Фізіолого-біохімічні та генетичні основи біотехнології видів роду Gentiana L

Ключові слова: види Gentiana L., мікроклональне розмноження, культура тканин, культура ізольованих коренів, флавоноїди, ксантони, цитогенетичний аналіз, блот-гібридизація, RAPD-ПЛР, геномна мінливість.

АННОТАЦИЯ

Дробык Н.М. Физиолого-биохимические и генетические основы биотехнологии видов рода Gentiana L. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

Впервые для видов рода Gentiana L. флоры Украины разработаны и теоретически обоснованы технологии микроклонального размножения, получения культуры тканей и органов этих растений на основе комплексных физиолого-биохимических и генетических исследований.

Изучена периодичность прорастания семян горечавок в условиях in vitro, их всхожесть и зависимость этих процессов от различных факторов. Получены жизнеспособные морфологически нормальные проростки семи видов рода Gentiana. Разработаны условия микроклонального размножения горечавок и получены их жизнеспособные адвентивные побеги. Оптимальной для мультипликации являлась среда МС с уменьшенным вдвое содержанием макро- и микросолей (МС/2), дополненная разными соотношениями цитокининов БАП (0,05-0,5 мг/л) и Кин (0,1-0,2 мг/л). Процент черенков с микроклонами для большинства видов лежал в пределах 70-90 %, показатель количества сформированных адвентивных побегов на одном черенке составлял 2,62-7,35. Розработанный способ микроклонального размножения позволяет мультиплицировать с одного растения за год от 20 до 100 тыс. идентичных растений.

Подобраны условия индукции, пролиферации и получены длительно культивируемые каллусы горечавок, способные к синтезу флавоноидов и ксантонов. Установлено, что для их роста оптимальным является дополненная фитогормонами БАП (0,1-02 мг/л) и 2,4-Д (0,3-1 мг/л) питательная среда МС/2, а для G. asclepiadea - B₅. Разработан способ длительного культивирования каллусных тканей горечавок в жидкой питательной среде на поролоновых подкладках, а также метод получения и выращивания культуры изолированных корней горечавок с высоким индексом роста и способностью накапливать флавоноиды и ксантоны.

Впервые использован комплексный подход к исследованию особенностей изменчивости генома Gentiana на цитологическом и молекулярном уровнях в природе и культуре in vitro.

Установлены хромосомные числа для 7 видов рода Gentiana. В частности, для G. lutea (2n=40), G. punctata (2n=40), G. acaulis (2n=36), G. asclepiadea (2n=36), G. pneumonanthe (2n=26), G. cruciata (2n=52), G. verna (2n=28). Для G. asclepiadea выявленное хромосомное число 2n=36 совпадает с установленным диплоидным набором одной из цитологических рас этого вида.

Культура тканей горечавок характеризовалась цитогенетической вариабельностью, проявляющейся в миксоплоидности клеточных популяций. Степень ее проявления зависела от видовой принадлежности, генотипа исходных растений и длительности культивирования. Наибольший размах изменчивости числа хромосом характерный для культуры тканей G. punctata. Несколько меньший он был в каллусах G. lutea, G. acaulis, G. cruciata, G. asclepiadea та G. pneumonanthe. Наименьшую вариабельность количества хромосом в клетках проявила культура тканей G. verna. В исследованных каллусах горечавок (за исключением G. punctata) преобладали клетки с диплоидным и/или околодиплоидным наборами. Результаты анафазного анализа культивируемых клеток показали сравнительно невысокий (до 10 %) уровень хромосомных аббераций.

С помощью блот-гибридизации на примере 18S-25S рДНК показано, что геномы растений видов рода Gentiana (G. acaulis, G. lutea, G. punctata) при культивировании в условиях in vitro подвергаются незначительным изменениям на молекулярно-генетическом уровне.

Установлено наличие индивидуальной и межпопуляционной вариабельности 18S-25S рДНК для вида G. lutea. Изменения генов рРНК в условиях изолированного роста клеток G. lutea на искусственных питательных средах не выходят за рамки внутривидовой изменчивости.

RAPD-анализ видов рода Gentiana дал возможность дифференцировать на молекулярном уровне горечавки флоры Украины и установить генетические взаимосвязи между ними. Полученные результаты свидетельствуют об отдаленности таксонов рода Gentiana, межвидовой полиморфизм в пределах которого составляла 0,54. Выявлены уникальные ампликоны, которые могут использоваться для видовой идентификации генотипов Gentiana. Результаты RAPD-анализа в целом согласуются с существующими классификациями и исследованиями других авторов.

Сравнение результатов RAPD-анализа G. acaulis, G. cruciata, G. punctata показало, что они характеризуются разным уровнем изменчивости как в природе, так и в культуре in vitro. Уровень внутривидовой изменчивости уменьшался в направлении G. acaulis > G. punctata > G. cruciata. Кластеризация объектов на дендрограммах отвечала их популяционной принадлежности, что свидетельствует об относительной генетической изоляции образцов с изученных локалитетов.

Результаты цитогенетического и молекулярно-генетических анализов свидетельствуют о сравнительно низком уровне изменчивости генома горечавок в культуре in vitro, не выходящей во всех случаях за пределы внутривидовой.

Установлено, что на фоне низкого уровня геномной изменчивости культура тканей этих растений в подобранных условиях выращивания in vitro способна синтезировать вторичные метаболиты, содержание которых во многих случаях было близким или превышало такое в корнях интактных растений.

Ключевые слова: виды Gentiana L., микроклональное размножение, культура тканей, культура изолированных корней, флавоноиды, ксантоны, цитогенетический анализ, блот-гибридизация, RAPD-ПЦР, геномная изменчивость.

ABSTRACT

Drobyk N.M. Physiological, biochemical and genetic bases of some Gentiana species biotechnology: - Manuscript.

Thesis for Doctor of Science degree by speciality 03.00.20 - biotechnology. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2009.

Technology of cultivation in vitro of Gentiana L. species from Ukrainian flora based on complex physiological, biochemical and genetic experiments was developed and substantiated.

Conditions for microclonal propagation of Gentiana species were worked out and viable adventitious shoots from stem cuttings of these species plants have been induced. Conditions for callus induction and proliferation were specified; long-term cultures of Gentiana calli capable to synthesize flavonoids and xanthones have been obtained. The procedure for a long-term cultivation of Gentiana callus in a liquid medium on foam-rubber substrate as well as technique for formation and maintenance of isolated Gentiana root cultures were developed. Cytogenetic study, blot-hybridization and RAPD technique were applied in the research of Gentiana callus cultures and intact plants; relative stability of their genome in in vitro conditions was established. Low level of cytogenetic and molecular-genetic variations in tissue culture of these plants in specified conditions of maintenance in vitro was found. Calli in vitro retained the ability to synthesize the secondary metabolites, the amount of which was comparable or exceeded that one in the roots of intact plants.

Key words: Gentiana L. species, microclonal propagation, tissue culture, culture of isolated roots, flavonoids, xanthones, cytogenetic analysis, blot-hybridization, RAPD-PCR, genome variability.

Размещено на Allbest.ru