі виявив схожу динаміку змін цього параметра в обох клітинних акумуляційних моделях на усіх експериментальних точках нагляду. Отримані криві залежностей "доза - час - ефект" мали 3 фази: фазу гострого зниження життєздатності на першому тижні культивування, плато, де накопичення дози не супроводжувалося змінами рівня ефекту, та фазу крутого підйому - швидке усунення радіаційно-індукованого ефекту на життєздатність клітин.

В культурах клітин лінії HeLa був визначений більш низький рівень плато на усіх "дозових" точках нагляду порівняно з рівнями плато в акумуляційній моделі hTERT-BJ1 (p < 0,01). Відновлення кінетики росту нормальних фібробластів лінії hTERT-BJ1 реєструвалося за усіма експериментальними точками нагляду приблизно з 12-го тижня культивування при кумулятивних дозах 62-243 мЗв, тоді як у культурах клітин лінії HeLa показник життєздатності почав зростати раніше - з 6-го тижня культивування при кумулятивних дозах від 27 мЗв до 112 мЗв відповідно до експериментальних точок нагляду. Це свідчило про різні, зумовлені біологічними характеристиками клітин механізми реагування на дію г-випромінювання Чорнобильського спектра при потужності доз від 0,2 Гр/рік до 1,0 Гр/рік. радіаційний імунна стовбурова міжклітинна

Кореляційний аналіз показав статистично достовірний (p < 0,05) кількісний зв`язок між накопиченою дозою та показником життєздатності клітин в обох акумуляційних моделях, на усіх "дозових" точках нагляду в динаміці експерименту. В акумуляційній моделі hTERT-BJ1 кореляційний коефіцієнт був у межах від 0,32 до 0,52, в акумуляційній моделі клітин лінії HeLa - від 0,29 до 0,47.

Формування генотоксичного ефекту у клітинах ліній hTERT-BJ1 та HeLa при дії тривалого безперервного г-опромінення при потужності доз від 0,2 до 1,0 Гр/рік. Експериментальне дослідження показало, що в цих умовах виникає генотоксичний ефект у вигляді підвищення частоти мікроядер у клітинах досліджуваних ліній. Початкова точка формування генотоксичного ефекту в обох акумуляційних моделях відповідала другому подвоєнню клітин (між 2-м і 3-м тижнями культивування). Це - ранній радіаційно-індукований ефект.

Число мікроядер на 1000 двоядерних клітин (МЯ/1000 ДК) було вірогідно підвищеним відносно контролю (р < 0,0001) як в акумуляційній моделі нормальних фібробластів лінії hTERT-BJ1, так і в порівняльній HeLa лінії упродовж 78 тижнів культивування в умовах безперервного г-опромінення. Вихід мікроядер у клітинах hTERT-BJ1 та HeLa демонстрував нелінійну залежність від тривалості пролонгованої дії іонізуючого г-випромінювання Чорнобильського спектра при потужності доз від 0,2 до 1,0 Гр/рік.

Криві розподілу частоти утворення мікроядер у клітинах обох ліній протягом експерименту мали зовнішню схожість і були М-подібними із двома піками t1 (глобальний) і t2 (локальний) (рис. 2).

Рис. 2. Криві розподілу частоти утворення мікроядер у клітинах ліній hTERT-BJ1 (а) та HeLa (б) протягом експерименту.

Нелінійний характер кривих був зумовлений наявністю 2 ділянок, які відрізнялися за кількісним взаємозв`язком між величиною накопиченої дози та частотою утворення мікроядер у клітинах.

Початкова, відносно прямолінійна ділянка в діапазоні доз 0,014-0,602 мЗв (для клітин лінії hTERT-BJ1 відповідно до "дозових" точок нагляду) та 0,015-0,404 мЗв (для клітин лінії HeLa відповідно до "дозових" точок нагляду) характеризувалася статистично достовірним кількісним взаємозв`язком зазначених параметрів (p < 0,05) із коефіцієнтами кореляції високого ступеня 0,81-0,96 та 0,75-0,96, відповідно.

Наступний етап відображав послаблення генотоксичного ефекту. На препаратах спостерігали суттєве зменшення утворення мікроядер у клітинах hTERT-BJ1 та HeLa, але показники МЯ/1000 ДК в обох акумуляційних моделях були достовірно підвищеними до кінця експерименту порівняно з контролем (p < 0,0001). Кількісний взаємозв`язок з дозою, яка продовжувала зростати, не був встановлений.

Клітини ліній hTERT-BJ1 та HeLa набули певної радіорезистентності, що свідчило про адаптивний характер реагування клітин на подальший вплив іонізуючого випромінювання. Локальний пік (t2) генотоксичного ефекту в акумуляційній клітинній моделі hTERT-BJ1 відповідав діапазону накопичених доз від 222 мЗв до 1,16 Зв, в порівняльної моделі - від 248 мЗв до 1,22 Зв згідно з експериментальними точками нагляду. Це повторне, але значно менше порівняно з першим (t1) зростання показника МЯ/1000 ДК в обох акумуляційних моделях ймовірно визначалося додатковим пошкодженням ядерних структур продуктами зміненого клітинного метаболізму.

Аналіз картини виявлених ефектів та їх співставлення дозволили віднести реакції клітин людини ліній hTERT-BJ1, HeLa на тривалу пролонговану дію г-випромінювання Чорнобильського спектра потужністю експозиційних доз від 2,28 до 13,28 мР на годину та поглинутих в діапазоні 0,2-1,0 Гр/рік до типологічних, і в цілому їх слід розглядати як адаптивну дозозалежну відповідь. Тобто накопичення і збереження у часі цитогенетичних пошкоджень в клітинах є проявами геномної нестабільності.

Радіаційно-індуковані ефекти щодо акумуляційної моделі з використанням іморталізованих нормальних фібробластів людини лінії hTERT-BJ1 є рішенням умов (припущень), які були прийняті при її побудові.

Імуно-гематологічні аспекти у когортної детекції радіаційних ефектів у віддаленому періоді аварії на ЧАЕС. Частота TCR-мутантних лімфоцитів в осіб, які зазнали радіаційного впливу. Т-клітини (хелпери) з дефектом експресії Т-клітинних рецепторних генів (продукти одного алеля TCR-б або в) утворюються спонтанно при дії іонізуючого випромінювання і визначаються як частота TCR Mf (х 10^-4) in vivo, що характеризує статус позаядерного (відносно ядерних структур) генома, рівень соматичного мутагенезу.

Частота TCR-мутантних лімфоцитів була визначена в периферичній крові УЛНА на ЧАЕС при динамічному спостереженні, у робітників зони ЧАЕС, які дотепер працюють в умовах підвищеного радіаційного фону та ризику інкорпорації трансуранових елементів, та в групі кадрових співробітників ЧАЕС (категорії А, Б) із стажем роботи понад 5 років у галузі атомної енергетики.

В досліджені терміни спостереження - 1999-2005 рр., що відповідали віддаленим строкам після опромінення внаслідок аварії на ЧАЕС, середні значення частоти TCR-мутантних лімфоцитів у периферичній крові у УЛНА з дозовими навантаженнями за документами від 0,10 до 0,99 Зв та в групі реконвалесцентів ГПХ з поглинутими дозами від 1,1 Зв до 5,7 Зв перевищували вікові контрольні із різним ступенем вірогідності (табл. 1).

Таблиця 1. Динаміка частоти TCR-мутантних лімфоцитів в УЛНА на ЧАЕС у віддаленому періоді

Примітки: 1) * - стандартна похибка середнього; 2) різниця порівняно з віковим контролем із ступенем вірогідності: № - p < 0,0001; І - p < 0,01; і - p < 0,05; ? - p < 0,1.

У цілому, зміни TCR Mf у УЛНА на ЧАЕС 1986-87 рр., в т.ч. реконвалесцентів ГПХ, із плином часу характеризувалися зниженням упродовж 6 вказаних років лише в 1,5-2 рази, що може пояснюватись як послабленням елімінації TCR-мутантних клітин у реконвалесцентів ГПХ у віддалені строки після гострого опромінення у високих дозах, так і зміною швидкості накопичення точкових мутацій у Т-клітинному рецепторі хелперних лімфоцитів. Статистично достовірне перевищення рівня TCR-мутантних лімфоцитів також спостерігали в осіб із числа персоналу та у робітників зони ЧАЕС із середньою ефективною дозою 8,240 ± 1,54 мЗв (p < 0,05) (табл. 2).

Таблиця 2. Частота TCR-мутантних лімфоцитів у робітників зони ЧАЕС з різними ефективними дозами та в групі кадрових працівників ЧАЕС

Примітки: 1) * - стандартна похибка середнього; 2) ** - різниця вірогідна з p < 0,05 відносно контролю за t-критерієм.

Частота Т-лімфоцитів з дефектом експресії Т-клітинних рецепторних генів в групі робітників зони ЧАЕС із середньою ефективною дозою 4,038 ± 0,44 мЗв не мала вірогідної різниці з віковим контролем.

Кореляційний аналіз визначив позитивний статистичний зв`язок (p < 0,05) між частотою TCR-мутантних Т-лімфоцитів і величиною дози опромінення від 1,1 Зв до 5,7 Зв у реконвалесцентів ГПХ в динаміці спостереження: за даними 1999 р. r = 0,36; за даними 2004-2005 рр. r = 0,52.

У групі УЛНА з дозами опромінення до 1,0 Зв коефіцієнти кореляції між зазначеними показниками були достовірними, але нижчими за величиною - 0,15 і 0,28. Кількісна міра взаємозв`язку між TCR Mf і кумулятивною дозою в обох групах робітників зони ЧАЕС і в групі персоналу була статистично значущою (p < 0,05), проте позитивні коефіцієнти кореляції не перевищували значення 0,11.

Між показниками віку і TCR Mf кількісний взаємозв`язок у УЛНА виявити не вдалося. В групі робітників зони ЧАЕС із середньою ефективною дозою 8,240 ± 1,54 мЗв і в групі персоналу із накопиченими за період роботи дозами опромінення від 11,8 мЗв до 214 мЗв коефіцієнти кореляції між підвищеною частотою TCR-мутантних лімфоцитів і віком були 0,45 і 0,23 (відповідно до груп обстежених).

Аналіз індивідуальних значень частоти TCR-мутантних лімфоцитів у експонованих осіб показав залежність показника від кількості Т-лімфоцитів з фенотипом CD3⁺CD4⁺; зміни частки цих клітин у периферичній крові можуть значно нівелювати TCR Mf на груповому та когортному рівнях.

Стан циркулюючого пулу CD34-позитивних клітин в осіб, які зазнали радіаційного впливу. Виявилось, що кількість CD34-позитивних клітин у периферичній крові УЛНА з дозовими навантаженнями від 0,18 Зв до 0,96 Зв, у т.ч. у реконвалесцентів ГПХ (поглинуті дози 1,1-5,7 Зв), у віддалені строки після гострого радіаційного опромінення та в групі робітників з ефективними дозами від 2,1 мЗв до 15,9 мЗв, які перебували у ранньому періоді пролонгованого радіаційного впливу внаслідок професійної діяльності, є значно підвищеною відносно контролю (p < 0,01; p < 0,001, відповідно).

У групі УЛНА зафіксовано вірогідно високий вміст недиференційованих клітин з імунофенотипом CD34⁺CD90^-CD10^-CD123^-CD38^-PCNA^-CD117^- в збільшеній у розмірі загальній CD34⁺-популяції периферичної крові з різницею p < 0,01 відносно контролю та p < 0,001 відносно значення в групі робітників зони ЧАЕС.

Аналогічне дослідження в групі пацієнтів з депресіями в імунній системі, що були сформовані на тлі тривалих хронічних соматичних захворювань (імунодепресії нерадіаційного походження), також виявило вірогідно (p < 0,01 відносно контролю) збільшений розмір циркулюючого CD34⁺ пулу, тоді як кількість недиференційованих CD34-позитивних клітин не відрізнялася від контрольного значення.

Результати порівняльного аналізу кількісних показників циркулюючого пулу CD34-позитивних клітин в осіб, які зазнали впливу пролонгованого опромінення внаслідок професійної діяльності в діапазоні доз від 2,1 мЗв до 15,9 мЗв, та УЛНА з дозовими навантаженнями 1,77 ± 0,41 Зв наведені на рис. 3.

Рис. 3. Вміст недиференційованих клітин з імунофенотипом CD34⁺CD90^-CD10^-CD123^-CD38^-PCNA^-CD117^- у загальній CD34⁺ популяції периферичної крові та розмір циркулюючого пулу CD34-позитивних клітин за групами обстеження: a) контрольна; б) робітники зони ЧАЕС - ранній період пролонгованого низькодозового радіаційного впливу; в) УЛНА у віддалені строки після гострого радіаційного опромінення.

Примітки: 1) * - різниця вірогідна відносно контролю; 2) ** - різниця вірогідна відносно контролю (p < 0,01) та відносно значення в групі б) з p < 0,001.

Цитофлюориметричний аналіз імунофенотипованого циркулюючого CD34⁺-пулу клітин дозволив встановити, що ці клітини є ранніми попередниками гемопоезу різного ступеня зрілості та функціональної спеціалізації за експресією поверхнево-мембраних молекул CD34, CD10, CD90, CD123, CD38, CD117, PCNA. Склад циркулюючого CD34⁺-пулу за експресією дослідних маркерів в осіб контрольної групи був сформований значною мірою субкласами, що коекспресували поверхневі і цитоплазматичні білки, рецептори, характерні для диференційованих клітин CD34⁺CD123⁺, CD34⁺PCNA⁺, CD34⁺CD38⁺. Різницю між імунофенотиповими профілями клітин CD34⁺-популяції периферичної крові у УЛНА без ГПХ в анамнезі із радіаційно-асоційованими імунодепресіями, і пацієнтів з імунодепресіями "нерадіаційного" походження встановлено за рахунок підвищеного рівня коекспресії CD90 - раннього імуноглобуліноподібного рецептора стовбурових клітин гемопоезу, що відіграє суттєву роль у процесі міграції та хоумінгу клітин, і значно зниженої презентації CD123 - рецептора до інтерлейкіну-3.

У УЛНА із середнім груповим значенням поглинутої дози 1,77 ± 0,41 Зв характерним було переважне представництво 3 субкласів клітин: 1) з експресією тільки поверхневого стовбуровоклітинного CD34-антигену; 2) таких, що коекспресували маркери ранніх попередників гемопоезу та маркери диференційованих клітин (CD34⁺CD123⁺, CD34⁺PCNA⁺, CD34⁺CD38⁺); 3) з експресією тільки окремих антигенів-маркерів диференційованих клітин (PCNA, CD38).

У групі робітників зони ЧАЕС із середньою ефективною дозою 8,16 ± 0,61 мЗв визначена ширша неоднорідність організації CD34⁺ популяції периферичної крові, що значною мірою була сформована за рахунок наступних 2 категорій клітин: 1) що коекспресували маркери кровотворних стовбурових клітин, ранніх клітин-попередників і маркери диференційованих клітин: CD34⁺CD90⁺, CD34⁺CD123⁺, CD34⁺PCNA⁺, CD34⁺CD38⁺; 2) з експресією тільки маркерів диференційованих клітин або маркерів ранніх попередників гемопоезу - CD90, CD123, PCNA, CD38, CD117.

Важливою характеристикою стовбурових клітин і клітин-попередників гемопоезу є присутність поверхнево-мембранної експресії рецепторів до факторів росту і трансформації. Продукт гену c-kit (CD117), підвищений рівень якого був зафіксований на CD34⁺-клітинах периферичної крові у осіб, які перебували у ранньому періоді протрагованого радіаційного впливу внаслідок професійної діяльності, є рецептором до фактору росту стовбурових клітин, що регулює мітотичний поділ та запуск антиапоптотичних подій у клітинах-попередниках. Середній вміст субкласу CD34⁺CD117⁺ ранніх попередників гемопоезу у периферичній крові робітників зони ЧАЕС з дозами опромінення від 3,13 мЗв до 13,7 мЗв вірогідно перевищував кількісні характеристики в осіб контрольної групи і УЛНА із середнім груповим значенням поглинутої дози 1,77 ± 0,41 Зв (p < 0,05).

Збільшення пропорцій CD34⁺-клітин, що коекспресували білок PCNA та поверхнево-мембраний антиген CD123, а також клітин у пізніших стадіях диференціювання, було доказом не тільки на користь функціонально-активного стану циркулюючого CD34⁺-пулу, більш вираженого у робітників зони ЧАЕС. Надмірна експресія цитоплазматичного білка PCNA і поверхнево-мембраного антигену CD123 на CD34-позитивних клітинах може свідчити про її радіаційну асоційованість за функціональними характеристиками цих молекул. Порівняльний аналіз імунофенотипових характеристик організації CD34⁺-популяції периферичної крові між групами обстеження за відповідними показниками із встановленням розбіжностей високих ступенів вірогідності дозволяє зробити висновок про моделюючий вплив іонізуючої радіації на представництво субкласів клітин у циркулюючому CD34⁺-пулі.

Динамічні дослідження кількісних характеристик циркулюючого пулу CD34-позитивних клітин у УЛНА-реконвалесцентів ГПХ із середнім груповим значенням дози 2,91 ± 0,41 Зв у віддаленому періоді виявили достовірне (p < 0,01) зменшення загального розміру циркулюючого CD34⁺-пулу та відсутність змін кількості CD34⁺-недиференційованих клітин через 2-3 роки після першого дослідження, котре було проведено через 16 років після гострого опромінення. У робітників зони ЧАЕС, опромінених в межах професійних дозових лімітів (середня ефективна доза у групі за 1-м дослідженням 7,56 ± 0,88 мЗв, за 2-м - 10,04 ± 0,98 мЗв), через 1-1,5 року після першого дослідження вірогідної різниці між зазначеними показниками встановити не вдалося.

Результати динамічного дослідження кількісних показників циркулюючого пулу CD34-позитивних клітин за групами обстеження наведені на рис. 4.

Рис. 4. Динаміка параметрів стану циркулюючого пулу CD34-позитивних клітин у УЛНА-реконвалесцентів ГПХ у віддаленому періоді та в робітників зони ЧАЕС, опромінених у межах професійних лімітів.

Примітка. * - різниця між параметрами вірогідна, p < 0,01.

Проведено формалізацію отриманих результатів за клітинним складом циркулюючого пула CD34-позитивних клітин в опромінених осіб, що дало змогу визначити особливості функціональної спеціалізації субкласів за експресією поверхнево-мембраних молекул CD90, CD123, CD38, CD117, PCNA та охарактеризувати їх організацію як доказ імовірних потенційних функціональних можливостей збільшеного у розмірах постійно циркулюючого CD34⁺-клітинного пулу.

Підхід, що був запропонований, включав розрахунок параметрів: k₁, …, k₁₀ - коефіцієнтів переходу від одного фенотипу до другого в межах субкласу та t₁, …, t₅ - величин, що характеризують кінетику зміни фенотипового портрета в межах субкласу, а також логарифмування отриманих групових середніх значень параметрів k і t за формулами:

Розрахункові карти організації субкласів циркулюючої CD34⁺ субпопуляції можна порівняти із своєрідним "відбитком пальця", котрий у динаміці спостереження може слугувати тонким діагностичним показником статусу цієї сукупності клітин у обстеженого контингенту, оскільки зміни поверхнево-мембраної композиції є ознаками набуття інших функціональних можливостей та іншої локалізації цих клітин.

Циркулюючі CD34-позитивні клітини здатні проліферувати у CD3⁺CD4⁺-лімфоцити [Rasia et al., 2003; А.А. Темнов и соавт., 2007], кількість яких прямо пов'язана із розрахунком TCR Mf та кількістю TCR-мутантних хелперів. За допомогою кореляційного аналізу в дослідних групах опромінених осіб встановлено достовірний (p < 0,05) кількісний взаємозв'язок двох змінних величин - вмісту CD3⁺CD4⁺-лімфоцитів та CD34-позитивних клітин у периферичній крові з позитивними коефіцієнтами кореляції. В групі робітників зони ЧАЕС (n = 95) з ефективними дозами від 0,31 мЗв до 9,45 мЗв коефіцієнт кореляції (r) був 0,15; у групі реконвалесцентів ГПХ (n = 28) за результатами обстеження через 18-19 років після гострого опромінення (середнє значення дозового навантаження 2,08 ± 0,53 Зв) - r = 0,31; у групі працівників атомноенергетичної галузі (n = 29; кумулятивна доза за стаж роботи 51,415 ± 9,12 мЗв) - r = 0,32. У групі контролю ці показники не демонстрували кількісної міри взаємозв'язку. Наявність позитивної кореляції зазначала, що відхилення кількості CD3⁺CD4⁺-лімфоцитів можуть відбудуватися одночасно зі змінами вмісту циркулюючих CD34-позитивних клітин.

Характеристика апоптозу в популяціях лімфоцитів, гранулоцитів периферичної крові у УЛНА у віддалені строки після опромінення. Дослідження найбільш універсального механізму біологічної загибелі клітин, що опосередковується через специфічні рецептори Fas, проведено в УЛНА з середньогруповим значенням дози опромінення за документами 0,63 ± 0,18 Зв та в групі робітників зони ЧАЕС з ефективними дозами опромінення значно меншими - від 2,1 мЗв до 15,9 мЗв (9,56 ± 0,51 мЗв у середньому), котра для групи УЛНА слугувала своєрідним "дозовим" контролем.

Встановлено різноспрямовані зміни готовності лімфоцитів та гранулоцитів до апоптозу у популяціях периферичної крові УЛНА за кількістю CD95-предикторів. Вміст CD95⁺-лімфоцитів був достовірно нижчим порівняно з віковим (p < 0,001) та дозовим контролями (p < 0,05). Підвищена кількість CD95 гранулоцитів-предикторів становила однакову вірогідну різницю з контрольним значенням показника і в групі робітників зони ЧАЕС, p < 0,01. Дані підтверджені in vitro у реакції на верапаміл за репрезентативними УЛНА і робітників зони ЧАЕС, у котрих значення вищезазначених показників були у інтервалі з високим ступенем довір'я (± у). У репрезентативній групі УЛНА ефект верапамілу характеризувався відповіддю лімфоцитів, проте кількість клітин з готовністю до Fas-апоптозу не відрізнялася від контрольного рівня. За кількістю CD95-гранулоцитів-предикторів ефект верапамілу реалізувався через їх достовірне підвищення (p < 0,03) відносно значення показника контрольної групи.

Однак оцінка реалізації програмованої загибелі клітин у анексиновому тесті свідчила про відсутність достовірної різниці рівнів спонтанних апоптотичних реакцій лімфоцитів та гранулоцитів у периферичній крові УЛНА із середнім груповим значенням дози опромінення 0,40 ± 0,079 Зв порівняно з аналогічними показниками у віковому контролі та в групі робітників зони ЧАЕС, опромінених у діапазоні професійного дозового ліміту. Верапаміл-індукована відповідь за кількістю лімфоцитів з ранніми апоптотичними ознаками, з гіподиплоїдним вмістом ДНК та за числом анексин V⁺/Pi^- гранулоцитів була більш інтенсивною, ніж у віковій контрольній групі (p < 0,01, p < 0,1, p < 0,1, відповідно за параметрами). Для репрезентативної групи робітників зони ЧАЕС з ефективними дозами від 4,1 мЗв до 8,9 мЗв характерним був підвищений спонтанний рівень апоптотичної реакції лімфоцитів за числом анексин V⁺/Pi^- клітин вірогідно до показника у контролі (p < 0,05). В УЛНА і робітників зони ЧАЕС вміст Bcl-2 позитивних клітин у циркулюючих популяціях лімфоцитів та гранулоцитів не відрізнявся від контрольного за віком. Це може показувати достатню життєздатність лімфоцитів та гранулоцитів і тривалість життя їхніх зрілих форм.

Тоді як у цілому, такі складні цитофлюориметричні прояви апоптозу у циркулюючих популяціях імунокомпетентних клітин з наявністю блокуючого ефекту вступу лімфоцитів до апоптозу в УЛНА, опромінених у дозах до 1,0 Зв, свідчать про порушення його Fas-рецептор-залежного механізму, які вірогідно мають регуляторний характер і причиною котрих у віддаленому періоді гострого опромінення найімовірніше може бути недостача енергетичного ресурсу у клітинах.

Феномен інактивації несингенних стовбурових клітин з використанням лімфоцитів периферичної крові опромінених осіб. Оцінка імунного механізму впливу алогенних стовбурових клітин in vitro. Дослідження феномену інактивації несингенних стовбурових клітин проводили у 24-годинній мішаній культурі донорських алогенних стовбурових (ранніх попередників гемопоезу) клітин (АСК) та Т-, В-лімфоцитів периферичної крові осіб, які зазнали радіаційного впливу в діапазоні доз від 1,16 мЗв до 0,52 Зв.

Кількісною характеристикою регулюючого впливу Т-, В-лімфоцитів на вміст стовбурових клітин і ранніх попередників гемопоезу в периферичної крові при їх збільшенні в вигляді інактиваційного ефекту слугував індекс інактивації - відносне число втрачених CD34⁺ клітин у мішаній культурі порівняно до контролю (тільки АСК). Позитивне значення індексу інактивації свідчило про інактивуючу дію лімфоцитів, негативне - про відсутність взаємодії лімфоцитів з АСК in vitro.

За даними індексів інактивації встановлено різноспрямований характер взаємодії у 24-годинних мішаних культурах АСК, Т- та В-лімфоцитів периферичної крові опромінених осіб (рис. 5-7).

Рис. 5. Характер взаємодії у 24-годинній мішаній культурі алогенних стовбурових клітин, Т- та В-лімфоцитів периферичної крові осіб контрольної групи.

Рис. 6. Характер взаємодії у 24-годинній мішаній культурі алогенних стовбурових клітин, Т- та В-лімфоцитів периферичної крові УЛНА із середньою поглинутою дозою 0,36 ± 0,051 Зв.

Рис. 7. Характер взаємодії у 24-годинній мішаній культурі алогенних стовбурових клітин, Т- та В-лімфоцитів периферичної крові робітників зони ЧАЕС із середньою ефективною дозою 4,89 ± 0,89 мЗв.

Встановлено внесок радіаційного фактора у регуляторний вплив збалансованості кооперації взаємодіючих імунокомпетентних клітин у виконанні функції нагляду імунної системи. У 24-годинних культурах АСК та лімфоцитів периферичної крові осіб, опромінених у межах професійних лімітів від 1,16 мЗв до 9,57 мЗв, де середнє значення співвідношення Т- і В-лімфоцитів було максимальним, інактиваційний ефект не спостерігався. Індекси інактивації CD34-позитивних клітин перебували в зоні відсутності проявів ефекту і були найнижчими з вірогідною різницею (p < 0,01) середньогрупового значення відносно аналогічних у контрольній групі та групі УЛНА з поглинутими дозами від 11 сЗв до 52 сЗв. Це свідчило про незбалансованість кооперації взаємодіючих клітин, про стан нульового регулювання лімфоцитами підвищеної кількості стовбурових клітин та ранніх попередників гемопоезу.

У мішаних клітинних культурах з використанням лімфоцитів периферичної крові УЛНА з поглинутими дозами від 11 сЗв до 52 сЗв, де середній показник співвідношення Т- і В-лімфоцитів був нижчим проти аналогічного у культурах інших груп дослідження за рахунок зниженого вмісту Т-клітин, визначено деформований прояв інактивуючого ефекту з індексом інактивації в середньому на рівні контрольного. Цим можна пояснити збільшення та тривалу присутність пулу CD34-позитивних клітин у периферичній крові УЛНА.