Размещено на http://www.allbest.ru/

ВВЕДЕНИЕ

Одна из важнейших задач нанотехнологии - задача освоения самосборки и саморазборки молекулярных структур. Без понимания механизма самосборки невозможно получение уникальных материалов и построения сверхминиатюрных платформ, например, в микромеханике.

Логика самосборки относится к числу малоисследованных явлений природы. Средством управления процессом самосборки могут выступать потоковые формальные системы. К моделям самосборки предъявляются требования отсутствия центрального управляющего звена и распределения механизма детерминации процесса между всеми его участниками.

Само явление самосборки и самоорганизации является распространенным, и имеются его многочисленные экспериментальные подтверждения. Одними из самых впечатляющих и сложных являются примеры самосборки биологических вирусов и цитоскелета.

Вирусная частица состоит из ДНК или РНК и белковой оболочки, называемой капсидом. Зрелая вирусная частица может формироваться из тысяч белков с участием белков-катализаторов и белков, участвующих только в промежуточных стадиях сборки. При этом белки могут вначале собираться в субъединицы, затем из субъединиц формируются отдельные крупные компоненты вирусной частицы, из которых собирается итоговая структура.

Освоение механизма самосборки вирусов может быть использовано на практике. Например, известны вирусы, имеющие форму трубки. Существует способ полностью или частично покрыть их поверхность металлом (платиной). Металлизированные нанотрубки могут быть использованы в электронике, а металлизированный вирус табачной мозаики, несущий в себе искусственно созданную лечебную РНК, может быть доставлен непременно в очаг заболевания, тем самым избегая интоксикации всего организма. Знание механизма самосборки позволило бы варьировать длину трубок и другие параметры.

Вместе с тем, большинство существующих моделей описывают физико-химическую природу отдельных взаимодействий, и являются очень специализированными. Из более общих моделей следует отметить логические модели на основе теории клеточных автоматов и фрактальные модели.

Алгоритмика самосборки -- набор инструкций, описывающих порядок действий исполнителя для достижения результата решения задачи за конечное число действий, однако под исполнителем стоит понимать не демона-сборщика, а сам объект сборки, в практически неизменном виде это компоненты (элементы) исходной структуры, аддитивно составляющие или «собирающие», как части целого, результирующую сложную структуру.

Самосборка относится к типичным методам получения наноструктур (наноматериалов) «снизу-вверх». Основная задача, которая стоит при ее реализации -- это необходимость таким образом повлиять на параметры системы и так задать свойства отдельных частиц, чтобы они организовывались с образованием желаемой структуры. Самосборка находится в основе многих процессов супрамолекулярной химии, где «инструкции», как собирать большие объекты, «закодированы» в структурных особенностях отдельных молекул.



ОСНОВНЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ПОНЯТИЯ

ТРЕБОВАНИЯ К МОДЕЛИ

Одним из требований, предъявляемых к данной модели, является отсутствие «демона-сборщика», способного производить сборку на молекулярном уровне, по некоторому заранее записанному сценарию. Так в основном функционируют существующие программно-управляемые модели. В нашем случае итоговые структуры должны формироваться в результате выполнения локальных актов взаимодействия простейших элементов, составляющих основу выращиваемой структуры. Управляющее центральное звено должно отсутствовать, а механизмы детерминации процесса должны быть распределены по всем участникам процесса.

Фон Нейман в работе «Теория самовоспроизводящихся автоматов» предложил при исследовании феномена самосборки разделить два аспекта - логический и кинематический. Это позволяет на начальном этапе исследования абстрагироваться от сложностей физико-химической природы исследуемых объектов и сосредоточиться только на логике взаимодействия неких условных компонентов процесса. И только после достижения понимания логических взаимосвязей можно продвигаться к их физической интерпретации. Мы принимаем этот метод и ограничиваемся на данном этапе исследованием логики самосборки.

АРХИТЕКТУРА САМООПРЕДЕЛЯЕМЫХ ДАННЫХ

Концепция самоопределяемых данных выступает в качестве ключевого принципа построения архитектуры вычислительных средств с рекуррентными внутренними языками. Суть концепции заключается в том, что существует только один поток - поток данных, сопровождаемых некоторыми функциональными полями. Элементарной лексической единицей вычислительной системы выступает операнд, состоящий из нескольких полей. Непосредственная запись операнда сопровождается полем управления селекцией пар операндов, полем кода операции и полем управления транспортом.

Операнд является самодвижущейся, активной компонентой вычислительного процесса. Кодовые состояния полей операнда обусловливают его поведение. Направления перемещения операндов определяются кодами управления транспортом. Выбор пар операндов для выполнения бинарных операций над ними управляется кодами селекции. Арифметические и логические операции закодированы в поле кода операции.

Рассмотрим функциональную схему операционного устройства. Схема состоит из набора однотипных арифметико-логических устройств АЛУ, набора запоминающих элементов и ортогонального поля селекции, объединяющего все компоненты схемы. Операнды могут быть записаны в запоминающие устройства двух типов - горизонтальный ряд магазинных запоминающих устройств (МЗУ) и вертикальный ряд ассоциативных запоминающих устройств (АЗУ). Операнды, расположенные в голове магазинных ЗУ по вертикальным шинам непосредственно подаются на первые входы АЛУ и одновременно через логические узлы поля селекции подбирают партнёров для выполнения бинарных операций. Для этого коды полей селекции с вертикальных шин через логические узлы подаются в АЗУ по горизонтальным шинам и исполняют роль опросных ключей. Выбор пар операндов осуществляется при совпадении кодов полей селекции. Отклик найденного в АЗУ операнда означает его выборку на горизонтальную шину. Затем логический узел селектора коммутирует горизонтальную и вертикальную шины, и найденный операнд подаётся на второй вход АЛУ.

Все АЛУ состоят из двух секций - в одной секции выполняются бинарные операции над операндами, вторая секция служит для преобразования функциональных полей. Текущий шаг обработки определяется наличием операндов и значениями кодов их функциональных полей. По кодам селекции отбираются пары операндов на входах АЛУ, по кодам операции настраиваются секции АЛУ, предназначенные для выполнения бинарных операций. В результате выполнения шага обработки на выходах АЛУ возникает новое поколение операндов с новыми состояниями функциональных полей, которые предопределяют следующий шаг обработки. На выходах АЛУ стоят коммутаторы, которые обрабатывают коды полей управления транспортом. Коммутатор может направить операнд на выход из операционного устройства, на вход ассоциативного ЗУ или на вход магазинного ЗУ.

На входах МЗУ вновь декодируется поле управления транспортом, на основе чего принимается решение о записи операнда в хвост или в голову. При программировании процессов необходимо следить за тем, что бы операнды с совпадающими кодами полей селекции не попадали в один тип ЗУ. Операнды с совпадающими кодами селекции отберутся в пары только при условии, что они расположены в разных типах ЗУ. Работа магазинных ЗУ организуется таким образом, что операнд, находящийся в голове и не нашедший партнёра перемещается в хвост. Ротация операндов в МЗУ предотвращает зависание процесса, а возможность записи в хвост или в голову может способствовать ускорению вычислений.

Рассмотрим предварительно, в самых общих чертах поведение рекуррентной кодовой последовательности. Например, возьмем только один тег _ поле управления селекцией. Все теговые поля преобразуются независимо своими функциональными преобразователями, и поведение каждого преобразователя может быть рассмотрено независимо от других. Значение тега заносится во входной регистр, над которым задан функциональный дискретный преобразователь F2. Результат преобразования фиксируется в выходном регистре. В целом такая конструкция характеризуется конечным множеством кодовых состояний N и отображением N N, заданным целочисленной, всюду определенной функцией F2. При этом размерность N равна 2^k, где k разрядность тега. Если мы рассматриваем теги малой разрядности, отображение N N удобно изобразить в виде ориентированного графа кодовых переходов G. Граф G строится таким образом, что его вершинами являются кодовые состояния тега T_j, а дуги определены как пары T₁ T₂, где T₂ = F(T₁). При многократной подаче результатов преобразования на вход преобразователя, динамика развития рекуррентных кодовых последовательностей представляет собой пути на ориентированном графе G.

В описанной ситуации существует определённое разнообразие структур графов кодовых переходов, ограниченное свойствами отображения N N. Коды тегов T_j могут иметь только однократное вхождение в граф, а также каждая вершина графа всегда имеет одну и только одну исходящую дугу. Бинарное дерево полностью соответствует перечисленным ограничениям и может быть графом кодовых переходов для функционального дискретного преобразователя на базе некой функции F.

Самоопределяемые данные функционируют как динамическая система, в которой текущее состояние данных и их функциональных полей определяет шаг обработки. В результате выполнения шага обработки появляется новое поколение данных с новыми значениями функциональных полей, которые предопределяют следующий шаг обработки. В системе развиваются два взаимодействующих процесса преобразования данных и преобразования их функциональных полей. Текущее состояние функциональных полей определяется не заранее зафиксированной последовательностью инструкций, а порождается на каждом шаге обработки как функция от предыдущего состояния.

общие сведения о вирусах

Вирус _ микроскопическая частица, способная инфицировать клетки живых организмов. Вирусы являются облигатными паразитами -- они не способны размножаться вне клетки. В настоящее время известны вирусы, размножающиеся в клетках растений, животных, грибов и бактерий (последних обычно называют бактериофагами). Вирусы представляют собой молекулы нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), заключённые в защитную белковую оболочку (капсид). Вирусы содержат только один тип нуклеиновой кислоты: либо ДНК, либо РНК.

Вирусные частицы (вирионы) представляют собой белковую капсулу _ капсид, содержащую геном вируса, представленный одной или несколькими молекулами ДНК или РНК. Капсид построен из капсомеров _ белковых комплексов. Нуклеиновая кислота в комплексе с белками обозначается термином нуклеокапсид. Некоторые вирусы имеют также внешнюю липидную оболочку. Размеры различных вирусов колеблются от 20 (пикорнавирусы) до 500 (мимивирусы) и более нанометров. Вирионы часто имеют правильную геометрическую форму (икосаэдр, цилиндр). Такая структура капсида предусматривает идентичность связей между составляющими её белками, и, следовательно, может быть построена из стандартных белков одного или нескольких видов, что позволяет вирусу экономить место в геноме.

Условно процесс вирусного инфицирования в масштабах одной клетки можно разбить на несколько взаимоперекрывающихся этапов:

· Присоединение к клеточной мембране _ так называемая адсорбция. Обычно для того, чтобы вирион адсорбировался на поверхности клетки, она должна иметь в составе своей плазматической мембраны белок _ рецептор, специфичный для данного вируса. Наличие рецептора нередко определяет круг хозяев данного вируса, а также его тканеспецифичность.

· Проникновение в клетку. На следующем этапе вирусу необходимо доставить внутрь клетки свою генетическую информацию. Некоторые вирусы привносят также собственные белки, необходимые для её реализации. Различные вирусы для проникновения в клетку используют разные стратегии. Вирусы также различаются по локализации их репликации, часть вирусов (например, те же пикорнавирусы) размножается в цитоплазме клетки, а часть _ в её ядре.

· Перепрограммирование клетки. При заражении вирусом в клетке активируются специальные механизмы противовирусной защиты. Заражённые клетки начинают синтезировать сигнальные молекулы _ интерфероны, переводящие окружающие здоровые клетки в противовирусное состояние и активирующие системы иммунитета. Повреждения, вызываемые размножением вируса в клетке, могут быть обнаружены системами внутреннего клеточного контроля, и такая клетка должна будет «покончить жизнь самоубийством» в ходе процесса, называемого апоптозом или программируемой клеточной смерти. От способности вируса преодолевать системы противовирусной защиты напрямую зависит его выживание. Кроме подавления противовирусной защиты, вирусы стремятся создать в клетке максимально благоприятные условия для развития своего потомства.

· Персистенция. Некоторые вирусы могут переходить в латентное состояние, слабо вмешиваясь в процессы, происходящие в клетке, и активироваться лишь при определённых условиях. Так построена, например, стратегия размножения некоторых бактериофагов _ до тех пор, пока заражённая клетка находится в благоприятной среде, фаг не убивает её, наследуется дочерними клетками и нередко интегрируется в клеточный геном. Однако при попадании заражённой лизогенным фагом бактерии в неблагоприятную среду, возбудитель захватывает контроль над клеточными процессами так, что клетка начинает производить материалы, из которых строятся новые фаги. Клетка превращается в фабрику, способную производить многие тысячи фагов. Зрелые частицы, выходя из клетки, разрывают клеточную мембрану, тем самым убивая клетку.

· Создание новых вирусных компонентов. Размножение вирусов в самом общем случае предусматривает три процесса.

1) транскрипция вирусного генома _ то есть синтез вирусной мРНК,

2) её трансляция, то есть синтез вирусных белков,

3) репликация вирусного генома.

У многих вирусов существуют системы контроля, обеспечивающие оптимальное расходование биоматериалов клетки-хозяина. Например, когда вирусной мРНК накоплено достаточно, транскрипция вирусного генома подавляется, а репликация напротив _ активируется.

· Созревание вирионов и выход из клетки. В конце концов, синтезированные геномные РНК или ДНК одеваются соответствующими белками и выходят из клетки. Следует сказать, что активно размножающийся вирус не всегда убивает клетку-хозяина. В некоторых случаях дочерние вирусы отпочковываются от плазматической мембраны, не вызывая её разрыва. Таким образом, клетка может продолжать жить и продуцировать вирус.

В данной работе предлагаются логические модели самосборки капсидов некоторых вирусных частиц на основе потоковых формальных систем.

ВИРУС ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ

Вирус табачной мозаики (ВТМ) - РНК вирус, инфицирующий растения, особенно табак и других представителей семейства пасленовых. Заражение определяется характерными рисунками (пятнами и выцветанием) на листьях. По этой причине вирус и получил свое название. ВТМ является первым обнаруженным вирусом.

Вирус табачной мозаики имеют спиральную палочковидную форму. Его капсид состоит из 2130 молекул белка-оболочки и одной молекулы генома - РНК с 6390 основаниями. Капсид состоит только из одного типа белковых субъединиц. Белок оболочки самособирается в палочковидную спиральную структуру (один оборот спирали содержит 16,3 молекулы белка), вокруг РНК, которая формирует «шпильку» в центре белковой спирали. Мономер белка состоит из 158 аминокислот. Вирионы имеют длину около 300 нм и диаметр около 18 нм. Электронные микрофотографии показывают различимый внутренний канал диаметром около 4 нм. РНК закручена с радиусом около 6 нм и защищена от воздействия клеточных ферментов белком оболочки. На три нуклеотида РНК приходится один белковый мономер. Размер нуклеиновой кислоты определяет размер капсида.

У растений вирус табачной мозаики вызывает серьезные потери урожая. Известно, что вирус поражает девять семейств растений и, по меньшей мере, 125 отдельных видов, включая табак, томаты, перцы, огурцы и многие декоративные растения. Существует большое количество штаммов ВТМ.

Рис. 1. Вирус табачной мозаики. Микрофотография.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Вирус табачной мозаики. Строение.

Значительное количество специальной литературы по ВТМ, его выбор для многих новаторских исследований в молекулярной биологии, дифракции рентгеновских лучей, вирусной сборки и разборки, и т. д., по существу обязаны возможности получения большого количества вирусных частиц, и тому факту, что вирус не поражает животных. Вырастив несколько зараженных растений табака в оранжерее и проделав лабораторные процедуры, исследователь может легко получить несколько граммов вируса. В результате, ВТМ часто рассматривается практически как органический химический продукт, а не инфекционный агент.

МЕХАНИЗМЫ СБОРКИ

Первые предположения о сборке ВТМ изображены в рис.3

Наглядно показано, что белки насаживаются на РНК. Считалось, что самосборка вируса обеспечивается, информацией, содержащейся в первичной структуре молекулы РНК.

И поэтому задним числом не кажется слишком удивительным результат классических экспериментов Френкеля-Конрата и Вильямса, которые в 1955 г. [1] продемонстрировали, что ВТМ может быть повторно собран из его выделенных белковых и нуклеиновых компонентов.

Они показали, что после простого их смешивания образовались инфекционные вирусные частицы, которые структурно неотличимы от первоначальных вирусов. Следовательно, вся информация, необходимая для сборки частицы, должна содержаться в ее компонентах, т. е. вирусу присуща «самосборка».

Рис. 3. Предположение о сборке ВТМ.

Более поздние эксперименты [2] показали, что повторная сборка весьма специфична для вириальной РНК; при этом она проходит наиболее легко, когда РНК гомологична оболочечному белку.

Все это было весьма неплохо, но существовало несколько фактов, которые давали повод для сомнений. Во-первых, в других экспериментах [3] было показано, что чужеродная РНК "может включаться в вирусно-подобные палочки, и это сильно ослабляло уверенность в том, что in vivo специфичность на самом деле достигалась во время сборки вируса. Другим фактом, относящимся к повторной сборке, который указывал на то, что в построенной схеме остались невыявленные элементы, была чересчур низкая скорость сборки. Необходимо было ждать от 8 до 24 часов, чтобы получить максимальный выход собранных частиц. Это представлялось довольно медленным для сборки вируса in vivo, так как только после ее завершения нуклеиновая кислота была полностью защищена.

Допустим белки собираются в пары и происходит рост капсида в одну сторону.

Рассмотрим данную схему без присутствии РНК. (Рис. 4.)

Рис. 4. Рост ВТМ без РНК



Стоит отметить, что и в опытах порой попадались не только «шайбы» -капсиды, но и 2-х этажные белки. (Рис. 4.)

Но данная схема никак не объясняет, что заставляет капсиды сдвигаться в «спираль» - столько компактную форму. Определенно это заслуга РНК.

При низких или кислотных рН, белок сам по себе образует спирали произвольной длины, которые по своей структуре весьма напоминают вирус за тем исключением, что в них отсутствует РНК. При рН выше нейтральной белок в основном существует в виде смеси малых агрегатов, начиная с тримеров и крупнее, которые находятся в быстром равновесии друг с другом; его обычно называют А-белком. Около рН = 7 и примерно при комнатной температуре доминирующей формой является диск, который находится в относительно медленном равновесии с А-формой в отношении 4:1. Таким образом, основным фактором, контролирующим состояние агрегации оболоченного белка, является рН. Регуляция опосредована группами (вероятно, как показал Каспар [4], карбоксильными кислотными остатками), которые аномально связывают протоны в спиральном состоянии, но не в А-форме. Следовательно, спиральная структура может быть стабилизирована либо, в случае вируса, взаимодействием РНК с белком, либо, в случае свободного белка, протонированием кислотных групп. Таким образом, эти группы вы ступают в роли «отрицательного ключа», гарантирующего, что при физиологических условиях спираль не образуется, и поэтому есть достаточно белка в виде дисков, или А-белка, для взаимодействия с РНК во время сборки вирусной частицы.



Рис. 5. Диаграмма, на которой указаны области, в которых определенные формы белка ВТМ играют существенную роль в установлении равновесия [5].

Следовательно, дисковый агрегат белка имеет ряд важных свойств. Он не только имеет непосредственное отношение к спиральной структуре вируса, но также является доминирующей формой белка при «физиологических» условиях; более того, дисковые формы были найдены и для других спиральных вирусов.



Рис. 6. Первоначальное представление о роли диска: специфическое узнавание особой (терминальной) последовательности ВТМ -- РНК вызывает переход диска в два витка спирали.

Субъединицы верхнего кольца диска лежат в плоскости, перпендикулярной к его оси, в то время как те, что расположены в нижнем кольце, повернуты вниз к центру, так что два кольца касаются только по внешней поверхности диска. Поблизости от центрального отверстия они, следовательно, широко расходятся, как пара открытых челюстей, которые могли бы «прикусить» отрезок РНК, проходящий через центральное отверстие. Более того, прохождение через центр было бы облегчено тем, что внутренний участок белка, начиная от места связывания с РНК, как оказалось, не упорядочен и не упакован в регулярную структуру.

Таким образом, имеет место быть мнению, что диск был устроен так, чтобы РНК могла проходить через центральное отверстие, эффективно увеличенное благодаря подвижности внутренней петли белка, и расположиться между двумя слоями диска. Понятно, что участком РНК, который окажется внутри диска, будет с необходимостью последовательность зарождения, расположенная довольно далеко от обоих концов молекулы РНК. Однако это может быть только в том случае, если РНК сложится вдвое в точке, находящейся в окрестности места зарождения сборки, и войдет в диск в виде петли шпильки. И на самом деле, последовательность оснований минимального фрагмента, защищенного при зарождении, такова, что он может складываться, образуя слабо спаренную двойную спираль с петлей наверху, т. е. шпильку. Это предположение выдвинул Зиммерн [6].

Она образует слабо связанную двойную спираль с петлей на верху, вероятно являющейся подлинным началом сборки. Последовательность в петле и в ее окрестности содержит мотив из трех оснований, у которых G находится в среднем положении, а А или U в двух других.

Рис. 7. Предполагаемая вторичная структура РНК в области зарождения [6].

Итак, гипотеза зарождение заключается в следующем: специальная шпилька РНК проникает через центральное отверстие диска в пространстве между челюстями, образованными двумя слоями белковых субъединиц. Все размеры хорошо для этого подходят. В результате открытая петля РНК может связаться с соответствующими местами на белке. По мере связывания РНК между челюстями белкового диска все большая часть довольно нестабильной двойной спирали будет плавиться и открываться. Некоторый, пока неизвестный, фактор этого взаимодействия, видимо, вызывает переход диска в короткий спиральный сегмент, включающий РНК, который после быстрого добавления к нему еще нескольких дисков [7] образует первую устойчивую нуклеопротеидную частицу.

Последующие после зарождения события можно назвать ростом. Рост может происходить, по существу, по тому же механизму, что и зарождение, только теперь нет необходимости в петле РНК со специфической последовательностью, а все происходит благодаря «путешествующей петле», которая может проникать в очередной подошедший диск. В этом механизме легко преодолевается основная проблема, связанная с тем, что трудно представить, как может взаимодействовать целый диск из белковых субъединиц с РНК в растущей спирали.



Рис. 8. Зарождение сборки вируса происходит благодаря проникновению шпильки РНК (см. рис. 7) в центральное отверстие белкового диска между двумя слоями субъединиц.

Петля на верху шпильки связывается с диском, образуя часть витка, при этом двойная спираль разделяется, что обусловливает переход диска в короткую спираль. Затем, вероятно, «челюсти смыкаются», заключая РНК между витками из белковых субъединиц, и начинается рост нуклеопротеидной спирали (которая может тогда быстро удлиняться до некоторого минимального стабильного размера).

При заражении растений табака вирусом табачной мозаики внутрь клеток проникает только РНК вируса, освобожденная от белковой оболочки. Вслед за этим в ядре клетки начинается синтез новой вирусной РНК. Под контролем этой вновь синтезированной РНК происходит синтез вирусного белка в цитоплазме. В результате соединения вновь синтезированной РНК с белком образуется новая полная вирусная частица. В нормальных условиях из 106 вирусных частиц только одна способна вызывать инфекцию, но из этой одной частицы за сутки образуется примерно 105 новых [16].

ВИРУС БАКТКРИОФАГ Т4

Рассмотрим хорошо изученный сценарий сборки вируса бактериофага Т4, описанный во всех учебниках и являющийся классическим объектом изучения самосборки. Имеет геномную ДНК порядка 169--170 тысяч пар нуклеотидов, упакованную в икосаэдрическую головку. Вирион также имеет ствол, основание ствола и стволовые отростки -- шесть длинных и шесть коротких. Бактериофаг T4 использует ДНК-полимеразу кольцевого типа; его скользящая манжетка является тримером, сходным с PCNA, но она не имеет гомологии ни с PCNA, ни с полимеразой в.T4 является относительно крупным фагом, имеет диаметр около 90 нм и длину около 200 нм. Фаг T4 использует только литический цикл развития, но не лизогенный. В сборке участвуют 54 типа белков, которые строго в определённой последовательности агрегируются в субагрегаты различных уровней и далее субагрегаты собираются в завершённую вирусную частицу, включающую более тысячи белковых молекул.

МЕХАНИЗМЫ СБОРКИ

Работы Вильяма Вуда и Роберта Эдгара (William Wood, Robert Edgar), посвященные мутантам фага Т4, дефектным по способности к сборке, позволили установить следующее:

1. Существует три основных пути превращений, которые приводят к образованию вируса. В результате этих превращений независимо формируются головка, отросток и нити отростка. Если блокировать образование одного из перечисленных компонентов, это не повлияет на синтез двух других.

2. Каждая из этих последовательностей превращений идет в строго определенном порядке. Все белки капсида синтезируются одновременно во второй половине цикла заражения. Таким образом, строгой последовательности сборки головки, отростка и нитей отростка способствуют структурные особенности самих промежуточных продуктов. Ни один из этих процессов ассоциации не может идти с заметной скоростью, пока не закончится предыдущий. Возможно, часть энергии связывания на каждом этапе используется для снижения энергии активации следующего процесса ассоциации и таким образом увеличивает его скорость.

3. Головка и отросток должны быть полностью собраны, прежде чем они соединяются друг с другом. Затем готовые нити отростка присоединяются к базальной пластинке. И в этом случае строгая последовательность событий обеспечивает выход только готовых вирусных частиц.

Образование вирионов фага Т4 идет не только путем самосборки. Важную роль на некоторых этапах этого процесса играют вспомогательные (морфопоэтические) белки и протеазы. Например, для образования центральной «втулки» базальной пластинки отростка нужны три белка, которые не входят в состав собранного отростка. Эти вспомогательные белки служат временными шаблонами для ассоциации компонентов «втулки». Протеазы играют важную роль в сборке головки. Основной белок головки с массой 45 кДа, который называется gp23* (gp - от англ. gene product - продукт гена), образуется из предшественника gp23 с массой 55 кДа. Расщепление происходит в тот момент, когда головка частично собрана; это свидетельствует о том, что оно запускает механизм втягивания ДНК в головку. Известны еще три белка головки, которые расщепляются в процессе сборки. Таким образом, фаг Т4 образуется путем самосборки и сборки с участием вспомогательных (морфопоэтических) белков и ферментов [17].



Рис. 9. Предполагаемый сценарий сборки бактериофага Т4.

1. Базальная пластинка (БП) строится из 15 белков, а также из нескольких молекул ферментов и фолиевой кислоты.

2. БП служит затравкой к сборке стрежня хвоста вируса, вокруг которого строится спиральный чехол (продукт гена 18).

3. Головке бактериофага предшествует проголовка (прокапсид, ДНК- несодержащий предшественник). Она «вырастает» на инициирующем белковом комплексе (портальный белок, коннектор) -- додекамере из 12 субъединиц, кодируемых геном 20. Этот комплекс прикреплен к внутренней поверхности цитоплазматической мембраны клетки-хозяина посредством мембранного каркасного белка, и на нем вырастает белковое ядро, служащее «строительными лесами» для прокапсида II. Далее вокруг этой белковой сердцевины группируются пентоны и гексоны из белков gp24 и gp23 (от англ. gene product -- продукт гена), сердцевина разрушается, белки gp24 и gp23 модифицируются до gp24* и gp23*, капсид увеличивается и прокапсид II отрывается от мембраны вместе с коннектором.

4. Через портальное отверстие белки gp16 и gp17 при участии коннектора и энергетических молекул АТФ упаковывают ДНК в прокапсид. ДНК обрезается в нужном месте, и этот «ящик Пандоры» для бактерий закупоривается пробкой из продуктов генов 13 и 14.

5. Головка бактериофага (точнее gp23*) «инкрустируется» сеткой белков HOC и SOC.

6. Каждая хвостовая нить соединяется из двух половинок -- дистальной (удалена от вириона и длиннее) и проксимальной (ближе к вириону и покороче).

7. Голова и хвост вируса самопроизвольно соединяются.

8. Хвостовые и воротничковые фибриллы крепятся на свои места (причем хвостовые удерживаются воротничковыми как и положено).

Базальная пластинка (БП)

Молекулы ДНК находятся in vivo в плотно упакованном, конденсированном состоянии. В таком виде генетическая информация хранится вируса. В то же время, для взаимодействия с регуляторными белками, ДНК должна перейти в менее конденсированное состояние.

Конденсация и деконденсация ДНК регулируют активность гена и клетки в целом. Молекула ДНК характеризуется высокой линейной плотностью отрицательного заряда, поскольку каждая пара оснований несет на себе две полностью депротонированные фосфатные группы. Среднее расстояние между проекциями фосфатных групп на ось двойной спирали составляет 1.7 нм. Возникающее электростатическое отталкивание обуславливает большую жесткость ДНК в растворе, которая при при физиологической ионной силе образует рыхлый клубок большого объема. В то же время, in vivo молекула ДНК локализована внутри объема, который в тысячи раз меньше.

Длина ДНК - 54 мкм

Диаметр упаковки - 0.1 мкм

Диаметр капсулы бактериофага Т4 почти в тысячу раз меньше длины вытянутой молекулы ДНК. Упаковка ДНК внутри капсулы вируса настолько плотная, что транскрипция с нее в таком состоянии невозможна [18].

При мягком лизисе фагов образуются тороидальные частицы, состоящие из большого числа витков ДНК [19]. При помощи криоэлектронной микроскопии интактных фагов можно увидеть локально упорядоченные, уложенные параллельно, сегменты ДНК [20]. Было предложено несколько моделей упаковки ДНК внутри фага:

1) ДНК намотана в виде клубка,

2) ДНК уложена параллельно при помощи резких изломов, или

3) ДНК сложена в деформированный тороид, который полностью заполняет все предоставленное ему пространство [21].

Рентгеноструктурный анализ дает расстояние между соседними двойными спиралями ДНК внутри вирусной капсулы порядка 1-2 диаметров молекулы воды [22]. In vitro при таком расстоянии между молекулами при физиологической ионной силе ДНК образует жидкокристаллическую фазу [23]. Это позволяет сделать предположение о возможности жидкокристаллической упаковки ДНК in vivo.

Упаковка ДНК внутри фага осуществляется за счет работы, совершаемой мощным молекулярным мотором. Это белковый комплекс, который, вращая нить ДНК вокруг своей оси, вталкивает ее внутрь капсулы через отверстие, сравнимое с диаметром двойной спирали. Словно сжатая пружина, ДНК внутри фага обладает энергией упругости, и поэтому оказывает сильное давление на стенки капсулы [24]. В заполненном бактериофаге Ф29, например, внутреннее давление обуславливает силу порядка 50 pN [25], которой достаточно для инициации самостоятельного выхода ДНК из фага внутрь клетки-хозяина при инфицировании. Таким образом, первая стадия инфицирования может проходить без участия белков, и контролироваться осмотическим давлением, а так же соотношением концентраций противоионов внутри и вне капсулы [26].

Запасенной внутри фага Ф29 энергии, однако, хватает лишь для выхода части нити ДНК [27]. Таким образом, процесс вирусного инфицирования нельзя полностью свести к неспецифической электростатике. Важную роль играет и специфическое взаимодействие с белками [28].



Рис. 11. Взаимодействие Т4 с оболочкой бактерии.

Основание бактериофага Т4 состоит из 16 различных типов белков. Перед иньекцией эти протеины собираются вместе, формируя гексагональную структуру.

Длинные отростки сперва находят E. Coli, а, затем короткие прочно прикрепляются к клетке. Основание при этом передает импульс в ствол, который сокращается, как мускул, выдавливая из себя вирусную ДНК в клетку-хозяина. Основание вируса управляется как прокалывающим устройством, расположенным у ствола, и энзимом, режущим мембрану клетки E. Coli. Этот энзим делает отверстие нанометровых размеров в мембране клетки, через которое вирусная ДНК поступает в клетку-хозяина. E. Coli, таким образом, инфицируется и биохимическая машина клетки продуцирует новые фаговые частицы, и, в конце концов, клетка гибнет.

Рис. 12. Модель работы белковой машины впрыска фага Т4.



Рис. 13. Строение белков основания, смоделированное с помощью программного обеспечения «SPIDER».

Данные для модели получены при исследовании 418 микрофотографий замороженных вирусных частиц. Область, обозначенная (gp27-gp5*-gp5c)3 - биохимическое прокалывающее устройство. Наибольшая активность прокалывающего энзима наблюдается посредине «иглы». Рис. а - стереофотография основания, рис. b - его молекулярная структура. 1 ангстрем = 1/100000 см [29].



Механизм действия бактериофагов

Уничтожение патогенных бактерий происходит в результате инфицирования бактериальной клетки бактериофагом. Процесс взаимодействия бактериофага с бактериями протекает циклично (до полного уничтожения бактерий).

Каждый жизненный цикл бактериофага состоит из последовательных этапов:

1. Адсорбция бактериофага на поверхности бактерии и инъекция нуклеиновой кислоты (генетического материала) внутрь бактериальной клетки.

2. Внутриклеточное развитие. Разрушение ДНК бактерии и репродукция ДНК бактериофага.



3. Лизис (разрушение) бактериальной клетки и выход нового поколения бактериофага.

Процент выхода годных (около 99%) говорит о невозможности какой-либо хаотичной сборки.

Способы получения образцов вируса

Почему же нельзя просто посмотреть на то, как происходит сборка и снять фильм?

ФУРЬЕ-ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Первые образцы вирусов были получены с помощью микрофотографий, однако они не давали простых прямых изображений образцов. Была ощутима ограниченность электронной микроскопии. Во-первых, были артефакты, порожденные подготовкой образца, а также радиационные повреждения во время наблюдения. Во-вторых, необходимо было использовать искусственные способы усиления контраста, так как большинство атомов в биологических образцах имели слишком малые атомные номера, чтобы самостоятельно обеспечить достаточную контрастность.

В-третьих, получающееся изображение зависит от условий работы микроскопа и его фокусировки, а также от имеющихся аберраций. Помимо всего, из-за большой глубины резкости обычного микроскопа все детали вдоль направления наблюдения накладываются на изображение. Наконец, в случае сильно рассеивающих или толстых образцов в них имеет место множественное рассеяние, что может разрушить даже эту связь между объектами его образом. По этим причинам те детали, которые можно видеть на необработанном изображении, часто ненадежны, и их нелегко интерпретировать, если не иметь методов, которые исправляют операционные ошибки микроскопа и позволяют разделить вклады, вносимые в изображение различными сечениями образца. Важно также уметь оценивать степень сохранности образца в каждом конкретном случае.

Двумерная реконструкция: цифровая компьютерная обработка

Далее ученые нашли альтернативу, а именно метод негативного окрашивания, который был разработан незадолго до этого Хаксли и Бреннером и Хорном [30]. По этому методу образец погружается в тонкий аморфный слой соли тяжелого металла, которая одновременно сохраняет и проявляет форму областей, из которых она вытеснена. Было видно большое количество тонких деталей, но в большинстве случаев было нелегко понять, что они означают.



Рис. 14. Оптическая дифракция и фильтрация изображений трубчатых структур, известных как «полиголовки», состоящих из основного белка головки бактериофага Т4 [31].

а) Электронная микрофотография негативно окрашенной уплощенной частицы (200 000);

б) оптическая дифркционная картина рис. б), на которой кругами обвелен набор дифракционных пиков, соответствующий одному слою структуры;

в) отфильтрованное изображение одного слоя на рис. а) с использованием дифракционной маски, показанной на рис. б). Апертура в маске выбирается таким образом, что усреднение здесь захватывает только несколько соседних клеток. Можно вдеть отдельные молекулы, организованные в гексамеры.

Трехмерная реконструкция изображения

Чтобы получить единственную или надежную картину трехмерной структуры, необходимо иметь возможность рассмотреть образец со множества различных направлений[32]. Эти различные ракурсы часто получались, когда образец был при наблюдении произвольно ориентирован, но их можно также получить, как говорилось выше, поворачивая образец под микроскопом.

Однако набор изображений, полученных при различных направлениях взгляда, можно объективно объединить, чтобы реконструировать трехмерный образ объекта.

Рис. 15. Схема общего процесса трехмерной реконструкции объекта по набору двумерных проекций [32].

Фазовоконтрастная микроскопия

Электронная микроскопия в сочетании с тем или иным методом анализа образцов, примененная к негативно окрашенным образцам, оказалась идеальным инструментом для определения расположения и формы малых белковых субъединиц в естественных и искусственных структурах, среди которых -- двумерные кристаллы и макромолекулярные ансамбли, такие, как вирусы и микротрубочки. Структурная информация, получаемая этим методом, оказалась весьма надежной для деталей, размеры которых не меньше 20 или 15 А. Однако стало ясно, что этот масштаб ограничен зернистостью негативного окрашивания и тем, насколько точно оно повторяет поверхность образца [33]. Чтобы получить более высокое разрешение, лучше 10 А, нужно отказаться от окрашивания и смотреть непосредственно на белок. При высоком разрешении возникает другая проблема: радиационное повреждение. Его можно уменьшить, снизив интенсивность облучающего пучка, но тогда увеличивается статистический шум и первичное изображение становится все менее и менее надежным.

Чтобы получить свое эффектное трехмерное реконструированное изображение пурпурной мембраны Halobacterium с разрешением около 7 А. м, Хендерсон и Анвин зафиксировали ряд изображений при низких дозах облучения разных кусков мембраны, повернутых на различные углы. Финальная картина была результатом усреднения примерно по 100 000 молекул. Слабый контраст на отдельных микрофотографиях, полученный дефокусировкой, был затем усилен и откорректирован с помощью ЭВМ по методу, описанному выше. Это был первый раз, когда внутреннюю структуру белковой молекулы «увидели» с помощью электронного микроскопа.

СФЕРИЧЕСКИЕ ВИРУСЫ

Сферические наночастицы можно получить путем термической денатурации белка оболочки вируса (например, ВТМ). В 1956 году вирусолог Роджер Харт показал, что термическая обработка частиц ВТМ при температуре 80-98 °C в течение 10 секунд ведут к набуханию вирионов из-за денатурации белков и преобразования их в шарообразные частицы [34]. Российские вирусологи выяснили, что размер сферических частиц варьирует в диапазоне 50-800+ нм. Для получения сферических наночастиц (СНЧ) они использовали собственно вирус табачной мозаики и его белковую оболочку [35]. Посредством электронной микроскопии было выявлено две стадии термической трансформации нативного вируса:

Рис. 15. Двухстадийная модификация ВТМ в СНЧ. Слева: первая стадия, температура 90 °C. Справа: дальнейшее нагревание, температура 94 °C.

Фотографии из статьи «Температурная модификация нативного вируса табачной мозаики и ВТМ-белков без РНК в сферические наночастицы» И.Г. Атабекова и его коллег.

Нагревание до 90 °C -- набухание частиц с одного или с двух концов и формирование несферических частиц различных размеров и форм.

Дальнейшее нагревание до 94 °C -- зрелые СНЧ.

Нагревание палочковидных ВТМ при 94-98 °C дает 100% выход СНЧ, объем которых не обязательно соответствует объему «палочек» ВТМ (радиус около 52 нм). Все СНЧ нерастворимы в воде и могут существовать в виде коллоидного раствора или стойкой суспензии. Что интересно, СНЧ получаются из любых фрагментов оболочки ВТМ, вплоть до А-белков (но при более низких температурах из-за меньшей стабильности, чем целостный ВТМ)

Рис. 16. Схема (не в масштабе) показывающая СНЧ, порожденные из природной ВТМ и ВТМ без РНК. Природный ВТМ (слева) и ВТМ без РНК (справа) нагревают при 94 или 65 ° С. Диапазоны размеров сферических наночастиц указаны.

Схема синтеза СНЧ из нативного ВТМ (слева) и белковых агрегатов ВТМ (справа). Указаны концентрации исходных структур и размеры СНЧ [35].

модель самосборки простейших сферических вирусов

Большинство вирусных частиц с замкнутым чехлом обладает икосаэдрической симметрией. Это самая эффективная симметрия для конструирования замкнутого чехла из отдельных субъединиц: в этом случае при сборке чехла фиксированного размера используются строительные блоки минимального размера. На поверхности любой структуры с икосаэдрической симметрией имеется 60 идентичных элементов, связанных друг с другом осями симметрии 2, 3 и 5-го порядков.

Способ упаковки элементов в структуру с данной симметрией показан на рисунке. Запятые, связанные осями симметрии 2-го порядка, расположены «лицом-к-лицу», связанные осями 3-го порядка -- «затылком-к-затылку», а 5-го порядка -- «хвостом-к-хвосту». Замкнутые капсиды с симметрией более высокого порядка, чем икосаэдрическая, строго говоря, существовать не могут. Молекула нуклеиновой кислоты большинства вирусов слишком велика, чтобы ее можно было упаковать в чехол из 60 субъединиц разумной молекулярной массы. Субъединица состоит из нескольких белковых цепей, иногда (например, в случае полиовируса) химически неидентичных. Однако нередко эти цепи бывают «генетически эквивалентны», и тогда вирусный чехол состоит из 60 п (где п>1) идентичных структурных элементов. В связи с этим возникают две важные проблемы, Поскольку не все субъединицы данного типа связаны друг с другом симметричным образом, то каждая субъединица в зависимости от ее местоположения в чехле оказывается включенной в один из нескольких возможных видов взаимодействия с соседями. Отсюда возникает первая проблема -- проблема белковой архитектуры. Каким образом обеспечивается альтернативность связывания субъединиц? Вторая проблема -- регулярность сборки: как в процессе сборки осуществляется столь точное переключение с одного вида взаимодействия на другой, что в чехле не возникает нерегулярностей и не происходит его неправильного замыкания?



Рис. 17. Структура, обладающая икосаэдрической симметрией и состоящая из 60 субъединиц. Б. Икосаэдрическая структура, состоящая из 180 субъединиц. Все 180 субъединиц образуют примерно одинаковые локальные контакты, однако строго говоря, здесь возникает три вида упаковочных модулей. Они обозначены буквами А, В и С.

Каспар и Клуг предложили одно из возможных решений первой проблемы, т. е. попытались ответить на вопрос, как могут возникать альтернативные типы связывания между субъединицами одного вида. Почти полная идентичность контактов между 60 п субъединицами в икосаэдрической капсиде может быть получена следующим образом. Рассмотрим плоскую гексагональную решетку из идентичных элементов. Из такой решетки можно получить икосаэдрическую оболочку, удалив «ломтики» в 60° и «сшив» края разрезов. Через каждую вершину такого икосаэдра проходит ось 5-го порядка. Если удалить «ломтик» у каждой из вершин гексагональной решетки, то получится икосаэдр из 60 субъединиц с идентичными меж-субъединичными контактами. Эти контакты аналогичны контактам в исходной гексагональной решетке, хотя наличие у оболочки кривизны подразумевает, что элементы конечной толщины не смогут полностью сохранить в икосаэдрической структуре те же связи, которые существовали между ними в плоской решетке. Если вырезать «ломтики» из каждого второго ближайшего соседа, получится оболочка большего размера -- из 180 субъединиц, а не из 60. При этом все контакты будут сходны, однако в действительности субъединицы окажутся разбитыми на три типа. На рисунке они обозначены буквами А, В и С. Отметим, что среди контактов, стабилизирующих эту структуру, будут присутствовать связи трех типов: «голова-к-голове» -- между парами субъединиц, «спина-к-спине» -- объединяющие в кольцо три элемента и «хвост-к-хвосту» -- замыкающие кольцо из пяти или шести элементов. Каждая субъединица будет участвовать во всех трех типах взаимодействия. Таким образом, несмотря на различия в деталях упаковки субъединиц А, В и С, с точки зрения образуемых ими контактов они очень сходны. Например, все субъединицы образуют контакты типа «хвост-к-хвосту», но субъединицы А-типа замыкаются в кольцо из пяти элементов, как в простых ансамблях из 60 субъединиц, а субъединицы В- и С-типов -- из шести. Контакты типа «хвост-к-голове» вообще отсутствуют. Гомологичные участки субъединиц всех классов образуют примерно одинаковые контакты. Такое связывание было названо Каспаром и Клугом «квазиэквивалентным», чтобы подчеркнуть, что все субъединицы образуют сходные, хотя и неидентичные контакты. Каспар и Клуг отметили, что нековалентные связи в белках обладают определенной лабильностью и это позволяет генетически и химически идентичным молекулам образовывать неидентичные контакты. Подобная упаковка (правда, немного отличающаяся от описанной выше) действительно наблюдается в случае вируса кустистой карликовости томатов (TBSV) и некоторых других вирусов. Это подтверждает постулат о «близко родственных» специфических взаимодействиях.

О структурах, подобных представленным на рисунке, иногда говорят, что они построены из пентамеров и гексамеров. Это действительно так, если связи «хвост-к-хвосту» особенно прочны. Если все контакты, кроме контактов «хвост-к-хвосту», разрушить, структура распадется на 12 пентамеров и 30 гексамеров. Часто субъединицы бывают снабжены выступающим наружу элементом, расположенным так, что на электронно-микроскопических фотографиях многих структур действительно наблюдаются группы из пяти и шести выступов. Это явление назвали пентамерно-гексамерной кластеризацией. Примером такого рода может служить CCMV. Подобные кластеры -- чисто морфологические образования. По ним можно судить о форме поверхности субъединиц, а также о том, каким образом они контактируют друг с другом. В действительности большинство изученных вирусов, которые состоят из 180 субъединиц (например, CCMV), при диссоциации в мягких условиях распадаются на димеры. Следовательно, несмотря на выступы, которые дают характерную картину при негативном контрастировании, «попарные» контакты («голова-к-голове») являются самыми прочными.

Классификация моделей

На данный момент существует некоторое количество вычислительных моделей, имитирующих самосборку сферических вирусов. Условно можно разделить их на следующие типы:

Формально-логические модели. В качестве примера можно рассмотреть теорию правил локальных взаимодействий, в которой с помощью некоторого заданного множества правил определяется набор допустимых взаимодействий, происходящих в процессе сборки. Такую модель применяют в совокупности с моделями более низкого уровня.

Дискретно-событийное моделирование с применением модели Гиллеспи. Моделирование построено на решении производящего уравнения с предположением, что реакции являются марковскими процессами. При этом множество допустимых реакций конечно и определяется с помощью какой-либо формально-логической модели.

Производящим уравнением называется уравнение, описывающее эволюцию системы во времени. Оно имеет вид , где и - вероятности того, что система находится в состояниях и соответственно, - вероятность перехода системы из состояния в состояние . В общем случае возможны обратные переходы из в с вероятностью . Тогда уравнение имеет вид .

Подход, построенный на молекулярной динамике. Метод молекулярной динамики (метод МД) -- это метод, в котором временная эволюция системы взаимодействующих атомов или частиц отслеживается интегрированием их уравнений движения. При этом применяется крупнозернистое, грубое моделирование, где одной субъединице соответствует одна частица (в более точных моделях - несколько частиц, имитирующих «жесткие» части субъединицы). Как правило, применяется в сочетании с формально-логической моделью, определяющей допустимые взаимодействия. Позволяет исследовать динамические траектории частиц и возможные нарушения в собирающихся структурах.

Моделирование кинетики сборки. Моделирование проводится с помощью решения системы уравнений скоростей реакции. Семейства траекторий в такой модели задаются явно. Модель позволяет исследовать заданное заранее семейство траекторий [36].

ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ СЦЕНАРИЙ САМОСБОРКИ СФЕЕРИЧЕСКИХ ВИРУСОВ

Для начала рассмотрим столь популярные опыты [37].

Физические модели были использованы для изучения самосборки вирусов. Справа, три кадра из фильма, показывающие самосборку вируса. Субъединицы были изготовлены на основе молекулярной структуры, а магниты размещены на границах раздела. Затем модели встряхивают в маленькой бутылке, модель собирается. Итоги данных экспериментов - random self-assembling. На данной модели не будем останавливаться из-за её антинаучности.

...