Исследование проблемы моделирования феномена



Рис. 18. Модель полиовируса капсида, состоящий из 12 одинаковых частей с магнитами, прикрепленными по краям.

Рассмотрим теорию, описывающую механизмы самосборки структур вирусных капсидов в рамках теории кристаллизации Ландау.

Хиральный пентагональный порядок вирусных оболочек семейства Паповавирусов объясняется в рамках классической теории упругости квазикристаллов нелинейной фазонной деформацией, конечной причиной которой является обычная неоднородная деформация додекаэдрических граней капсида, возникающая в результате их выпучивания.

Теория, объясняющая процессы формирования капсидов вирусов, как со сферической, так и с промежуточной формой со слабо выраженной огранкой, разработана на основе обобщения и объединения подхода, описывающего процессы формирования капсидов семейства Паповавирусов, с концепцией образования капсидов малых вирусов в рамках теории кристаллизации Ландау.

1. В рамках теории кристаллизации Ландау путем минимизации соответствующей свободной энергии с учетом простейших ограничений на относительное расположение структурных единиц в квазикристаллической фазе построены квазикристаллические решетки с октагональной и декагональной симметрией.

2. Разработана концепция нелинейных фазонных деформаций в рамках классической теории упругости квазикристаллов, позволяющая рассчитать расположение белков и, таким образом, объяснить формирование капсидов вирусов семейства Паповавирусов.

3. Предложен основанный на принципах квазиэквивалентности геометрический тайлинговый подход для описания капсидов малых вирусов со сферической топологией.

4. Построена объединенная теория формирования структур малых и средних вирусов, основанная на теории кристаллизации Ландау и минимизации фонон-фазонной энергии вирусного квазикристаллического порядка [38].

теория сборки, основанная на локальных правилах

Рассмотрим теперь более подробно теорию локальных правил, которая лежит в основе предыдущей модели.

Для любого возможного размера капсида икосаэдрального вируса существует одно или несколько возможных множеств локальных правил, по которым этот капсид строится. Предполагается, что идентичные субъединицы белка принимают небольшое число различимых конформаций. Для каждой конформации локальные правила определяют, с какими конформациями допустимо связывание, и приблизительные углы и расстояние между субъединицами. Соблюдая эти правила, субъединицы образуют замкнутую икосаэдральную оболочку определенного размера.

Теорию локальных правил можно проиллюстрировать на примере оболочки бактериофага P22, который является T = 7 вирусом. Семь конформаций, или форм белковых субъединиц наблюдались в предкапсиде вируса P22, хотя не совсем ясно, все ли они различны. Вначале предположим, что действительно, имеется семь различных конформаций. Рассмотрим рис. 1919. На схеме вверху слева показано правило, по которому происходит связывание одной из конформаций, назовем ее первой. Первая конформация имеет позицию взаимодействия с конформацией второго типа и две позиции для взаимодействия с конформацией первого типа. Аналогично, локальные правила могут быть построены для всех семи конформаций субъединиц фага P22. Когда субъединица участвует хотя бы в одном взаимодействии связывания, эти правила могут применяться однозначно, определяя оставшихся соседей субъединицы. Различные порядки применения локальных правил задают возможные пути, по которым может протекать сборка.

Рис. 19. Локальные правила взаимодействий для сборки фага P22.

Возникает вопрос, какие структуры могут быть построены при выполнении этих локальных правил? Применение локальных правил к произвольному начальному белку может привести только образованию T = 7 оболочки или ее части. Для проверки этого факта можно использовать компьютерное симулирование.

Симуляция работает следующим образом: устанавливается энергетическая модель, при предположении, что имеется квадратичный штраф при отклонении от заданных в правилах углов и расстояний. Существующая позиция взаимодействия выбирается для присоединения следующего белка. Если в существующей структуре на расстоянии до одного диаметра белковой субъединицы нет белков-кандидатов, способных присоединиться, добавляется новый белок. Локальные правила определяют конформацию и положение каждого нового белка. После добавления белка, получившаяся структура оптимизируется, что минимизировать энергию по итеративному алгоритму. На каждом шаге, все белки двигаются согласно силам и моментам, вычисленным в энергетической модели. Позиции взаимодействия рассматриваются в случайном порядке, и по методу поиска в ширину, в обоих случаях результатом симуляции будет образование замкнутой оболочки.

Вычисления показывают, что локальные правила относительно устойчивы. Даже если нарушить каждый угол в правилах на рис.19 на 9.60 (около 8%) и на 8% длину каждой связи, то это приводит к образованию почти идентичной замкнутой оболочки в трехмерном пространстве. Если нарушить углы на 10%, оболочка не замыкается в приблизительно половине попыток, но, тем не менее, выглядит похожей на эталон при успешном замыкании. При более существенных (неслучайных) изменениях локальных правил, оболочка вируса может принять как сферическую, так и спиральную форму.

Рассуждения, приведенные выше, наводят на мысль, что замыкание капсида легко гарантировать. Но на самом деле симуляции показывают, что нарушение формы растущего капсида и образование спирали могут произойти, если локальные правила разбиты всего один раз. Такие некорректно образованные структуры наблюдались для P22 и других вирусов.

Локальные правила могут помочь в определении вирусных структур.

Рис. 20. Пример множества правил взаимодействия для T = 7 вируса с 4-мя конформациями [39].

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВА ПАРАМЕТРОВ ПРИ САМОСБОРКЕ

Производилось исследование пространства параметров модели сборки икосаэдральных вирусных капсидов как функций скоростей связывания мономеров. При этом обнаружилось три основных механизма сборки: стандартный путь приращения мономеров и две различных иерархические траектории сборки, кроме того, существуют области, в которых имеются кинетические ловушки. Имеются граничные участки, в которых вероятно встречаются и гибридные пути. Рассматривалась октамерная и икосаэдральная модели, при этом октамерная система оказалась менее чувствительной к изменению параметров системы. Модели наводят на мысль, что умеренные изменения условий сборки, согласующиеся с ожидаемыми различиями между сборкой in vivo и in vitro, могут дать значительные сдвиги в траекториях сборки. То есть, следует быть осторожными в выводах при сравнении динамики сборки in vivo, in vitro, и в различных вычислительных моделях.

При моделировании использовалась модель Гиллеспи, представление химии стохастических реакций, основанное на марковской модели с непрерывным временем, представляющей возможные траектории системы реакций с конечным числом промежуточных видов. Модель Гиллеспи реализована алгоритмом, основанным на очередях для быстрой, эффективной по памяти симуляции систем с большими количествами различимых промежуточных продуктов. Здесь применяются локальные правила взаимодействия, в которых назначаются, помимо допустимых соседей, константы скорости реакции. Эти правила для субъединиц определяют все структуры и реакции, которые возможны в системе. Для корректирования скорости диссоциации, симулятор запускался с опцией, запрещающей диссоциацию субъединиц, удерживаемую несколькими взаимодействиями, пока все, кроме одной, соседние субъединицы не отсоединятся от сборки первыми.

Системы параметризовались двумя константами прямой скорости и двумя константами обратной скорости для двух типов взаимодействия связывания. Мы обозначаем четыре константы скорости k_a+ (константа прямой скорости интракапсомерных взаимодействий), k_a- (константа обратной скорости интракапсомерных взаимодействий), k_r+ (константа прямой скорости интеркапсомерных взаимодействий), k_r- (константа обратной скорости интеркапсомерных взаимодействий). В моделях рассматриваются фиксированные константы обратных скоростей и варьируются константы прямых скоростей. Каждый прогон системы длился до достижения псевдоравновесного состояния.

На рис. показан конечный выход (Y) целых продуктов (октамеров или икосаэдров) в равновесии и время достижения половины этого выхода (T₅₀) как функция от интер- и интракапсомерных скоростей связывания. Рисунки a и c относятся к октамерной модели. Когда обе скорости высокие, мы наблюдаем область низкого выхода, согласующуюся с прежними свидетельствами высокой вероятности попадания в кинетическую ловушку. Хотя выход в этой области мал, общая скорость роста велика, как вытекает из малого T₅₀ в передней области c. Напротив, когда обе скорости малы, наблюдался почти стопроцентный выход, но за более длительное время сборки, как и ожидалось. Две различные плоские области высокого выхода наблюдаются в левой и правой частях рисунков, справа отвечающей низкой скорости интракапсомерного связывания, но высокой скорости интеркапсомерного связывания, и слева, отвечающей высокой скорости интракапсомерного связывания, но низкой скорости интеркапсомерного связывания.



Рис. 21. Зависимость конечного выхода и времени, требуемого для половины от конечного выхода от скоростей связывания.

Меньшая из двух скоростей является ограничивающей в каждом из этих доменов, поскольку Y и T₅₀ нечувствительны к дальнейшему увеличению большей скорости. Выход оказывается постоянным и в левой, и в правой частях рассматриваемого пространства, хотя выход в левой области заметно выше, чем в правой. Имеется непрерывный переход между этими областями через третью область высокого выхода, где скорости близки (сзади на рисунке). Скорость и выход чувствительны к изменениям каждого параметра в этой области. Имеется постепенное уменьшение выхода и T₅₀ при увеличении параметров по направлению к передней части рисунков. Мы можем частично интерпретировать этот рисунок в терминах главных траекторий сборки, которые мы ожидали бы в различных точках пространства параметров.

Рассмотрим сначала сборку октамеров. Когда интеркапсомерные скорости значительно выше интракапсомерных скоростей, мы ожидаем иерархический механизм сборки, в котором будут быстро накапливаться димеры, за формирование которых отвечают интеркапсомерные скорости, до сборки октамеров из димеров через нуклеацию тетрамеров. Авторы называют этот тип сборки иерархической сборкой первого типа. Эта траектория отвечает области плато с правой стороны на рисунке a и c. Поскольку быстро производящиеся димеры являются строительными блоками для образования октамеров, некоторое количество гексамеров образовалось бы и продолжило свое существование в псевдоравновесном состоянии, когда не останется димеров, чтобы расширить гексамеры до октамеров. Тогда эти гексамеры окажутся кинетической ловушкой, вызывая наблюдаемое уменьшение выхода октамеров в таком домене параметров.

Когда интракапсомерные скорости выше, мы ожидаем быстрое накопление тетрамерных «капсомеров» в четырехступенчатой реакции, за которой следует накопление пар тетрамеров в октамеры за один дополнительный шаг. Мы называем это иерархической сборкой второго типа. Она соответствует области плато с левой стороны рисунков a и c.

Когда скорости примерно равны, мы ожидаем стандартную одношаговую сборку с ограниченной нуклеацией, где за четырехступенчатой нуклеацией тетрамеров следует двухступенчатая элонгация присоединением мономеров. Ядра могут быть капсомерами или гетерогенными тетрамерами. Мы называем этот неиерархический механизм сборкой третьего типа. Он отвечает области прямо посередине графиков.

Несмотря на различные траектории сборки, домены типа 2 и 3 способны достигнуть одинакового конечного состояния почти полного превращения мономеров в октамеры. Однако сборка типа 2 дает более эффективную траекторию для достижения этого состояния. Сборка типа 3 подвержена попадания в кинетическую ловушку, когда обе скорости связывания высоки. Такая кинетическая ловушка наблюдалась во многих ранних симуляциях и экспериментальных исследованиях таких систем. Впрочем отметим, что такой анализ траекторий является очень сильным упрощением. Он может приблизительно описать поведение систем при крайних значениях скоростей в терминах трех дискретных механизмов. Однако, эмпирические данные показывают гладкий переход выхода и скорости при перемещении между доменами. Поэтому, большая часть пространства параметров занята областями, где ожидаются комбинации трех главных типов сборки или гибридные реакции, не включенные ни в один из рассмотренных типов.

Рис. b и d показывают изменение выхода и T₅₀ для икосаэдра. Как и с предыдущими рисунками, мы выявляем три продуктивные области пространства параметров: область первого типа сзади справа, область второго типа сзади слева и область третьего типа сзади посередине. Рис. b показывает области высокого выхода вдоль всей задней границы рисунка, отвечающие малым скоростям по обоим параметрам. Высокие интеркапсомерные скорости относительно интракапсомерных скоростей дают область умеренного выхода сзади справа рисунка. Высокие интракапсомерные скорости относительно интеркапсомерных скоростей дают область высокого выхода сзади слева. Хотя эти особенности качественно аналогичны наблюдаемым в октамерной системе, имеются заметные отличия. Икосаэдр показывает крутое падение каждой области высокого выхода при увеличении ограничивающей скорости.

Напротив, октамер показывает только постепенные уменьшения выхода. Правая область фазового пространства для сборки икосаэдра достигает максимального выхода при заметно большей общей скорости сборки, чем это возможно для левой области. Левая область существенно шире и подвергается более плавному уменьшению выхода и увеличению скорости с возрастанием скорости интеркапсомерного связывания. Например, правая область падает от почти стопроцентного выхода до нулевого выхода при изменении интракапсомерной скорости примерно на сто порядков, в то время как в левой области для достижения подобного эффекта требуется изменение интеркапсомерной скорости в 10000 раз. Таким образом, правая область выглядит оптимальным доменом для максимизации скорости пикового выхода при жестко управляемых условиях, тогда как левая область может быть лучшей для достижения устойчивого высокого выхода при непредсказуемых условиях. Опять же, имеется гладкий переход между этими условиями через промежуточную область, где две скорости связывания примерно пропорциональны. Скорости и выходы чувствительны к обеим скоростям связывания в этой средней области, но почти нечувствительны к большей из двух скоростей за ее пределами.

Мы можем снова интерпретировать рисунок в терминах трех вероятных путей связывания. Следующий рисунок показывает три траектории, ожидаемые для икосаэдральной системы. Первый тип снова отвечает быстрому интеркапсомерному связыванию, приводящему к производству димеров, которые затем собираются в целые капсиды через нуклеацию гетерогенных гексамеров. Второй тип снова является иерархическим механизмом, за счет быстрого интракапсомерного связывания. Однако, для икосаэдра сборка второго типа протекает через агрегацию в пентамеры, а затем рост, ограниченный нуклеацией, через ядро вида тример из пентамеров. Асимметрия чувствительности к изменению скорости между этими областями может в основном объясняться различиями в числе требуемых шагов элонгации после этапа агрегации. Обе области имеют скорости трехступенчатой нуклеации после агрегации, но тип 2 имеет намного меньше шагов элонгации, чем тип 1, поскольку рост происходит за счет присоединения пентамеров, а не димеров. Длинная фаза элонгации делает домен первого типа менее устойчивым к кинетическим ловушкам и изменениям скорости при малых изменениях параметров. Область неиерархической сборки третьего типа снова предсказывается при примерном равенстве скоростей. В этом случае, неиерархическая сборка, ограниченная нуклеацией, как ожидается, протекает за счет медленной нуклеации пентамеров, за которой следует присоединение мономеров. Как ожидается, все три области демонстрируют ограниченный нуклеацией рост после реакции агрегации, что делает их уязвимыми к кинетическим ловушкам, когда скорости связывания высоки. «Ловушечные» промежуточные виды могут, однако, быть различными для этих трех доменов. Большие порядки большинства ключевых шагов сборки для икосаэдра, по отношению к октамеру, объясняются общей большей чувствительностью скоростей и выхода для икосаэдра. Заметим, что эти три типа траекторий являются результатом определенного шаблона взаимодействий связывания, используемого в нашей капсидной модели.

Модель допускает больше типов взаимодействий связывания с независимыми скоростями, и потенциально может открыть дополнительные типы траекторий, недоступные для двухпараметрической модели рассматриваемой в исследовании [40].

СИМУЛЯТОР

Существует симулятор, позволяющий моделировать сложные биологические самособирающиеся системы, в том числе белковые оболочки вирусов. Симулятор применяет обобщенную модель самосборки, основанную на локальных правилах взаимодействия, определяющих поведение сложных реакций самосборки.

Теория локальных правил предполагает, что образование вирусного капсида может управляться локальными взаимодействиями между субъединицами белков, образующих капсид, при этом геометрия капсида является следствием того, что субъединицы при выборе положения в капсиде и выборе партнеров для образования связей исходят только из их непосредственного окружения в капсиде.

Простейшее множество локальных правил, используемое для описания вируса типа T=1, изображено на рис. Эта модель применялась для объяснения нормальных геометрических структур вируса и возможных причин нарушения сборки. Позднее появился базис для более сложной модели, получившей название динамики локальных правил, сочетающей локальные правила со сложной динамической моделью движения и структуры частиц, и скоростей реакций. Однако, из-за большого объема требуемых вычислений, применение данной модели ограничено.

Рис. 22. Локальные правила для капсида T=1.

Модель дискретных событий

Химические реакции часто описывают формулой вида:

.

Формула означает, что молекулы A и B взаимодействуют, образуя молекулу C с характеристической скоростью . C может обратно преобразовываться в A и B со скоростью .

Системы таких реакций часто детерминировано моделируются с использованием обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ), что позволяет отследить концентрации молекул, участвующих в реакции как функций от времени и постоянных параметров реакции. Модель дискретных событий использует стохастический подход для моделирования протекания реакций в терминах отдельных событий, разделенных временем ожидания. Времена ожидания распределены экспоненциально со средними временами и для каждого типа реакции. Если объем симуляции равен единице, мы можем легко связать ОДУ модель и модель дискретных событий для некоторой системы. Если мы определим единицу времени как и , то дискретное количество реагентов в модели дискретных событий будет приближаться к непрерывной концентрации реагентов в ОДУ модели для достаточно больших систем.

Модель белка

Модель выведена из теории локальных правил и определяет самособирающиеся системы в терминах простых парных взаимодействий связывания. Теория локальных правил является не только гипотезой о сборке капсида, происходящей в действительности, но и полезной вычислительной абстракцией. Физическая модель симулятора аналогична модели динамики локальных правил. Однако новая модель использует метод симуляции дискретных событий, а не более требовательный к вычислениям метод, подобный методу молекулярной динамики. Базовый строительный блок в симуляции - субъединица, которая представляет отдельный белок или капсомер в биологической самособирающейся системе. Каждая субъединица имеет установленное множество позиций связывания с определенных положением в пространстве относительно центра субъединицы и множество позиций связывания, с которыми она может соединиться. К свойствам каждого типа позиций относится среднее время ожидания образования и прекращения связывающего взаимодействия, и . Поскольку времена ожидания распределены экспоненциально, средние полностью определяют распределения времени ожидания. Некоторые модели сборки требуют, чтобы субъединицы могли динамически изменять свои конфигурации связывания. Для этого в симуляторе субъединицы определены как комбинации доменов, каждый из которых имеет несколько допустимых конформаций.

Реализация событий

Все возможные события для каждого объекта берутся из экспоненциальных распределений. Эта модель математически эквивалента N-кратной модели для кинетики реакции Гиллеспи, которая, в свою очередь, является представлением системы как непрерывного марковского процесса.

Технические особенности

При запуске симуляции системе задается популяция из m сборок и пустая очередь событий. Для каждой сборки выбираются все возможные события, возникающие в процессе сборки, и одно из них с минимальным временем ожидания помещается в очередь событий. Выбор события образования связи (FormBondEvent) задействует парные взаимодействия между всеми сборками. Для предотвращения дублирования выбора и добавления в очередь этого события, производится m(m-1)/2 сравнений, и созданный список событий просматривается, и повторные события удаляются. В реализации симулятора на настоящий момент этот метод инициализации требует однократного вычисления с оценкой сложности O(m²) и является узким местом с точки зрения загрузки процессора. Однако авторы собираются применить более эффективный метод.

После того, как событие с наименьшим временем задержки извлекается из очереди, текущее время симуляции обновляется. Событие считается действительным, если изменения состояний частиц, участвующих в предыдущем событии, к этому моменту обновили свое состояние. В противном случае, событие признается недействительным. Различные типы событий обрабатываются следующим образом.

· Действительное событие разрушения связи (BreakingBondEvent): если разбиение может разделить сборку на две несоединенные подсборки, выбираются новые события для них, и их состояния изменяются (события, время выборки, информация о компонентах, и т. п.). В некоторых случаях могут быть применены дополнительные правила.

· Действительное событие образования связи (FormBondEvent): обычно это событие включает две сборки, которые объединяются в единую сборку, и будет выбрано новое событие минимального времени для единой сборки. Связывание может произойти и между совместимыми позициями взаимодействия в единой сборке и запускает повторный выбор событий для этой сборки. Такое связывание разрешено, если только позиции взаимодействия имеют совместимые типы и расстояние и углы между ними находятся в определенных пределах. Добавленное в очередь событие связывания может оказаться невыполнимым, если две сборки имеют субъединицы, которые после связывания будут перекрываться, это называется «пространственная помеха», или из-за того что количество субъединиц в сборке превысит некоторый заданный порог. В этих случаях событие связывания не выполнится, и новые события будут выбираться для двух сборок.

· Действительное событие изменения конформации (ConfChangeEvent): текущая конформация мономера переключается на другую, заданную в этом событии. Это запустит выбор новых возможных событий для задействованной сборки.

· Недействительное событие: такое событие не вызывает изменений в состоянии симуляции. Однако если один агент в недействительном событии впоследствии не участвует в событиях, то создается новое событие с минимальным временем. Это гарантирует, что для каждой сборки всегда будет некоторое событие в очереди.

Во время запуска симуляции повторный выбор новых событий по-прежнему включает получение одного типа событий с минимальным временем. Однако, поскольку не более, чем для двух сборок нужно назначать новые события, за один шаг в очередь помещается не более двух событий, в отличие от инициализации. Объем вычислений за один шаг линейно зависит от размера системы.

Рис. 23. Схема выполнения шага симуляции.

Симулятор написан на языке Java и является кроссплатформенным [41].



ДИНАМИЧЕСКИЕ ТРАЕКТОРИИ СБОРКИ ВИРУСНОГО КАПСИДА

Разработан класс моделей, которые имитируют сборку частиц в объекты наподобие капсидов T1 с использованием ньютоновской динамики. Выполняя симуляцию для различных значений параметров системы, варьируются силы, направляющие сборку. Для некоторых диапазонов параметров сборка протекает легко, для других сборка динамически нарушается кинетическими ловушками, соответствующими «уродливым», или незавершенным капсидам. Симуляции замеряют большое число независимых траекторий при различных концентрациях капсомеров, что позволяет сделать статистически значимые выводы. В зависимости от геометрии субъединицы (т. е., капсомера), успешная сборка протекает разными способами, включая связывание промежуточных продуктов разных размеров.

Изучение самосборки с помощью численных моделей является непростой задачей, поскольку короткодействующие свойства межсубъединичных взаимодействий управляют образованием общей структуры. Соединение и разъединение отдельных субъединиц происходит на порядки быстрее общего процесса сборки. Кроме того, эти скорости управляются взаимодействиями, определенными на расстояниях, сопоставимых с размером атомов, которые на три порядка меньше типичного размера капсидов.

В данной модели предпринята попытка изучения природы возможных кинетических ловушек и объем ансамблей событий успешной сборки. Вычисляются термодинамические свойства модели, обсуждаются результаты динамических симуляций. Симулированием сборки для различных значений параметров системы, варьируются силы, благоприятствующие и, наоборот, препятствующие сборке. Определяются области пространства параметров, в которых преобладают два вида кинетических ловушек и разъясняются процессы, благодаря которым удается избежать попадания в кинетические ловушки в других областях пространства параметров.

Модель

вирус бактериофаг сферический сборка

Белки капсида обычно содержат несколько сотен аминокислотных остатков, которых сворачиваются в четко определенные фигуры со специфическими взаимодействиями, которые приводят к притяжениям между комплементарными сторонами близлежащих субъединиц. Представляется, что интегрированием по степеням свободы можно прийти к модели, в которой субъединицы имеют исключенный объем и асимметричные парные взаимодействия связывания между комплементарными сторонами. В данной модели используется исключенный объем в виде сферы для каждого капсомера, и используются внутренние векторы связывания, чтобы учесть эффекты формы белка и комплементарности. Целью является определение того, достаточно ли, и если достаточно, то при каких условиях этих компонентов, чтобы управлять сборкой.

Рассматриваются три типа моделей: B₃, B₄ и B₅, которые содержат три, четыре и пять внутренних векторов связывания, соответственно. Векторы связывания, , изображены на рис. . Индекс пробегает от 1 до , где для модели B₃, для модели B₄ и для модели B₅, пробегает от 1 до N, где N - число капсомеров в системе. Вектор является позицией взаимодействия в капсомере i, где является центром капсомера i. Все векторы связывания имеют одинаковую длину b и жестко фиксированы в системе отсчета относительно центра капсомера. Движения осуществляются только за счет перемещений и вращений капсомера. Возможные в действительности флуктуации мы считаем усредненными, и не учитываем их в модели с рассматриваемым уровнем абстракции.

Рис. 24. Геометрия векторов связей в моделях капсомеров B₃, B₄ и B₅. является центром капсомера i. Углы между векторами связей указаны в градусах.

Общая потенциальная энергия взаимодействия между N капсомерами, U(1, 2, …, N) считается попарно: U(1, 2, …, N) = , где зависит от векторов связей и центров капсомеров и . Конкретный вид потенциала зависит от выбранного типа капсомера, B₃, B₄ или B₅. Однако потенциал должен быть таким, чтобы конфигурация с наименьшей энергией соответствовала отдельным икосаэдральным кластерам из 60-ти идентичных капсомеров. В каждой модели, векторы связей или позиции взаимодействия имеют комплементарные пары. Например, в модели B₃ пары позиций взаимодействия являются первичными комплементарными парами. Это значит, что благоприятная потенциальная энергия взаимодействия между парой капсомеров i и j может образоваться двумя способами:

1. Взаимодействие позиции 1 одного капсомера с позицией 2 другого капсомера, при этом соответствующие векторы связей почти антипараллельны.

2. Взаимодействие позиции 3 одного капсомера с позицией 3 другого капсомера, при этом соответствующие векторы связей почти антипараллельны.

Благоприятными взаимодействиями (т. е. взаимодействиями притяжения) являются только взаимодействия, связанные с первичными комплементарными парами.

Кроме того, имеются вторичные комплементарные пары. Например, в модели B₃ с первичной комплементарной парой , имеется вторичная комплементарная пара . Это означает, что благоприятное взаимодействие, вызванное первичной комплементарной парой , также требует, чтобы векторы и были почти компланарны. Аналогично, для первичной комплементарной пары , вторичная пара - или означает, что если и антипараллельны, благоприятные взаимодействия появятся, только если и почти компланарны, и и почти компланарны. Конечно, поскольку капсомеры являются твердыми телами, из компланарности и вытекает компланарность и . Первичные и вторичные пары для каждой модели перечислены в табл. 1. Локальные связи, ассоциированные с этими комплементарными парами и результирующими капсидными структурами, показаны на рис. 25. При создании этих изображений предполагалось, что взаимодействия исключенных объемов запрещают позициям взаимодействия участвовать одновременно более чем в одном благоприятном комплементарном взаимодействии.



Табл. 1. Первичные и вторичные комплементарные пары и соответствующие углы для трех моделей капсомеров.

	Первичные	Вторичные
	б	в	г	е	з	н
B3	1	2	2	1	3	3
	2	1	1	2	3	3
	3	3	1	2	2	1
B4	1	4	2	3
	2	3	1	4
	3	2	4	1
	4	1	3	2
B5	1	5	5	1	2	4
	2	2	3	1	1	3
	3	4	2	5	4	3
	4	3	5	2	3	4
	5	1	1	5	4	2

, , , .



Рис. 25. Комплементарные пары и связи капсомеров. Первый столбец определяет модель, второй изображает локальное связывание, согласованное с комплементарными парами векторов связей, третий - полученный целый капсид.

Зависимость взаимодействий субъединица-субъединица от ориентации первичных и вторичных пар включает то, что существует движущая сила, выравнивающая комплементарные области в субъединицах, чтобы максимизировать контакт между комплементарными остатками. Кривизна капсида при ориентации с минимумом потенциальной энергии вытекает из того, что углы между векторами связывания для заданной субъединицы не равны в сумме .

Парный потенциал

Парный потенциал взаимодействия между двумя капсомерами, скажем, 1 и 2, состоит из симметричной отталкивающей части, и притягивающей части. Она, в свою очередь, зависит от и векторов связей, относящихся к двум капсомерам,

. (1)

Для отталкивающей части выбран потенциал WCA (Weeks-Chandler-Andersen),

(2)

Для притяжений выбран

,(3)

где сумма берется по первичным комплементарным парам,

(4)



имеет минимальное значение , достигаемое при нулевом разделении между позициями взаимодействия, и - переключательная функция, заданная

(5)

для моделей B₃ и B₅ и

(6)

для модели B₄. Переменные - углы, используемые в этих выражениях, определены в табл. 1. Заметим из таблицы, что определение первичной пары комплементарных связей задает соответствующие вторичные пары. Переключательная функция плавно изменяется от 1 до 0 при изменении переменных-углов , и от 0 до и , соответственно. Увеличение максимальных углов расширяет область конфигурационного пространства, в котором две близлежащие субъединицы притягиваются друг к другу, но также ослабляет силу, толкающую систему к ориентации с минимальной энергией. Вид потенциалов взаимодействий выбраны так, чтобы дать сильные, короткодействующие, зависящие от ориентации взаимодействия. Все остальные особенности потенциалов взаимодействия, характеризующие взаимодействия между белками вируса, игнорируются.

Связь моделируемых капсидов с реальными

Модели капсомеров рассматриваемых типов могут быть выведены из капсидных кристаллических структур помещением центра тяжести капсомера в центр тяжести каждой субъединицы и назначением связей между каждой парой сильно взаимодействующих субъединиц. Полученные связи задают ориентации векторов связей в субъединицах модели, и свободная энергия связей белок-белок задает силы взаимодействия в модели, . Модели выведены из трех различные решеток, изображенных на рис. , но не из определенных кристаллических структур. Эти решетки покрыты упрощенными белками, имеющими форму треугольников, ромбов и трапеций для B₃, B₄ и B₅, соответственно. Пары схематичных белков испытывают благоприятных взаимодействия на общем ребре целиком, или его части. Решетка B₄ вписана в кристаллическую структуру canine parvovirus. Решетка B₅ наиболее точно представляет T1 вирусы. Модель B₃ меньше других согласуется с кристаллическими структурами вирусных капсидов. Хотя B₄ и B₅ покрывают икосаэдр, B₃ покрывает двойственный ему додекаэдр. Каждая решетка представляет вирус T1 в том смысле, что эти капсиды имеют 60 идентичных белков и икосаэдральную симметрию.

Рис. 26. Решетки, из которых выведены три капсомерные модели. Толстые черные линии определяют икосаэдр для B₄ и B₅ или додекаэдр для B₃. Тонкие черные линии, как укладываются простые фигуры, определяющие капсомеры. Прерывистые линии показывают один белок. Для B₄ показана структура canine parvovirus.

Динамика для трех моделей капсомеров изучается для определения условий, которые приводят к сборке в такой простой модели. При заданных различных связностях в трех различных моделях неудивительно, что все они собираются по разным траекториям. Однако, несмотря на эти различия, кинетика сборки качественно аналогична во всех трех классах моделей.

Динамические симуляции

Динамические траектории вычислялись с помощью броуновской динамики, в которой движения частиц вычисляются из законов Ньютона с силами и моментами, взятыми из межсубъединичных взаимодействий, а также сопротивлением и случайным бафтингом, обусловленными неявным присутствием раствора. Используются пары уравнений движения

, , (7)

где - угловая скорость, сила задается

, (8)

момент задается

, (9)

где и - случайная сила и момент с ковариациями, заданными

,

, (10)

где - единичная матрица. Коэффициенты трения для переноса и вращения задаются и , соответственно, - тепловая энергия.

В реализации, вращения твердого тела выполнялись с помощью кватернионов. Вращения и сдвиги вычислялись с помощью стохастического метода Рунге-Кутта второго порядка. Применялись периодические граничные условия для моделирования всей системы. Использовались сокращенные единицы, в которых диаметр частицы , - единица тепловой энергии. Время масштабировалось на . В каждой траектории рассматривается субъединиц и выполняется шагов, обычно с шагом по времени 0,006. Значения всех параметров указаны в табл. 2. Если единицы длины, и , конечное время наблюдения через шагов будет равно ; концентрации субъединиц, , варьируются от 2,0810^-4 до 0,156 моль/л; энергии связей, варьируются от 5,4 до 13,2 ккал/моль. Поскольку допустимые времена симуляций меньше, чем наблюдаемые в типичных экспериментах in vitro (примерно минуты), концентрации в симуляции значительно выше, чем типичные экспериментальные значения (~1 - 100 мкмоль/л). Однако, изменение кинетики симулируемой сборки в зависимости от концентрации и времени наблюдения означает, что выводы для экспериментальных времен и концентраций будут аналогичными.

Табл. 2. Значение параметров, используемых в динамических симуляциях. - единица длины, - тепловая энергия, - постоянная трения смещения, ур. (7), - единица времени.

Параметр	Значение	Определение
	1	Параметр энергии WCA, ур. (2)
	9 - 22	Величина энергии притяжения, ур. (4)
		Длина вектора связи
	0,4	Коэффициент трения вращения, ур. (7)
	3,14	Максимальный двугранный угол, ур. (5)
	0,1 - 3,0	Максимальный угол связи, ур. (5)
	11 - 100	Размер симулируемого параллелепипеда
	1000	Число субъединиц
	0,001 - 0,75	Концентрация субъединиц
	2,5	Расстояние отсечки энергии притяжения
	0,006	Шаг времени
		Конечное время наблюдения, 108 шагов

Термодинамика сборки капсида

Равновесные концентрации свободных субъединиц (мономеров) и промежуточных продуктов сборки могут быть связаны законом действующих масс

, (11)

где - плотность промежуточного продукта из n субъединиц, - размер молекулы, - величина, обратная тепловой энергии, - движущая сила, образующая промежуточный продукт размера n. Движущая сила сборки выбирается из соображения, что субъединицы обладают благоприятной энергией при связывании, но также сталкиваются с энтропийным штрафом, который зависит от количества связей и сети локальных связей.

Свободная энергия образования единичной связи для получения димера может определяться вычислением отношения статистических интегралов двух связанных субъединиц к двум свободным субъединицам, как

, (12)

где определено в ур. (1), описывает углы Эйлера 2-й субъединицы, которые определяют множество ориентаций векторов связей, - единица, когда , и ноль в противном случае. Другими словами, два капсомера определяются связанными, если их потенциальная энергия взаимодействия . Свободные субъединицы берутся в стандартном состоянии с единичной плотностью и свободным вращением, с центром системы координат в .

Разложение до второго порядка по каждой координате в минимуме потенциала дает

, (13)

И

, (14)

где два слагаемых представляют энтропию переноса и вращения, соответственно. Результат сравнен с симуляциями Монте-Карло на рис. 1.

Рис. 17.Свободные энергии связывания для димеризации, вычисленные из ур. (13) и (14) (линия) и симуляций Монте-Карло (точки).

Хотя существует много возможных структур капсидов, согласованных с много большими значениями n, есть только одна структура, согласованная с целым капсидом, который имеет субъединиц ( в рассматриваемых капсидах). Тот факт, что неправильно сформированные капсиды и промежуточные продукты обычно не наблюдаются означает, что имеет острый пик при ; дефекты, ведущие к большим или меньшим капсидам, неблагоприятны. Имеется порог плотности, при котором доля субъединиц в капсидах становится значительной

. (15)

Свободная энергия завершенного капсида может быть записана как

, (16)

где - энтропийный штраф для субъединицы в целом капсиде, где у каждой субъединицы связей. Если пренебречь зависимостью энтропийного штрафа от числа связей (т. е. положить ), можно использовать уравнения (14)

(16) для вычисления . Значения для модели капсида B₃ () с (значение, используемое для всех динамических симуляций) показано на рис. и сравнивается с кинетическими результатами сборки.



Рис. 28. Критическая термодинамическая концентрация субъединиц для образования капсида, , вычисленная из ур. (14) (16) для модели B₃ и .

Кинетика сборки капсида

Кривые скорости образования капсидов имеют сигмоидальный вид.

Была рассмотрена динамика сборки капсида для модели B₃ (см. 24, 25) при разных концентрациях субъединиц, , рассматриваемых в безразмерных единицах, ; разных энергиях связывания, ; и разных максимальных углах связывания . В приведенных результатах используется , эффект от изменения аналогичен эффекту от изменения , но менее выражен.

Доля субъединиц в целых капсидах, , показана как функция от времени для нескольких энергий связывания на рис. (a). Во всех случаях, при которых происходит значимая сборка, скорость образования капсидов имеет приблизительно сигмоидальную форму. Это общая особенность реакций сборки. Имеется фаза начальной задержки, за время которой образуются и проходят каскад реакций сборки промежуточные продукты, фаза быстрого роста, во время которой эти промежуточные продукты собираются в целые капсиды. Наконец, рост замедляется, когда мономеры (свободные субъединицы) заканчиваются, и оставшиеся промежуточные продукты оказываются не в состоянии соединиться в капсид.

Рис.29. Примеры влияния параметров системы на динамику сборки для модели B₃.

Конечный выход капсидов немонотонно зависит от значений параметров, но возможно достижение высокого выхода.

Доля субъединиц в целых капсидах, в конечный момент времени наблюдения, , показана на рис.. При увеличении , промежуточные продукты образуются и растут быстрее, поэтому выход капсидов возрастает до 90%, т. е. 15 из 16 возможных капсидов завершаются. Одним из главных результатов этого исследования является то, что модель частицы, не включающая гетерогенную нуклеацию или конформационные изменения, может предсказывать такие высокие выходы капсидов.

Хотя капсиды образуются быстрее при увеличении значений параметров, насыщение роста также происходит раньше, и выходы капсидов немонотонны по каждому параметру. Чувствительность выхода капсидов по отношению к параметрам, наблюдаемая на рис., изображена на рис. . Также приведена кинетическая фазовая диаграмма, показывающая парные зависимости выходов капсидов от параметров системы. Фазы разделены в зависимости от того, наблюдается ли в них значимая сборка, которая произвольно определяется как .

Рис. 30. Изменение параметров модели открывает кинетическую фазовую диаграмму для модели B₃.

Сплошные точки обозначают значения параметров, для которых 30% субъединиц находятся в завершенных капсидах () за время наблюдения (), пустые точки показывают значения, при которых , пунктирная линия показывает положение критической термодинамической поверхности, посчитанной в ур. (14).

Немонотонное изменение выхода капсидов при изменении значений параметров обусловлено конкуренцией между более быстрым ростом капсида и попаданием в кинетические ловушки.

Начальные шаги в сборочном каскаде приводят к образованию меньшего числа связей, чем более поздние шаги. Если энергия притяжения этих связей недостаточна, чтобы преодолеть энтропийные потери, начальные шаги с трудом преодолевают барьер свободной энергии, и потому, медленны. Для значений параметров, близких к , (рис. ) когда половина субъединиц находится в целых капсидах в равновесии, из того, что целые капсиды имеют намного больше связей, чем начальные продукты сборки вытекает, что барьер свободной энергии должен быть в несколько раз больше тепловой энергии, . Поэтому значимая сборка не происходит за рассматриваемое конечное время наблюдения, пока значения параметров не станут много больше критических термодинамических значений. Исходя из этого, определяется нижняя критическая поверхность, которая ограничивает области со значимой сборкой снизу и слева на рис. . Рассматриваются конечные времена, поскольку реакции сборки капсидов ограничены in vivo временем расщепления белков и in vitro временем наблюдения.

Увеличение параметров увеличивает общую скорость роста капсидов. Более высокие концентрации субъединиц, , приводят к более частым столкновениям субъединиц, более высокие значения увеличивают вероятность связывания при столкновении, более высокие значения энергии связывания, уменьшают скорость обратной реакции (расцепления субъединиц). Когда значения параметров пересекают нижнюю критическую поверхность, более быстрый рост капсидов приводит к значимому выходу капсидов, как показано на рис.. Однако, при еще больших значениях, сборка начинает нарушаться из-за попадания в две кинетические ловушки (см.рис. ), и поэтому определяется верхняя критическая поверхность сверху и справа от областей, в которых сборка кинетически достижима. Из-за этих кинетических ловушек сборка происходит, только когда энергии связывания субъединиц значительно меньше значений, вычисленных в работе Reddy et al [42]. Однако, при включении энтропии связывания (см. ур. (14)), получившиеся свободные энергии согласуются с константами ассоциации, относящимся к экспериментам по сборке капсидов вируса гепатита B в работе Ceres, Zlotnick [43].

Кинетические ловушки

Рис. 31. Скриншоты, соответствующие точка на рис., демонстрирующие две кинетические ловушки. (a) соответствует точке, отмеченной ромбом, (b) - треугольником.

Представлены результаты для трех времен наблюдений, показывающие, как расстояние между границами расширяются во всех направлениях при увеличении времени. Примерная граница кинетически достижимой области на рис. является мерой статистической погрешности, которая вызвана тем, что каждая точка описывает одну стохастическую траекторию. Для траекторий, пробегающих с различным начальным значением генератора псевдослучайных чисел для заданных значений параметров, конечное число готовых капсидов обычно не различается более, чем на единицу, но различия во время фазы быстрого роста были больше.

Кинетическая ловушка, изображенная на рис. (a) появляется из-за того, что начальные шаги сборки проходят слишком быстро, начинается сборка настолько большого числа капсидов, что запаса свободных субъединиц и малых промежуточных продуктов не хватает, чтобы завершилась сборка значимого числа капсидов. Если оставшиеся частичные капсиды имеют несовместимую геометрию, дальнейшее связывание потребует предварительной разборки. Эта кинетическая ловушка наблюдалась в экспериментах и была предсказана теоретически (правда, только для ситуации, когда допускается присоединение только отдельных субъединиц).

Описанная кинетическая ловушка может не ограничить рост in vivo, когда имеется непрерывное подпитывание новых белков капсида. Однако связывание субъединиц в конфигурации, несогласованные с целым капсидом (некорректное связывание) может привести к кинетической ловушке, которая может нарушать сборку даже при неограниченном количестве субъединиц. Заметим, что подход с уравнением скорости, который предполагает заведомо определенные траектории сборки, неспособен выявить такую ловушку. Неудивительно, что некорректное связывание случается чаще при увеличении , поскольку в этом случае движущая сила, направляющая систему в конфигурацию с минимальной энергией, слабее. Но, как показывают исследования Бергера, увеличение концентрации и энергии связывания может стабилизировать субъединицы с деформированными связями, и при этом боґльшая скорость роста капсидов будет достигнута, прежде чем некорректно связанные субъединицы станут причиной кинетической ловушки. Поскольку имеется так много траекторий сборки, не приводящих к целым капсидам при этих значениях параметров, конфигурация с минимальной энергией с целыми капсидами редко реализуется, и некорректные капсиды со спиральными или многоголовочными конфигурациями преобладают, как показано на рис. (b). Развитие их этого состояния до целого капсида исключительно медленно, поскольку требуется разбиение большого числа связей. Было бы сложно оценить значимость конфигураций, показанных на рис. (b), с моделями, использующими предопределенные траектории сборки.

Капсиды B₅ растут преимущественно за счет присоединения отдельных субъединиц, соединение кластеров обязательно для сборки капсидов B₃ и B₄.

Изменения конечного выхода капсидов в зависимости от для типов капсидов B₃, B₄ и B₅ показаны на рис. (a). Хотя сборка происходит при различных диапазонах для каждого типа, кинетика внутри этих диапазонов аналогична, как видно на рис. (b). Оптимальная сборка () для каждого типа достигается примерно при одном и том же значении , означая, что целые капсиды примерно одинаково устойчивы. Изменения сборки в зависимости от или также аналогичны для всех типов капсидов.

Рис. 32. Кинетика сборки аналогична в типах капсидов B₃, B₄ и B₅.

Хотя способность к спонтанной сборке аналогична для всех типов капсидов, механизм сборки вблизи оптимального значения для B₅ качественно отличается от механизма для B₃ и B₄. Были вычислены механизмы сборки из симуляций сведением в таблицу размера наименьшего промежуточного продукта, участвующего в каждом событии соединения или разъединения. Общий вклад в рост капсида промежуточных продуктов размера , , показан для каждого типа капсида на рис. . Хотя примерно 33% субъединиц собирались в кластеры () для капсидов B₃ и B₄, на связывание кластеров пришлось только 6% всех реакций связывания для капсидов B₅. При превышении параметрами оптимальных значений, образование малых промежуточных продуктов становилось более быстрым, и связывание кластеров приобретало большее значение для всех типов капсидов.

Рис. 33. Влияние типа капсида на механизм можно понять рассмотрением траекторий сборки доступных, если рост происходит только за счет присоединения мономеров, как показано на рис. .

Как только происходит образование димера для B₅, все последующие мономеры могут присоединяться так, что образуются две и более связей. Для оптимальных значений параметров, образование единичной связи неблагоприятно из-за энтропийных потерь, но образование двух и более связей благоприятно. Следовательно, примерное математическое ожидание свободной энергии в зависимости от размера кластера, показанное на рис. , монотонно уменьшается после образования димера. Заметим, что эти свободные энергии сравнивают относительную устойчивость различных кластеров. Также имеются непоказанные барьеры свободной энергии, связанные с соединением и разъединением субъединиц, требующиеся для перехода между этими состояниями.

Рис. 34. Примеры путей сборки.



Рис. 35. Зависимость свободной энергии от числа частиц в капсиде.

Для архитектур B₃ и B₄ невозможно построить траекторию сборки, для которой мономеры образуют множественные связи при всех размерах кластеров больше двух субъединиц. Профили свободных энергий, согласованные с этими архитектурами, показаны на рис. и имеют многочисленные барьеры свободной энергии и локальные минимумы. Шаги, которые переходят через эти барьеры присоединением мономеров с образованием одной связи, сравнимо по скорости с первым шагом сборки, образованием димера. Злотник показал, что промежуточные продукты накапливаются, когда шаг, ограничивающий скорость следует за метастабильными видами, или, когда энергии ассоциации или концентрации высокие и начальные шаги сборки (шаги нуклеации) сопоставимы по скорости с поздними шагами (шагами элонгации). Однако, как показано на рис., некоторые промежуточные продукты могут связываться с другими таким образом, что избегается образование единичных связей. Следовательно, поздние шаги траекторий, включающие эти шаги связывания кластеров быстрее начальных шагов, и промежуточные продукты не накапливаются для значений параметров, рассматриваемых на рис. . Например, тримеры - преобладающий промежуточный продукт сборки для B₄, но доля субъединиц в триммерах всегда мала по сравнению с долей субъединиц в мономерах или целых капсидах (см. рис. ).

...