Клітинні механізми формування радіаційних ефектів в імунній системі у віддаленому періоді Чорнобильської аварії (клініко-експериментальне дослідження)

Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 03.00.01 - радіобіологія (медичні науки). - ДУ "Науковий центр радіаційної медицини АМН України". Київ, 2009.

Дисертаційна робота присвячена вирішенню актуальної проблеми радіобіології з розкриття клітинних механізмів розвитку радіаційного ефекту в імунній системі при аварійному опроміненні. На підставі клініко-експериментальних досліджень встановлено закономірності формування радіаційного ефекту в імунній системі через адаптивні, генотоксичні, проліферативні, активаційні, диференційні реакції кровотворних стовбурових (ранніх попередників) і імунокомпетентних клітин на опромінення та через незбалансованість міжклітинної взаємодії, що дозволило запропонувати механізм реалізації клітинних реакцій на опромінення на рівнях кровотворних стовбурових, імунокомпетентних клітин та їх взаємодії, а також концепцію методичного забезпечення оптимізованого контролю формування пізніх ефектів опромінення в імунній системі у постраждалих від аварійного радіаційного впливу.

Експериментально in vitro на акумуляційній hTERT-BJ1 клітинній моделі при потужності доз г-випромінювання реакторного спектра до 1,0 Гр/рік та кумулятивних дозах від 14 мЗв до 1,16 Зв підтверджено вплив тривалого безперервного г-опромінення у діапазоні доз, близьких до тих, що мали місце у випадку Чорнобильської аварії, на геном і життєздатність кровотворних стовбурових клітин людини із формуванням адаптивної дозозалежної відповіді у часі. Експеримент був виконаний в експедиційних умовах. Іморталізовані нормальні hTERT-BJ1-фібробласти людини були опромінені у культурах. Як -випромінювач використовували ґрунт з Рудого лісу (1,5 км від 4-го енергоблоку ЧАЕС). Досліджено індукцію утворення мікроядер та життєздатність hTERT-BJ1 клітин, г-опромінених in vitro впродовж довгострокового періоду (78 тижнів). Відповіді клітин на усіх експериментальних точках нагляду демонстрували ефективність доз від 0,167 Зв до 0,666 Зв у вигляді скорочення генетичного пошкодження від послідовних кумулятивних доз. Хронічне г-опромінення потужністю від 0,2 до 1,0 Гр/год призвело до достовірної різниці рівнів формування мікроядер у культурі hTERT-BJ1 клітин відносно контролю (p < 0,0001). Воно продемонструвало стимулюючий ефект на життєздатність hTERT-BJ1 клітин. Однак дані не підтверджували лінійної порогової гіпотези, хоча адаптивна дозозалежна відповідь була очевидною.

Отримані результати експериментального дослідження слугували передумовою для проведення клінічного дослідження, що було спрямоване на виявлення клітинних фенотипових проявів радіаційного ефекту в імунній системі опромінених осіб у широкому діапазоні доз, у т. ч. учасників ліквідації наслідків аварії на ЧАЕС (УЛНА). Обстежено й проаналізовано стан клітинної ланки імунітету у 265 УЛНА. Визначена вірогідна підвищена кількість CD34-позитивних клітин у периферичній крові УЛНА у віддалені строки після опромінення, що відображає відповідь кровотворної тканини на радіаційний вплив, котра опосередковується через зниження функції імунологічного нагляду.

Встановлено статистично значущий (r = 0,52; p < 0,05) кількісний взаємозв'язок між рівнем радіаційно-індукованого соматичного мутагенезу за частотою TCR-мутантних лімфоцитів і дозою опромінення від 1,1 Зв до 5,7 Зв, а також достовірну (p < 0,05) кількісну міру залежності між кількістю CD3⁺CD4⁺-лімфоцитів і кількістю CD34-позитивних клітин у периферичній крові осіб, опромінених у діапазоні доз від 0,31 мЗв до 214 мЗв та в групі УЛНА (середня доза опромінення 2,08 ± 0,53 Зв). Ці дані демонструють потенційну асоційованість інтенсивності мутаційного процесу у клітинах крові з дестабілізацією функціонування кровотворного стовбурово-клітинного компартменту та загальною системною реакцією імунітету на вплив іонізуючої радіації, що може являти собою відображення мутаційного процесу в інших соматичних клітинах у контексті часу через розлади імунної регуляції.

За результатами 8-річного імунологічного моніторингу УЛНА встановлено напрямок імунних змін у віддаленому періоді та типологічні особливості статусу клітинної ланки імунітету, міра виразності яких залежить від характеристик радіаційного фактора. Результати роботи в цілому склалися у модель механізму реалізації клітинних реакцій на опромінення на рівнях кровотворних стовбурових, імунокомпетентних клітин та їх взаємодії, що дозволило сформулювати концепцію методичного забезпечення оптимізованого контролю за формуванням пізніх ефектів опромінення в імунній системі у постраждалих від аварійного радіаційного впливу.

Ключові слова: іонізуюча радіація, Чорнобиль, акумуляційна клітинна модель, іморталізована лінія hTERT-BJ1 клітин, кровотворні стовбурові клітини, імунна система, віддалений період після опромінення, CD34-позитивні клітини, частота TCR-мутантних лімфоцитів.

АННОТАЦИЯ

Беляева Н.В. Клеточные механизмы формирования радиационных эффектов в иммунной системе в отдаленном периоде Чернобыльской аварии (клинико-экспериментальное исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 03.00.01 - радиобиология (медицинские науки). - Государственное Учреждение "Научный центр радиационной медицины АМН Украины". Киев, 2009.

В диссертационной работе представлены теоретическое обоснование, экспериментальное подтверждение и новое решение актуальной проблемы радиобиологии, которое заключается в раскрытии механизмов развития радиационного эффекта в иммунной системе, формирующегося через адаптивные, генотоксические, пролиферативные, активационные, дифференцировочные реакции кроветворных стволовых (ранних предшественников) и иммунокомпетентных клеток на облучение и через несбалансованность межклеточного взаимодействия.

В работе предложены механизм реализации клеточных реакций на облучение на уровнях кроветворных стволовых, иммунокомпетентных клеток и их взаимодействия, а также концепция методического обеспечения оптимизированного контроля формирования поздних эффектов радиационного воздействия в иммунной системе у пострадавших в результате аварии на ЧАЭС.

Доказательство наличия эффектов хронического влияния г-излучения Чернобыльского спектра при мощности доз до 1,0 Гр/год на геном кроветворных стволовых клеток человека с развитием адаптивного дозозависимого ответа во времени было получено в эксперименте in vitro на аккумуляционной hTERT-BJ1 клеточной модели. Экперимент был выполнен в экспедиционных условиях. Иммортализованные нормальные hTERT-BJ1 фибробласты человека подверглись культивированию и облучению на протяжении 78 недель. В качестве -излучателя использовался реальный источник излучения Чернобыльского спектра - грунт из Рыжего леса (1,5 км от 4 энергоблока ЧАЭС). Радиационно-индуцированный эффект оценивали по индукции образования микроядер и показателю жизнеспособности hTERT-BJ1 клеток, которые по своим биологическим характеристикам близки человеческим стволовым клеткам.

Результаты эксперимента показали, что хроническое воздействие г-излучения реакторного спектра при мощности доз до 1,0 Гр/год и кумулятивных дозах от 14 мЗв до 1,126 Зв на культуры клеток hTERT-BJ1 приводит к раннему генотоксическому эффекту в виде достоверного различия в образовании микроядер (p < 0,0001) на фоне восстановления регенерации hTERT-BJ1 клеточной популяции с 12-й недели после облучения при кумулятивных дозах 62-243 мЗв. Кривые "доза - время - эффект" носили нелинейный характер. hTERT-BJ1 клетки с уровня накопленных доз от 0,167 Зв до 0,666 Зв приобрели радиорезистентность.

Полученные результаты экспериментального исследования послужили предпосылкой для проведения клинического исследования, направленного на выявление клеточных фенотипических проявлений радиационных эффектов в иммунной системе лиц, подвергшихся радиационному воздействию в широком диапазоне доз, в т. ч. участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС. Обследовано и проанализировано состояние клеточного звена иммунитета у 265 участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС (УЛПА).

В отдаленном периоде после облучения у УЛПА выявлено повышенное содержание CD34-позитивных клеток в периферической крови, что представляет собой ответ кроветворной ткани на радиационное воздействие, опосредуемый через снижение функции иммунологического надзора. Количество (х 10^-3) CD34⁺CD45^{-/low or dim} клеток статистически значимо (p < 0,05) коррелировало (r = 0,56) с величиной дозы в группе УЛПА со среднегрупповым значением дозовой нагрузки 0,56 ± 0,15 Зв. Корреляционный анализ выявил у УЛПА в отдаленном периоде достоверную (r = 0,52; p < 0,05) количественную взаимосвязь между уровнем радиационно-индуцированного соматического мутагенеза по частоте TCR-мутантных лимфоцитов и дозой острого облучения от 1,1 Зв до 5,7 Зв. Статистически значимая (p < 0,05) количественная мера зависимости была установлена между количеством CD3⁺CD4⁺-лимфоцитов и числом CD34-позитивных клеток в группе лиц, облученных в диапазоне доз от 0,31 мЗв до 214 мЗв, и в группе УЛПА, включая реконвалесцентов ОЛБ. Эти данные можно рассматривать как доказательство ассоциированности интенсивности мутационного процесса в клетках крови с дестабилизацией функционирования кровотворного стволовоклеточного компартмента и общей системной реакцией иммунитета на радиационное воздействие, а также как отражение мутационного процесса в других соматических клетках в контексте времени через расстройства иммунной регуляции.

По результатам 8-милетнего иммунологического мониторинга УЛПА установлены направленность иммунных изменений в отдаленном периоде после облучения и типологические особенности статуса клеточного звена иммунитета, степень выраженности которых зависима от характеристик радиационного фактора. Результаты работы, в целом, сложились в модель механизма реализации отдаленных последствий облучения в иммунной системе и концепцию методического обеспечения оптимизированного контроля за их формированием у пострадавших от аварийного радиационного воздействия.

Ключевые слова: ионизирующая радиация, Чернобыль, аккумуляционная клеточная модель, иммортализованная линия hTERT-BJ1 клеток, кроветворные стволовые клетки, иммунная система, отдаленный период после облучения, CD34-позитивные клетки, частота TCR-мутантных лимфоцитов.

ANNOTATION

Belayeva N.V. Cellular mechanisms of formation of radiation effects in immune system in the remote period of Chernobyl accident (clinical and experimental research). - Manuscript.

The dissertation (manuscript) for the academic degree of a Doctor of Medical Science in radiobiology (03.00.01). - State Institute "Research Center for Radiation Medicine of Academy of Medical Science of Ukraine". Kyiv, 2009.

The dissertation is aimed to resolve the radiobiological problem on revealing cellular mechanisms of development of radiation effects in the immune system after accidental radiation exposure. On the basis of clinical and experimental studies established were the regularities of radiation effect formation on the immune system through adaptive, genotoxic, proliferative, activation, and differentiation response of hematopoietic stem, progenitor and immune cells to radiation and through imbalance of intercellular interactions. This allowed to form a model of mechanism for the implementation of cellular responses to radiation at the levels of hematopoietic stem cells, immune cells, and their interactions, as well as to formulating concept of methodological optimization control of the formation of late radiation effects in the immune system at the victims of accidental radiation exposure.

Influence on the genome and the viability of human hematopoietic stem cells with the formation of adaptive response were confirmed by experiments in vitro on accumulative hTERT-BJ1 cell models exposed to doses of 14 mSv to 1,126 Sv of г-radiation of the reactor spectrum with power 1,0 Gy/year, similar to those occurred during Chernobyl accident. Experiments have been executed in expeditional conditions. Immortalized normal hTERT-BJ1 fibroblasts of human were exposed in cultures by soil from specific areas of the Red Forest (1.5 km far from the 4^th Chernobyl Reactor), which has been placed into plastic boxes. Investigated were the induction of micronucleus formation and cell viability in hTERT-BJ1 cell cultures exposed in vitro of г-rays over a long period (78 weeks). Cell response in all experimental placements demonstrated that doses from 0,167 З to 0,666 З of г-rays are effective in reducing genetic damage from a subsequent accumulation dose. Results demonstrated that chronic exposures about 1,0 Gy/year gamma radiation resulted in clear-cut distinction levels of micronucleus formation as compared to controls (p < 0,0001). Stimulant effect on viability of hTERT-BJ1 cells has been shown. The data did not support the linear threshold hypothesis. Adaptive dose-dependent effect was apparent.

The obtained results of experimental studies have been a prerequisite for conducting clinical research, which was aimed to identify cellular fenotyping manifestation of radiation effects in the immune system of exposed individuals in a wide range of doses, including clean-workers of the Chernobyl accident. Examined and analyzed was the state of cellular immunity levels of the 265 clean-workers of the Chernobyl accident. Established was a significantly increased the number of CD34-positive cells in the peripheral blood of the clean-workers of the Chernobyl accident in the remote period after exposure. This is a response of the hematopoietic tissue to radiation exposure as a result of decreased function of immunological inspection.

Established were statistically significant (r = 0,52; p < 0,05) quantitative interrelation between the radiation-induced somatic mutagenesis on frequency of TCR-mutant lymphocytes and a dose of acute exposure from 1,1 Зв to 5,7 Зв and reliable statistically significant (p < 0,05) quantitative measure of dependence between quantity CD3⁺CD4⁺-lymphocytes and number of CD34-positive cells in the peripheral blood of the exposured persons in a range of doses from 0,31 мЗв to 214 мЗв and in a group of clean-workers of the Chernobyl accident (average dose 2,08 ± 0,53 Зв). These results demonstrate a potential associative communication of intensity of mutation process in blood cells with functional destabilization of hematopoietic stem-cell compartment and the total reaction of immune system to radiation, which may be a reflection of the mutation in other somatic cells in the context of time, through the disorder of immune regulation.

As a result of 8 years of immunological monitoring identified were the direction of immune changes and typological features of the state of cellular immunity at the clean-workers of the Chernobyl accident in remote period after acute exposure, the degree of expression of which depends on the characteristics of the radiation factor. The results of the work were formed to a model of the mechanism of implementation of cellular reactions on exposure to levels of blood stem cells, immune cells and their interaction and allowed to formulate the concept of methodological optimization control for the formation of late radiation effects in the immune system of accidental radiation exposure.

Keywords: ionizing radiation, Chernobyl, accumulative cellular model, immortalized hTERT-BJ1 cell line, hematopoietic stem cells, immune system, the remote period after exposure, CD34-positive cells, frequency of TCR-mutant lymphocytes.

Размещено на Allbest.ru