Фізіолого-біохімічні та генетичні основи біотехнології видів роду Gentiana L

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИ

УДК 58.085:582.923.1 + 577.127+575.22

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора біологічних наук

ФІЗІОЛОГО-БІОХІМІЧНІ ТА ГЕНЕТИЧНІ ОСНОВИ БІОТЕХНОЛОГІЇ РОСЛИН ВИДІВ РОДУ GENTIANA L.

03.00.20 - біотехнологія

ДРОБИК Надія Михайлівна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Тирлич (Gentiana L.) - найбільший рід родини Gentianaceae Juss., який охоплює близько 400 видів (Ho, Liu, 1990; Yuan et al., 1996). В Україні рід Gentiana представлений 10 видами: 8 багаторічними - G. acaulis L., G. аsсlepiadea L., G. cruciata L., G. laciniata Kit. ex Kanitz., G. lutea L., G. pneumonanthe L., G. punctata L., G. verna L., і 2 однорічними - G. nivalis L. та G. utriculosa L. (Определитель…, 1987; Загульський, Чорней, 2004; Шиян, Джус, 2005).

В Україні види роду Тирлич поширені здебільшого у високогірних районах Карпат. П'ять видів роду занесені до Червоної книги України: G. lutea, G. punctata належать до зникаючих видів, G. acaulis, G. laciniata, G. verna - до вразливих, які у майбутньому можуть бути віднесені до категорії зникаючих (Червона книга України, 1996).

Рослини цих видів знайшли широке застосування у світовій офіцинальній та народній медицині. Лікувальні властивості рослин зумовлені синтезом у їхній підземній та надземній частинах широкого спектра біологічно активних речовин (БАР) - іридоїдів, алкалоїдів, ксантонів, флавоноїдів, фенолкарбонових кислот тощо, дія яких на організм людини проявляється у регуляції діяльності травної, дихальної, видільної систем, поліпшенні обміну речовин в організмі тощо (Растительные ресурсы…, 1990; Лікарські рослини…, 1992; Грицик та ін., 2003).

Відомо, що екстракти G. lutea є основою імпортних лікарських препаратів "Афлубін", "Бальзам Маурера" (Австрія), "Шведська гіркота", "Синупрет", "Лімфоміозот", "Тонзилла композитум" (Німеччина),"Шлункові краплі" (Словенія), "Гемамеліс" (Швейцарія & Росія), які офіційно зареєстровані для використання в Україні. Тирлич жовтий (G. lutea) було включено до Державної фармакопеї СРСР I-IX видань, а тирлич крапчастий (G. punctata) - до Державної фармакопеї СРСР III-VII видань. У зв'язку з недостатньою сировинною базою та неможливістю заготівлі лікарської рослинної сировини G. lutea та G. punctata у подальші видання Державної фармакопеї не внесені. Інші поширені в Україні тирличі мають цінність для народної медицини.

Одним із основних способів забезпечення фармацевтичної промисловості рослинною сировиною є створення промислових плантацій. Однак, для тирличів, зокрема вище зазначених видів, такий підхід через біологічні особливості рослин є низькоефективним і економічно невигідним. Для цих видів характерними ознаками є: низька схожість насіння, пізній вступ у фазу цвітіння, вибагливість до умов зростання, повільний приріст біомаси - для отримання кореневища масою 100-200 г необхідно вирощувати рослини до 10-12 років, та ін.

Зважаючи на скорочення ареалів більшості видів роду Gentiana та широкий спектр фармакологічної активності їхніх БАР, для відновлення стабільності природних популяцій видів та поповнення сировинної бази, поряд із традиційними методами, доцільним є використання сучасних біотехнологічних методів і підходів.

Основними напрямами, за якими проводяться біотехнологічні дослідження лікарських рослин у світі, є:

- одержання продуктивних культур клітин, тканин, органів;

- регенерація рослин з культури клітин, тканин, протопластів;

- мікроклональне розмноження;

- генетична трансформація культивованих клітин;

- розробка технології кріозбереження.

Використання культури тканин як одного із найперспективніших методів для отримання альтернативної сировини стримується обмеженою кількістю ефективних розробок введення видів роду Gentiana в культуру in vitro, умов вирощування культивованих тканин у тривалій пересаджуваній культурі, відсутністю даних про синтез БАР in vitro. Поряд із цим відомо, що культивування клітин і тканин in vitro може супроводжуватися високим рівнем генетичних змін, які проявляються у зміні кількості та морфології хромосом, їхніх структурних перебудовах, диференціальній реплікації або елімінації різних послідовностей ДНК тощо. Високий рівень гетерогенності та мінливості клітинних популяцій in vitro може бути однією з причин значного зниження вмісту вторинних сполук або ж нестабільної продуктивності культур тканин у процесі тривалого вирощування, що описано для багатьох видів рослин.

З огляду на це, необхідним є не лише введення в культуру in vitro, але і всестороннє вивчення отриманих культур, включаючи дослідження їхніх фізіолого-біохімічних та генетичних особливостей. Особливо це стосується лікарських видів Gentiana, для декількох з яких проведено лише окремі фрагментарні дослідження (Польща, Югославія, Японія, Китай, Росія та ін.).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційну роботу виконано у лабораторії екології та біотехнології Тернопільського національного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка (ТНПУ), в рамках держбюджетних тем «Реґіональний екологічний моніторинг забруднення природних та урбанізованих екосистем важкими металами та дослідження їх цитотоксичної дії на рослини. Розробка біотехнологічних прийомів культивування цінних лікарських рослин» (№ держреєстрації 0194U004761, 1997-1999 рр.), „Використання методів біотехнології для збереження рідкісних, цінних лікарських видів рослин з метою їх наступної реінтродукції. Отримання в культурі in vitro високопродуктивних ліній-продуцентів фармакологічно активних речовин” (№ держреєстрації 0100U002411, 2000-2002 рр.), “Механізми регуляції вторинного метаболізму в культурах клітин лікарських рослин. Збереження лікарських та декоративних рослин” (№ держреєстрації 0203U000876, 2003-2005 рр.), «Дослідження фізіолого-біохімічних та генетичних особливостей культур тканин видів роду Gentiana L. флори України» (№ держреєстрації 0106U002383, 2006-2008 рр.), науково-технічного проекту “Отримання високопродуктивних штамів рідкісних, лікарських видів рослин з використанням біотехнологічних методів” (№ держреєстрації 32.1/0045728, 2004-2006 рр.) та у відділі генетики клітинних популяцій Інституту молекулярної біології та генетики (ІМБГ) НАН України за бюджетними темами «Дослідження структурно-функціональної мінливості геному в процесах диференціювання і дедиференціювання клітин вищих рослин в інтактному організмі та при культивуванні in vitro» (шифр теми 2.2.4.5, № держреєстрації 0101U000007, 2001-2005 рр.) і «Порівняльне вивчення геномної мінливості рослин в природі та в культурі in vitro» (шифр теми 2.2.4.5, № держреєстрації 0105U0053444, 2006-2010 рр.), а також у рамках наукової програми ДФФД Міністерства освіти і науки України, проект «Особливості геномної мінливості рідкісних лікарських рослин роду Тирлич (Gentiana L.) флори України в природі та в культурі in vitro» (шифр теми 25.5/009, № держреєстрації 0107U010340, 2007-2008 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було розробити наукові основи біотехнології in vitro рослин видів роду Gentiana флори України.

Для вирішення мети були поставлені такі завдання:

- вивчити схожість насіння тирличів in vitro та підібрати оптимальні умови отримання асептичних проростків як джерела вихідних експлантів для культури тканин і органів;

- розробити умови мікроклонального розмноження тирличів;

- індукувати дедиференціацію і калюсоутворення на різних типах експлантів in vitro;

- підібрати умови проліферації калюсів на різних субстратах та отримати тривало культивовані in vitro тканини;

- отримати культуру ізольованих коренів;

- дослідити біосинтетичну активність тирличів (вміст флавоноїдів і ксантонів) у культурі тканин і органів;

- з'ясувати особливості геномної мінливості/стабільності культури тканин тирличів на хромосомному та молекулярному рівнях.

Об'єкт дослідження - вирощування (культивування) in vitro рослин видів роду Gentiana флори України.

Предмет дослідження - особливості мікроклонального розмноження, калюсогенезу та органогенезу тирличів in vitro; фізіолого-біохімічні та генетичні особливості тирличів у природі та в культурі in vitro.

Методи дослідження: методи роботи з культурами рослинних тканин та органів, спектрофотометричні і хроматографічні методи, цитогенетичний аналіз, електрофорез ДНК в агарозному гелі, блот-гібридизація, RAPD-ПЛР, методи статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для видів роду Gentiana розроблено та науково обґрунтовано технології мікроклонального розмноження, одержання і тривалого підтримання культури тканин, культури ізольованих коренів тирличів на основі їхніх комплексних фізіолого-біохімічних та генетичних досліджень.

Вперше відпрацьовано умови мікроклонального розмноження видів роду Gentiana; підібрано умови індукції, проліферації та отримано тривало культивовані калюси тирличів, здатні до синтезу флавоноїдів і ксантонів. Вперше розроблено спосіб тривалого культивування калюсних тканин тирличів у рідкому живильному середовищі на поролонових підкладках, а також одержання і вирощування культури ізольованих коренів тирличів із високим індексом росту та здатністю накопичувати флавоноїди і ксантони.

Для оцінки придатності розроблених біотехнологій тирличів вперше використано комплексний підхід, що дозволив з'ясувати особливості мінливості геному Gentiana на хромосомному і молекулярно-генетичному рівнях у природі та культурі in vitro. Вперше проведено цитогенетичний аналіз культури тканин тирличів і встановлено відносну стабільність геному видів роду Gentiana у культурі in vitro та збереження культурами цитогенетичних особливостей вихідних видів. Вперше проведено молекулярно-генетичні дослідження культури in vitro та інтактних рослин тирличів з використанням блот-гібридизації і RAPD-методу, результати яких засвідчили відносно низький рівень мінливості в культурі in vitro тирличів, яка у всіх випадках не виходила за межі внутрішньовидової.

Встановлено, що на фоні низького рівня геномної мінливості культура тканин вивчених рослин у підібраних умовах вирощування in vitro здатна синтезувати вторинні метаболіти, вміст яких у багатьох випадках був близьким або перевищував такий в коренях інтактних рослин.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено технології прискореного розмноження деяких генотипів тирличів для подальшої їхньої реінтродукції, вирощування калюсних тканин на агаризованому та у рідкому живильних середовищах, культури коренів із високою продуктивністю, які можуть бути використані для збереження генофонду цих цінних зникаючих видів, а також для отримання альтернативного джерела сировини для фармацевтики.

Запропонований спосіб мікроклонального розмноження видів роду Gentiana дозволяє мультиплікувати з однієї рослини за рік до 20-100 тис. ідентичних рослин-регенерантів тирличів, що в перспективі може бути використано для відновлення чисельності природних популяцій тирличів.

Розроблені способи культивування калюсних тканин тирличів у рідких живильних середовищах на поролонових підкладках та двоетапного вирощування культури ізольованих коренів тирличів відкривають перспективи використання отриманих культур in vitro як джерела сировини для фармацевтики.

Підібрані склад живильних середовищ та умови вирощування, які забезпечують низький рівень геномних змін у культурах in vitro тирличів, створюють передумови їхнього використання для збереження генофонду цих рідкісних зникаючих видів.

Визначені числа хромосом і підібрані молекулярно-генетичні маркери можуть застосовуватися для ідентифікації видів роду Gentiana та паспортизації клітинних ліній і штамів.

Створено колекцію штамів і клітинних ліній культивованих тканин та органів, а також банк ДНК видів роду Gentiana флори України для подальшого використання у біотехнологічних, фізіолого-біохімічних, генетичних та інших дослідженнях.

Отримані результати можуть бути використані у науково-дослідницькій практиці для розробки методології отримання та вивчення культури тканин інших цінних лікарських рослин.

Теоретичні положення та практичні результати роботи використовуються при читанні навчальних курсів “Біотехнологія”, “Цитологія”, “Молекулярна біологія” та “Екологія рослин” у ТНПУ та інших ВНЗ. Результати досліджень були використані автором при підготовці навчальних посібників і методичних рекомендацій для студентів біологічних спеціальностей вищих навчальних закладів: «Цитологія» (2007 р., автори Шуст І., Грубінко В., Страшнюк (Дробик) Н.) «Лабораторний практикум з біотехнології» (2000 р., автори Страшнюк (Дробик) Н.М., Феник С.Й., Грубінко В.В.), «Методичні рекомендації для лабораторно-практичних занять з цитології (2000 р., автори Шуст І.В., Страшнюк Н.М.), «Лабораторний практикум із загальної екології» (2008 р., автори Страшнюк (Дробик) Н.М., Грицак Л.Р., Гуменюк Г.Б.) та інші.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, розроблено програму і методологію експериментальних досліджень, здійснено підбір та опрацювання літературних джерел. Основні положення і висновки дисертаційної роботи, сформульовані автором, обговорено разом з науковим консультантом, д.б.н., професором, чл.-кор. НАН України Кунахом В.А.

Автором особисто проведено основну частину експериментальних досліджень, що стосуються мікроклонування, отримання культури тканин і органів тирличів, а також дослідження їхніх фізіолого-біохімічних особливостей. Частину експериментів з одержання та підтримання культури тканин проведено спільно з працівниками лабораторії екології та біотехнології ТНПУ. Окремі результати біохімічних досліджень отримано з м.н.с. Леськовою О.М та к.х.н. Загричуком Г.Я. Результати цитогенетичного аналізу тирличів одержано разом з к.б.н. Твардовською М.О., к.б.н. Мельником В.М. та м.н.с. Адоніним В.І., молекулярно-біологічного аналізу - з к.б.н. Мельником В.М., к.б.н. Андрєєвим І.О., к.б.н. Спірідоновою К.В., к.б.н. Твардовською М.О., к.б.н. Бублик О.М. та асп. Конвалюк І.І. Результати досліджень опубліковано у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідалися і обговорювалися на таких конференціях: XVI Міжнародному ботанічному конгресі (Сент-Луіс, США, 1999); 12 Конгресі федерації Європейських товариств фізіологів рослин, FESPP (Будапешт, Угорщина, 2000); XXXII щорічній нараді Європейської Спільноти з нових методів у сільськогосподарських дослідженнях та Міжнародного Союзу радіоекологів, ESNA (Варшава, Польща, 2002); VIII Міжнародній конференції «Біологія рослинних клітин in vitro і біотехнологія» (Саратов, Росія, 2003); XXXІII щорічній нараді Європейської Спільноти з нових методів у сільськогосподарських дослідженнях, ESNA (Вітербо, Італія, 2003); Міжнародній науковій конфереції «Современные проблемы генетики» (Мінськ, Республіка Білорусь, 2005); засіданні Консорціуму регіонального співробітництва в галузі здоров'я, науки і технології (RECOOP HST) (Печ, Угорщина, 2007); ІХ Міжнародній конференції «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, Росія, 2008); Міжнародній науковій конференції «Значення та перспективи стаціонарних досліджень для збереження біорізноманіття» (Львів-Пожижевська, Україна, 2008); ІІ конференції молодих вчених Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ (Київ, Україна, 2008) та V Міжнародній науковій конференції «Геном рослин» (Одеса, Україна, 2008).

Публікації. Результати досліджень опубліковано в 28 наукових статтях у фахових виданнях, 3 патентах України та тезах 12 доповідей у збірниках матеріалів міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із: переліку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, експериментальної частини, яка включає три розділи, аналізу і узагальнення результатів, висновків та списку використаних джерел. Її обсяг складає 346 сторінок друкованого тексту, враховуючи 81 рисунок та 31 таблицю. Перелік цитованої літератури містить 380 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи досліджень.

Досліджено такі види роду Gentiana: тирлич жовтий (G. luteа), т. крапчастий (G. punctata), т. безстебловий (G. acaulis), т. ваточниковидний (G. asclepiadea), т. звичайний (G. pneumonanthe), т. хрещатий (G. cruciata), т. весняний (G. verna). У роботі використовували дикорослі рослини з різних місць зростання на території України, а також асептичні рослини, вирощені з насіння в стерильних умовах. Насіння стерилізували у розчині Н₂О₂ і пророщували на середовищі Мурасіге-Скуга (МС) (Murashige, Skooog, 1962). З метою підбору умов для мікроклонування використовували стеблові живці 2-3 місячних особин. Для індукції калюсоутворення використовували асептичні 1,5-2 місячні рослини, які ділили на експланти і висаджували на різні типи середовищ: MС, МС з половинним вмістом макро- та мікросолей (MС/2) та Гамбурга-Евелай (B₅) (Gamborg, Eveleigh, 1968), доповнені комбінаціями різних концентрацій 6-бензиламінопурину (БАП), кінетину (Кін), 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти (2,4-Д) та 1-нафтилоцтової кислоти (НОК). Культури вирощували в темряві при +25 - 26,5С, субкультивування проводили через кожні 4 тижні.

Для культивування калюсів тирличів, крім агаризованого, використовували рідке живильне середовище з поролоновими підкладками як підтримуючим субстратом. У колбу поміщали по 3-4 г калюсної тканини тирличів, яку вирощували без доступу світла при температурі +24 - 26^оС і відносній вологості повітря 70-80 %. Через кожні 30 діб культивування нарощений калюс зважували в асептичних умовах і визначали індекс росту (ІР) його сирої маси. Паралельно вирощували калюси тирличів на агаризованих середовищах відповідного складу і визначали ІР їхньої сирої маси. Калюси культивували без пересадки у підібраному раніше, оптимальному для проліферації рідкому живильному середовищі МС/2 чи B₅ (у випадку G. asclepiadea) протягом 90 діб. Для забезпечення росту культури потрібними поживними компонентами у колби через 30 та 60 діб доливали свіжі порції (по 5 мл) рідкого живильного середовища такого ж складу.

Отримання культури ізольованих коренів проводили у два етапи. Як вихідні експланти при цьому використовували інокулюми (апікальні відрізки) довжиною 1,0-1,5 см 2-х місячних рослин in vitro тирличів. На першому етапі інокулюми культивували у рідкому живильному середовищі MС/2 чи B₅, доповненому комбінаціями різних концентрацій фітогормонів БАП і НОК; Кін і НОК, протягом 2-3 тижнів. На другому етапі корені з утвореними бічними корінцями, отримані на першому етапі культивування, пересаджували у рідке живильне середовище MС/2 та B₅ без фітогормонів і вирощували протягом 2-3 тижнів до отримання біомаси культури ізольованих коренів тирличів.

Кількісне дослідження сумарного вмісту флавоноїдів у рослинах та культурі тканин і коренів тирличів проводили модифікованим нами спектрофотометричним методом (Селиванчикова и др., 2001). Як стандарт використовували рутин. Сумарний вміст ксантонів визначали за допомогою модифікованого нами хроматоспектрофотометричного методу (Николаева, 2000). Як стандарт використовували мангіферин.

Для цитологічного аналізу використовували корінці проростків довжиною 0,5 - 0,8 см, які з метою накопичення і синхронізації мітозів перед фіксацією витримували протягом 1 доби при температурі +3 - 4С або протягом 2-х годин в 0,1 %-му розчині колхіцину при кімнатній температурі. Калюсні тканини тирличів досліджували на 7-му добу росту (у період найвищої мітотичної активності). Зразки фіксували в суміші етанол : льодяна оцтова кислота у співвідношенні 3:1 протягом 1 доби. Зафіксований матеріал зберігали у 70 етанолі при кімнатній температурі. Зразки зафарбували 1 %-им ацетоорсеїном і виготовляли давлені препарати.

Матеріалом для виділення ДНК були листки дикорослих рослин, асептичні рослини, а також калюси тирличів на 20-25-ий день росту. У роботі за основу було взято метод виділення ДНК (Rogers, Bendich, 1985).

Для молекулярно-генетичного аналізу методом блот-гібридизації реакцію гідролізу ДНК ферментами рестрикції проводили в об'ємі 30 мкл згідно рекомендацій фірм-виробників («Fermentas», Литва; «СибЭнзим», Росія). Розділення фрагментів ДНК здійснювали в 1 % агарозі в 1ґ трис-ацетатному або 0,5ґ трис-боратному (ТВЕ) буферах (Маниатис и др., 1984). Електрофорез проводили при напрузі 2,5 В/см протягом 16-20 год. ДНК візуалізували бромистим етидієм і фотографували в ультрафіолетовому світлі. Як маркери молекулярних мас використовували ДНК фага , гідролізовану рестриктазами HindIII і PstI.

Як зонди для блот-гібридизації були використані такі послідовності ДНК: повний повтор 18S-25S рДНК гороху (плазмідна конструкція pHA1 (вставка по HindIII)) (Jorgensen et al., 1987) довжиною 8,8 т.п.н.; повний повтор 18S-25S рДНК пшениці (клон pТА71) (Gerlach, Bedbrook, 1979) довжиною 9 т.п.н.

Реакцію мічення проводили методом розсіяної затравки, використовуючи (-³²P)-dCTP (цитозин-трифосфат). Блот-гібридизацію проводили згідно стандартної процедури, рекомендованої фірмою «Amersham», США (1985). Для отримання радіоавтографів мембрану експонували з рентгенівською плівкою РП-1С (МПТВП “Оніко”, Україна). Експозицію проводили при -20°C.

При проведенні молекулярно-генетичного аналізу методом полімеразної ланцюгової реакції із праймерами довільної послідовності (RAPD-ПЛР) використано 27 праймерів. Реакційна суміш для ПЛР об'ємом 20 мкл містила: 20 нг ДНК, 0,2 мМ dNTP, 1,25 од. Taq-полімерази, 0,25 мкМ праймера, 1ЧПЛР-буфер з 1,5 мM MgCl₂. На реакційну суміш нашаровували 15 мкл мінеральної олії. ПЛР проводили за програмою: 94°С - 2 хв, 5 циклів (94°С - 30 с, t_гібр 37°С - 30 с, 72°С - 1 хв), 35 циклів (94°С - 20 с, t_гібр 37°С - 20 с, 72°С - 40 с), 72°С - 2 хв 30 с. Температура гібридизації (t_гібр) для праймерів А16 та А17 становила 38°С, для інших - 37°С. Реакцію з кожним праймером повторювали щонайменше двічі, враховували тільки відтворювані амплікони.

Продукти ампліфікації розділяли за допомогою горизонтального електрофорезу в 1,3 %-му агарозному гелі з додаванням 0,5 мкг/мл бромистого етидію, у 1ЧТВЕ буфері при напрузі поля 3 - 4 В/см. Для визначення розміру фрагментів користувалися ДНК-маркером "100 bp +1,5 Kb" («СибЭнзим», Росія). Для кількісної оцінки RAPD-поліморфізму електрофоретичні спектри ПЛР-продуктів записували у вигляді матриці бінарних ознак, у якій наявність або відсутність фрагментів у спектрі позначали як "1" або "0". На основі складених матриць за допомогою комп'ютерної програми POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) розраховували генетичні відстані за Неі, Лі (Nei, Li, 1979) і методом незваженої попарно-групової кластеризації (UPGMA) будували дендрограму взаємозв'язків між дослідженими об'єктами.

Результати досліджень та обговорення.

Культивування in vitro рослин видів роду Gentiana флори України.

Проростання насіння in vitro. У результаті проведених досліджень вивчено сезонну періодичність проростання насіння семи видів тирличів з 16-ти популяцій, його схожість та залежність проростання від різних чинників. Поряд із виявленими відмінностями, для всіх досліджених видів ми встановили спільні ознаки: використання як стерилента пероксиду водню (ефективність стерилізації в усіх випадках складала 98-100 %); порушення спокою насіння холодовою стратифікацією (низькими позитивними температурами +3-+4С) та обробкою гібереловою кислотою (ГК₃,); проростання насіння на світлі. Види відрізнялися між собою за оптимальною тривалістю холодової стратифікації, а також за концентрацією та часом обробки ГК₃, необхідними для успішного проростання насіння. Максимальна схожість в умовах in vitro для різних видів та представників виду з різних місць зростання припадала на різні місяці.

Вегетативне розмноження та ріст рослин в умовах in vitro. Підібрано умови для вегетативного розмноження і росту семи видів роду Gentiana. Ріст стеблових живців G. asclepiadea, G. punctata, G. cruciata G. pneumonanthe, G. verna з усіх досліджених популяцій та G. lutea з пожижевської, трояської, рогнєської та лемської популяцій краще відбувався на живильних середовищах МС/2, рН 5,7, доповнених низькими (0,1-0,3 мг/л) концентраціями Кін. Оптимальним із протестованих для росту in vitro рослин G. lutea з рівненської популяції було середовище МС/2 із збільшеним вдвічі вмістом СаCl₂ (МС/2_мод) та рН 5,5; G. acaulis з туркульської популяції - МС/2_мод та рН 5,7; реберської популяції - МС/2 зі стандартною концентрацією СаCl₂ та рН 5,5. Вкорінення тирличів проводили на зазначених вище середовищах, доповнених 0,1 мг/л НОК.

Мікроклонування in vitro. З'ясовано, що оптимальним для мультиплікації різних видів тирличів було середовище МС/2, доповнене різними співвідношеннями цитокінінів БАП (0,05-0,5 мг/л) та Кін (0,1-0,2 мг/л). Поряд із цим, для G. verna і G. lutea процес формування мікроклонів із стеблових живців рослин краще відбувався в рідкому середовищі МС/2, тоді як для видів G. acaulis, G. asclepiadea, G. cruciata, G. pneumonanthe та G. punctata - на агаризованому. Рослини з окремих популяцій G. lutea (рівненська) та G. acaulis (туркульська) для підвищення ефективності формування адвентивних пагонів потребували внесення у живильні середовища підвищених кількостей солей кальцію. У той же час, ефективність мікроклонування тирличів залежала від співвідношення концентрацій фітогормонів у середовищі, яке, у свою чергу, визначалося потребами конкретного виду та вихідного генотипу. Рослини G. lutea, G. acaulis, G. cruciata з різних популяцій відрізнялися за оптимальними співвідношеннями фітогормонів у живильному середовищі, необхідними для ефективного мікроклонування. Для рослин із різних популяцій G. asclepiadea, G. pneumonanthe та G. punctata таких відмінностей не виявлено. Відсоток живців з мікроклонами для більшості видів був у межах 70-90 %. Кількість утворених адвентивних пагонів на одному живці становила 2,62-7,35, була найбільшою у випадку G verna і найменшою - у G. acaulis і G. punctata. Отримані мікроклони вкорінено в умовах in vitro та перенесено в ґрунт.

Культура тканин тирличів. На середовищах різного складу (B₅, МС та МС/2, доповнених комбінаціями різних концентрацій ауксинів і цитокінінів) усі типи експлантів (стеблові, кореневі, листкові) формували калюс. Проте, інтенсивність калюсогенезу залежала від типу експланта та складу живильного середовища.

Нами підібрано умови індукції калюсу та його проліферації для семи видів тирличів та отримано тривало вирощувану на різних субстратах культуру тканин шести із вивчених семи видів тирличів, окрім G. verna.

Встановлено, що для індукції калюсоутворення з різних типів експлантів шести видів оптимальним із протестованих було живильне середовище MС/2, доповнене 0,1-0,2 мг/л БАП і 0,3-1 мг/л 2,4-Д. Винятком був G. asclepiadea, калюс якого отримували на середовищі В₅. У деяких випадках ефективність калюсоутворення з кореневих та стеблових експлантів досягала 100 %. Листкові експланти рослин досліджених видів (за винятком G. asclepiadea) характеризувалися найменшим значенням цього показника. Калюсогенна активність серед усіх досліджених видів була найнижчою у G. acaulis. Встановлено, що для проліферації калюсних культур п'яти досліджених видів оптимальним було середовище МС/2, для G. asclepiadea - B_5. У всіх випадках живильні середовища доповнювали фітогормонами БАП і 2,4-Д. Виявлено відмінності у концентраціях фітогормонів, необхідних для успішної проліферації калюсів від рослин різних видів, від рослин одного виду з різних місць зростання та калюсів різного походження. Тривалість пасажування для всіх калюсів становила 4 тижні.

Вирощування калюсних тканин на поролонових підкладках у рідкому живильному середовищі. Для здешевлення та спрощення процедури культивування нами підібрано умови для тривалого росту у рідкому живильному середовищі на поролонових підкладках калюсних культур кореневого походження G. lutea (трояська і рогнєська популяції), G. acaulis (туркульська популяція), G. punctata (брескульська популяція), G. asclepiadea (пожижевська популяція), G. cruciata (креничська і медоборська популяції), G. pneumonanthe (вигодська популяція). Виявлено, що адаптація культури тканин тирличів до росту у рідкому живильному середовищі на поролонових підкладках залежала від виду та генотипу вихідного експланта. Найбільший стимулюючий ефект вирощування у рідкому живильному середовищі на поролонових підкладках виявлено для калюсів G. punctata (брескульська популяція), G. asclepiadea (пожижевська популяція) - 170,1 % та 151,7 % відповідно.

Отримання та характеристика культури ізольованих коренів. Розроблено спосіб отримання культури коренів шести видів тирличів з 15 популяцій за допомогою двоетапного культивування in vitro. Через 4-6 тижнів вирощування ІР за сирою масою культури коренів, отриманої від рослин різних видів тирличів з різних популяцій, складав: для G. luteа - 298,5-926,5, G. punctata - 192,8-308,3, G. acaulis -324,0, G. pneumonanthe - 289,3-686,4, G. cruciata - 505,3-654,2, G. asclepiadea - 216,4-250,2.

Встановлено, що у вибірці досліджених культур найвищим вихід біомаси був у випадку G. lutea (трояська популяція), і становив 225 г на 1 л живильного середовища, що відповідає масі кореня 10-12-річної дикорослої рослини. тирлич мікроклональний розмноження геномний

Таким чином, нами досліджено особливості і відпрацьовано умови введення в культуру in vitro видів роду Gentiana флори України, їхнього мікроклонального розмноження; підібрано умови індукції, проліферації й отримано на різних субстратах культуру тканин та культуру коренів тирличів, здатні до інтенсивного тривалого росту і накопичення біомаси.

Вміст біологічно активних речовин в інтактних рослинах та в культурі тканин і органів тирличів.

Вміст флавоноїдів і ксантонів у культурі тканин за вирощування на агаризованих живильних середовищах

Лікувальні властивості тирличів обумовлені синтезом широкого спектра БАР, одними з основних груп яких є ксантони і флавоноїди. Саме за вмістом цих речовин ми оцінювали біосинтетичні особливості культур in vitro. Встановлено, що досліджені калюси здатні до тривалого росту та накопичення флавоноїдів і кcантонів. При цьому вихід сухої біомаси (вміст сухої маси у калюсі складав 5-9,6 % від сирої) через чотири тижні вирощування калюсних культур, отриманих від рослин різних видів і від рослин одного виду з різних місць зростання, відрізнявся і лежав у межах від 11,6 до 31,5 г/л. Калюсні культури досліджуваних видів, за винятком G. pneumonanthe, здатні синтезувати флавоноїди і ксантони.

Вміст флавоноїдів. Вміст флавоноїдів (у % на суху масу) у калюсах тирличів через чотири тижні їх вирощування лежав у межах від 0,12 до 1,31 %. У багатьох калюсних культурах (G. lutea з трояської, рогнеської та пожижевської популяцій; G. punctata з трояської популяції, G. acaulis з туркульської популяції, G. cruciata з медоборської популяції) показник вмісту флавоноїдів перевищував такий у коренях інтактних рослин. Калюсні тканини тирличів здатні накопичувати від 31 до 269 мг флавоноїдів у розрахунку на 1 л живильного середовища. Цей показник був найвищим (279 та 208 мг) у калюсах G. acaulis.

Вміст ксантонів. Вміст ксантонів (у % на суху масу) у калюсах тирличів через чотири тижні їх вирощування коливався від 0,03 до 0,98 %. У багатьох калюсних культурах (G. lutea з трояської та рогнеської популяцій, G. acaulis з туркульської популяції, G. asclepiadea з великомиглівської та пожижевської популяцій, G. cruciata з медоборської популяції) показник вмісту ксантонів перевищував такий у коренях інтактних рослин. Калюсні тканини тирличів здатні накопичувати від 11 до 249 мг ксантонів у розрахунку на 1 л живильного середовища. Цей показник був найвищим (249 та 235 мг) у калюсах G. lutea з рогнеської та трояської популяцій відповідно. У калюсах G. pneumonanthe, отриманих від рослин з обох досліджуваних популяцій, ксантонів не виявлено.

Динаміка приросту біомаси культури тканин G. acaulis і G. lutea та вмісту у них флавоноїдів і ксантонів. Відомо, що у багатьох культурах вторинні метаболіти накопичуються в значних кількостях лише при сповільненні або зупинці росту, хоча у деяких випадках синтез продукту сприяє росту клітин. Тому для одержання специфiчного продукту при перiодичному вирощуваннi культури тканин рослин необхiдно намагатись досягнути оптимальних умов як для приросту бiомаси, так i для накопичення вторинних метаболiтiв.

Для культур, що характеризувалися підвищеним вмістом флавоноїдів і ксантонів, нами проведено дослідження взаємозв'язку між динамікою приросту біомаси калюсів та накопиченням у них флавоноїдів і ксантонів.

Нами отримано високопродуктивну калюсну культуру кореневого походження G. acaulis (туркульська популяція), яка здатна до тривалого росту (протягом 6 років) в умовах in vitro. Вміст ксантонів і флавоноїдів у ній на 40 добу культивування був максимальним і перевищував аналогічні показники у коренях та надземних частинах інтактних рослин. Порівнюючи динаміку накопичення БАР у калюсній культурі із динамікою приросту калюсу, слід зазначити зворотну залежність: коли приріст біомаси зменшується - вміст БАР збільшується, що часто спостерігається в культурі тканин. Очевидно, в даному випадку на 40 добу культивування ріст калюсної культури G. acaulis сповільнюється, а весь потенціал спрямовується на синтез вторинних метаболітів.

Аналогічні дослідження ми провели із калюсною культурою G. lutea. З'ясування динаміки приросту дворічного калюсу G. lutea (трояська популяція) та накопичення в ньому флавоноїдів і ксантонів, також показало зворотну залежність між цими показникам.

Індекс росту за сухою масою калюсу був найвищим на 20 добу культивування, тоді як показники вмісту флавоноїдів і кcантонів досягали максимуму на 35 добу - 2,34 % та 1,64 % відповідно. У той же час на даному етапі вирощування приріст сухої маси калюсу був мінімальним. Порівняння отриманих результатів вмісту БАР у калюсі та інтактних рослинах G. lutea показало, що вміст флавоноїдів і ксантонів у культурі in vitro перевищував такий у коренях інтактних рослин G. lutea в 5 та в 3,6 раза відповідно.

Порівняння вмісту флавоноїдів і ксантонів на 15-ому та 33-ому пасажах у калюсі G. acaulis, а також на 13-ому і 26-ому пасажах у калюсі G. lutea показали, що кількість цих вторинних метаболітів змінюється несуттєво, тобто в процесі тривалого культивування продуктивність залишається відносно стабільною.

Вміст БАР у калюсних культурах за вирощування у рідкому живильному середовищі на поролонових підкладках. Проведені дослідження показали здатність калюсів тирличів, що вирощувалися у рідких живильних середовищах на поролонових субстратах, до синтезу флавоноїдів і ксантонів. Вміст цих БАР у культурі тканин, які вирощувалися у рідких живильних середовищах, перевищував (G. punctata, брескульська популяція, G. asclepiadea, пожижевська популяція, G. cruciata, креничська популяція та G. lutea, рогнєська популяція), був близьким (G. acaulis, туркульська популяція) або нижчим (G. cruciata, медоборська популяція, G. lutea, трояська популяція) порівняно з такими показниками у відповідних калюсах на агаризованих субстратах. У калюсі G. pneumonanthe (вигодська популяція) при культивуванні як на агаризованому, так і у рідкому на поролонових підкладках середовищі, флавоноїдів і ксантонів не виявлено. Їхній вміст у більшості калюсних культур, що зростали як на агаризованому, так і на поролоновому субстратах, був більшим або близьким до такого в коренях дикорослих рослин, але нижчим порівняно з пагонами.

Для культур тканин тирличів: G. punctata (брескульська популяція), G. asclepiadea (пожижевська популяція), G. cruciata (креничська популяція), G. lutea (рогнєська популяція), вирощування у рідкому живильному середовищі на поролонових підкладках дозволяє підвищити як приріст біомаси калюсу (в 1,3-1,7 раза), так і вміст у ньому флавоноїдів (в 1,2-1,6 раза) і ксантонів (в 1,2-2,3 раза), порівняно з тими ж культурами на агаризованих середовищах. Для калюсів G. cruciata (медоборська популяція) та G. lutea (трояська популяція) на рідких з поролоновими підкладками середовищах як ІР за сирою масою, так і вміст вторинних метаболітів, нижчі порівняно з культурами з агаризованого середовища. Ріст калюсу G. acaulis (туркульська популяція) на середовищі з поролоновими підкладками відбувається інтенсивніше, ніж на агаризованому, однак вміст БАР при цьому дещо менший.

Вміст флавоноїдів і ксантонів у культурі ізольованих коренів. Отримані нами культури ізольованих коренів G. lutea, G. punctata та G. acaulis, G. asclepiadea, G. сruciata здатні синтезувати флавоноїди і ксантони. Вміст цих вторинних метаболітів у всіх морфогенних культурах був вищим або близьким до аналогічних показників у відповідних калюсних тканинах. У культурі коренів кількість флавоноїдів (окрім, G. cruciata, креничська популяція) та ксантонів (окрім, G. cruciata, креничська популяція та G. punctata, брескульська і трояська популяції) була більшою або практично такою ж, як у коренях інтактних рослин.

Високі значення ІР культури ізольованих коренів тирличів, великий вихід біомаси та її здатність накопичувати флавоноїди і ксантони є тими передумовами, що дозволяють припускати можливість використання її як перспективного джерела сировини БАР.

Отже, культури тканин та ізольованих коренів тирличів здатні до синтезу вторинних метаболітів, вміст яких у більшості випадків був вищим або близьким до такого у коренях рослин природних популяцій. Поряд із цим, відомо, що у багатьох випадках використання культури тканин рослин стримується високим рівнем генетичних змін, наслідком яких може бути втрата здатності до біосинтезу речовин вторинного метаболізму за тривалого вирощування культур. Тому наступним завданням роботи була комплексна оцінка геномної мінливості культури in vitro тирличів з використанням цито- та молекулярно-генетичних методів.

Геномна мінливість у культурі тканин та в інтактних рослинах.

Цитогенетичні дослідження видів роду Gentiana

Аналіз кількості хромосом в інтактних рослинах. У літературі наводяться різні числа хромосом для видів роду Gentiana з багатьох гірських масивів та рівнинних територій Європи, Азії, Америки та Африки. Цитогенетичні дослідження тирличів з території України до цього часу не проводилися. Одним із завдань нашої роботи було встановлення хромосомних чисел для рослин видів роду Gentiana з різних популяцій в Україні.

Цитогенетичний аналіз корінців рослин тирличів показав, що диплоїдний набір для представників виду з різних популяцій не відрізнявся і становив: для G. lutea та G. punctata - 2n=40, G. acaulis та G. аsclepiadea - 2n=36, G. cruciata - 2n=52, G. pneumonanthe - 2n=26 і для G. verna - 2n=28. Визначені нами хромосомні числа підтверджують дані, наведені іншими дослідниками для цих видів, і свідчать про їхню каріотипову консервативність.

Отримане нами для G. asclepiadea хромосомне число 2n=36 збігається із встановленим диплоїдним набором для однієї із цитологічних рас цього виду.

Деякі з досліджених корінців проростків G. cruciata (заповідник “Медобори”) виявились міксоплоїдними - поряд із диплоїдними клітинами (2n=52), знайдено кілька клітин з 26 та 36 хромосомами. Міксоплоїдія для видів роду Gentiana до цього часу не була описана.

Хромосомна мінливість у культурі тканин. Проведений цитогенетичний аналіз культури тканин показав, що кількість хромосом у метафазах варіює як між калюсами, отриманими від рослин різних видів, від рослин одного й того ж виду з різних популяцій, так і в межах однієї калюсної культури. Спостерігали широкий розмах мінливості числа хромосом, який для різних видів був різним.

Ступінь прояву міксоплоїдності клітинних популяцій залежав від видової приналежності рослин. Найбільший розмах мінливості числа хромосом характерний для культури тканин G. punctata. Дещо меншим він був у калюсах G. lutea, G. acaulis, G. cruciata, G. asclepiadea та G. pneumonanthe. Найменшу варіабельність кількості хромосом у клітинах мала культура тканин G. verna. Модальним класом у всіх досліджених калюсах (за винятком G. punctata (г. Брескул)) були диплоїдні та гіподиплоїдні клітини.

Досліджені клітинні популяції характеризувалися наявністю значної кількості анеуплоїдних клітин. Найвищий рівень анеуплоїдії було виявлено в культурі тканин G. lutea, G. cruciata та G. asclepiadea (г. Велика Мигла). Найменшою кількістю анеуплоїдних клітин характеризувалися калюси G. punctata (г. Брескул) та G. pneumonanthe (Корюківське лісництво).

Генетична варіабельність клітинних популяцій тирличів залежала і від генотипів вихідних рослин. Різна популяційна приналежність останніх є, очевидно, причиною різного рівня змін числа хромосом в однакових за тривалістю та умовами вирощування культурах. Найбільше за кількістю поліплоїдних та анеуплоїдних клітин відрізнялися калюси G. punctata і G. asclepiadea, отримані від рослин з різних популяцій.

Результати анафазного аналізу, отримані паралельно з підрахунком кількості хромосом у метафазах, показали порівняно невисокий для культивованих клітин (до 10 %) рівень мутацій. Найвищою частка хромосомних аберацій була у калюсах G. punctata (г. Брескул - 10 % і г. Трояска - 8,3 %) та G. acaulis (г. Ребра) - 8 %. 90 % усіх аберацій складали мости без фрагментів (серед них - більше 2/3 одиночні мости).

Перевага у досліджених калюсах тирличів (за винятком G. punctata) клітин з диплоїдними і/або білядиплоїдними наборами хромосом та низький рівень або відсутність анафазних аберацій свідчить про відносну стабільність геному видів роду Gentiana. Поряд із цим, для всіх культур тканин тирличів встановлено видову специфічність мінливості геномів та залежність характеру цитогенетичної варіабельності від популяційної приналежності вихідних рослин.

Вплив тривалості вирощування на хромосомну мінливість у культурі тканин G. acaulis. Проведені цитогенетичні дослідження культури тканин G. acaulis різної тривалості вирощування показали значний розмах мінливості за числом хромосом як на 11-му, так і на 71-му пасажах - 16-107 та 18-110 хромосом відповідно. Спектр плоїдності клітин у дослідженому калюсі варіював від n до 6n.

Встановлено, що в 11-му пасажі (однорічна культура тканин) модальним класом були клітини з диплоїдним та білядиплоїдним наборами хромосом, а в 71-му (шестирічна культура) - клітини з триплоїдним та білятриплоїдним наборами хромосом. Цитогенетичний аналіз калюсу G. acaulis показав, що із збільшенням тривалості культивування зростає відсоток поліплоїдних клітин та структурних перебудов хромосом. Серед анафазних аберацій хромосом, рівень яких був у межах 2-15 %, переважали одиночні мости без фрагментів.

Цікавою особливістю культури тканин G. acaulis було те, що високий відсоток анеуплоїдних клітин спостерігали вже в 11-му пасажі, і цей показник залишався практично незмінним у процесі тривалого вирощування до 71-го пасажу.

Молекулярно-генетичні дослідження тирличів

Варіабельність 18S-25S рДНК у природі та в культурі in vitro

Порівняння мінливості в культурі тканин з міжвидовою варіабельністю G. lutea, G. punctata, G. acaulis та G. asclepiadea. Проведені раніше за допомогою рестрикційного аналізу дослідження показали, що в культурі тканин G. lutea і G. punctata відбуваються зміни геному на рівні послідовностей ДНК, що виявляються за спектром рестрикційних фрагментів (Мельник та ін., 2002). Однак, залишилося нез'ясованим, яка функціональна роль у геномі тих ділянок ДНК, які зазнають змін. Щоб наблизитись до розуміння характеру геномних перебудов, які спостерігаються при культивуванні в умовах in vitro, було досліджено гени 18S-25S рРНК культивованих тканин G. acaulis, G. lutea і G. punctata та проведено їхнє порівняння з рДНК дикорослих рослин цих видів.

Отримані результати свідчать про відсутність у калюсних культурах G. punctata і G. acaulis якісних змін наборів HindIII, BamHI, EcoRI i TaqI рестрикційних фрагментів 18S-25S рДНК порівняно з інтактними рослинами. На гібридизаційних профілях калюсних культур G. punctata і G. acaulis наявні фрагменти 18S-25S рДНК, ідентичні за довжиною таким у геномах рослин вихідних видів. Поряд із цим, у геномі тривало культивованих in vitro клітин G. lutea знайдено суттєві структурні перебудови генів 18S-25S рРНК.