Фізіологія та біохімія рослин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державний вищий навчальний заклад

"Запорізький національний університет"

Міністерства освіти і науки України

ЛАБОРАТОРНИЙ ПРАКТИКУМ З ФІЗІОЛОГІЇ ТА БІОХІМІЇ РОСЛИН

"Фізіологія та біохімія рослин"

(Частина І)

для студентів денної форми навчання

спеціальності 6.070400 - Біологія

О.М.Войтович, В.О.Лях, Г.М. Левчук

Запоріжжя

2008



Зміст

Вступ

1. Фізіологія рослинної клітини

1.1 Властивості клітинних мембран

1.2 Порівняння проникності клітинних мембран для різних речовин. Стійкий і тимчасовий плазмоліз

1.3 Вплив іонів калію і кальцію на форму плазмолізу

1.4 Спостереження ковпачкового плазмолізу в розчинах нітрату калію і роданіду калію

1.5 Проникність живої і мертвої цитоплазми

1.6 Виявлення життєздатності клітин

1.7 Прижиттєве фарбування клітин нейтральним червоним

1.8 Використання солей тетразолію для виявлення живих і мертвих клітин

1.9 Рух цитоплазми

1.10 Спостереження за рухом цитоплазми у різних об'єктів

1.11 Визначення швидкості руху цитоплазми

2. Хімічний склад рослин

2.1 Білки

2.2 Властивості рослинних білків

2.3 Виділення рослинних білків

2.4 Визначення амінокислотного складу рослинних білків за допомогою якісних реакцій

2.5 Визначення ізоелектричної точки рослинних тканин

2.6 Вуглеводи

2.7 Жири

3. Водний обмін рослин

3.1 Рослинна клітина як осмотична система

3.2 Водообмін рослин

3.3 Вплив зовнішніх умов на процес гутації

3.4 Визначення інтенсивності транспірації за зменшенням маси зрізаного листя

3.5 Порівняння транспірації верхньої і нижньої сторін листа хлоркобальтовим методом

4. Фізіологія фотосинтезу

4.1 Пігментний апарат рослини

4.2 Хімічні властивості пігментів

4.3 Метод Крауса

4.4 Метод Цвета

4.5 Метод хроматографії на папері

4.6 Оптичні властивості пігментів зеленого листа

4.7 Спектри поглинання пігментів

4.8 Флуоресценція хлорофілу

4.9 Кількісне визначення пігментів

4.10 Фізіологія фотосинтезу

4.11 Визначення інтенсивності фотосинтезу і дихання за зміною вмісту вуглецю

Список рекомендованої літератури



Вступ

Фізіологія рослин - фундаментальна біологічна дисципліна, вивчення якої на 3 курсі денного відділення біологічного факультету є необхідним кроком у формування системи сучасних біологічних знань майбутніх біологів. Важливе значення цієї дисципліни полягає в тому, що базуючись на анатомо-морфологічних та системно-аналітичних підходах до вивчення живої матерії, а саме ці напрямки підготовки переважають на 1 та 2 курсах, є усі передумови формування нового фізіолого-біохімічного підходу до розуміння механізмів існування усіх живих істот взагалі, і рослин зокрема.

Викладання курсу "Фізіологія рослин", яке триває рік, передбачає лекційний курс, самостійну роботу та проведення лабораторно-практичних занять. I частина "Лабораторного практикуму" містить повний обсяг лабораторних робіт, передбачених навчальною програмою за темами "Фізіологія рослинної клітини", "Фізіологія водообміну" та "Фізіологія фотосинтезу". Кожній роботі передує короткий огляд теоретичного матеріалу за темою дослідження, що в значній мірі спрямовує студента на виконання роботи з метою чи то практичного підтвердження, чи то деталізації вивчення певного фізіологічного явища або процесу.

При виконанні робіт, передбачених "Лабораторним практикумом" перед студентами ставляться наступні завдання: набуття практичних навичок щодо дослідження певних фізіологічних явищ, зокрема вміння планувати експеримент, моделювати необхідні умови для спостереження, здійснювати поточний контроль за ходом експерименту, отримувати результати практичних досліджень та аналізувати їх, роблячи обгрутовані та змістовні висновки.

Наведені лабораторні роботи можуть бути використані під час виконання курсових та дипломних проектів, а також модифіковані залежно від спрямованості наукових досліджень студента.



1. Фізіологія рослинної клітини

Мета заняття.

Дослідити основні фізичні та хімічні властивості рослинної клітини, зокрема її мембранного апарату щодо функціонування за різних умов існування, оволодіти основними засобами визначення життєздатності клітини та швидкості метаболічних процесів.

Питання до обговорення.

1. Відмінності в будові та функціонуванні рослинної клітини порівняно з тваринної та грибною.

2. Система мембран рослинної клітини.

3. Засоби визначення життєздатності клітин.

4. Фізичні та хімічні властивості цитоплазми.

1.1 Властивості клітинних мембран

Зовнішня цитоплазматична мембрана клітини (плазмалема) відділяє клітину від навколишнього середовища, контролює транспорт речовин в клітину та із клітини, перша сприймає інформацію про зовнішнє середовище. Внутрішньоклітинні мембрани забезпечують просторову впорядкованість численних процесів, що протікають в клітині. Вони створюють ізольовані простори (компартменти), в яких одночасно можуть протікати протилежно направлені процеси. В мембрани вбудована велика кількість мультиферментних комплексів, транспортних систем, рецепторних молекул, що забезпечують протікання основних життєвих процесів.

Найважливіша властивість клітинних мембран -- вибіркова проникність, завдяки якій крізь них проходять молекули тільки деяких речовин. Ця властивість може змінюватися залежно від процесів, що протікають в клітині. Виборча проникність мембрани зберігається до тих пір, поки клітина залишається живою. Після її загибелі мембрани стають повністю проникними.

Матеріали і обладнання: 1) мікроскоп; 2) предметні і покривні скельця; 3) скляна паличка; 4) препаровальна голка, скальпель або лезо безпечної бритви; 5) пробірки; 6) штатив для пробірок; 7) фільтрувальний папір; 8) спиртівка або газовий пальник; 9) 30% розчин оцтової кислоти; 10) 1М розчин глюкози; 11) 1М розчин роданіду калію; 12) 1М розчин нітрату калію; 13) 0,7М розчин нітрату кальцію;14) 1М розчин карбаміду;15) коренеплід столового буряка; 16) цибулина синьої ріпчастої цибулі; 17) листя елодеї і валіснерії.

1.2 Порівняння проникності клітинних мембран для різних речовин. Стійкий і тимчасовий плазмоліз

Виборча проникність мембран забезпечує проходження через них молекул води, перешкоджає проникненню розчинених у воді речовин і обумовлює явище плазмолізу при дії на клітину гіпертонічного розчину. Якщо ж молекули розчиненої речовини через мембрану проходять, але повільніше, ніж молекули води, то плазмоліз потім зникає. Деплазмоліз відбувається в результаті поступового проникнення розчиненої речовини в клітину, вирівнювання концентрацій зовні і всередині, а також надходження води в клітину із зовнішнього розчину за градієнтом концентрації.

Хід роботи

На два предметні скельця наносять по краплі розчину: на одне -- 1 М розчин сахарози, на інше -- 1 М розчин карбаміду. В кожну краплю поміщають по листку елодеї, накривають покривним скельцем і розглядають під мікроскопом спочатку при малому (об'єктив 8), потім при великому збільшенні (об'єктив 40). Знаходять ділянки листка, в яких добре помітні плазмолізовані клітини. Визначають час початку плазмолізу (початок спостереження), замальовують плазмолізовані клітини і залишають препарати на 30--60 хвилин, потім знову їх розглядають. В розчині сахарози плазмоліз в клітинах зберігався, а в розчині карбаміду відбувався деплазмоліз. В розчині сахарози спостерігається стійкий плазмоліз, а в розчині карбаміду -- тимчасовий. Причиною деплазмолізу в розчині карбаміду є проникність клітинних мембран для його молекул. Оскільки проникність для карбаміду менше ніж для води, то вода з клітини виходить швидше, ніж в неї входить сечовина. Це і викликає плазмоліз, який потім зникає при збільшенні в клітині концентрації карбаміду і надходженні води.

Завдання: описати роботу, замалювати плазмолізовані та деплазмолізовані клітини і сформулювати висновки.

1.3 Вплив іонів калію і кальцію на форму плазмолізу

В ході плазмолізу форма плазмолізованого протопласту міняється. Спочатку протопласт відстає від клітинної стінки лише в окремих місцях, частіше всього в куточках. Плазмоліз такої форми називають кутковим. Потім протопласт продовжує відставати від клітинних стінок, зберігаючи зв'язок з ними в окремих місцях, поверхня протопласту між цими точками має увогнуту форму. На цьому етапі плазмоліз називається увогнутим. Поступово протопласт відривається від клітинних стінок по всій поверхні і приймає округлу форму. Такий плазмоліз носить назву опуклого. А якщо між протопластом та клітинною стінкою зв'язок в окремих місцях зберігається, то при подальшому зменшенні об'єму в ході плазмолізу протопласт набуває неправильної форми. Такий плазмоліз носить назву судорожного (рис. 1.1). Час, протягом якого увогнутий плазмоліз переходить в опуклий, дозволяє оцінювати ступінь в'язкості цитоплазми.



Рис. 1.1 Форми плазмолізу:

1 - кутковий; 2 - увігнутий; 3 - опуклий; 4 - судорожний; 5 - ковпачковий (а-цитоплазма; б-вакуоль)

При порівнянні в'язкості цитоплазми в розчинах солей калію і кальцію можна відзначити, що іони калію, проникаючи в цитоплазму, підвищують її гідрофільність, зменшують в'язкість і сприяють її швидкому відриву від клітинної стінки. Тому в розчинах солей калію плазмоліз швидко приймає форму опуклого. Іони кальцію, навпаки, підвищують в'язкість цитоплазми, збільшують сили зчеплення її з клітинною стінкою, і плазмоліз приймає форму судорожного.

Хід роботи

На одне предметне скельце наносять краплю 1 М розчину нітрату калію, на інше -- 0,7 М розчину нітрату кальцію. В обидві краплі поміщають по шматочку епідермісу цибулі, знятого з увігнутої поверхні однієї і тієї ж луски цибулини (лист елодеї або валіснерії), накривають покривними скельцями. Через 5--10 хв. препарати розглядають під мікроскопом.

Завдання: замалювати форми плазмолізу, описати роботу і зробити висновки.

1.4 Спостереження ковпачкового плазмолізу в розчинах нітрату калію і роданіду калію

При тривалому знаходженні клітин в розчині нітрату калію (15 хв. і більше) цитоплазма набухає в подовжених клітинах, там, де протопласт не торкається клітинних стінок, утворюються так звані ковпачки цитоплазми. Такий плазмоліз носить назву ковпачкового (див. рис. 1.1). Ще більше набухання відбувається в розчинах роданіду калію, в яких ковпачки цитоплазми утворюються зразу ж після початку плазмолізу. Ковпачковий плазмоліз може свідчити про різну проникність плазмалеми і тонопласту для іонів калію.

Іони калію, проникаючи через плазмалему в цитоплазму, викликають її набухання. У вакуоль через тонопласт вони не проходять. Об'єм плазмолізованої вакуолі не збільшується і плазмоліз зберігається.

Хід роботи

На предметне скло наносять краплю 1М розчину роданіду калію, поміщають в неї шматочок епідерми луски ріпчастої цибулі, накривають покривним склом і відразу розглядають під мікроскопом з об'єктивом .

Завдання: зробити малюнок і сформулювати висновок про причину появи ковпачкового плазмолізу.

1.5 Проникність живої і мертвої цитоплазми

Мембрани цитоплазми - плазмолема і тонопласт - мають вибіркову проникність. Це явище властиво тільки живим клітинам. При дії на клітину пошкоджуючих агентів мембрани втрачають властивість напівпроникності. Це добре можна прослідити на рослинних об'єктах, що містять в клітинному соці пігмент антоціан. Ступінь пошкодження корелює з кількістю пігменту, який виділяється у водне середовище.

Частіше за все для демонстрації цього досліду використовують столовий буряк. Його пігмент - в-цианін - добре розчиняється у воді.

Матеріали і обладнання: 1) столовий буряк (Beta vulgaris L.); 2) штатив з пробірками; 3) пробкове свердло; 4) піпетки; 5) скальпель; 6) електрична плитка; 7) хлороформ; 8) 30% оцтова кислота; 9) 50% етиловий спирт; 10) 1М розчин нітрату калію; 11) мікроскоп; 12) покривні та предметні скельця; 13) пробірки; 14) ФЕК.

Хід роботи

Вирізують пробковим свердлом циліндри з коренеплоду червоного буряка (діаметр 0,5-0,7 мм). Нарізують їх на рівні частини завдовжки 2 см і промивають проточною водою. Потім кладуть по одному шматочку коренеплоду в пробірки (варіанти розчинів в пробірках за табл.1.1), через 1 годину пробірки струшують. Визначають інтенсивність забарвлення розчинів в пробірках за допомогою фотоелектроколориметра (ФЕК), використовуючи синій світлофільтр. У відповідну графу табл.1.1 записують показання ФЕКу. Шматочки буряка витягують з пробірок і готують тонкі зрізи, які розглядають під мікроскопом в 1М розчині нітрату калію. Наявність плазмолізу свідчить, що клітина жива. В мертвих клітинах плазмоліз не спостерігається.

Таблиця 1.1

Номер пробірки	1	2	3	4	5
Варіант	10 мл водопровідної води	10 мл водопровідної води кип'ятити	10 мл водопровідної води + 6 крапель хлороформу	10 мл 30% оцтової кислоти	10 мл 50% етилового спирту
Забарвлення розчину в пробірці
Показання ФЕКу, опт.од.

Завдання: зробити висновок про зміну проникності цитоплазми при пошкодженні клітин.

1.6 Виявлення життєздатності клітин

Визначення життєздатності насіння методом фарбування (за Д. Н. Нелюбовим)

Матеріали і обладнання: 1) насіння гороху, намочене у воді за 10--15 годин; 2) 0,1% розчин індигокарміну (1 г на 1 л дистильованої води); 3) чашки фарфорові (2 шт.); 4) стакан хімічний; 5) стакан фаянсовий з вологою тирсою; 6) тарілка; 7) препаровальна голка; 8) електроплитка; 9) олівець по склу.

Метод фарбування насіння для визначення їх схожісті заснований на непроникності живої цитоплазми для деяких фарбників (індигокармін, кислий фуксин), тоді як мертва цитоплазма легко забарвлюється. Бувають випадки, коли зародок мертвий, але насіння не забарвлюється через те, що оточуючі зародок частини насіння не пропускають фарбник. У зв'язку з цим необхідно заздалегідь оголити зародок: у насіння з ендоспермом витягнути зародок або розрізати насінину уподовж, а у насіння без ендосперма видалити насінні покриви.

Підготовлене таким чином насіння витримують в розчині фарбника від 1 до 3 годин (залежно від виду рослини) і оцінюють життєздатність насіння: насіння з повністю забарвленими зародками або із забарвленими корінцями вважається несхожими, насіння незабарвлене або з частково забарвленими сім'ядолями відносять до числа життєздатних.

Даний метод використовують для швидкої оцінки схожісті насіння гороху, квасолі, люпину, льону, коноплі, гарбуза.

Хід роботи

Відрахувати, не вибираючи, дві порції по 20 штук набряклого насіння гороху. Одну порцію помістити в стакан з водою і прокип'ятити протягом 5 хв. (контроль). Обережно, не ушкоджуючи сім'ядолі, очистити препаровальною голкою насіння обох порцій від шкірки, помістити у фарфорові чашки, залити розчином індигокарміну і витримати 1 годину, після чого злити барвник назад в пляшку, а насіння відмити водою від надлишку барвника.

Відзначити забарвлення насіння, вбитого кип'ятінням. В дослідній порції підрахувати кількість забарвленого, частково забарвленого і незабарвленого насіння. Для перевірки схожісті висадити все 10 насіння в стакан з вологою тирсою (перед набиванням стакана віджати з тирси надлишок води) поставити в темну шафу і щодня поливати. Через декілька днів підрахувати кількість пророслого насіння.

Результати записати в таблицю 1.2:

Таблиця 1.2

№ п/п	Об'єкт	Кількість узятого насіння, шт.	Кількість насіння, шт.
			Забарвлених	Незабарвлених

Завдання: заповнити таблицю і написати висновок.

1.7 Прижиттєве фарбування клітин нейтральним червоним

Матеріали та обладнання: 1) цибулина звичайної цибулі, листя різних рослин; 2) 0,02% розчин нейтрального червоного в крапельниці; 3) 1 М розчин КNO3 в крапельниці; 4) 10% розчин аміаку в крапельниці з піпеткою; 5) скальпель; 6) лезо бритви; 7) препаровальна голка; 8) мікроскоп; 9) предметні і покривні скельця; 10) скляна паличка; 11) стаканчик з водою; 12) шматочки фільтрувального паперу; 13) кольорові олівці.

Подібно метиленової сині, фарбник нейтральний червоний здатний проникати в живі клітини і накопичуватись в них у великих кількостях. При нетривалому перебуванні клітин в розчині нейтрального червоного цитоплазма не відмирає, в чому можна переконатися, викликавши плазмоліз забарвлених клітин (плазмолізуватися можуть тільки живі клітини). Нейтральний червоний -- двобарвний індикатор: в кислому середовищі (рН<6) він має малинове забарвлення, в лужній -- жовте.

Для розуміння результатів даної роботи необхідно мати на увазі, що в розчині з рН близько 7 нейтральний червоний знаходиться у формі недисоційованих молекул, добре розчинних в ліпідах мембран, тоді як в кислому середовищі ця речовина дисоціює на іони, погано розчинні в ліпідах. Цитоплазма живої клітини має слабку спорідненість до фарбника. Забарвлення цитоплазми і ядра -- ознака пошкодження клітини.

Хід роботи

Приготувати 2--3 зрізи епідермісу луски цибулі або листя рослин і помістити їх на предметне скло у велику краплю розчину нейтрального червоного, не накриваючи покривним склом (при доброму доступі повітря забарвлення відбувається швидше). За 10--15 хв. (не більше) відсмоктати фарбу фільтрувальним папером, перенести зрізи в краплю води, накрити покривним склом і розглянути в мікроскоп. Замінити воду 1 М розчином КNO3 і продовжувати спостереження при великому збільшенні. Замалювати плазмолізовану клітину, відзначивши, яка частина забарвлена барвником (клітинна стінка, цитоплазма або вакуоль) і в який колір (замалювати кольоровим олівцем).

Відсмоктати з-під покривного скла розчин КNO3 і ввести краплю 10% аміаку, що є сильною отрутою.

Завдання: розглянути препарат під мікроскопом, звернувши увагу на забарвлення цитоплазми і ядра в загиблих клітинах. Замалювати клітину.

1.8 Використання солей тетразолію для виявлення живих і мертвих клітин

Солі тетразолію в окисленому стані безбарвні, а при відновленні забарвлюються. Відновлення їх відбувається за участю ферментів дегідрогеназ, які активні тільки в живих клітинах. Тому відновлення тетразолію в мертвих клітинах, а значить, і появи забарвлення не відбувається.

Відновлені форми солей тетразолію (формазани) -- інтенсивно забарвлені сполуки. Різні солі тетразолію (трифенілтетразолій хлористий -- ТТХ, неотетразолій синій, нітросиній тетразолій та ін.) при відновленні забарвлюються у різний колір (червоний, синій, фіолетовий) залежно від виду барвника і повноти відновлення. На повітрі формазани не окислюються, тому їх зручно використовувати для виявлення активності дегідрогеназ на зрізах рослинних тканин.

Матеріали і обладнання: 1) проростки насіння різних культур; 2) лезо безпечної бритви; 3) покривні і предметні скельця; 4) мікроскоп; 5) 0,1 % розчин ТТХ, виготовлений на 0,87% розчині К2НРО4; 6) термостат.

Хід роботи

З вибраних об'єктів (зародки насіння, верхівки проростків, великі бруньки деревних рослин) роблять зрізи лезом безпечної бритви. Зрізи не повинні бути тонкими. Можна використовувати також цілі кінчики коренів завдовжки не більше 2--3 см. Частину об'єктів "вбивають", нагріваючи у воді над полум'ям. Живі і мертві тканини поміщують в годинникове скло в 0,1 % розчин ТТХ, приготований на 0,87%-ном розчині К2НРО4, і витримують протягом 10-15 хв. Цей час можна скоротити, помістивши годинне скло із зрізами в термостат з температурою 30--35°С. У живих зрізів спостерігається забарвлення, особливо яскраве в місцях розташування мерістематичних тканин. У мертвих зрізів такого забарвлення не відбувається.

Завдання: у всіх дослідах порівняти забарвлення живих і мертвих клітин, зробити малюнки, сформулювати висновки про можливість використання фарбників для виявлення живих і мертвих кліток.

1.9 Рух цитоплазми

Рух цитоплазми -- характерна особливість живої рослинної клітини, показник активності процесів її життєдіяльності. Найбільш зручними для спостереження за переміщенням клітинних органел є крупні клітини з великими вакуолями. Розрізняють рух цитоплазми спонтанний, постійний та індукований зовнішніми чинниками -- зміною освітленості, температури, хімічними речовинами, механічними впливами і т.п. Рух цитоплазми -- один з найчутливіших показників життєздатності клітини. Навіть незначні впливи зупиняють або, навпаки, прискорюють його. Рух цитоплазми забезпечує внутріклітинний і міжклітинний транспорт речовин, переміщення органел всередині клітини. В його здійсненні беруть участь елементи цитоскелету -- мікрофіламенти. Джерелом енергії цього руху служить АТФ.

Матеріали і обладнання: 1) мікроскоп; 2) настільна лампа; 3) термостат на 35 і 40°С; 4) предметні і покривні скельця; 5) секундомір; 6) пінцет; 7) препаровальна голка; 8) фільтрувальний папір; 9) етанол; 10) рослини елодеї, валіснерії, хари або нітели; 11) квітки традесканції з опушеними тичинковими нитками; 12) натрієва сіль АТФ.

1.10 Спостереження за рухом цитоплазми у різних об'єктів

Хід роботи

1. Елодея. Відривають лист поблизу верхівки і кладуть його в краплю води, взятої з судини з елодеєю. Об'єкт накривають покривним склом і розглядають спочатку при малому, потім при великому збільшенні. Лист елодеї складається тільки з двох шарів кліток, і кожний шар є легко видимим під мікроскопом. Обрив листка викликає в його клітках рух цитоплазми, який легко спостерігати за переміщенням всіх хлоропластів в одному напрямку уздовж клітинної стінки. Такий рух називається ротаційним. В двох сусідніх клітинах він може відбуватися у різних напрямах -- за годинниковою стрілкою і проти неї. Найінтенсивніший рух можна побачити в довгих вузьких клітинах середньої жилки листа. У рослин, що знаходилися перед дослідженням при слабому освітленні або в темряві, рух хлоропластів зазвичай не спостерігається. Нерухомі хлоропласти розташовуються під клітинними стінками паралельно поверхні листової пластинки. Але якщо препарат витримати декілька хвилин при освітленні, не знімаючи із столика мікроскопа, то рух з'являється.

Хлоропласти починають рухатися спочатку поволі, потім швидше і займають положення уздовж бічних клітинних стінок, розташованих перпендикулярно поверхні пластинки.

Рух цитоплазми в клітинах елодеї можна побачити також за переміщенням більш дрібних, ніж хлоропласти, органел -- дрібних безбарвних "зерняток", зважених в цитоплазмі. Їх переміщення найлегше виявити в крайових клітинах листової пластинки, де значно менше хлоропластів або вони відсутні.

2. Валіснерія. Такий же рух цитоплазми, як і в клітинах елодеї, можна спостерігати в клітинах листка водної рослини валіснерії. Для цього від листової пластинки гострою бритвою відрізують невеликий шматочок, прагнучи якомога менше травмувати лист, поміщають його в краплю води і розглядають під мікроскопом. Робити зрізи з листа не рекомендується, оскільки клітини при цьому сильно травмуються і рух в них зупиняється.

3. Нітела або хара. У всіх харових водоростей, що характеризуються крупними клітинами до 30--40 мм завдовжки, звичайно спостерігається дуже швидкий рух цитоплазми, але хлоропласти в цих клітинах нерухомі. Для спостереження краще всього брати шматочок водорості з цільною мутовкою щоб уникнути пошкодження окремих клітин. У нітели кожна гілочка мутовки утворена однією клітиною. У хари кожна гілочка утворена пучком клітин, і лише кінець гілочки закінчується одиничною клітиною, в якій спостерігається рух цитоплазми. До целюлозної оболонки безпосередньо примикає щільний і нерухомий шар цитоплазми - ектоплазма. В цьому шарі фіксовані хроматофори, які за величиною і формою дуже схожі з хлоропластами вищих рослин. Вони утворюють один шар щільно примикаючих один до одного подовжніх або злегка розташованих рядів. Між шаром ектоплазми і вакуолею знаходиться внутрішній рідкий шар цитоплазми, так звана ендоплазма. Шар ендоплазми постійно рухається, тече. Його можна спостерігати за переміщенням окремих хроматофорів, а також ядер і інших органел. Уздовж всієї клітини проходить вузька світла смуга, розташована з деяким нахилом до подовжньої осі клітини. Ця смуга, так звана індиферентна зона, є вверненням оболонки всередину клітини. Вона розсовує шар хроматофорів, завдяки чому і виникає світла смужка. З одного боку від індиферентної зони ендоплазма тече в одну сторону, а з іншого -- в протилежну.

4. Волоски тичинкових ниток традесканції. З квітки або з бутона, що ще не розкрився, обережно виймають одну тичинку, відділяють від неї пиляк, а нитку з волосками кладуть на предметне скло в краплю води і обережно накривають покривним склом, прагнучи не роздавити волоски. Препарат розглядають спочатку при малому, а потім при великому збільшенні мікроскопа з об'єктивом 40. Кожний волосок є ланцюжком клітин. Усередині всякої живої непошкодженої клітини відбувається постійний рух цитоплазми, який виявляється за переміщенням дрібних органел в одному напрямі. Особливо добре цей рух видно в тяжах цитоплазми, що перетинають у різних напрямах велику вакуоль. Часто можна спостерігати, як міняється розташування самого цього тяжа цитоплазми. В пошкоджених клітинах руху не спостерігається і цитоплазма представлена у вигляді згустків.

Завдання: зробити схематичні малюнки клітин всіх розглянутих об'єктів і стрілками вказати напрям руху цитоплазми. Відзначити, чи спостерігався рух відразу після приготування препарату або він змінювався під дією освітлення.

1.11 Визначення швидкості руху цитоплазми

На одному з препаратів, що використовуються в роботі 1.3.1, визначають швидкість руху цитоплазми: у елодеї і валіснерії -- за переміщенням хлоропластів, у нітели і хари -- за руху окремих частинок, переміщення яких легко спостерігати разом із струмом цитоплазми. Визначення ведеться до і після дії підвищеної температури, світла, розчину етанолу, розчину натрієвої солі АТФ. Виявити вплив світла або температури можна, витримуючи препарат на яскравому світлу або в термостаті при температурі 35 і 40°С протягом 5, 10 і 15 хв.

Хід роботи

Для визначення швидкості руху цитоплазми використовують секундомір і окуляр-мікрометр мікроскопа. За допомогою секундоміра відлічують час, протягом якого хлоропласт або інша частинка, що рухається, проходить відстань між двома вибраними поділками окуляра-мікрометра. Такі вимірювання в одній і тій же клітині проводять кілька разів. За ними розраховують середню величину і середню швидкість руху, яка виражається числом поділок окуляр-мікрометра, пройдених частинкою за 1с. Якщо відома ціна поділок окуляра-мікрометра при даному збільшенні мікроскопа, то швидкість руху можна знайти, поділивши величину відстані в мікрометрах на число секунд, за які частинка проходить цю відстань (мкм/с).

Вимірювання проводять в одних і тих же клітинах до і після дії на них зовнішніх чинників, які можуть спочатку прискорювати рух цитоплазми, потім він сповільнюється і навіть зупиняється. Найнадійнішим способом стимуляції руху цитоплазми є освітлення клітин. При цьому необхідно стежити, щоб освітлення не призводило до перегріву клітин. Витримка препарату в термостаті при температурі вище 40°С, як правило, веде до припинення руху цитоплазми.

Завдання: визначити швидкість руху цитоплазми у вибраному об'єкті до і після дії на нього підвищеної температури, світла, АТФ (або іншого чинника).

Контрольні питання.

I. Виконати тестові завдання:

1. Де в клітині відбувається накопичення антоцианів?

a) у вакуолі; c) в мітохондріях;

b) в гіалоплазмі; d) в клітинній стінці.

2. Визначення величини осмотичного тиску клітинного соку рослини має велике значення в екологічних дослідженнях. У клітинах яких рослин осмотичний тиск клітинного соку найбільший?

a) у гігрофітів

b) у степових рослин;

c) у лучних рослин;

d) у галофітів - рослин засолених ґрунтів.

3. Плазмоліз спостерігається при поміщенні клітин у розчин:

a) дистильована вода;

b) етиловий спирт;

c) сахарозу;

d) карбамід

4. Рух цитоплазми є явищем, залежним від:

a) температури;

b) наявності АТФ;

c) наявності світла ;

d) концентрації вуглекислого газу.

5. Життєздатність насіння можна визначити за:

a) здатністю набухати;

b) наявністю плазмолізу при поміщенні зрізу в розчин сахарози;

c) спеціальним забарвленням.

6. Різка зміна рН в той чи інший бік негативно впливає на рослину. При цьому значно менше негативна дія спостерігається при зменшенні рН в лужний бік. З чим це пов`язано?

a) з виділенням коренями вуглекислого газу, який нейтралізує надлишок лугу;

b) з виділенням органічних кислот, які нейтралізують надлишок лугу;

c) лужна реакція не пошкоджує клітин рослини.

7. Рослинні клітини не мають:

a) мітохондрій;

b) сферосом;

c) пероксісоми;

d) лізосом.

8. Іони, які надходять до цитоплазми, беруть участь у різних процесах. Одні входять до складу органічних компонентів. Другі, перебуваючи у вільному стані, регулюють фізико-хімічні властивості цитоплазми, а треті транспортуються у вакуоль. Які іони переважно потрапляють у вакуоль?

a) іони, які знаходяться в цитоплазмі в низьких концентраціях;

b) іони, які насичують цитоплазму;

c) іони, які активно використовуються під час метаболізму;

d) іони, які не використовуються в метаболізмі клітини.

II. Відповісти на запитання

1. Як провести визначення плазмолізу і деплазмолізу в рослинній клітині

2. Проаналізуйте той факт, що хлоропласти та мітохондрії крім зовнішньої, мають ще й внутрішню мембрану. Яка функція цих внутрішніх мембран?

3. Як визначити проникність живої та мертвої протоплазми для різних речовин?

4. Як провести визначення життєздатності насіння за забарвленням цитоплазми та наявністю плазмолізу?

5. Як довести експериментально залежність швидкості руху цитоплазми від зовнішніх факторів?



2. Хімічний склад рослин

Мета заняття.

Дослідити найбільш важливі фізичні та хімічні властивості основних метаболітів рослинної клітини, зокрема білків, вуглеводів та жирів за схемою: склад - будова - функції, оволодіти основними засобами визначення фракційного складу та функціональної активності речовин в залежності від фізіологічної потреби рослинної клітини.

Питання до обговорення.

1. Функціональні групи рослинних білків. Їх склад та властивості. Ізоелектрична точка.

2. Функціональні групи рослинних вуглеводів. Будова, утворення та мобілізація.

3. Рослинні ліпіди. Жири. Склад. Утилізація.

2.1 Білки

Основна маса протоплазми живих клітин складається з білків. Ферменти, багато гормонів також мають білкову природу. В білках окрім вуглецю, водню і кисню, завжди міститься азот, іноді фосфор і майже завжди сіра. Молекулярна маса білкових речовин може досягати декількох мільйонів. Найвищими кількісними показниками вмісту білку характеризується насіння бобових і олійних культур, наприклад: гороху, квасолі, соняшнику.

Білки рослин розділяють на групи за розчинністю в різних речовинах:

- альбуміни - (добре розчинні у воді);

- глобуліни - (добре розчинні в слабому розчині солей);

- проламіни - (добре розчинні в спирті);

- глютеліни - (добре розчинні в слабому розчині лугу).



2.2 Властивості рослинних білків

Матеріали і обладнання: 1) пшеничне і горохове борошно; 2) кристалізатори; 3) 70% розчин етилового спирту; 4) 0,2% розчин їдкого натру; 5) 1% розчин CuSO4; 6) концентрована азотна кислота; 7) аміак; 8) реактив Мілону; 9) 40% розчин їдкого натру; 10) насичений розчин (CH3COO)2Pb; 11) 10% розчин (NH4)2SO4; 12) фільтри; 13) воронки; 14) пробірки в штативах; 15) 10% розчин NaCl.

2.3 Виділення рослинних білків

1. Отримання проламінів і глютелінів з насіння пшениці

Хід роботи

100 г пшеничного борошна замішують з 50 мл дистильованої води в густе тісто і грудку цього тіста обережно промивають в проточній воді. Промивання ведуть до тих пір, поки вода не перестане каламутніти від крохмалю. У складі отриманої клейковини знаходяться 2 білки: гліадин (з групи проламінів) і глютенін (з групи глютелінів). Клейковину ділять на дві проби.

Першу пробу для екстракції гліадину розчиняють в 70% спирті, а другу, що служить для екстракції глютеніну, - в 0,2% розчині NaOH.

З кожною пробою здійснюють якісні реакції на білки.

2. Отримання альбумінів з бульб картоплі

Хід роботи

100 г бульб картоплі розтирають в ступці до гомогенного стану з 50 мл дистильованої води. Макуху віджимають через 2-3 шари марлі, а рідину фільтрують через паперовий складчастий фільтр, і фільтрат використовують для визначення альбумінів, проте перед цим відділяють альбуміни від всієї решти водорозчинних речовин: моно- і олігосахарів, крохмалю і ін. Для цього білки спочатку висолюють (NH4)2SO4 до повного насичення, а потім розчиняють отриманий осад альбумінів в 5 мл дистильованої води (до 20 мл фільтрату додають 10 г (NH4)2SO4, потім центрифугують розчин при 10 000 g, осад розчиняють в 5 мл дистильованої води). З отриманим розчином альбуміну здійснюють якісні реакцій на білки.

3. Отримання глобулінів з насіння гороху

Хід роботи

20 г горохового борошна засипають в колбу і заливають 50 мл 10% розчину (NH4)2SO4. Колбу закривають пробкою, струшують 10 хвилин на ротаторі і залишають стояти. Білок з групи глобулінів легумін, що знаходиться в гороховому борошні, переходить в розчин.

Через 30 хвилин розчин фільтрують крізь складчастий фільтр, змочений розчином цієї ж солі.

Щоб переконатися в тому, що даний білок не розчиняється у воді, наливають в пробірку 1 мл отриманого розчину білка і надлишок води, з'являється муть внаслідок випадання глобуліну в осад. Якщо додати слабкий розчин нейтральної солі (NH4)2SO4 або NaCl, муть зникне.

2.4 Визначення амінокислотного складу рослинних білків за допомогою якісних реакцій

1.Биуретова реакція

В лужному середовищі розчин білка при додаванні розбавленого розчину CuSO4 забарвлюється в синьо-фіолетовий колір. Забарвлення обумовлено утворенням комплексів іонів міді з пептидними групами білка.

Біуретову реакцію дають всі білки, а також олігопептиди, що містять не менше 2-х пептидних зв'язків.

Хід роботи

В одну пробірку наливають 1 мл розчину білка, а в другу - 1 мл розчину екстрагенту (дистильована вода; 10% розчин (NH4)2SO4; 70% розчин спирту; 0,2% розчин їдкого натру). В кожну пробірку додають по 5 мл 10% розчину NaOH і по 1 мл 1% розчину CuSO4. У присутності білка спостерігається стійке синьо-фіолетове забарвлення. Результати досліду вносять в таблицю2.1.

2. Реакція на ароматичні амінокислоти (реакція нітрування)

При нагріванні з концентрованою HNO3 білки дають жовте забарвлення. Реакція обумовлена наявністю в білках циклічних амінокислот (фенілаланіну, тірозину, триптофану) і заснована на утворенні нітропохідних цих амінокислот:

Після підлуження розчином NH4OH жовте забарвлення переходить в помаранчеве (утворюються амонійні солі хіноїдної структури).

Реакцію з азотною кислотою дають майже всі білки, за винятком деяких, в яких відсутні названі вище амінокислоти.

Хід роботи

В одну пробірку наливають 1 мл розчину білку, а в другу - 1 мл розчину екстрагенту (дистильована вода; 10% розчин (NH4)2SO4; 70% розчин спирту; 0,2% розчин їдкого натру). В кожну пробірку додають по 1 мл концентрованої азотної кислоти і нагрівають

У присутності білка спостерігається випадіння білого осаду, який при нагріванні забарвлюється в жовтий колір і поступово розчиняється (відбувається гідроліз білка), забарвлюючи розчин у жовтий колір. Пробірки охолоджують, до охолоджених розчинів додають по 2 мл концентрованого розчину аміаку або 30% розчину NaOH і спостерігають зміну забарвлення розчину, що містить білок, внаслідок утворення амонійної солі дінітротірозину.

Результати досліду вносять в таблицю 2.1

3. Реакція на цистеїн (реакція Фоля)

При додаванні до розчину білка розчину NaOH, (CH3COO)2Pb і подальшому кип'ятінні розчин починає темніти. Реакція обумовлена наявністю в білку цистеїновых та напівцистеїнових залишків, які при нагріванні у присутності міцного лугу руйнуються з вивільненням Na2S.

Ацетат свинцю реагує з лугом з утворенням плюмбіту натрію.

Сульфід натрію при взаємодії з плюмбітом дає чорний осад сульфіду свинцю.

Хід роботи

В одну пробірку наливають 1 мл розчину білку, а в другу - 1 мл розчину екстрагенту (дистильована вода, 10% розчин (NH4)2SO4, 70% розчин спирту, 0,2% розчин їдкого натру). В кожну пробірку додають по 1 мл 30% розчину NaOH і по 0,2 мл розчини (CH3C00)2Pb. При інтенсивному кип'ятінні рідина з білком, що містить сірковмісні амінокислоти темніє, оскільки утворюється чорний осад сульфіду свинцю.

Результати досліду вносять в таблицю 2.1

Таблиця 2.1

Група рослинного білка	Якісні реакції
	Біуретова	Фоля	Нітрування
Альбуміни
Глобуліни
Проламіни
Глютеліни

Завдання: заповнити таблицю 2.1, відзначивши "+", якщо реакція пройшла і "-", якщо реакція не пройшла. Замалювати кольоровими олівцями якісні реакції на білки.

2.5 Визначення ізоелектричної точки рослинних тканин

Білки складають структурну основу цитоплазми. Найважливіші каталізатори живої клітини - ферменти - також є по своїй природі білковими речовинами. Білки здатні змінювати свої властивості під впливом різних чинників (рН, температура та ін.), що позначається на структурному і фізіологічному стані цитоплазми в цілому. Одна з причин цієї мінливості полягає в тому, що білкова молекула містить в собі як позитивні, так і негативні іони, а також іони, що несуть одночасно позитивні і негативні заряди. Відомо, що білки складаються з амінокислот, сполучених між собою пептидними зв'язками

Кожна амінокислота має, принаймні, одну кислу і одну основну дисоціюючу групи, а саме карбоксильну і аміногрупу, тому амінокислоти є амфолітами і утворюють цвітеріони:

Разом з тим характер дисоціації непостійний і залежить від рН середовища. В кислих розчинах дисоціація йде по слаболужному типу, у зв'язку з чим амінокислоти виконують роль слабих основ, при дисоціації дають катіони:

У присутності лугів амінокислоти при дисоціації утворюють аніони і поводяться як слабі кислоти:

В певній зоні рН дисоціація кислих і основних груп зрівнюється. Зона рН, в якій молекула білка стає електронейтральною, називається ізоелектричною точкою (ІЕТ). ІЕТ залежить від кількості вільних карбоксильних і аміногруп.

Завдяки наявності пептидного зв'язку в білках відсутні всі здатні до дисоціації вільні б-карбоксильні і б-аміногрупи, за винятком однієї кінцевої б-карбоксильної і б -аміногрупи. Проте в численних бічних ланцюгах білкової молекули є кислі і основні групи, що і обумовлює амфолітні властивості білків. Значення ІЕТ білка залежить не стільки від констант дисоціації, скільки від числа бічних ланцюгів з кислими і основними групами. Тому значення ІЕТ білків коливається в широких межах (глобулін зерна ячменю - 4,9, уреази кінських бобів - 7,2, пепсин - 1,0). Визначення ІЕТ протоплазми, безумовно, може дати відомості лише про деяку середню величину.

В ІЕТ молекула білка має мінімум електричних зарядів, а оскільки, ймовірно, зарядом визначається ступінь електростатичного притяжіння молекул води (гідратація, набухання), ІЕТ співпадає з мінімумом набухання і мінімумом розчинності білка.

Коли амфоліт дисоціює як основа, він зв'язує аніони. Це спостерігається при рН нижче його ІЕТ. В середовищі з рН вище ІЕТ амфоліт дисоціює як кислота і зв'язує катіони.

Визначення ІЕТ: при зануренні зрізів рослинних тканин в розчини з рН нижче за її ІЕТ, тканина утримує кислий барвник - еозин, у якого забарвлений аніон. В розчинах з рН вище за ІЕТ тканина утримує основний барвник - метиленовий синій, у якого забарвлений катіон. При визначенні ІЕТ окремого амфоліту спостерігається різкий перехід забарвлення від рожевого до синього. Для різних тканин перехід забарвлення від червоного до синього, знаходитиметься при різних значеннях рН.

Матеріали і обладнання: 1) 10-тиденні проростки квасолі, рицини; 2) препаровальне обладнання; 3) предметні і покривні скельця; 4) мікроскоп; 5) 70% етиловий спирт; 6) 0,1М розчин лимонної кислоти; 7) 0,2М розчин Na2HPO4; 8) 0,1% розчин еозину; 9) 0,01% розчин метиленового синього; 10) фарфорові чашки; 11) бюкси.

Хід роботи

Приготувати в бюксах буферні розчини з наступними значеннями рН: 2,2; 3,0; 3,6; 5,0; 5,4; 6,0; 7,0; 8,0, використовуючи табл. 2.2

Таблиця 2.2

№	рН	0,2М розчин Na2HPO4 (в мл)	0,1М розчин лимонної кислоти (в мл)
1	2,2	0,20	9,80
2	3,0	2,05	7,95
3	3,6	3,22	6,78
4	5,0	5,15	4,85
5	5,4	5,57	4,43
6	6,0	6,31	3,69
7	7,0	8,23	1,77
8	8,0	9,72	0,28

Узяти чотири фарфорові чашки. В першу налити 3 - 5 мл 70% розчину етилового спирту, в другу - 3 мл 0,1% розчину еозину, в третю - 3 мл 0,01% розчину метиленового синього, в четверту - 5 мл дистильованої води.

Зробити 20 -25 тонких зрізів з досліджуваних об'єктів. Розглянути під мікроскопом і вибрати 16 найвдаліших. Занурити їх на 5 хвилин в першу фарфорову чашку, потім на 10 хвилин по черзі в інші. Потім занурити по 2 зрізи в буферні розчини з різними значеннями рН на 1,5 - 2 години.

Таблиця 2.3

Об`єкт	Тканина	Забарвлення тканини при різних рН	Величина ІЕТ
		2,2	3,0	3,6	5,0	5,4	6,0	7,0	8,0
	Ксилема
	Кора



Після закінчення вказаного терміну вийняти зрізи з буферних розчинів і помістити їх на предметне скло в певній послідовності. Накрити покривними скельцями і розглянути під мікроскопом. Окремі ділянки зрізу забарвляться по-різному. При рН нижче ІЕТ тканина забарвиться в рожевий колір, при рН вище ІЕТ - в синій. Якщо величина рН буферного розчину відповідає ІЕТ, тканина набуває бузкового або фіолетового забарвлення, оскільки адсорбуються в рівному ступені метиленовий синій і еозин. Якщо перехідне забарвлення не спостерігається, то ІЕТ обчислюють як середню з двох сусідніх показників. У тому випадку, коли цитоплазма кліток має суміш різних амфолітів, перехід забарвлення з одного в інше відбуватиметься в широкому діапазоні.

Завдання: заповнити таблицю 2.3 і визначити величину ІЕТ в досліджуваному об'єкті.

2.6 Вуглеводи

Вуглеводи є групою органічних сполук, надзвичайно важливих для рослинних організмів, тому що є основним проміжним продуктом ряду біохімічних циклів перетворення речовин. На частку вуглеводів доводиться до 90% сухої речовини. За хімічною природою це альдегіди або кетони багатоатомних спиртів або продукти їх конденсації. Вуглеводи є одним з основних джерел енергії, яка утворюється в результаті обміну речовин в рослинах. За розмірами і властивостями молекул їх розділяють на прості (моносахариди) і складні (полісахариди). Моносахариди містять 2-7 атомів вуглецю, сполучених в нерозгалужений ланцюг; є безбарвними кристалічними речовинами, розчинними у воді, солодкі, оптично активні. Найважливішими з них є сполуки з 5 атомами вуглецю - пентози: рибоза і дезоксирибоза, що входять до складу нуклеїнових кислот і ксілоза, що міститься в деревині, соломі і т.п.;

б-D-рібоза б-D-дезоксірібоза б-D-ксілоза

Рисунок 2.1 Найпоширеніші пентози рослин

та гексози: глюкоза і фруктоза, що входять до складу клітинного соку (рис.2.2)

б -D-глюкоза б -D-глюкофураноза б -D-глюкопираноза

б -D-фруктофураноза б -D-фруктопираноза

б -D-фруктоза

Рисунок.2.2 Найпоширеніші гексози рослин

Полісахариди є продуктами конденсації пентоз і гексоз. Під дією кислот, приєднуючи воду (гідроліз), вони розпадаються знову на моносахариди. Залежно від будови молекул вищі сахари діляться на гомо- і гетерополісахариди.

Важливими представниками гомополісахаридів є целюлоза і крохмаль. Це високополімерні сполуки із загальною формулою (С6Н10О5)n, переважно аморфні речовини, без смаку; розчиняються у воді (інулін), створюючи при цьому колоїдні речовини, і нерозчинні (клітковина, крохмаль), у воді лише набухають. Вагома більшість полісахаридів в рослинних організмах знаходиться у вигляді резервних вуглеводів; целюлоза і пектинові речовини грають роль опорних структур.

Отримання розчинів моно-, ді-, полісахаридів і вивчення їх властивостей

Матеріали і обладнання: 1) коренеплоди моркви, цукрового буряка; 2) терки металеві; 3) колби на 100 мл; 4) стакани; 5) фільтрувальний папір; 6) тканина, марля; 7) водяна лазня; 8) Н2SO4 (конц.); 9) 10% розчин соди; 10) Фелінгова рідина; 11) солод; 12) 1% розчин крохмалю; 13) I2 в KI; 14) 10% розчин б-нафтолу.

Екстракція сахарів з рослинних тканин

Сахара виділяють із запасаючих органів рослин (коренеплодів, насіння, бульб), оскільки саме там міститься найбільша їх кількість.

Хід роботи

1 Екстракція глюкози

Для отримання моносахариду глюкози можна використовувати коренеплід моркви. Обчищений і вимитий коренеплід моркви натирають на терці, беруть від 5 до 10 г мезги, поміщують в колбу, заливають 10-15 мл води, кип'ятять і фільтрують. З фільтратом проводять якісні реакції на сахари.

2. Екстракція сахарози

Для отримання дісахариду сахарози можна використовувати коренеплід цукрового буряка, звідки її і одержують технічно. Очищений і вимитий коренеплід цукрового буряка натирають на терці, беруть 20 г мезги, поміщують в колбу, заливають 50 мл води, ретельно перемішують і через 20 хвилин фільтрують. З фільтратом проводять якісні реакції на сахари.

1. . Екстракція мальтози

Для отримання дісахариду мальтози використовують солод: беруть 20 г солоду, поміщають в колбу, заливають 50 мл води, підігрітої до 300С, і фільтрують. З фільтратом проводять якісні реакції на сахари.

2. Отримання розчину крохмалю

Беруть 50 мл води, нагрітої до кипіння, і додають 1 г крохмалю, заздалегідь розчиненого в 10 мл холодної води. При додаванні крохмалю до киплячої води слідує киплячу рідину весь час розмішувати скляною паличкою. Після додавання крохмалю рідину кип'ятять до тих пір, поки вона не стане більш менш прозорою. З отриманим розчином проводять якісні реакції на сахари.

Визначення сахарів за допомогою якісних реакцій

1. Реакція на редукуючі сахари (реакція Фелінга)

Це якісна реакція на вільні альдегідні групи в молекулах сахарів. При взаємодії реактиву Фелінга, а саме Cu (OH)2, з альдегідною групою сахарів, остання окислюється до карбоксильної групи і при цьому в осад випадає Cu2O, який має цегляно-червоне забарвлення (рис.2.3)

+ 2CuSO4 + 4NaOH + Cu2O +2Na2SO4 + 2H2O+О2

Рисунок 2.3 Реакція Фелінга

Тому за допомогою реактиву Фелінга можна знайти тільки редукуючі (що містять вільну альдегідну групу) сахари: глюкозу, мальтозу. Для проведення цієї реакції з сахарозою і крохмалем потрібен їх попередній гідроліз (щоб звільнити зв'язані альдегідні групи).

Хід роботи

1.1 Виявлення глюкози і мальтози

Беруть в пробірку 1-2 мл фільтратів витяжок цих сахарів, додають рівний об'єм реактиву Фелінга і кип'ятять. За наявності редукуючих сахарів випадає цегляно-червоний осад закису міді.

1.2 Виявлення сахарози

Беруть в пробірки 2 проби фільтрату по 10 мл. З однією пробою проводять реакцію Фелінга. Осідання міді не утворюється, оскільки сахароза не є редукуючим сахаром. В другу пробу підливають 2-3 краплі концентрованої сірчаної кислоти. Ретельно перемішують і ставлять на 30 хвилин в киплячу водяну лазню. У присутності кислоти відбувається гідроліз сахарози на моносахари - фруктозу і глюкозу.

Через 30 хвилин пробірку знімають з лазні, нейтралізують 10% розчином соди, беруть 1 мл нейтралізованого розчину і проводять реакцію Фелінга. Випадає цегляно-червоний осад закису міді.

1.3 Виявлення крохмалю

Беруть в пробірки 2 проби розчину крохмалю по 5 мл. З однією пробою проводять реакцію Фелінга. Осідання міді не утворюється, оскільки крохмаль не є редукуючим сахаром. В другу пробу підливають 2-3 краплі концентрованої сірчаної кислоти. Ретельно перемішують і ставлять на 30 хвилин в киплячу водяну лазню. У присутності кислоти відбувається гідроліз крохмалю на моносахарид глюкозу.

Через 30 хвилин пробірку знімають з лазні, нейтралізують 10% розчином соди, беруть 1 мл нейтралізованого розчину і проводять реакцію Фелінга. Випадає цегляно-червоний осад закису міді.

Крім того, на крохмаль проводять якісну реакцію з I2 в KI. Ця реакція є якісною на крохмаль. При її позитивному протіканні розчин забарвлюється в синій колір. При нагріванні забарвлення зникає, а при охолоджуванні з'являється знов.

2. Реакція з б-нафтолом

1-2 мл досліджуваного розчину наливають в пробірку, додають 2 краплі 10% розчину б-нафтолу на 70% етиловому спирті, потім до суміші обережно по стінках підливають 2-3 мл концентрованої сірчаної кислоти так, щоб вона опускалася на дно, не змішуючись з рідиною. Через короткий проміжок часу на межі двох рідин утворюється кільце червоно-фіолетового кольору. Цю дуже чутливу реакцію дають всі вуглеводи.

Кислотний гідроліз крохмалю

Матеріали і обладнання: 1) 1% крохмальний клейстер; 2) 20% соляна кислота; 3) розчин I в К1 в крапельниці (концентрований); 4) Фелінгова рідина; 5) Nа2SO3; 6) електроплитка з азбестовою сіткою; 7) штатив з пробірками (7 шт.); 8) піпетка, градуйована на 2 мл; 9) мірний циліндр; 10) колба.

Крохмаль є полісахаридом (точніше, суміш двох близьких полісахаридів -- амілози і амілопектину) з емпіричною формулою (С6Н10О5) H2O. Молекула крохмалю складається з великої кількості залишків глюкози, сполученої попарно в мальтозу. Крохмаль є нерозчинним у холодній воді, а в гарячій воді утворює колоїдний розчин -- крохмальний клейстер. При кип'ятінні крохмального клейстеру з мінеральною кислотою крохмаль гідролізується до глюкози через ряд проміжних продуктів з молекулярною масою, що поступово зменшується, які називають декстринами. Прослідити за процесом гідролізу крохмалю можна за допомогою реакції з розчином йоду, який забарвлює крохмаль в синій колір, амілодекстрин -- у фіолетовий, еритродекстрин -- в червоний, ахродекстрин -- в помаранчевий, а з мальтодекстрином і мальтозою забарвлення не дає (залишається жовтим).

Хід роботи

Налити в колбу 50 мл 1% крохмального клейстеру. Поставити в штатив 7 пробірок і відлити в першу пробірку 4--5 мл крохмального клейстеру. Внести в колбу 1,5 мл 20% розчину НС1 і нагрівати на електроплитці або газовому пальнику. При появі перших пухирців (початок кипіння) відлити з колби 4--5 мл в другу пробірку. Продовжувати кип'ятити вміст колби, відливаючи з неї через кожні 5 хв. по 4--5 мл в наступні пробірки. Дати пробам в пробірках охолодитися, розбавити їх водою і додати по 5 крапель розчину I2 в КI. Якщо забарвлення йоду відсутнє, гідроліз можна вважати закінченим. Виконати з розчином, що залишився в колбі, реакцію на редукуючі сахари: налити 2--3 мл рідини в чисту пробірку, нейтралізувати кислоту содою, підлити рівний об'єм Фелінгової рідини і довести до кипіння. Результати занести в таблицю 2.4

...