Исследование проблемы моделирования феномена

Рис. 36. Массовая доля мономеров, триммеров, целых капсидов как функция от времени для модели B₄.Используются параметры из рис.

В поддержку гипотезы, что шаги связывания кластеров необходимы, чтобы избежать накопления промежуточных продуктов для B₃ и B₄, рассмотрена кинетическая модель, в которой только мономеры могут присоединяться к растущим капсидам. В этой модели разрешены только промежуточные продукты с минимальной энергией и недеформированными связями. Мономеры присоединяются или отсоединяются от промежуточных продуктов стохастически со средними скоростями связывания и разъединения, удовлетворяющими уравнению детального равновесия. Динамика сборки, предсказанная для этой модели для B₅ согласуется с той, что мы видели в симуляциях броуновской динамики. Однако концентрации промежуточных продуктов в локальном минимуме свободной энергии построены для B₄, как для моделей в работе Endres, Zlotnick. Поскольку эти промежуточные продукты не могут связываться друг с другом, кинетическое уравнение предсказывает, что сборка будет значительно менее эффективной, чем для симуляций броуновской динамики. Результаты говорят о том, что может быть важно учитывать связывание кластеров, а не только отдельных субъединиц при построении гипотез о механизмах сборки из экспериментальных данных.

Для многих вирусов базовыми единицами сборки можно положить малые промежуточные продукты, такие как димеры или тримеры. Экспериментально наблюдаемые концентрации этих видов во время сборки говорят, что они образуются быстро и обладают высокой метастабильностью. Эта особенность может быть включена в иодель разработкой новой субъединицы, представляющей базовую единицу сборки, или выбором более высоких энергий связывания для соответствующих векторов связей. В рассматриваемой модели все максимальные энергии связывания равны, и важность связывания кластеров для капсидов B₃ и B₄ не является результатом взаимодействия между отдельными субъединицами. Вместо этого, общие взаимодействия многих субъединиц приводят к профилю свободной энергии с многочисленными локальными минимумами, который заставляет траекторию сборки проходить через связывание кластеров. Хотя связывание триммеров и других кластеров необходимо для сборки B₄ в симуляции, доля субъединиц, содержащихся в этих промежуточных продуктах, всегда мала по сравнению с долей субъединиц в мономерах или целых капсидах (см. рис.). Следовательно, значимость связывания кластеров было бы трудно определить только в экспериментах, таких как рассеяние света или эксклюзионная хроматография. Комбинация этих техник с выборочным удалением остатков или экспериментов над отдельными молекулами, впрочем, может дать объяснение важности различных субъединиц в сборке капсидов.

Капсиды метастабильны в бесконечно малой концентрации, разборка капсидов проявляет гистерезис.

Поскольку даже одного вириона может быть достаточно, чтобы заразить клетку, вирусные капсиды должны быть метастабильными в бесконечно малой концентрации. Капсиды в модели демонстрируют эту особенность, например, значимая сборка при не происходит для , (см. рис.) но изолированные целые капсиды симулируемые с периодическими граничными условиями (для имитации бесконечно малой концентрации) являются метастабильными при для . Это показывает, что конечный выход капсидов при некоторых значениях энергий связывания будет различаться для траектории, начинающейся с почти собранного капсида и траектории, начинающейся со случайных конфигураций субъединиц (рис.). Другими словами, имеется гистерезис между сборкой и диссоциацией. Гистерезис происходит, потому что могут быть большие барьеры свободной энергии, разделяющие ранние этапы сборки, когда на субъединицу приходится мало связей, и целыми капсидами, у которых на субъединицу приходится связей. Поэтому мономеры (или целые капсиды) могут быть метастабильными на конечной траектории выше (или ниже) . Как только первая субъединица будет удалена из метастабильного целого капсида, ближайшие субъединицы потеряют часть связей, и дальнейшая разборка пойдет быстро. Гистерезис в сборке-разборке капсидов наблюдался в экспериментах Злотника.

Рис. 37. Выход капсидов, как функция, зависящая от , показывает гистерезис между ассоциацией и диссоциацией.

Приложение

Уравнения движения, заданные в ур. (7), интегрируются следующим образом. Ориентации векторов связей определяется в привязанных к частице координатах до симуляции. Координаты, привязанные к пространству, , определяются из матрицы вращения, , изменение которой в зависимости от времени определяется с помощью кватернионов, которые удовлетворяют уравнению движения. Это уравнение требует задание угловых скоростей, , которые вычисляются аналогично смещениям

, (17)

где моменты вычисляются в двух точках

, ,(18)

где прогнозируемые позиции определяются как

. (19)

Прогнозируемые ориентации связей определяются из прогнозируемой матрицы вращения, вычисленной по прогнозируемым угловым скоростям как

. (20)

Такая формулировка предполагает, что субъединицы гидродинамически изолированы, и что источники трения, связанные с вращением и переносом не сцеплены.

Вклад связывания кластеров в конечный продукт сборки вычислялся в симуляциях следующим образом. Кластеры обозначались количеством субъединиц, соединенных одной или более связями. Событие связывания происходило, когда менялся размер кластера или при объединении двух кластеров (положительное связывание), или разделением кластера (отрицательное связывание). Размеры кластеров выводились через каждые 10 шагов, т. к. более одного события связывания для одного кластера за 10 шагов происходило крайне редко. Размер события связывания, , определяется как размер наименьшего кластера, участвовавшего в реакции для положительного связывания или размер меньшего продукта при отрицательном связывании. Общее количество связываний, вызванное событиями размера задано формулой

, (21)

где и - количества положительных и отрицательных событий связывания размера , соответственно.

Свободная энергия,

,(22)

где сумма берется по всем субъединицам в капсиде, - число субъединиц в конфигурации i, - число связей для субъединицы j. Берется математическое ожидание свободной энергии по числу субъединиц в капсиде n суммированием по конфигурациям, содержащим n субъединиц

.(23)

Суммирование выполнено с помощью симуляций Монте-Карло, в которых пробные конфигурации капсидов генерировались добавлением или удалением субъединиц из текущих конфигураций, а затем принимались или отклонялись согласно критерию Метрополиса с больцмановским распределением, заданным уравнением. Рассматривались только конфигурации, согласованные с минимальной энергией связывания, поэтому подход применим только для параметров, при которых некорректные капсиды не собираются. Средняя свободная энергия капсидов размера n эффективно вычислялась выполнением зонтичного измерения, в котором использовался гармонический потенциал как функция от размера капсида для смещения числа субъединиц в капсиде [44].

АНАЛИЗ КИНЕТИКИ СБОРКИ ВИРУСНЫХ КАПСИДОВ, ОСНОВАННЫЙ НА МОДЕЛИРОВАНИИ

Сборка вирусных капсидов или других сферических полимеров - пустых замкнутых структур, состоящих из сотен белковых субъединиц плохо понятна. Существует модель, основанная на каскаде низкоуровневых реакций, позволяющая произвести кинетические симуляции. Поведение модели отражает кинетику сборки, наблюдаемую в растворе. Представлено два примера общей модели, описывающие икосаэдральные и додекаэдрические капсиды. Показано, как получить устойчивые оценки параметров сборки из доступных экспериментальных данных. Эти параметры, размер ядра, средняя скорость нуклеации и средняя свободная энергия ассоциации могут быть определены при измерении изменений субъединиц и капсидов в зависимости от концентрации и времени. Приведены математические выводы анализа, сделанные из общей модели. Объяснение сборки капсидов довольно обобщенное, примеры могут быть изменены для имитации различных биологических систем.

Накопление капсидов показывает сигмоидальную кинетику, типичную для многоступенчатых реакций. За время фазы начальной задержки успешные промежуточные продукты временно накапливаются и затем используются в последующих реакциях. Однако, без регуляции, реакция сборки склонна к попаданию в кинетические ловушки. Были предложены несколько регулирующих механизмов, уменьшающих склонность к попаданию в кинетические ловушки. Автостерия, в которой свободные субъединицы находятся в равновесии между состояниями готовности и неготовности к сборке, ее разновидность использовалась в модели квазиэквивалентной сборки с локальными правилами. Здесь регуляция входит в нуклеацию включением «кинетического ограничения» раннего шага в реакции, где первые несколько промежуточных продуктов собираются медленно, или неустойчивы. Нуклеация наблюдалась в сборке капсидов, структура-ядро может быть целой вершиной или замкнутым кольцом из субъединиц. Эти и другие механизмы регуляции могут быть включены в общие модели.

В максимально общем виде модель допускает присваивание различных скоростей и/или порядков для каждого каскада сборочных реакций.

Табл. 3. Обозначения констант и переменных

N	число субъединиц в целом капсиде
[N]	концентрация капсидов
[m]	концентрация m-го вида
[u]	концентрация субъединиц
	начальная концентрация субъединиц
nuc	число субъединиц в ядре
j	вырождение (количество лежащих в одной плоскости симметрий вращения) отдельной субъединицы
c	число контактных позиций в субъединице
	число межсубъединичных контактов в m-м промежуточном продукте
C	число межсубъединичных контактов в целом капсиде
	константа ассоциации для целого капсида, выраженное в
	константа ассоциации для одного субъединичного контакта
	микроскопическая константа прямой скорости для реакций элонгации
	микроскопическая константа прямой скорости для реакций нуклеации
	статистический коэффициент, вырождение прямой реакции, приводящей к m-у виду
	статистический коэффициент, вырождение диссоциации m-го вида
	постоянная обратной скорости для диссоциации m-го вида
	отношение постоянных прямых скоростей, для реакций нуклеации
	концентрация m-го вида при равновесии,
	явная константа диссоциации, значение , для которого
	константа равновесия для

Методы

Моделирование сборки капсида в равновесии

Рис. 38. Геометрии капсидов. (А) Додекаэдрическая модель капсида из 12-и пятиугольных субъединиц. (B) Икосаэдральная модель капсида из 30-и парных симметричных субъединиц.

В симуляциях используются две модели капсидов (см. рис. 38). Первая модель, изначально разработанная без нуклеации как равновесная (EQ) модель, состоит из 12 пятивалентных пятиугольных субъединиц, собирающихся как грани додекаэдра за счет 30 межсубъединичных контактов. Такая геометрия отражает четвертичную структуру пикорнавирусов. Вторая система построена из 30 четырехвалентных прямоугольных субъединиц (образующих 60 межсубъединичных контактов), ее можно считать T=1 икосаэдром, построенным из димеров. Четырехвалентные субъединицы отражают геометрию, используемую в схематичных представлениях димеров капсида вируса гепатита B.

Чтобы описать полимеризацию капсида, разработана система скоростных уравнений для концентраций видов, образующихся в каскаде сборки (37). Уравнения определяются геометрией капсида, траекторией сборки и энергиями межсубъединичного связывания. В равновесии, дифференциальные скоростные уравнения превращаются в системы алгебраических уравнений, из которых можно определить равновесные значения для субъединицы, капсида и промежуточных продуктов. В самой простой модели в равновесии только мономер и капсид присутствуют в заметных концентрациях. Равновесное отношение между конечными точками каскада реакций:

, (24)

где N - число субъединиц в целом капсиде, например, N = 12 в додекаэдральном, и N = 30 в икосаэдральном капсиде.

Уравнение (24) дает результат в неудобных единицах для константы ассоциации . Более удобными выражениями являются , прямая константа диссоциации, определенная при равновесной концентрации капсидов и субъединиц (25), и парная (на контакт) константа ассоциации между субъединицами (26). Поскольку N обычно велико, практичнее использовать логарифмическую форму уравнений, включающих , при работе с численными данными.

. (25)

Подстановки через последовательность уравнений модели в равновесии дают как произведение 1) статистического коэффициента, рассчитанного для общего вырождения реакции, 2) степени для каждого контакта, образуемого при сборке капсида. Это может быть записано в общем виде для сборки полиэдральной структуры из N субъединиц с c контактами на субъединицу, где каждая субъединица имеет j-кратное вырождение. Такая N-эдральная структура имеет всего контактов, приводя к общему виду, где - произведение статистических множителей для вырождения компонентов реакции (26).

. (26)

Отдельные статистические факторы могут быть определены явно для каждого шага сборки. Применяя последнее уравнения к додекаэдральной и икосаэдральной моделям, получаем

додекаэдральная модель (27)

икосаэдральная модель

В общем, равновесное состояние описывается системой скоростных уравнений с производными, равными нулю. Для моделей, имеющих одну конформацию для каждого размера промежуточного продукта, полученная алгебраическая система легко решается обратной подстановкой и дает равновесные концентрации всех видов.

, (28)

где задает общее число межсубъединичных контактов, образуемых при сборке m-х видов (состоящих из m субъединиц). Для моделей, включающих несколько траекторий, это выражение представляет усложненную зависимость от и вырождения.

В принципе, может быть не одинаковым для всех взаимодействий. Например, , используемое для взаимодействий нуклеации, должно быть меньше, чем используемое для контактов, устанавливаемых во время элонгации. Если это простой энтропийный штраф, следовало бы ожидать, что штраф будет возмещен, когда ядро соберется. Для простоты, для всех реакций используется одинаковое значение .

Моделирование кинетики сборки

Описанная модель сборки допускает вычисление кинетики сборки при дополнительных предположениях. Для простоты полагаем, что каждому контакту сопоставляется одинаковая энергия ассоциации на контакт, , из которой мы определяем через отношение Аррениуса . Во-вторых, вычисления ограничиваются только двумя микроскопическими константами прямых скоростей для нуклеации () и элонгации (), которые модифицируются соответствующими статистическими коэффициентами. В-третьих, сборка ограничивается только добавлением отдельных субъединиц, без (псевдо)высокоуровневых шагов элонгации. Наконец, должны быть сделаны некоторые предположения относительно выбора траекторий сборки, используемых в кинетических симуляциях: типичный капсид может иметь сотни или тысячи возможных траекторий сборки, проходящих через десятки и сотни промежуточных продуктов. Однако, первая и последняя реакции в сборке капсида имеют малое вырождение, наибольшее вырождение встречается, когда сборка завершена наполовину.

Есть две очевидные стратегии для ограничения количества траекторий, используемых в модели: 1) использование «лучших» путей и 2) использование «среднего» пути. В первой стратегии определяется мера «значимости», или вероятность траектории. Во второй определяется только один промежуточный продукт каждого размера, «средний» промежуточный продукт этого размера. Оба этих пути следуют линии наискорейшего спуска по энергии, причем нет энергетических минимумов, отличных от целого капсида; эти траектории близки к гладкой линии наискорейшего спуска на энергетической поверхности.

Одна из реализаций стратегии лучшей траектории - использование траекторий, проходящих через максимально устойчивые промежуточные продукты, msi-мера. Например, обычно есть две конфигурации тримера - открытая (линейная) и замкнутая (треугольная). Известно, что геометрия субъединицы допускает обе конфигурации, закрытая конфигурация обладает меньшей энергией, чем открытая, поскольку имеет одну дополнительную единицу энергии контакта. Msi-мера назначает меру 1 путям, выходящим из самых устойчивых промежуточных продуктов, и 0 остальным, удаляя их. Msi-мера используется для выбора промежуточных продуктов в додекаэдральной модели. По-прежнему, для учета вырождения нужны статистические коэффициенты.

В стратегии «среднего пути» энергия и вырождение распределены равномерно среди шагов вдоль одной траектории сборки, которая может быть, а может и не быть действительной траекторией. Хотя разработана версия икосаэдральной модели с msi-мерой, поведение msi модели незначительно отличается от версии со средней траекторией по отношению к концентрациям капсидов ([N]) и субъединиц ([u]). При создании среднего пути имеется 29 реакций, по которым распределяется энергия 60-и контактов. Шаг димеризации дает только дает только одну единицу энергии, т. к. имеет только один контакт. Следующие 26 шагов назначают по две единицы энергии (два межсубъединичных контакта на ассоциацию субъединицы), поскольку действительные траектории образуют от одного до трех контактов за шаг. Последние две субъединицы образуют три и четыре контакта при ассоциации и им назначаются три и четыре единицы энергии, соответственно. Вырождение реакции распределено аналогичным образом.

Кинетика сборки симулируется как концентрации видов [u], [2], …, [N], меняющиеся согласно дифференциальным скоростным уравнениям (37), из которых выделен типичный пример.

(29)

Это уравнение учитывает вклады ассоциации субъединицы с промежуточным продуктом (прямое f-слагаемое) и диссоциации (обратное b-слагаемое) в кинетику m-го промежуточного продукта. Статистические коэффициенты и подстраивают скорости для учета вырождения реакций. Константа обратной скорости для m-й реакции

(30)

вычисляется из прямой скорости (), энергии на контакт (из ), числа контактов r, разбиваемых при диссоциации m-й субъединицы, и вырождения обратной реакции .

Система скоростных уравнений (37), полученная из описанной формализации, не поддается точному решению. Решения были посчитаны с помощью BERKELEY MADONNA c численными методами интегрирования RK4 или метода Rosenbrock, и реализации Waterloo MAPLE интегратора RKF45.



Обзор кинетики сборки

Рис. 39. Кинетика сборки, посчитанная для икосаэдральной модели.

Сигмоидальная кинетика, демонстрируемая сборкой капсида (рис. 39), типична для синтеза продукта любой многоступенчатой реакции. Для сборки капсида три этапа кинетики (задержка, быстрая сборка, асимптотика) могут быть связаны с хорошо определенными характеристиками каскада реакций.

Фаза начальной задержки характеризуется последовательным построением промежуточных продуктов сборки. Каждый промежуточный продукт достигает пиковой концентрации и затем его концентрация медленно снижается к равновесной. Пока первый промежуточный продукт не начнет подходить к своей пиковой концентрации, капсиды производятся очень медленно. Фаза задержки может быть охарактеризована как начальный интервал, за который собирается «сборочная линия» промежуточных продуктов, близкая к устойчивому состоянию. В реакциях с компонентами элонгации и нуклеации, скорость элонгации явно влияет на длительность задержки.

Во время быстрой фазы кинетики происходит взрывной синтез капсидов, т. к. свободные субъединицы взаимодействуют с промежуточными продуктами, что дает почти устойчивое превращение массы свободных субъединиц в массу капсидов. Быстрая скорость синтеза капсидов поддерживается относительно высокими концентрациями свободных субъединиц и промежуточных продуктов. Во время этой фазы концентрации промежуточных продуктов сохраняются почти постоянными. Скорости нуклеации и элонгации дают вклад в наклон этой части кинетической траектории.

Получается, что вырождение пути сборки не является важной проблемой для симуляций, в которых концентрации промежуточных продуктов низки. Различные пути сборки ведут к малым изменениям концентрации различных промежуточных продуктов, но не субъединиц и капсидов. Обратные реакции несущественны в шагах элонгации до тех пор, пока реакции не достигнут равновесия. Поскольку все реакции сборки задействуют одну субъединицу за раз при почти одинаковых прямых скоростях, все возможные траектории занимают приблизительно одно и то же время, хотя некоторые траектории более вероятны, чем другие.

Асимптотическая фаза наступает, когда истощение запаса свободных субъединиц становится значительным. Низкая концентрация субъединиц вызывает низкую скорость образования ядер, что является главным регулирующим фактором в синтез капсидов.

Концептуально, нуклеация происходит, когда первые несколько промежуточных продуктов в последовательности реакции менее устойчивы, чем последующие продукты. Нуклеация сферического полимера может зависеть от образования примитивной замкнутой структуры, такой как первая грань или вершина полиэдра. Энергетически, реакции нуклеации могут отделяться от последующих реакций элонгации более медленной прямой скоростью и (или) меньшей энергией ассоциации. Для простоты, выбран отделенный по скорости шаг нуклеации, поскольку результаты незначительно зависят от механизма отличий элонгации от нуклеации.

Симуляции реакций менее подвержены попаданию в кинетические ловушки, когда сборка регулируется шагом нуклеации. Реакции нуклеации могут дать почти равновесные концентрации капсидов без попадания в ловушку, несмотря на относительно высокие энергии ассоциации, высокие начальные концентрации субъединиц и большие скорости. Устойчивость к кинетическим ловушкам приводит к предотвращению перенасыщения сборки. Поскольку прямая скорость пропорциональна концентрации субъединиц, когда концентрация субъединиц слишком высокая, практически все субъединицы собираются в промежуточные продукты при отсутствии шага регуляции. В реакциях нуклеации, или в реакциях, «автостерично» регулируемых устойчивостью пригодных и непригодных к сборке форм субъединиц, несвязанная субъединица содержится в резерве. Введение непригодных к сборке подвидов является не более чем формальным добавлением медленного начального шага реакции первого порядка. С математической точки зрения неудивительно, что эти механизмы ограничивают попадание в ловушку, поскольку вводят медленные координаты в ранние уравнения каскада сборки.

Нуклеация и линия сборки в устойчивом состоянии

При отсутствии регулирующего шага, успешная сборка требует баланса между концентрацией белка и энергией ассоциации. При увеличении близости контакта, , или начальной концентрации субъединиц, , количество субъединиц в линии сборки возрастает. Во время фазы быстрой сборки субъединицы можно считать превращающимися через сборочную линию «напрямую» из свободного в связанное в капсиде состояние. Концентрации промежуточных продуктов находятся в почти устойчивом состоянии. Когда или слишком велико, сборка перенасыщена, слишком большая масса включена в сборочную линию, из-за этого реакциям не хватает свободных субъединиц, что приводит к кинетической ловушке. Наоборот, слишком малая масса в сборочной линии приводит к медленной реакции, которой не хватает промежуточных продуктов. Поскольку производство капсидов медленно из-за той или иной крайности, имеется оптимальная концентрация промежуточных продуктов для устойчивого состояния для при некотором значении (рис. 41).

В сборке с нуклеацией концентрация свободных субъединиц падает более медленно, чем при сборке без регулирующего шага. Сборка с нуклеацией устойчива по отношению к кинетически ловушкам, но не невосприимчива к ним. Степень устойчивости зависит от разделения между фазами нуклеации и элонгации. Например, если отношение констант прямой скорости , сборка может быть исключительно устойчива к попаданию в ловушку, если , реакция отражает EQ сборку и может легко попасть в ловушку. Более слабая энергия контакта для реакций нуклеации усиливает устойчивость сборки с нуклеацией к кинетическим ловушкам.

Рис. 40. Изотерма сборки для икосаэдральной модели. Массовая доля капсидов - сплошная линия, массовая доля свободных субъединиц - пунктирная линия.



Рис. 41. Энергия на контакт, , посчитанная при , наблюдаемой в конце симуляций для додекаэдральной (пустые значки) и икосаэдральной модели (закарашенные значки). Использовались .

Константы ассоциации вычислялись из уравнений (24), (25) и преобразовывались в единицы энергии с помощью , где , R - газовая постоянная, равная . Симуляции для модели 12-меров соответствуют -2,5 (круги), -2,7 (квадраты) и -3,4 (треугольники) ккал/моль. Симуляции для модели 30-меров были посчитаны для -3,4 (круги), -4,1 (квадраты) и -4,8 (треугольники) ккал/моль.

Явная и псевдокритическая концентрация

При увеличении равновесная концентрация капсидов быстро возрастает из-за высокой степени ур. (24). Как показано на рис. 40, точна максимальной чувствительности к изменению хорошо аппроксимируется (ур. (25)), концентрации субъединиц, при которой равновесные концентрации капсидов и субъединиц равны. Поскольку вычисляется на молярной основе, начальная концентрация, требуемая для достижения равна . В этих моделях - псевдокритическая концентрация (рис. 40). Из ур. (24) ясно, что концентрация свободных субъединиц будет изменяться, хотя медленно, для . Поскольку увеличивается медленно как функция от , создается видимость постоянной , приближаемой .

может быть оценено с помощью кинетических траекторий на больших временах.

Реакция должна находится в равновесии для точного определения энергии ассоциации, хотя кинетические симуляции реакции сборки вирусов достигают равновесия асимптотически (см. рис. 39). Проведены симуляции на длительных временах для наблюдения, как близко они подходят к состоянию равновесия и проверки оценок парной энергии ассоциации, . Реакции симулировались для диапазона значений . Для любой фиксированной концентрации, реакции при умеренной быстро достигают равновесия, при бо'льших значениях реакции склонны к попаданию в ловушку. Попадание в ловушку происходит, когда концентрации реактантов так малы, что бимолекулярные реакции не протекают с значимой скоростью.

Когда кинетика сборки достигает равновесия, концентрация капсидов изменяется очень медленно. Примерные значения вычислялись с концентрациями капсидов [N] и субъединиц [u], измеренных за длительное время при их равновесных значениях в ур. (24), (26), (27). Промежуточные продукты не включались в эти вычисления, чтобы сделать результаты более «реалистичными», поскольку концентрации промежуточных продуктов ожидаются такими малыми, что их нельзя определить. В длительных симуляциях с умеренной оцениваемая энергия на контакт, была найдена с точностью до 10%. Оценки для реакций с бо'льшими энергиями ассоциации дают худшие аппроксимации, поскольку эти реакции нарушаются, когда начинает ощущаться недостаток субъединиц и промежуточных продуктов в течении длительного времени. Это происходит из-за того, что большая отвечает очень низкой равновесной концентрации субъединиц, (ур. (24) и (26)), так что реакции достигают состояния недостатка субъединиц и останавливаются, не достигая равновесия. Оценка несколько более точная при малом начальном числе субъединиц даже при том, что более высокие начальные концентрации субъединиц дают более высокую молярную долю капсидов. Это выглядит непонятным в свете остановки из-за недостатка субъединиц, однако, это просто результат того, что ближе к, когда мало. Для додекаэдральной модели оценка получается точнее, чем для икосаэдральной (рис. ), поскольку геометрия субъединиц дает меньшую для заданной , как можно видеть из ур. (25) и (27).

додекаэдральная модель (31)

икосаэдральная модель

В любом случае, намного ниже, чем приведет к останову реакции.

Скорость нуклеации может быть определена из скорости образования капсидов.

Шаг регуляции глубоко влияет на кинетику сборки. Для сборки с нуклеацией размер ядра и скорость нуклеации должна приниматься во внимание. Рассматривается случай, когда нуклеация протекает от медленной ассоциации субъединиц к образованию метастабильного ядра.

Когда реакция достигает асимптотической фазы, сборочная линия промежуточных продуктов все еще находится в активном состоянии, хотя скорость производства капсидов падает. Поскольку каждое новое ядро входит в сборочную линию и проходит ее, образуя ядро, утверждается, что скорость образования капсидов пропорциональна скорости образования ядер. Более точно, константа средней прямой скорости для шагов нуклеации пропорциональна скорости образования капсидов, деленной на . Это выражается в виде

(32)

где - равновесная константа для образования [nuc - 1]. Значение является коэффициентом в ур. (28). Можно прийти к ур. (32), поскольку в сборке с нуклеацией 1) реакции элонгации обязательно однонаправлены, 2) начиная с относительно раннего времени, промежуточные продукты ядра оказываются почти в своих равновесных концентрациях. Ур. (32) выполняется при ранних временах в асимптотической фазе, до того, как промежуточные продукты в сборочной линии начнут разбираться. При этих условиях, почти каждое образованное ядро приводит к формированию целого капсида, т. е. скорость образования капсидов примерно равна прямой скорости образования ядер.

При заданном размере ядра геометрия ядра и статистические коэффициенты могут быть выведены. Значение может быть вычислено из и статистических коэффициентов. Ур. (32) тогда становится уравнением с одной неизвестной - . На рис. 42 показано отношение

(33)

посчитанное с использованием трех значений . Рис. 42 отражает влияние уменьшения прямой скорости нуклеации на это отношение. Значение отношения не зависит от концентрации после того, как реакция достигает устойчивого состояния. Высота плато в каждом случае равна константе прямой скорости, , умноженной на . Нужно обратить внимание, что оценка зависит только от скорости нуклеации, но не от скорости элонгации. В симуляциях с фиксированной скоростью нуклеации и варьируемой скоростью элонгации, высота плато остается постоянной. Вообще, независимость концентрации от величины, посчитанной из данных, зависящих от концентрации, означает, что величина является параметром системы. В этом случае, независимость концентрации на графиках показывает зависимость отношения (33) от коэффициентов в уравнениях (37), но не от начальных условий.

Рис. 42. Скорость образования капсидов по отношению к скорости нуклеации. Значение принималось равным (A), (B), (C). , .



Размер ядра может быть определен из зависимости концентрации от величины сборки

Симуляции показывают, что размер ядра не может быть точно определен поиском лучшего приближения к экспоненте в ур. (32). Разработана чувствительная оценка для размера ядра. Анализ основывается на двух предположениях 1) отношение в ур. (33) не зависит от , и 2) реакции находятся в переходном устойчивом состоянии, в котором образование капсида равно удалению свободной субъединицы (ур. (34)).

(34)

Результаты показывают, что размер ядра оказывается временным минимумом функции

(35)

Функция L - это наклон графика ln[N] к ln[u] в одно время на диапазоне начальных концентраций белков, . Минимум может быть найден только для семейства реакций, находящихся одновременно в устойчивом состоянии. Это значит, что есть диапазон времен и концентрации, для которого функция L вблизи своего минимума аппроксимирует размер ядра.

Рис. 43 показывает график функции L на диапазоне времен и концентраций для икосаэдральной модели с размером ядра nuc = 3. Минимальное значение L мало отличается от размера ядра. Рис. 43 показывает серии симуляций, используемых для вычисления поверхности на рис, при этом затененная область очерчивает домен, в котором размер ядра аппроксимирован с точностью до 0,33. Размер ядра однозначно аппроксимируется на довольно широком диапазоне начальных концентраций в ранее время. Для меньших концентраций, аппроксимация выполняется и при более поздних временах. Рис. показывает поверхности для размеров ядер 3, 4, 5 в додекаэдральной модели.

Рис. 43. Определение размера ядра для икосаэдральной модели. Минимум функции L задает оценку размера ядра. (A) Поверхность L (светло-серый цвет) показана для . (B) Соответствующие кинетические симуляции показывают, где (серая область) размер ядра оценивается с точностью .



Рис. 44. Определение размера ядра трех различных семейств симуляций для додекаэдральной модели.

Кинетика элонгации наиболее видна на ранних фазах реакций сборки

Рис. 45. Влияние скорости элонгации наиболее заметно на ранних фазах сборки. (A) скорость элонгации варьируется при постоянной начальной концентрации субъединиц.

Скорости элонгации равны , , и слева направо, скорость нуклеации равна . (B) - (E) Семейства кинетических симуляций, где равняется 20, 10, 6 и 2 мкМ, соответствуя , равным 0,063, 0,032, 0,019, 0,0063. Для этих реакций равняется , , и . Все расчеты проводились для модели 30-мера с ядром - триммером, , .

Рассмотрение симуляций кинетики (рис. 39) показывает, что фаза задержки обусловлена временем, требуемым для сборки промежуточных продуктов. На длительность этой фазы влияет размер ядра, скорость нуклеации, устойчивость промежуточных продуктов, входящих в состав ядра (т. е. ), и скорость элонгации. Симуляции показывают локализованную зависимость длительности задержки от скорости элонгации, , если другие параметры остаются постоянными,. Заметим, что различные симуляции сливаются при более длительных временах, когда скорость нуклеации регулирует скорость образования капсида. При проверке диапазона концентраций субъединиц, влияние на длительность задержки наиболее наглядно при низких (рис. ). Изменение времени задержки показывает, что возможно аппроксимировать подбором кривой.

Для маленьких ядер в больших капсидах становится важнее из-за большого числа шагов после нуклеации. Скорость элонгации в основном регулирует фазу задержки, а скорость нуклеации регулирует все фазы (37). Поскольку скорость нуклеации влияет на все фазы, она аппроксимирует коэффициент масштабирования общего времени симуляции.

Математические подробности

В самом общем случае кинетика модели описывается системой уравнений:

, (36)

где - заданные концентрации реактантов и продуктов, а V задает скорости изменения видов. Конкретный вид V определяет особенности каскада реакций. Ур. (36) решается для серии времен , где координаты - концентрации в заданное время, а - вектор начальных концентраций.

Для упрощения модели, введены предположения: 1) за один раз возможно присоединение лишь одной субъединицы, 2) все виды содержат разное количество субъединиц, 3) имеется идеальная геометрия ассоциации, при которой изоэнергетические контакты приводят к одинаковому продукту и 4) все энергии аддитивны. При этих предположениях, система уравнений (36) принимает вид:

(37)

Коэффициенты обратной реакции определяются как

, (38)

где задает число контактов, которые необходимо разбить, чтобы диссоциировать субъединицу из m-того промежуточного продукта с .

Уравнения (37) решаются для начального условия , т. е. реакция начинается исключительно со свободных субъединиц. Для каждого решение достигает равновесия , полученного явно решением алгебраической системы при выполнении уравнения сохранения массы

. (39)

Масштабирование кинетики сборки

Уравнение сохранения (39) инвариантно относительно произвольного масштабирования времени и массы. Решения дифференциальных уравнений (37) таковыми не являются, хотя они почти инвариантны относительно преобразования

(40)

Преобразованные уравнения идентичны уравнению (36), за исключением дополнительного коэффициента , появляющемся в каждом слагаемом для обратной реакции. Например, результат применения этого преобразования к типичному уравнению из (37):

приводит к

.(41)

Обратные слагаемые в преобразованных уравнениях наименее значимы, когда 1) траектория сборки распределяет не менее двух контактов за шаг, 2) , 3) имеется запас свободных субъединиц и 4) . Первое условие вызвано тем, что обратные слагаемые будут содержать по меньшей мере один дополнительный коэффициент , аннулирующий , появляющийся при преобразовании, когда имеется контактов, образующихся в данной реакции (38). Далее, условия 2) и 3) вызваны тем, что прямые слагаемые инвариантны относительно преобразования и имеют преобладающее влияние в скоростных уравнениях. Требование из пункта 4) специфично для начального шага димеризации, где имеется только один контакт, r = 1.

Масштабирование (37) упрощает сравнение временных серий и соответствующих количественных параметров реакции с изменением энергии контакта с использованием как единицы концентрации. Масштабирование оказывается почти точным во время задержки, стадии быстрого роста, и начала асимптотической фазы, когда прямые слагаемые являются определяющими и запас субъединиц не слишком истощен. После истощения субъединиц, как только реакция достигнет равновесия, обратные слагаемые приобретут большее значение, и инвариантность (37) относительно преобразования (40) станет менее точной.

Изоляция скорости нуклеации

После пика во время фазы быстрого роста, концентрации промежуточных продуктов падают экспоненциально до равновесных значений. Для m-го промежуточного продукта вытекает, что

(42)

где и обозначают концентрации при равновесии и при времени , после которого аппроксимация действительна с некоторой заранее заданной относительной ошибкой. Собирая вместе соответствующие аппроксимации (42) для последовательных промежуточных продуктов, получаем (используя (28) и устанавливая общее изменение количества контактов между субъединицами )

(43)

С улучшением аппроксимации при времени . Данные стандартной многоступенчатой сборки, изображенные на рис., показывают, почему быстро увеличивается с m, т. е. высшие промежуточные продукты могут быть построены только из низших, поэтому приближение (43) становится точным намного быстрее для ранних промежуточных продуктов. В частности, ур. (43) становится действительным для компонентов ядра намного раньше, чем оно будет выполняться для ядер и промежуточных продуктов элонгации. При стабилизации сборочной линии, концентрации компонентов ядра будут соблюдать отношения, приближенные к условиям равновесия, что может быть записано как

(44)

Кроме того, для сильной прямой реакции, пока не слишком мало, т. е. до более поздней части асимптотической фазы, слагаемые прямой реакции будут стремиться преобладать в правой части

(45)

С начала фазы быстрой сборки, пока масса, связанная в сборочной линии, остается приблизительно постоянной, концентрации промежуточных продуктов находятся в устойчивом состоянии, и, в частности, является почти постоянной. При этих условиях обратные слагаемые пренебрежимо малы. Это значит, что почти каждое образованное ядро провидит к образованию следующего более крупного промежуточного продукта. То же можно сказать про все последующие промежуточные продукты, поэтому каждое ядро приводит к образованию капсида. Скорость производства капсидов тогда оказывается примерно равной прямой скорости образования ядер, и мы имеем

(46)

Последовательная подстановка для , , … в ур. (46) с использованием аппроксимации (44) дает

(47)

Константы определяются геометрией капсида и находятся обратной подстановкой в (37) при равновесии. Когда запас субъединиц истощается, устойчивое состояние сборочной линии и оценка (46) постепенно нарушается.

Оценка размера ядра

Последняя часть исследования посвящена зависимости и от t и . Рассматриваются симулированные реакции, в которых имеется большое начальное количество субъединиц, и которые затем быстро входят в устойчивое состояние, в котором концентрации промежуточных продуктов медленно меняются. При этих условия выполняется (47) и отношение

(48)

не зависит от для . Кроме того, масса, связанная в сборочной линии, почти постоянная, так что и масса, не занятая в сборочной линии (капсиды и субъединицы) также почти постоянна, что приводит к

(49)

В симуляциях точность аппроксимации (49) также не зависит от для достаточно большой , чтобы задавать сборку (для реакций с у сборочной линии нет устойчивого размера, поскольку нет фазы быстрого роста). Решая (49) относительно , разделяя на и дифференцируя по , получаем

что приводит к условиям

При этих условиях также имеем

Разделив эти выражения и поменяв порядок производных, получаем

(50)

Теперь допустим, что для каждого в момент времени

(51)

Тогда в момент времени в силу (51) ур. (50) будет иметь вид

которое может быть решено

и приближение

(52)

выполняется с , если при . Значение является искомым размером ядра.

Как найти время , для которого выполняется аппроксимация? - временной минимум функции

достигаемый во время устойчивого состояния при . Для того, чтобы убедиться в этом, продифференцируем L по t

(53)

Эта производная равна нулю при , когда достигается временной минимум L в реакции с начальной концентрацией . Следовательно, числитель (53) должен быть нулем.

Условия, при которых не зависит от , сохраняются в течение длительного временного интервала, но начало этого интервала откладывается при уменьшении . Когда мало по сравнению с , сборочная линия перестает существовать. Чтобы выполнялось (49), общая масса, удерживаемая в промежуточных видах должна быть постоянной.

Сборочные каскады подвержены истощению и кинетическим ловушкам. Для , реакции истощаются из-за недостатка свободных субъединиц, для достаточно большой [u] реакции хорошо снабжаются доступными свободными субъединицами. Для , имеются в избытке, пока не наступит перенасыщение сборки, приводящее к кинетической ловушке. В истощившейся реакции нет избытка массы субъединиц для передачи через сборочную линию, поэтому диссоциация промежуточных продуктов становится существенным источником массы для производства капсидов [45].

МОДЕЛИРОВАНИЕ КИНЕТИКИ СБОРКИ, ОСНОВАННОЕ НА ЛОКАЛЬНЫХ ПРАВИЛАХ

Сборка в этой модели происходит согласно шаблонам локальных правил связывания. Субъединицы задаются объединением сфер, обладающими массой, заданным радиусом и конфигурацией связывания. В простейшем случае, субъединица моделируется как одиночная сфера с множеством связей, каждая из которых представляет потенциальное взаимодействие связывания с другой субъединицей. Взаимодействия связывания моделируются связями, образующимися между отдельными субъединицами. Связь характеризуется длиной, направлением, вращательным вектором, парой энергий активации для реакций ассоциации и диссоциации, набором упругих констант, используемых для моделирования сил, вызванных взаимодействиями связывания, множеством допусков и множеством допустимых соседей. Связи присоединяются, или разъединяются вероятностно, согласно их характеристическим энергиям, и расположению в заданных допусках. Для связи с энергией ассоциации E и энергией диссоциации -E_d вероятность образования связи с другой связью разрешенного типа в заданном допуске составляет и вероятность разрушения существующей связи , где - константа Больцмана и T - температура. Конформационное переключение реализуется разрешением субъединицам принимать различные формы с характеристической энергией. Переключения субъединиц между разрешенными формами вероятностны и согласуются с больцмановским распределением энергий. Вероятность того, что субъединица займет конформацию k на определенном временном шаге задается формулой: , где - энергия i-й конформации. Если субъединица образовала связи, то энергии этих связей добавляются к энергии текущей конформации, поскольку связи должны быть разрушены, чтобы произвести конформационное переключение.

Основными силами, действующими на субъединицу, являются силы, вызванные ее соседями. Каждая связь имеет силы, стремящиеся придать связи идеальное значение. Они моделируются тремя упругими элементами, представляющими силу переноса, F_t, момент вращения вокруг связи, T_t, и момент изгиба, T_s, который распрямляет связи. Эти силы вычисляются из следующих уравнений:

Здесь , , - упругие константы, и - конечные точки связей один и два, и - вращательные векторы, определяющие желаемые относительные вращения двух субъединиц вокруг связей, и - направления связей. Конечные точки связей определяют оптимальные относительные позиции двух связанных субъединиц.

Столкновения между двумя субъединицами или между субъединицей и искусственной границей вокруг симулируемого раствора дают второй класс сил. Когда две сферы сталкиваются, они прикладывают друг к другу силы, равные , где - константа, установленная как 50000 а. е. м. нм/мкс², - вектор между центрами сфер, - их радиусы. Аналогично, когда сфера сталкивается с границей, граница прикладывает к сфере силу, равную , где M - масса субъединицы, r - радиус сферы, o - расстояние, на которое перекрывается граница сферы с границей симулируемой области. Такие силы выбраны методом проб и ошибок, чтобы дать разумное поведение при столкновениях, и одновременно, чтобы иметь не слишком высокую вычислительную стоимость.

Последний класс сил взят из модели броуновского движения, чтобы сохранять среднюю кинетическую энергию частиц близко к константе в течение длительного периода времени. Модель содержит две силы - демпфирующую силу и случайную силу с адаптивной величиной, введенную для увеличения кинетической энергии. Демпфирующая сила на каждом шаге времени вычисляется присваиваниями

,

где - скорость, - угловая скорость, M - масса субъединицы, I - момент инерции субъединицы относительно ее оси вращения, d - определенная демпфирующая постоянная. Демпфирующая сила стремится уменьшить энергию в симуляции. Случайная сила добавляет малые возмущения в скорость субъединицы, а их распределения адаптивно выбираются стремящимися увеличить энергию субъединицы. Вместе эти две силы предотвращают ошибки вычислений, заключающиеся в постепенном увеличении или уменьшении средней кинетической энергии в ходе симуляции, и в то же время, не вносят значительных изменений в траектории сборки.

Основной вычислительной проблемой является интегрирование уравнений движения, основанные на уравнениях, описанных выше. Уравнения движения могут быть записаны в терминах векторов скоростей, , и позиций, , как два дифференциальных уравнения:

,

где вычисляет ускорения, основанные на текущих позициях и скоростях. Общий подход - это адаптивный метод Эйлера с экстраполяцией Ричардсона. Метод допускает распареллеливание с помощью многопоточной системы Cilk.

Метод Эйлера - это простейший метод численного интегрирования, вычисляющий симулируемое состояние в будущий момент времени, исходя из состояния в текущий момент. Прямой метод Эйлера для интегрирования скорости сочетается с боратным методом Эйлера для интегрирования позиции, что дает следующую пару шагов итерации:

Это дает приближение первого порядка, которое требует одно вычисление функции за шаг.

Из-за нерегулярной природы задачи, эта схема интегрирования изменена, и в ней применяется адаптивный размер шага. Когда симулятор пытается перейти на один шаг по времени, сначала решается задача при единичном размере шага. Затем повторяется вычисление для всех субъединиц при размере шага 0,5. Затем делается проверка на сходимость, то есть проверяется, не слишком ли велика разность между полученными результатами. Если две полученные величины лежат вне определенного пользователем допуска, то вычисление повторяется еще раз с вдвое уменьшенным размером шага, т. е. с размеров шага 0,25 от единичного. Процесс продолжается до тех пор, пока тест на сходимость не даст успешный результат. Хотя этот процесс не дает гарантии ограничения ошибок, он устанавливает примерную границу значений численных ошибок.

Следующее усложнение - применение экстраполяции Ричардсона. Это прием, который сочетает низкоуровневые представления для получения высокоуровневого представления. Он сочетается с адаптивным размером шага, так что значения для различных размеров шагов экстраполируются для получения n-кратной аппроксимации при использовании n различных размеров шагов. Поскольку есть вероятность вмешательства в интерполяцию скачкообразных сил, симулятор пытается строить экстраполяцию с k наименьшими доступными размерами шагов для каждого k, и использует любое из сходящихся, предпочитая значения большего порядка, если более, чем одно экстраполируемое значение сходится на данном шаге.

Каждый запуск симуляции набор субъединиц, представляющих белки оболочки, которые свободно перемещаются в симулируемом растворе. Субъединицы способны образовывать взаимодействия связывания друг с другом, согласно локальным правилам, определяющим разрешенные шаблоны связывания, снабженные определенными допусками на углы и расстояния. Хотя идеальные правила для капсида T = 1 могут дать только корректно сформированные капсиды T = 1, допуски и гибкость существующих взаимодействий связывания допускают неоптимальное связывание, которое приводит к «уродливым», капсидам, т. е. капсидам с нарушенной геометрией. Симуляция может приостанавливаться для записи данных текущего состояния популяции, что позволяет записывать количество субъединиц, находящихся на правильной траектории сборки, и вне ее, через регулярные промежутки времени.

В модели субъединицы имели две конформации: более устойчивую несвязывающую конформацию м потенциальной энергией -2 ккал/моль и неустойчивую связывающую конформацию с нулевой потенциальной энергией. Субъединица представлялась одиночной сферой с массой 100000 а. е. м., и диаметром 3 нм в несвязывающей конформации и 1 нм в связывающей конформации. Разные размеры были выбраны исключительно для удобства наблюдения. Параметры, ассоциированные с взаимодействиями связывания выбраны эмпирически так, чтобы позволить быстрый рост капсида и одновременно низкий уровень «уродливых» капсидов. Базовые энергии связывания, которые управляют вероятностью образования связей, когда частицы находятся в пределах геометрических допусков, и вероятностью последующего разрыва связей, установлены в -8500 ккал/моль. Выбраны угловой допуск в 30 и допуск базового расстояния в 10 нм. В тестах использовалось 300 субъединиц. Размер симулируемой области составлял 125 нм по каждому измерению давая концентрацию 2,4710^-4 моль/л. Такая высокая концентрация, по сравнению с наблюдаемой в экспериментах, выбрана, чтобы ускорить рост капсидов для экономии машинного времени. Однако, авторы модели полагают, что результаты будут при таком допущении качественно аналогичны результатам, полученным при значительно меньших концентрациях, но большем времени симуляции с подстройкой энергий связывания.

...